• 《中国科学引文数据库(CSCD)》来源期刊
  • 中国科技期刊引证报告(核心版)期刊
  • 《中文核心期刊要目总览》核心期刊
  • RCCSE中国核心学术期刊

狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析

肖宇, 吴凡, 张宝石, 徐孟磊, 龙家慧, 罗均, 郭霄峰, 罗永文

肖宇, 吴凡, 张宝石, 等. 狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析[J]. 华南农业大学学报, 2024, 45(2): 190-198. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015
引用本文: 肖宇, 吴凡, 张宝石, 等. 狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析[J]. 华南农业大学学报, 2024, 45(2): 190-198. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015
XIAO Yu, WU Fan, ZHANG Baoshi, et al. The different regulatory effect of glycoproteins from virulent and attenuated strain of rabies virus on type I interferon signaling pathway[J]. Journal of South China Agricultural University, 2024, 45(2): 190-198. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015
Citation: XIAO Yu, WU Fan, ZHANG Baoshi, et al. The different regulatory effect of glycoproteins from virulent and attenuated strain of rabies virus on type I interferon signaling pathway[J]. Journal of South China Agricultural University, 2024, 45(2): 190-198. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015

狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析

基金项目: 广东省基础与应用基础研究基金(2018A030313163)
详细信息
    作者简介:

    肖 宇,硕士研究生,主要从事动物病毒学研究,E-mail: xiaomou1022@163.com

    通讯作者:

    罗永文,副教授,博士,主要从事预防兽医学研究,E-mail: ywluo@scau.edu.cn

  • 中图分类号: S852.655

The different regulatory effect of glycoproteins from virulent and attenuated strain of rabies virus on type I interferon signaling pathway

  • 摘要:
    目的 

    狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种高致死性人兽共患传染病。I型干扰素(IFN-I)通路在抵抗RABV感染中发挥重要作用。RABV可通过磷蛋白及核蛋白的功能逃逸IFN-I的抗病毒作用,本研究旨在探讨对RABV的致病性有重要影响的糖蛋白(Glycoprotein,G)在调节IFN-I通路方面扮演怎样的角色。

    方法 

    将RABV弱毒株Hep-Flury的G基因替换成致病株CVS-11的G基因,拯救得到重组病毒HepG,分析Hep-Flury、CVS-11和HepG这3种毒株在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差别,比较它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异性。

    结果 

    替换了CVS-11的G基因后,重组病毒HepG致病力增强,能够100%致死小鼠,在鼠脑中的增殖水平显著高于亲本株Hep-Flury。在感染鼠脑早期及体外神经细胞时,弱毒株Hep-Flury能够较快地激活IFN-I通路相关基因的表达,重组病毒HepG的激活能力介于Hep-Flury和CVS-11之间。利用Poly(I:C)激活神经细胞的IFN-I通路后,Hep-Flury的增殖被显著抑制,CVS-11和HepG的复制几乎不受影响,表现出一定的抵抗能力。

    结论 

    RABV的G蛋白在调节和抵抗IFN-I通路方面发挥重要功能,为进一步探究RABV致病毒株的G蛋白如何协助病毒在中枢神经系统中逃逸IFN-I提供了线索和依据。

    Abstract:
    Objective 

    Rabies is a highly lethal zoonotic infectious disease caused by rabies virus (RABV). Type I interferon (IFN-I) pathway plays an important role in resisting RABV infection. RABV can escape the antiviral effect of IFN-I through the function of its phosphoprotein and nucleoprotein. The aim of the study was to investigate the role of glycoprotein (G), which has an important impact on the pathogenicity of RABV, in regulating IFN-I pathway needs more comprehensive exploration.

    Method 

    This study replaced the G gene of the RABV attenuated strain Hep-Flury with the G gene of the pathogenic strain CVS-11 to rescue and acquire the recombinant virus HepG. We analyzed the differences in the activation and regulation of IFN-I pathway in vivo and in vitro infected with Hep-Flury, CVS-11 and HepG, and compared the differences of these virus strains in fighting against antiviral effect of IFN-I in nerve cells.

    Result 

    After replacing G gene, the recombinant virus HepG had enhanced pathogenicity, was able to kill 100% of mice and the proliferation level in the mouse brain was significantly higher than that of the parental strain Hep-Flury. While infecting mouse brain early and in vitro neuronal cells, the attenuated strain Hep-Flury was able to activate the expression of IFN-I pathway-related genes faster, and the activation ability of HepG was between that of Hep-Flury and CVS-11. After activation of the IFN-I pathway in neuronal cells using Poly(I:C), the proliferation of Hep-Flury was significantly inhibited, and the replication of CVS-11 and HepG was almost unaffected, showing some resistance.

    Conclusion 

    G protein of RABV plays an important role in regulating and resisting the IFN-I pathway, providing the clue and evidence for further exploring how the G protein of RABV pathogenic strains helps the virus escape IFN-I pathway in the central nervous system.

