Evaluation of guava fruit quality and mining of genes related to flavonoid synthesis
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摘要:目的
综合评价番石榴Psidium guajava不同品种间的果实品质差异并挖掘黄酮类化合物合成的关键基因。
方法对番石榴6个品种的11个果实品质指标进行测定，并结合主成分分析方法综合评价其品质差异，运用转录组测序技术比较各品种间的差异表达基因(Differentially expressed gene, DEG)，通过 GO 和 KEGG 富集分析，挖掘黄酮类化合物合成的DEG，利用实时荧光定量 PCR (Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)研究DEG在不同品种间的特异性表达。
结果6种番石榴试材中‘金斗香’和‘胭脂红’品质最优，得分较高，‘水晶’和‘西瓜红’较低，‘珍珠’和‘红宝石’居中；‘金斗香’和‘胭脂红’的类黄酮质量分数较高，分别为9.76和10.05 mg/g，是‘水晶’(5.74 mg/g)的1.5倍以上，显著高于其他品种(P>0.05)。转录组测序分析显示，‘金斗香’和‘胭脂红’的DEG聚为一类，其余4种的DEG聚为一类。黄酮类化合物的生物合成途径中CHS、FLS、CYP73A、CYP98A3、DFR、E2.1.1.104、E1.14.11.19和CYP75A基因在‘金斗香’和‘胭脂红’中表达量显著上调。qRT-PCR验证结果表明，FLS基因在‘胭脂红’中表达量最高，是‘西瓜红’的10倍以上；CYP73A、CYP75A、E2.1.1.104和CHS基因在‘金斗香’中表达量最高，‘珍珠’中表达量最低，其中CYP73A和CYP75A基因在‘金斗香’中的表达量是‘珍珠’的30倍以上；而DFR基因在‘胭脂红’中表达量较高，‘金斗香’中表达量较低。qRT-PCR检测到DEG的表达水平与转录组测序结果一致，证明番石榴6个品种的转录组测序结果可靠。
结论本研究系统评价了6种番石榴果实品质差异，并挖掘到8个与番石榴黄酮类化合物合成相关的关键基因，为后期番石榴的品种选育、功能基因挖掘和黄酮类化合物的生物合成途径等研究提供科学依据。
Abstract:ObjectiveThe purpose of this study was to comprehensively evaluate the differences in fruit quality among different guava (Psidium guajava) cultivars and explore key genes for flavonoid synthesis.
MethodA total of 11 fruit quality indexes of six guava cultivars were measured and principal component analysis was carried out. Transcriptome sequencing technology was used to compare the differentially expressed genes (DEGs) among the cultivars, and GO and KEGG enrichment analyses were carried out to mine the DEGs of flavonoid synthesis. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to study the specific expression of differential genes in different cultivars.
ResultAmong the six guava cultivars, ‘Jindouxiang’ and ‘Yanzhihong’ scored higher, ‘Shuijing’ and ‘Xiguahong’ scored lower, and ‘Zhenzhu’ and ‘Hongbaoshi’ scored in the middle. The flavonoid contents of ‘Jindouxiang’ and ‘Yanzhihong’ were significantly higher compared to other cultivars (P>0.05), which were 9.76 and 10.05 mg/g, respectively, more than 1.5 times that of ‘Shuijing’ (5.74 mg/g). Transcriptome sequencing analysis showed that the DEGs of ‘Jindouxiang’ and ‘Yanzhihong’ were clustered into one category, and the DEGs of the other four cultivars were clustered into one category.CHS, FLS, CYP73A, CYP98A3, DFR, E2.1.1.104, E1.14.11.19 and CYP75A genes in the biosynthetic pathway of flavonoids were significantly up-regulated in ‘Jindouxiang’ and ‘Yanzhihong’. qRT-PCR verification showed that the expression of FLS gene was the highest in ‘Yanzhihong’, which was more than 10 times of that in ‘Xiguahong’. The expression levels of CYP73A, CYP75A, E2.1.1.104 and CHS genes were the highest in ‘Jindouxiang’ and the lowest in ‘Zhenzhu’. Among them, the expression levels ofCYP73A and CYP75A genes in ‘Jindouxiang’ were more than 30 times of those in ‘Zhenzhu’, while the expression level of DFR gene was higher in ‘Yanzhihong’ and lower in ‘Jindouxiang’. The expression levels of DEGs were consistent comparing the qRT-PCR and transcriptome sequencing results, indicating the transcriptome sequencing results of six guava cultivars were reliable.