  • 狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种人兽共患中枢神经系统传染病,人类及所有的温血动物均易感,病死率几乎达100%[1]。现今狂犬病仍呈全球性流行,90%以上分布在亚洲和非洲,对公众健康安全构成严重威胁[2-3]。固有免疫是机体抵抗外来病原入侵的第一道防线,RABV感染激活宿主固有免疫主要是通过维甲酸诱导基因I(Retinoic acid induced gene I,RIG-I)识别病毒5'−三磷酸化的基因组RNA或者转录前导RNA链(Leader RNA),从而诱导I型干扰素(Type I interferon,IFN-I)通路的活化,发挥抵抗RABV的作用[4];IFN-I系统对于机体抗RABV感染起着非常重要的作用,敲除IFN-I受体的小鼠对RABV感染的敏感性增加[4];也有研究显示,敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)或者其下游关键接头分子MyD88(Myeloid differentiation primary response protein 88)的小鼠对于某些中强毒力RABV的保护力显著下降,说明TLR7介导的IFN-I途径也在抗RABV中发挥重要作用[5-6]。但是,RABV也进化出了拮抗IFN-I作用的方式[7]。一方面,RABV的磷蛋白(Phosphoprotein,P)能够与TBK-1(TANK-binding kinase 1)相互作用,阻断IRF3(Interferon regulatory factor 3)的磷酸化,阻断其二聚化以及核转移,从而抑制IFN-I的产生[8]。另一方面,P蛋白还能与激活后的STAT1/2(Signal transducer and activator of transcription 1/2)相互作用,阻止它们的核转移进而抑制下游干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表达[9]。另外,RABV的核蛋白(Nucleoprotein,N)在一定程度上也可以通过抑制IRF3激活的方式,抑制下游IFN-I基因的表达。因此,通过改变N基因序列可达到减弱病毒毒力的效果[10]。但是,对病毒致病力起关键作用的糖蛋白(Glycoprotein,G)是否在调节或对抗IFN-I途径中发挥着作用?其在RABV抵抗IFN-I通路作用中扮演着什么样的角色?这些问题在目前的研究中都极少涉及。为了探究上述相关问题,我们利用RABV的反向遗传操作系统将弱毒Hep-Flury的G基因替换成CVS-11的G基因,拯救出重组病毒HepG,分别研究弱毒株Hep-Flury、攻毒固定毒株CVS-11和HepG在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差异,并对比分析它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异,拟阐释不同RABV的G蛋白与IFN-I通路的相互作用。

    RABV疫苗弱毒株Hep-Flury及致病固定毒株CVS-11由华南农业大学兽医学院兽医微生物学实验室保存。6周龄SPF级雌性昆明系(KM)小白鼠购自南方医科大学实验动物中心,其狂犬病病毒血清、抗体检测均为阴性,健康状况良好,在严格的饲养管理条件下进行试验。所有动物试验均在华南农业大学兽医学院动物生物安全三级(ABSL-3)实验室完成,所有试验程序和条件均遵守《中华人民共和国实验动物管理条例》,并通过了华南农业大学动物福利委员会审查。

    细胞株:乳仓鼠肾细胞(BHK-21)、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)。其中,BHK-21、SK-N-SH培养于含10%(φ)FBS的DMEM培养基,Neuro-2a细胞培养于含10%(φ)FBS的RPMI-1640培养基,所有细胞均置于37 ℃、5%(φ)CO2细胞培养箱中培养。

    利用基于Hep-Flury基因组骨架的反向遗传操作系统及无缝连接技术将弱毒株HEP-Flury的G基因替换成强毒的CVS-11的G基因,构建并拯救出重组毒株HepG,如图1所示。

    图  1  RABV重组毒株HepG构建示意图
    Figure  1.  Construction diagram of RABV recombinant strain HepG

    在含Hep-Flury基因组全长cDNA的pHEP-3.0质粒的合适位置设计2对引物(表1),以pHEP-3.0为模板进行PCR,得到L片段和C区段(C区段包括NPM基因)。在CVS-11的G基因位置设计1对引物(表1),以CVS-11 cDNA为模板进行PCR,扩增G基因片段。以上引物均在相应的连接区设计15~20 bp的重叠序列。将上述3个片段扩增回收,利用无缝连接试剂盒(Vazyme)进行连接反应,筛选得到G基因替换的重组质粒pHepG。质粒转染及病毒拯救方法参照郭霄峰等[11],利用SuperFect Transfection Reagent(Qiagen)将pHepG和4个辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G共转染到BHK-21细胞中,培养6 d后,筛选并鉴定出重组病毒,全程以pHEP-3.0及辅助质粒拯救Hep-Flury作为阳性对照。

    表  1  HepG构建的引物序列
    Table  1.  Primer sequences for construction of HepG
    基因片段
    Gene segment
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence
    HEP-L F: AGGCCGGTCATCCTTTTGACACCTCAAGTCCAGA
    R: ATTTTAGCATGTACAGGCTTTCATTAATGTCCGGC
    HEP-C F: GCCTGTACATGCTAAAATTCTTGTAYGATGCATCTTG
    R: CTTTCCTTAAGTCTTTTGAGGGATGTTAATAGTTTT
    CVS-G F: CAAAAGACTTAAGGAAAGATGGTTCCTCAGGTTCTT
    R: CAAAAGGATGACCGGCCTTCACAGTCTGATCTCACCT
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    将狂犬病病毒分别倍比稀释(10−1~10−8)并与BHK-21细胞混合后,铺于96孔细胞培养板中,每个稀释度重复4孔。在37 ℃、5%(φ)CO2培养箱中培养48 h。弃去细胞培养液,每孔加入预冷丙酮100 μL,然后将培养板放置于−20 ℃冰箱静置1 h。弃去丙酮,用200 μL PBS洗3遍。每孔避光加入25 μL抗RABV的N蛋白荧光抗体(Fujirebio),于37 ℃条件下孵育1 h。弃去荧光抗体,用200 μL PBS洗涤细胞3次。在荧光显微镜下观察并计数,按照Reed-Muench法计算病毒滴度。

    将RABV Hep-Flury、HepG、CVS-11分别对6周龄的SPF级KM小鼠进行滴鼻攻毒(每只小鼠105 FFU),每组10只小鼠。同时滴鼻DMEM为空白对照,每天观察小鼠状态并称量体质量。

    为了排除血液中的细胞因子对检测小鼠脑组织中细胞因子的干扰,在取鼠脑之前对小鼠进行心脏灌流。攻毒后第4、7、10天分别从各试验组和对照组中取3只小鼠,麻醉后,进行活体心脏灌流。

    小鼠心脏灌流完成后,在生物安全柜内取出完整鼠脑,放入无RNA酶的1.5 mL EP管中。对鼠脑进行编号、标记并称质量,加入适量的Trizol溶液进行研磨处理。

    利用HiPure Universal RNA Kits (Magen)试剂盒抽提鼠脑样品总RNA,在抽提时加入DNase I去除基因组DNA污染。用NanoDrop 2000c微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。取等质量的RNA进行反转录,按HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme)反转录试剂盒说明书进行操作,引物为Oligo (dT)23和Random hexamers。

    根据各检测基因的序列设计特异引物(表2),以GADPH为内参基因。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme)荧光定量试剂盒进行RT-qPCR。反应结束后,对所有靶基因与内参基因GAPDH作均一化处理以消除试验误差,各基因转录水平通过2−ΔΔCt方法计算得出,表达倍数计为各组中不同基因的转录值与未感染细胞(Mock)组转录值的比值。各个样本靶基因的表达差异分析由GraphPad 5.0软件完成。显著性差异按双因素方差分析(Two-way ANOVA)法计算,以P<0.05、0.01、0.001记为差异显著。

    表  2  RT-qPCR检测引物
    Table  2.  Primers used for RT-qPCR
    基因
    Gene
    上游引物序列(5′→3′)
    Forward primer sequence
    下游引物序列(5′→3′)
    Reverse primer sequence
    RABV genome GACAGCGTCAATTGCAAAGCAAAAAT GGGTACTTGTACTCATATTGATCCACGAT
    N GCACTGGCAGATGACGGAAC TCGGCGAATGAGTTTGGACG
    Leader RNA TGTAGGGGTGTTACATTTTT ACGCTTAACAACAAAACC
    Cxcl10 TCCATATCGATGACGGGCCA CAACACGTGGGCAGGATAGG
    Dhx58 CCAGAGCACACACATGACCC CCATAGCGCACCACCACATT
    IFN-α4 AGCCTGTGTGATGCAGGAACC CAGCAAGTTGGTTGAGGAAGAG
    IFN-κ TGGAGTTGGGCAAGTATTTCTTC GGACTTGGAAAATATAATGAAACATCTTC
    IFN-β ACCTACAGGGCGGACTTCAA ACACTGTCTGCTGGTGGAGT
    IFN-γ TCAGCAACAGCAAGGCGAAA ATTGAATGCTTGGCGCTGGA
    IL6 TGCCTTCTTGGGACTGATGC GACAGGTCTGTTGGGAGTGGT
    IRF3 TCAGGATCCCGTGGAAGCAT TGACACGTCCGGCTTATCCT
    IRF7 ACTGGCTATTGGGGAGGTC ACGACCGAAATGCTTCCAGG
    ISG15 GACGCAGACTGTAGACACGC TTAGGCCATACTCCCCCAGC
    MDA5 GAGCACCTACGCACTTTCCC CCACCGTCGTAGCGATAAGC
    MyD88 TCATGTTCTCCATACCCTTGGT AAACTGCGAGTGGGGTCAG
    RIG-I CCTTGATTGCCCTGATGTTG ATTTCTCCCTGTCCCTCCAA
    RNF125 GGCGCACATAAGGACCTGTG TCATCCAGTTCCCGCTGACA
    TLR3 GTGAGATACAACGTAGCTGACTG TCCTGCATCCAAGATAGCAAGT
    TLR7 TCTTTGGGTTTCGATGGTTTCC GCAGTCCACGATCACATGGG
    TLR9 ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT GAGGCTTCAGCTCACAGGG
    GAPDH AGAGTGTTTCCTCGTCCCGT CTGTGCCGTTGAATTTGCCG
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    将Hep-Flury、HepG和CVS-11病毒以相同的感染复数(MOI=3)感染6孔板中的Neuro-2a细胞,同时设置未接毒的Neuro-2a细胞为空白对照。接毒后6、12、24、48 h,在每孔细胞加入1 mL Trizol溶液处理并抽提RNA。利用上述RT-qPCR检测病毒的载量及IFN-I通路相关基因的表达水平。