ConclusionThe quality differences of six guava cultivars were systematically evaluated, and eight key genes related to the synthesis of guava flavonoids were discovered. This study provides a scientific basis for the research of guava cultivar breeding, functional gene mining and biosynthetic pathway of flavonoids.
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Keywords:
- Psidium guajava /
- Fruit quality /
- Transcriptome /
- Flavonoid /
- Differentially expressed gene
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近年来，随着粮食产量的不断提高及氮磷钾化肥的大量投入，土壤中、微量元素含量逐渐相对不足，并成为粮食产量进一步增加的限制因素[1-2]，土壤中、微量元素缺乏的国家和地区也明显增加。硫含量一般占植物干物质的0.1%~0.5%，是继氮、磷、钾之后的第四大营养元素[3]。缺硫会影响植物的产量及品质[4]，进而影响人类的健康[5-8]。研究表明，硫参与叶绿素的合成并影响呼吸作用，从而调节植物的生长[9]。陈国安[10]研究发现，我国东北地区玉米、小麦、大豆均出现缺乏硫素症状。吴宇等[11]研究指出，在缺硫条件下，大豆种子中含硫氨基酸的蛋白的积累明显下降，缺乏含硫氨基酸的β-conglycinin蛋白增加；Cys和Met是合成蛋白质的必需氨基酸，充足的硫含量有利于富含Cys和Met的蛋白质含量提高，降低籽粒中的氮硫比例，提高籽粒的营养价值，从而影响大豆的品质。
中国是秸秆资源丰富的国家，每年产生的各种秸秆达8亿t以上[12]，这些秸秆绝大部分被焚烧或被用来做饲料和燃料。秸秆中含有有机质及丰富的营养元素[13-15]，实行玉米秸秆还田具有提高土壤肥力、改善土壤的理化性质和增产等作用[16-18]。李荣等[19]研究发现，秸秆还田可以提高玉米籽粒质量以及水分利用效率。朱泽亮等[20]认为秸秆还田可以极大促进水稻的分蘖，提高植株高度及质量。虽然目前对硫肥及秸秆还田的研究相对较多，但对秸秆还田配施硫肥对春玉米生长及硫素积累分配影响的研究报道相对较少。本研究探讨了在秸秆还田的条件下配施硫肥对春玉米产量及硫素的积累、分配及转运的影响，以期为硫素的合理调控及粮食的稳产高产提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验点概况
试验于2019年在吉林省乾安县赞字乡父字村进行，试验土壤为黑钙土，0~20 cm土壤耕层养分质量分数为：有机质17.39 g·kg−1、有效氮102.36 mg·kg−1、有效磷35.86 mg·kg−1、速效钾109.38 mg·kg−1、有效硫15.36 mg·kg−1，pH 7.86。试验田常年采用玉米连作模式。
1.2 试验设计
试验采用双因素裂区设计，主区分为秸秆还田(秸秆还田量为12 000 kg·hm−2)和秸秆不还田2个水平，副区分为施硫(施硫量为纯硫60 kg·hm−2)和不施硫2个水平，不施任何肥处理为对照(CK)，共包括CK、秸秆不还田不施硫、秸秆还田不施硫、秸秆不还田施硫、秸秆还田施硫 5个处理。试验小区面积39 m2(垄宽0.65 m × 6垄 × 10 m长)，随机区组排列，重复3次。硫肥作为基肥施用，因施用量较小，为了撒施均匀，用塑料盆将每个小区的硫肥与一定量土壤混匀后手施撒入垄沟内。秸秆还田处理于春播前将秸秆粉碎覆于地面，通过旋耕将其与土壤充分混合，该地区农民采用膜下滴灌。玉米品种为‘富民985’，每公顷种植70 000株。试验田的氮磷钾施用量参照当地常规施肥量：4个试验处理均施氮240 kg·hm−2，其中基肥占总施氮量的40%，拔节期与抽雄期再分别各追施30%氮肥；4个试验处理均施P2O5 100 kg·hm−2、K2O 100 kg·hm−2，作为基肥一次性施入。5月9日播种，10月10日收获，其他管理同常规大田管理技术。
1.3 取样方法与时期
分别在春玉米的拔节期(播种后第55天)、喇叭口期(播种后第64天)、抽雄期(播种后第73天)、灌浆期(播种后第94天)、乳熟期(播种后第113天)、完熟期(播种后第130天)进行田间采样。选择大小和长势均匀的玉米植株进行采集，每个时期均采集3株，按叶片、茎秆、穗部营养体(苞叶和穗轴)和籽粒分开，于恒温箱内在105 ℃条件下杀青30 min，再于80 ℃条件下烘至恒质量后保存待测。
1.4 测定项目与方法
春玉米各器官中硫元素测定方法采用HNO3-HClO4消煮法和原子分光光度法。
硫素转运量/(kg·hm−2)=营养体最大硫素积累量−成熟期营养体硫素积累量，