    将Neuro-2a和SK-N-SH细胞接种至直径为3.5 cm的细胞培养板中,细胞贴壁后用无血清培养基洗1遍,然后每板细胞利用脂质体转染50 ng的Poly(I:C),孵育6 h。之后弃去Poly(I:C)和培养基的混合液,用无血清的培养基洗3遍,以MOI=3接种不同RABV毒株。分别于接毒后1、2、3、4及5 d收集病毒培养上清液120 μL,测定上清液中病毒滴度。

    将扩增得到的C、L片段和CVS-11 G基因(图2)回收后,进行无缝连接和重组质粒筛选,进一步利用Hep-Flury反向遗传操作系统拯救出重组病毒HepG(图3)。

    图  2  构建重组病毒HepG的扩增片段
    M:DNA marker DL10000;1、2:C区段基因;3、4:L片段基因;5、6:CVS-11 G基因
    Figure  2.  Amplified fragments for construction of recombinant virus HepG
    M: DNA marker DL10000; 1, 2: C-segment gene; 3, 4: L-segment gene; 5, 6: CVS-11 G gene
    图  3  重组病毒HepG的免疫荧光检测
    Figure  3.  Immunofluorescence detection of recombinant virus HepG

    将CVS-11、Hep-Flury和HepG滴鼻感染小鼠(105 FFU),CVS-11和HepG分别在第8天和第10天100%致死小鼠,试验小鼠均呈现麻痹型的狂犬病症状(图4),说明G蛋白对病毒的致病力起着关键作用。感染Hep-Flury的小鼠在感染第10天出现明显的体质量下降,之后第14天体质量开始回升,出现耸毛、弓背等症状,但16 d后逐渐恢复正常,所有小鼠均成活(图4)。

    图  4  3种RABV毒株感染的KM小鼠的体质量变化
    Figure  4.  Body weight changes of KM mice infected with three RABV strains

    采用RT-qPCR分别检测Hep-Flury、HepG、CVS-11滴鼻感染鼠脑后第4天和第7天NG基因,leader RNA和病毒基因组RNA的含量。

    滴鼻感染小鼠后第4天,Hep-Flury、HepG和CVS-11在鼠脑中的整体复制水平比较低,CVS-11的基因组水平最高(图5A),而对于leader RNA、NG基因的转录水平,Hep-Flury显著高于CVS-11 (P<0.05、P<0.01、P<0.05)(图5B~5D)。在感染第7天,CVS-11的复制程度超过Hep-Flury约4 000倍(P<0.001);HepG的复制水平及基因转录水平介于Hep-Flury和CVS-11之间(图5A)。在感染中后期,HepG和CVS-11的复制量大大增加,感染7 d后小鼠开始发病,10 d内全部死亡;Hep-Flury在脑内的总体复制水平较低,小鼠感染后不死亡(图5B~5D)。

    图  5  RABV感染鼠脑后病毒载量和病毒基因转录水平变化
    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)
    Figure  5.  Changes of viral load and viral gene transcription in the brains of mice infected with RABV
    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    小鼠感染Hep-Flury、HepG和CVS-11后,利用RT-qPCR检测小鼠中枢神经系统中IFN-I通路相关分子的表达水平变化。

    结果表明,在病毒感染的第4天,IFN-I通路上游基因RIG-IMDA5Dhx58以及下游基因ISG15IL6均在Hep-Flury感染后有较高水平的表达(图6A~6C6G6H),HepG感染后对这些基因的激活水平处于Hep-Flury和CVS-11之间。在病毒感染后第7天,上述基因及TLR3在CVS-11和HepG感染后的激活水平显著高于Hep-Flury(图6A~6D6F~6H)。另外,IRF3则在3种毒株的不同感染时间都没有显著的表达变化(图6E)。结果说明,弱毒Hep-Flury能够更早地激活IFN-I通路,而致病毒株CVS-11则在感染后期大大刺激IFN-I通路相关基因表达。HepG感染后对IFN-I通路相关基因的激活水平介于Hep-Flury和CVS-11之间,暗示着在RABV感染中枢神经系统中不同G基因对于IFN-I通路的激活具有一定的调节作用。

    图  6  RABV感染鼠脑后IFN-I通路相关基因表达分析
    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)
    Figure  6.  Expression analysis of IFN-I pathway related genes in the brains of mice infected with RABV
    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    RT-qPCR检测不同RABV毒株感染后鼠脑中各IFN基因的表达变化,发现IFN-α4/β/γ/κ这4个基因在3种病毒感染的第4天表达量均较低,各毒株间无显著差异(图7A~7D),但在HepG和CVS-11感染后第7天诱导的IFN-α4/β/γ基因表达量显著超过了Hep-Flury,其中IFN-γ的表达水平上调最显著(图7C)。而IFN-κ则只在CVS-11感染后第7天显著上调(图7D)。

    图  7  RABV感染鼠脑后不同IFN基因表达分析
    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)
    Figure  7.  Expression analysis of IFN genes in the brains of mice infected with RABV
    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    为了研究Hep-Flury、HepG和CVS-11在感染体外细胞后,IFN-I通路相关基因表达量的变化,我们测定了它们感染(MOI=3)Neuro-2a细胞后的一步生长曲线,并利用RT-qPCR检测感染后6、12、24和48 h IFN-I通路上游和下游分子的表达情况。

    不同RABV毒株感染Neuro-2a细胞时,病毒滴度均在感染后第3天达到峰值,CVS-11和HepG的滴度较高,超过了107 FFU/mL,Hep-Flury的滴度较低,接近106 FFU/mL,之后下降较快(图8)。 IFN-I通路上游因子TLR3RIG-IIRF7在RNBV感染后6 h即被激活表达,且被Hep-Flury和HepG感染激活的水平显著高于CVS-11(图9A9E9F),而TLR9在HepG感染后12 h和24 h有较高水平的表达(图9C)。MyD88则在Hep-Flury的感染后期(48 h)有显著的上调表达,在HepG和CVS-11感染细胞中的表达差异不显著(图9D)。TLR7在3种病毒感染的不同时间均未有激活表达(图9B)。结果表明,相较于CVS-11,Hep-Flury和HepG感染Neuro-2a细胞能够通过激活TLR3RIG-I相关的通路,更强地激起体外神经细胞的IFN-I通路反应,HepG感染的激活强度相较Hep-Flury更弱一些。

    图  8  不同RABV毒株感染Neuro-2a细胞的一步生长曲线
    “*”“**”分别表示CVS-11/HepG与Hep-Flury在P<0.05和P<0.01水平差异显著(t检验)
    Figure  8.  One-step growth curve of different RABVs in Neuro-2a
    “*” and “**” indicate significant differences between CVS-11/HepG and Hep-Flury at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively (t test)
    图  9  RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路上游基因表达的影响
    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)
    Figure  9.  Effect of RABV infection on expression of upstream genes of IFN-I pathway in Neuro-2a cells
    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    Hep-Flury和HepG感染Neuro-2a细胞后6 h即能快速地激活IFN-α4及下游基因CXCL10ISG15的表达,在激活能力上,Hep-Flury略强于HepG(图10A10C10D)。较为特殊的是,在感染后48 h,只有HepG未上调IFN-β的表达(图10B)。

    图  10  RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路下游基因表达的影响
    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)
    Figure  10.  Effect of RABV infection on expression of downstream genes of IFN-I pathway in Neuro-2a cells
    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    为了检测体外细胞IFN-I通路激活对不同RABV毒株复制的影响,我们在病毒感染前6 h先用Poly(I:C)刺激神经细胞激活其IFN-I通路,之后再分别接种Hep-Flury、HepG、CVS-11 (MOI=3),在不同时间测定病毒滴度。从感染Neuro-2a和SK-N-SH的不同RABV复制动力学曲线(图11)可以看出,2种神经细胞在经Poly(I:C)处理后,对Hep-Flury复制的影响较为显著,病毒增殖滴度在早期下降明显,到了第4天和第5天影响减小,说明IFN-I对Hep-Flury接毒后前3天复制的抑制作用较强。CVS-11和HepG在感染Poly(I:C)刺激的Neuro-2a的前2天受到一定程度的抑制,之后回升到正常水平(图11A)。而在SK-N-SH上,CVS-11和HepG对于Poly(I:C)的刺激均不敏感,病毒复制几乎没有受到影响(图11B)。综合来看,2种神经细胞在预先用Poly(I:C)处理之后,能够较显著地抑制Hep-Flury的复制,而对替换了G基因的HepG的影响较弱,从一定程度上说明CVS-11的G基因具有抵抗IFN-I通路作用的能力。

    图  11  Poly(I:C)处理体外神经细胞对RABV复制的影响
    “*”表示相同RABV毒株感染Poly(I:C)处理和未处理细胞在P<0.05水平差异显著(t检验)
    Figure  11.  Effect of Poly(I:C) treatment on the replication of RABV for in vitro nerve cells
    “*” indicates significant differences between Poly(I:C) treated and untreated cells infected with the same RABV strain at P<0.05 level (t test)