硫素转运率=硫素转运量/营养体最大硫素积累量×100%，
硫素转运对籽粒的贡献率=硫素转运量/成熟期籽粒硫素积累量×100%。
于完熟期每处理取10 m2果穗，称其总鲜质量，按平均鲜穗质量从中取10穗，待自然风干后考种，考察产量与产量构成因素(千粒质量和穗粒数等)，按含水量14%折算最终理论产量。
1.5 数据处理与分析
试验数据采用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 23进行整理和统计分析。
2. 结果与分析
2.1 秸秆还田配施硫肥对春玉米产量及构成因素的影响
由表1可知，施用硫肥显著提高了春玉米的千粒质量和穗粒数，其中对穗粒数的提高更显著，从而显著提高了春玉米的产量，不同处理总体表现为秸秆还田施硫>秸秆不还田施硫>秸秆还田不施硫>秸秆不还田不施硫>CK。在无秸秆还田条件下，施硫的产量比不施硫提高11.70%；秸秆还田条件下，施硫的产量比不施硫增加11.98%，说明施用硫肥可以起到增产的效果。施用硫肥时，秸秆还田的春玉米产量比无秸秆还田提高7.73%；无硫肥施用时，秸秆还田的春玉米产量比无秸秆还田增加了7.46%，说明秸秆还田能够起到增产的作用。秸秆与硫肥对产量无显著交互效应。
表 1 秸秆还田和施硫对春玉米产量和产量构成因素的影响及方差分析1)Table 1. Effects of straw returning and sulfur fertilizer application on yield and yield components of spring maize and variance analysis处理
Treatment千粒质量/g
1000-grain
weight穗粒数
Kernel
number产量/
(kg·hm−2)
Yield增产/(kg·hm−2)
Yield increase增产率/%
Yield
increase rateCK 319.40d 379.76e 8 256.63d 秸秆不还田不施硫
No straw returning and no sulfur fertilizer329.10cd 467.12d 10 523.02c 2 266.40c 27.45c 秸秆不还田施硫
No straw returning and sulfur fertilizer343.64b 482.20c 11 754.10b 3 497.47b 42.36b 秸秆还田不施硫
Straw returning and no sulfur fertilizer336.10bc 505.72b 11 307.95b 3 051.32b 36.96b 秸秆还田施硫
Straw and sulfur fertilizer367.70a 549.10a 12 663.11a 4 406.48a 53.37a 秸秆还田
Straw returning10.036* 407.163* 30.571* 施硫
Sulfur fertilizer application22.156* 125.020* 71.261* 秸秆还田×施硫
Straw returning × sulfur fertilizer application3.027 29.298* 0.164 1) 同列数据后不同小写字母表示处理间在P < 0.05水平差异显著，“*”表示在 P<0.05水平影响显著(Duncan’s 法)
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at P < 0.05 level among different treatments, “*” indicates significant effect at P<0.05 level (Duncan’s method)2.2 秸秆还田配施硫肥对春玉米硫素积累的影响
如图1所示，随着生育期的延长，春玉米植株中硫素积累量持续增加，至完熟期达到最大值；在灌浆期前硫素积累迅速，灌浆期至完熟期积累相对缓慢。其中CK处理硫素积累量最低，且在整个生育期硫素积累量增长曲线较为平缓，最大硫素积累量为14.54 kg·hm−2，与其他4个处理存在显著差异。秸秆还田施硫处理的硫素积累量达到最大值，为34.16 kg·hm−2。各处理硫素积累量整体表现为秸秆还田施硫>秸秆不还田施硫>秸秆还田不施硫>秸秆不还田不施硫>CK。秸秆还田条件下，施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高35.06%；秸秆不还田条件下，施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高37.09%，且差异显著，说明施用硫肥可以促进植物对硫的积累。在施用硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高11.37%；在不施硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高13.04%，说明秸秆还田也具有促进植株对硫素吸收积累的作用。秸秆还田施硫处理的硫素积累量比秸秆不还田不硫肥处理提高52.67%，说明秸秆还田配施硫肥可以进一步促进植株对硫素的积累。