    我们前期的研究结果表明弱毒Hep-Flury滴鼻感染小鼠能够更早(感染后第4天)、更强地激活IFN-I相关基因表达,而致病毒株CVS-11则在感染后第7天强烈地激活IFN-I相关基因表达[12]。为了探讨这2种毒株携带的G基因是否在调节IFN-I通路的作用上有差异,本研究将Hep-Flury的G基因替换成CVS-11的G基因,拯救出重组毒株HepG,分别在小鼠和细胞水平分析不同毒株感染对IFN-I通路相关基因表达调控的影响。结果显示,Hep-Flury在感染后够较快地诱导IFN-I上游基因的表达,重组病毒HepG感染鼠脑激活这些基因的表达水平介于亲本株Hep-Flury和CVS-11之间。这些结果说明不同毒株的G蛋白对于病毒感染激活IFN-I通路的程度具有一定的调节作用。已有研究表明,RABV感染激活宿主IFN-I通路的主要成分是病毒的基因组或转录出的leader RNA[13-15],本研究发现在病毒感染后第4天,弱毒Hep-Flury的基因组含量虽然比CVS-11少,但其转录出的leader RNA较多。因此,我们推测leader RNA对IFN-I的诱导能力可能比病毒基因组强,这使得Hep-Flury能够在感染后第4天较强地激活IFN-I通路。有文献报道RABV的G蛋白与病毒leader RNA的转录相关[14],据此推测,Hep-Flury的G蛋白也许在一定程度上能够较早地调控转录出leader RNA,使其更强地激活IFN-I通路。这种调控的具体机制还需要进一步研究。在感染后第4天,我们检测到3种毒株对IFN-α4/β/γ/κ这些基因的刺激都不显著,而在感染后第7天,CVS-11和HepG较显著地上调IFN-α4/β/γ,从而推测在感染早期, Hep-Flury虽然激活了IFN-I通路的上游基因,但受到了病毒P蛋白的抑制作用,使得IFN基因的表达未受到明显诱导,到了感染后期,由于CVS-11和HepG在脑内大量地增殖,产生的病毒基因组及leader RNA强烈诱导IFN-I通路,而使得P蛋白无法完全抑制该通路,导致了IFN-α4/β/γ的明显上调。

    不管是RABV弱毒株还是致病株都能在鼠脑中激活IFN-I通路相关基因的表达,但它们的复制水平有显著差异,致病株CVS-11在感染后第7天鼠脑内病毒载量约是Hep-Flury的4 000倍。这表明中枢神经系统的IFN-I通路虽然被激活了,但其在对抗致病毒株的能力上似乎受到了限制。为了探究携带不同G基因的RABV在神经细胞中抵抗IFN-I作用的差异,我们预先用Poly(I:C)诱导激活神经细胞Neuro-2a和SK-N-SH的IFN-I通路,再测定3种病毒的复制水平,发现Hep-Flury在感染早期受到IFN-I通路的抑制最为明显,而CVS-11和HepG的复制只略微受到了影响。这些结果说明,CVS-11以及携带其G基因的HepG在神经细胞中具备较好的抵抗IFN-I作用的能力。这也从一个侧面解释了CVS-11和HepG在鼠脑内诱导激活IFN-I通路却依然能够高水平复制的原因。

    综上所述,我们推测弱毒株Hep-Flury在感染早期,其G蛋白能够通过某种方式调控leader RNA较高水平地表达,从而较强地诱导IFN-I通路,有效地抑制病毒的复制。而致病毒株较晚诱导IFN-I通路,后期虽然IFN-I通路被强烈激活,但其G蛋白能够在神经细胞中有效地抵抗IFN-I的作用,因此,病毒依然能在脑中大量繁殖。关于致病株的G蛋白如何在神经细胞中抵抗IFN-I作用的疑问尚需更深入的研究进行阐释。

  • 图  1   RABV重组毒株HepG构建示意图

    Figure  1.   Construction diagram of RABV recombinant strain HepG

    图  2   构建重组病毒HepG的扩增片段

    M:DNA marker DL10000;1、2:C区段基因;3、4:L片段基因;5、6:CVS-11 G基因

    Figure  2.   Amplified fragments for construction of recombinant virus HepG

    M: DNA marker DL10000; 1, 2: C-segment gene; 3, 4: L-segment gene; 5, 6: CVS-11 G gene

    图  3   重组病毒HepG的免疫荧光检测

    Figure  3.   Immunofluorescence detection of recombinant virus HepG

    图  4   3种RABV毒株感染的KM小鼠的体质量变化

    Figure  4.   Body weight changes of KM mice infected with three RABV strains

    图  5   RABV感染鼠脑后病毒载量和病毒基因转录水平变化

    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)

    Figure  5.   Changes of viral load and viral gene transcription in the brains of mice infected with RABV

    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    图  6   RABV感染鼠脑后IFN-I通路相关基因表达分析

    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)

    Figure  6.   Expression analysis of IFN-I pathway related genes in the brains of mice infected with RABV

    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    图  7   RABV感染鼠脑后不同IFN基因表达分析

    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)

    Figure  7.   Expression analysis of IFN genes in the brains of mice infected with RABV

    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    图  8   不同RABV毒株感染Neuro-2a细胞的一步生长曲线

    “*”“**”分别表示CVS-11/HepG与Hep-Flury在P<0.05和P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  8.   One-step growth curve of different RABVs in Neuro-2a

    “*” and “**” indicate significant differences between CVS-11/HepG and Hep-Flury at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively (t test)

    图  9   RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路上游基因表达的影响

    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)

    Figure  9.   Effect of RABV infection on expression of upstream genes of IFN-I pathway in Neuro-2a cells

    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    图  10   RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路下游基因表达的影响

    “*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)

    Figure  10.   Effect of RABV infection on expression of downstream genes of IFN-I pathway in Neuro-2a cells

    “*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

    图  11   Poly(I:C)处理体外神经细胞对RABV复制的影响

    “*”表示相同RABV毒株感染Poly(I:C)处理和未处理细胞在P<0.05水平差异显著(t检验)

    Figure  11.   Effect of Poly(I:C) treatment on the replication of RABV for in vitro nerve cells

    “*” indicates significant differences between Poly(I:C) treated and untreated cells infected with the same RABV strain at P<0.05 level (t test)

    表  1   HepG构建的引物序列

    Table  1   Primer sequences for construction of HepG

    基因片段
    Gene segment
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence
    HEP-L F: AGGCCGGTCATCCTTTTGACACCTCAAGTCCAGA
    R: ATTTTAGCATGTACAGGCTTTCATTAATGTCCGGC
    HEP-C F: GCCTGTACATGCTAAAATTCTTGTAYGATGCATCTTG
    R: CTTTCCTTAAGTCTTTTGAGGGATGTTAATAGTTTT
    CVS-G F: CAAAAGACTTAAGGAAAGATGGTTCCTCAGGTTCTT
    R: CAAAAGGATGACCGGCCTTCACAGTCTGATCTCACCT
    下载: 导出CSV

    表  2   RT-qPCR检测引物

    Table  2   Primers used for RT-qPCR

    基因
    Gene
    上游引物序列(5′→3′)
    Forward primer sequence
    下游引物序列(5′→3′)
    Reverse primer sequence
    RABV genome GACAGCGTCAATTGCAAAGCAAAAAT GGGTACTTGTACTCATATTGATCCACGAT
    N GCACTGGCAGATGACGGAAC TCGGCGAATGAGTTTGGACG
    Leader RNA TGTAGGGGTGTTACATTTTT ACGCTTAACAACAAAACC
    Cxcl10 TCCATATCGATGACGGGCCA CAACACGTGGGCAGGATAGG
    Dhx58 CCAGAGCACACACATGACCC CCATAGCGCACCACCACATT
    IFN-α4 AGCCTGTGTGATGCAGGAACC CAGCAAGTTGGTTGAGGAAGAG
    IFN-κ TGGAGTTGGGCAAGTATTTCTTC GGACTTGGAAAATATAATGAAACATCTTC
    IFN-β ACCTACAGGGCGGACTTCAA ACACTGTCTGCTGGTGGAGT
    IFN-γ TCAGCAACAGCAAGGCGAAA ATTGAATGCTTGGCGCTGGA
    IL6 TGCCTTCTTGGGACTGATGC GACAGGTCTGTTGGGAGTGGT
    IRF3 TCAGGATCCCGTGGAAGCAT TGACACGTCCGGCTTATCCT
    IRF7 ACTGGCTATTGGGGAGGTC ACGACCGAAATGCTTCCAGG
    ISG15 GACGCAGACTGTAGACACGC TTAGGCCATACTCCCCCAGC
    MDA5 GAGCACCTACGCACTTTCCC CCACCGTCGTAGCGATAAGC
    MyD88 TCATGTTCTCCATACCCTTGGT AAACTGCGAGTGGGGTCAG
    RIG-I CCTTGATTGCCCTGATGTTG ATTTCTCCCTGTCCCTCCAA
    RNF125 GGCGCACATAAGGACCTGTG TCATCCAGTTCCCGCTGACA
    TLR3 GTGAGATACAACGTAGCTGACTG TCCTGCATCCAAGATAGCAAGT
    TLR7 TCTTTGGGTTTCGATGGTTTCC GCAGTCCACGATCACATGGG
    TLR9 ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT GAGGCTTCAGCTCACAGGG
    GAPDH AGAGTGTTTCCTCGTCCCGT CTGTGCCGTTGAATTTGCCG
    下载: 导出CSV
  • [1]

    SCOTT T P, NEL L H. Lyssaviruses and the fatal encephalitic disease rabies[J]. Frontiers in Immunology, 2021, 12: 786953. doi: 10.3389/fimmu.2021.786953.

    [2]

    FOOKS A R, BANYARD A C, HORTON D L, et al. Current status of rabies and prospects for elimination[J]. Lancet, 2014, 384(9951): 1389-1399. doi: 10.1016/S0140-6736(13)62707-5

    [3] 扈荣良, 张守峰, 刘晔. 我国狂犬病预防和控制建议[J]. 中国人兽共患病学报, 2012, 28(5): 487-491. doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2012.05.020
    [4]

    FAUL E J, WANJALLA C N, SUTHAR M S, et al. Rabies virus infection induces type I interferon production in an IPS-1 dependent manner while dendritic cell activation relies on IFNAR signaling[J]. PLoS Pathogens, 2010, 6(7): e1001016. doi: 10.1371/journal.ppat.1001016

    [5]

    LI J, FABER M, DIETZSCHOLD B, et al. The role of toll-like receptors in the induction of immune responses during rabies virus infection[J]. Advances in Virus Research: Research Advances in Rabies, 2011, 79: 115-126.

    [6]

    LUO Z, LV L, LI Y, et al. Dual role of toll-like receptor 7 in the pathogenesis of rabies virus in a mouse model[J]. Journal of Virology, 2020, 94(9): e00111-20.