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图 1 不同生育时期春玉米硫素的积累量CK：不施任何肥，WO：秸秆不还田不施硫，JO：秸秆还田不施硫，WS：秸秆不还田施硫，JS：秸秆还田施硫；完熟期折线图上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Accumulation amount of sulfur in spring maize at different growth stagesCK: No fertilizer, WO: No straw returning and no sulfur fertilizer, JO: Straw returning and no sulfur fertilizer, WS: No straw returning and sulfur fertilizer, JS: Straw returning and sulfur fertilizer; Different lowercase letters in the line chart at full ripening stage indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)从图2可以看出，春玉米硫素积累量在各个时期呈现先上升后下降趋势，各时期硫素积累量总体表现为秸秆还田施硫>秸秆不还田施硫>秸秆还田不施硫>秸秆不还田不施硫>CK。硫素积累量最高峰出现在抽雄期至灌浆期，此时期最大硫素积累量为秸秆还田施硫处理，达到13.09 kg·hm−2，最低硫素积累量为CK，积累量为4.85 kg·hm−2。硫素积累速率的规律同硫素积累量不同，其最大速率出现在喇叭口期至抽雄期，其中最大积累速率为秸秆还田施硫处理，达到0.70 kg·hm−2·d−1。各时期硫素积累量占总的硫素积累量比例的最高峰值出现在抽雄期至灌浆期，最高比例为秸秆还田施硫处理，达到38.33%，最低比例为CK的33.32%。
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图 2 不同生育时期春玉米硫素积累动态变化CK：不施任何肥，WO：秸秆不还田不施硫，JO：秸秆还田不施硫，WS：秸秆不还田施硫，JS：秸秆还田施硫；各小图中相同生育时期柱子上不同小写字母表示处理间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)Figure 2. Dynamic changes of sulfur accumulation in spring maize at different growth stagesCK: No fertilizer, WO: No straw returning and no sulfur fertilizer, JO: Straw returning and no sulfur fertilizer, WS: No straw returning and sulfur fertilizer, JS: Straw returning and sulfur fertilizer; Different lowercase letters on the columns of the same growth stage indicate significant differences at P<0.05 level among different treatments (Duncan’s method)2.3 秸秆还田配施硫肥对春玉米器官中硫素积累的影响
2.3.1 秸秆还田配施硫肥对春玉米叶片中硫素积累的影响
如图3A所示，春玉米叶片中硫素积累量总体趋势表现为拔节期至灌浆期硫素积累量不断增加，至灌浆期达最大值，灌浆期至完熟期呈下降趋势。4个试验处理灌浆期的叶片硫素积累量都显著高于CK，其中秸秆还田条件下，施用硫肥处理的叶片硫素积累量比不施硫肥处理提高49.67%，秸秆不还田条件下，施用硫肥处理的叶片硫素积累量比不施硫肥处理提高51.99%；施硫条件下，秸秆还田处理的硫素积累量比秸秆不还田提高21.23%，不施硫条件下，秸秆还田处理的硫素积累量比秸秆不还田提高23.10%。以上结果说明，秸秆还田和施硫都能够促进春玉米叶片硫素的积累。秸秆还田配施硫肥处理的硫素积累量比秸秆不还田且不施硫肥处理增加84.25%，说明秸秆还田配施硫肥可以显著提高春玉米叶片硫素的积累量。
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图 3 春玉米各器官硫素积累量CK：不施任何肥，WO：秸秆不还田不施硫，JO：秸秆还田不施硫，WS：秸秆不还田施硫，JS：秸秆还田施硫；相同生育时期折线图上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 3. Sulfur accumulation amount in each organ of spring maizeCK: No fertilizer, WO: No straw returning and no sulfur fertilizer, JO: Straw returning and no sulfur fertilizer, WS: No straw returning and sulfur fertilizer, JS: Straw returning and sulfur fertilizer; Different lowercase letters in the line chart at the same stage indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.3.2 秸秆还田配施硫肥对春玉米茎秆中硫素积累的影响
图3B中，春玉米茎秆硫素积累量总体表现为先上升，至灌浆期达到最大值，灌浆期后开始下降。硫素积累速率最快的阶段为抽雄期至灌浆期。在灌浆期，4个试验处理的硫素积累量均比CK显著增加。在秸秆还田条件下，施硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高42.66%，秸秆不还田条件下，施硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高34.35%，说明施用硫肥可以促进春玉米茎秆中硫素的积累；在施用硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高17.13%，在无硫肥施入条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高10.31%。秸秆还田施硫处理的硫素积累量比秸秆不还田不施硫提高57.37%，说明秸秆还田配施硫肥可以进一步促进茎秆中硫素的积累。
2.3.3 秸秆还田配施硫肥对春玉米穗部营养体中硫素积累的影响
由图3C可以得出，春玉米穗部营养体硫素积累量呈持续增加趋势，至完熟期达到最大值。春玉米穗部营养体的硫素积累量明显低于茎秆和叶片。秸秆还田条件下，施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高46.69%，在秸秆不还田条件下，施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高67.54%，说明施用硫肥促进了春玉米穗部营养体的硫素积累；在施用硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高8.11%，在无硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高23.48%，说明秸秆还田具有促进春玉米穗部营养体硫素积累的作用。秸秆还田施硫的硫素积累量比秸秆不还田不施硫提高81.14%，说明秸秆还田配施硫肥能够进一步促进春玉米穗部营养体硫素的积累。
2.3.4 秸秆还田配施硫肥对春玉米籽粒中硫素积累的影响
图3D可以得出，各处理春玉米籽粒中硫素积累量持续增加，至完熟期达到最大值。在秸秆还田条件下，施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高31.02%，在无秸秆还田条件下，施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高35.58%；在施用硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高9.76%，在不施硫肥条件下，秸秆还田的硫素积累量比秸秆不还田提高13.57%。秸秆还田施硫的硫素积累量比秸秆不还田不施硫提高48.80%。以上结果说明，秸秆还田配施硫肥可以进一步促进春玉米籽粒中硫素的积累。
春玉米籽粒的硫素积累量在所有器官中最高，玉米植株中各器官硫素积累量整体表现为籽粒>叶片>茎秆>穗部营养体。
2.4 秸秆还田配施硫肥对春玉米营养器官硫素转运的影响
由表2可知，不同处理茎秆的硫素转运量差异显著；在叶片的硫素转运量上，秸秆还田施硫和秸秆不还田施硫与其他处理差异显著。不同处理硫素总转运量表现为秸秆还田施硫>秸秆不还田施硫>秸秆还田不施硫>秸秆不还田不施硫>CK。其中秸秆还田施硫的硫素总转运量达到最高，为15.29 kg·hm−2，比秸秆不还田不施硫提高74.54%，说明秸秆还田配施硫肥促进了春玉米营养器官中硫素向籽粒中的转运。在转运率上，秸秆还田不施硫的茎秆转运率显著高于其他处理，但叶片转运率和总转运率在不同处理间差异不显著。在硫素转运量对籽粒贡献率上，不同处理间的贡献率大小与转运量规律基本一致，其中秸秆还田施硫的总贡献率为所有处理中最高，达到64.43%，比秸秆不还田施硫、秸秆还田不施硫、秸秆不还田不施硫及CK处理分别提高9.15%、11.53%、17.27%和18.61%。
表 2 秸秆还田和施硫对成熟期春玉米植株硫素转运特征的影响1)Table 2. Effects of straw returning and sulfur fertilizer application on sulfur transport characteristics of spring maize at mature stage处理