    [7] 王林栋, 张守峰, 刘晔, 等. 基于RIG-I的狂犬病病毒免疫逃逸机制[J]. 中国生物制品学杂志, 2013, 26(10): 1517-1521. doi: 10.13200/j.cnki.cjb.001924
    [8]

    BRZOZKA K, FINKE S, CONZELMANN K K. Identification of the rabies virus alpha/beta interferon antagonist: Phosphoprotein P interferes with phosphorylation of interferon regulatory factor 3[J]. Journal of Virology, 2005, 79(12): 7673-7681. doi: 10.1128/JVI.79.12.7673-7681.2005

    [9]

    VIDY A, CHELBI-ALIX M, BLONDEL D. Rabies virus P protein interacts with STAT1 and inhibits interferon signal transduction pathways[J]. Journal of Virology, 2005, 79(22): 14411-14420. doi: 10.1128/JVI.79.22.14411-14420.2005

    [10]

    MASATANI T, ITO N, SHIMIZU K, et al. Rabies virus nucleoprotein functions to evade activation of the RIG-I-mediated antiviral response[J]. Journal of Virology, 2010, 84(8): 4002-4012. doi: 10.1128/JVI.02220-09

    [11] 郭霄峰, 富振芳. 狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救[J]. 华南农业大学学报, 2006, 27(1): 104-106. doi: 10.3969/j.issn.1001-411X.2006.01.027
    [12]

    ZHANG D, HE F, BI S, et al. Genome-wide transcriptional profiling reveals two distinct outcomes in central nervous system infections of rabies virus[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 751. doi: 10.3389/fmicb.2016.00751.

    [13]

    HORNUNG V, ELLEGAST J, KIM S, et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I[J]. Science, 2006, 314(5801): 994-997. doi: 10.1126/science.1132505

    [14]

    YANG Y, HUANG Y, GNANADURAI C W, et al. The inability of wild-type rabies virus to activate dendritic cells is dependent on the glycoprotein and correlates with its low level of the de novo-synthesized leader RNA[J]. Journal of Virology, 2015, 89(4): 2157-2169. doi: 10.1128/JVI.02092-14

    [15]

    ZHANG H, HUANG J, SONG Y, et al. Regulation of innate immune responses by rabies virus[J]. Animal Models and Experimental Medicine, 2022, 5(5): 418-429. doi: 10.1002/ame2.12273

  • 期刊类型引用(13)

    1. 潘婷婷,康喜龙,黄霞,孟闯,潘志明,焦新安. 非洲猪瘟诊断靶标的研究进展. 微生物学通报. 2025(02): 510-521 . 百度学术
    2. 苗雅倩,杨艳歌,赵健淞,魏莹,王秀娟,袁飞,王正亮,张峰. 配方乳粉中6种致病菌双重酶促等温扩增快速检测方法的建立. 微生物学报. 2025(03): 1319-1336 . 百度学术
    3. 华冰洁. 非洲猪瘟的研究进展. 中国动物保健. 2024(02): 7-8+28 . 百度学术
    4. 潘建良. 非洲猪瘟防控期间养猪场生物安全管理探讨. 今日畜牧兽医. 2023(02): 22-23+26 . 百度学术
    5. 王帅,杨艳歌,吴占文,李红娜,李涛,孙冬梅,袁飞. 重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展. 食品科学. 2023(09): 297-305 . 百度学术
    6. 林志伟,王帅,王迎春,吴占文,李涛,李红娜,杨艳歌,袁飞. 婴儿配方乳粉中食源性致病菌双重ERA快速检测方法的建立. 食品科学. 2023(18): 347-354 . 百度学术
    7. 杨艳歌,王帅,李红娜,李涛,吴占文,孙冬梅,袁飞. 沙门氏菌ERA可视化快速检测方法的建立. 中国食品学报. 2023(10): 261-272 . 百度学术
    8. 杨艳歌,吴占文,李涛,王帅,李红娜,孙冬梅,袁飞. GI和GII诺如病毒ERA的可视化快速检测. 华南理工大学学报(自然科学版). 2023(12): 140-151 . 百度学术
    9. 王翠,许宗丽,黄溢泓,覃艳然,梁竞臻,周师师,刘针伶,黄小武,马小蓉,李志源,严斯刚. 非洲猪瘟病原学检测技术研究进展. 中国动物检疫. 2022(02): 74-81 . 百度学术
    10. 张帅,刘媛,赵云环,刘莹,左玉柱,范京惠. 非洲猪瘟病毒研究进展. 中国兽医学报. 2022(12): 2569-2577 . 百度学术
    11. 魏晓通,周宇航,刘扬,荣馨锐,张士新,徐亚维. 酶促恒温扩增技术快速鉴定食品中牡蛎成分. 食品科技. 2022(11): 255-261 . 百度学术
    12. 倪俊芬,陈前岭,仲向前. 我国对非洲猪瘟病毒的研究进展综述. 中国猪业. 2022(06): 70-74 . 百度学术
    13. 王良辉. 精准清洗消毒是防控非洲猪瘟的重要措施. 兽医导刊. 2021(23): 79-80 . 百度学术

    其他类型引用(4)

图(11)  /  表(2)
计量
  • 文章访问数:  139
  • HTML全文浏览量:  49
  • PDF下载量:  40
  • 被引次数: 17
出版历程
  • 收稿日期:  2022-11-05
  • 网络出版日期:  2024-01-05
  • 发布日期:  2022-11-29
  • 刊出日期:  2024-03-09

目录

/

返回文章
返回