Treatment转运量/(kg·hm−2) Transport amount 转运率/% Transport rate 对籽粒贡献率/% Contribution rate to grain 茎秆 Stem 叶片 Leaf 总和 Total 茎秆 Stem 叶片 Leaf 总和 Total 茎秆 Stem 叶片 Leaf 总和 Total CK 2.60e 2.84c 5.44e 62.72c 59.78a 61.25a 25.94c 28.38a 54.32b WO 5.82d 2.94c 8.76d 70.32b 51.29a 60.80a 36.47b 18.47b 54.94b JO 6.68c 3.78c 10.46c 73.26a 53.99a 63.62a 36.90ab 20.87ab 57.77ab WS 7.72b 5.04b 12.77b 69.47b 58.58a 64.02a 35.70b 23.33ab 59.03ab JS 9.06a 6.23a 15.29a 69.61b 59.58a 64.60a 38.18a 26.25a 64.43a 1) CK：不施任何肥，WO：秸秆不还田不施硫，JO：秸秆还田不施硫，WS：秸秆不还田施硫，JS：秸秆还田施硫；同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，Duncan’s 法)。
1) CK: No fertilizer, WO: No straw returning and no sulfur fertilizer, JO: Straw returning and no sulfur fertilizer, WS: No straw returning and sulfur fertilizer, JS: Straw returning and sulfur fertilizer; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, Duncan’s method)3. 讨论与结论
3.1 秸秆还田配施硫肥对春玉米产量及构成因素的影响
适宜的硫肥处理能够提高小麦的穗粒数、结实率和千粒质量[21]，特别是施用硫肥对多穗型‘豫麦49’产量的提高幅度较大[22]。施用硫肥提高了小麦叶片的光合特性、干物质积累[23]及籽粒产量[24]。施用锌肥可以提高玉米的产量，比不施锌肥增产5.2%，且在一定的范围内产量随着施锌量的增加而增加[25]。因此，施用一定量的中、微量元素化肥有一定的增产作用。本研究中，秸秆还田施硫的产量比秸秆还田不施硫提高11.98%，秸秆不还田施硫比秸秆还田不施硫、秸秆不还田不施硫和CK的产量分别增加3.95%、11.70%和42.36%，说明施用硫肥对春玉米有一定的增产作用，这与前人的研究结论[26-27]基本符合。
秸秆还田影响植物生长发育主要通过2种方式，一是玉米秸秆中含有丰富的有机质、氮磷钾和中微量元素等养分，通过腐解直接释放营养物质供给作物生长发育；二是秸秆还田后能够促进微生物大量繁殖，改善土壤微生物环境和理化特性，间接促进作物生长[28]，从而起到增产作用[29-31]。本试验中秸秆还田施硫处理的产量比秸秆不还田施硫处理提高7.73%；秸秆还田施硫的产量比秸秆不还田不施硫增加20.34%，比CK增加53.37%，说明秸秆还田配施硫肥可以进一步提高春玉米产量。
3.2 秸秆还田配施硫肥对春玉米硫素积累的影响
研究指出施用硫肥提高了冬小麦地上部营养器官的硫含量，其中施用112.5和150.0 kg·hm−2硫肥处理地上部营养器官的硫含量与不施用硫肥相比，均达显著差异水平[32]。曹殿云[33]研究指出，适量的硫肥能够促进玉米硫素吸收，完熟期施用80 kg·hm−2硫肥处理的地上部营养器官硫素积累量与不施用硫肥处理具有显著差异。本研究中，在春玉米成熟期，秸秆不还田条件下，配施硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高37.09%；秸秆还田条件下，配施硫肥的硫素积累量比不施硫肥提高35.06%，再次证明施用硫肥促进春玉米对硫素的吸收和积累。曹殿云等[34]研究发现玉米对硫素的最高吸收强度出现在喇叭口期和抽雄期，本研究发现抽雄期的春玉米硫素积累速率在整个生育期中最高，说明在此时期一定要保证硫素的供应。崔彦宏等[35]研究指出，夏玉米有2个硫素吸收高峰期，分别出现在喇叭口至抽雄期和吐丝后第30~45天，王空军等[36]指出夏玉米吸收硫素有2个高峰期，分别为拔节期至大口期和开花期至乳熟期。本试验中硫素吸收出现1个高峰期，是抽雄期至灌浆期。由于之前的研究材料都为夏玉米，本试验的研究材料为春玉米，说明关键时期的养分补充要考虑不同品种的差异。
秸秆还田既能释放各种大、中、微量元素，又能提高土壤对水、肥、气、热的供应和协调能力[37]，从而促进作物对养分的吸收与积累[13, 38]。本研究中，至春玉米成熟期，秸秆还田施硫的硫素积累量比秸秆不还田施硫提高13.37%，证明秸秆还田可以促进春玉米对硫素的吸收和积累；秸秆还田施硫的硫素积累量比秸秆不还田不施硫提高52.67%，说明秸秆还田配施硫肥能够进一步促进春玉米对硫素的吸收和积累。
3.3 秸秆还田配施硫肥对春玉米器官中硫素分配及转运的影响
研究指出小麦开花前硫主要分配在叶片、茎秆和叶鞘中，后期则开始向籽粒转运[39]。本研究春玉米叶片及茎秆中硫素积累量都在灌浆期达到最高峰，然后开始降低，而籽粒的硫素积累则从灌浆期开始持续增加至完熟期达到最高。春玉米营养生长时期硫素的积累以叶片和茎秆为主，后期则以籽粒为中心进行积累。刘宝存等[40]指出完熟期玉米植株器官硫素积累量大小趋势为籽粒>叶片>茎秆>穗部器官，本研究在完熟期硫素积累量同样表现为籽粒>叶片>茎秆>穗部营养体。秸秆还田可以促进植株对锰元素的吸收，植株的不同器官中锰的积累量始终高于对照[41]，而有机肥和无机肥配施可以显著提升氮磷钾养分在水稻中的积累[42]。本研究中，秸秆还田提高了各器官中硫素的积累，不配施硫肥条件下，秸秆还田处理玉米籽粒中硫素积累量比秸秆不还田提高13.57%，说明秸秆还田促进春玉米各器官的硫素积累。
王东等[43]研究指出由茎秆转入籽粒的硫素最多，叶片中的硫素转入量次之。本研究中秸秆还田施硫处理的茎秆硫素转运量达到最高，为9.06 kg·hm−2，叶片转运量最高为6.23 kg·hm−2，与上述研究结果相符。有研究指出施用硫肥能够促进硫的吸收利用，增加小麦花后氮、硫从营养器官中向籽粒转运，增加总运转量对籽粒硫素含量的贡献率[32, 44]。本试验中秸秆不还田施硫对籽粒的总贡献率比不施硫提高7.44%，秸秆还田施硫对籽粒的总贡献率比不施硫提高11.53%，说明施用硫肥提高了春玉米器官茎秆、叶片中硫素转运量对籽粒的贡献率。
3.4 结论
施用硫肥能够促进春玉米的硫素积累，本研究中施用硫肥的硫素积累量比不施硫肥平均提高36.07%。玉米植株中各器官硫素积累量整体表现为籽粒>叶片>茎秆>穗部营养体。施硫提高了植株各器官中的硫素含量，并促进营养器官中硫素向籽粒转运，提高了转运硫素对籽粒中硫素的贡献率。秸秆还田配施硫肥能够进一步促进春玉米的硫素积累以及植株营养器官硫素向籽粒的转运，并最终提高春玉米产量。
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图 1 6个品种番石榴果实差异基因(DEG)的表达情况
a：差异基因表达量热图；b：类黄酮合成信号通路中的DEG； G1：红宝石，G2：西瓜红，G3：胭脂红，G4：珍珠，G5：水晶，G6：金斗香
Figure 1. The expressions of differential genes (DEGs) in fruits of six guava cultivars
a：Heat map of differential gene expression; b: The DEGs in flavonoid synthesis signaling pathway; G1: Hongbaoshi, G2: Xiguahong, G3: Yanzhihong, G4: Zhenzhu, G5: Shuijing, G6: Jindouxiang
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图 2 差异表达基因的qRT-PCR分析
G1：红宝石；G2：西瓜红；G3：胭脂红；G4：珍珠；G5：水晶；G6：金斗香
Figure 2. The qRT-PCR analysis of differentially expressed genes
G1: Hongbaoshi; G2: Xiguahong; G3: Yanzhihong; G4: Zhenzhu; G5: Shuijing; G6: Jindouxiang
表 1 差异表达基因的qRT-PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of differentially expressed genes for qRT-PCR
基因名称 Gene name 上游引物序列(5′→3′) Forward primer sequence 下游引物序列(5′→3′) Reverse primer sequence FLS ATGGAGGTGGAGAGAGTTCAAGC CTTAGCATATTCCTTGTTGGCCT CYP73A CAATTGAGACAACACTATGGTCGAT TTCTTCAGGGTTTTTCCAGTGG CYP75A TATGGTGTTTGCTCATTACGGATC AGCAACATGCTCCTCAATCATG CHS GTCCCTAAGCTAGGCAAAGAAGC CGAAGATGGGTTTCTCTCCGA DFR CTGACTCTCTGGAAGGCCGA GGATTCGCAGAGATCGTCGG E2.1.1.104 ATGGAAGAGAAAATGAAAGCAGCA TTTCCATCATCAGGAATTGCTAGG GAPDH TTGCTGGACGCGTCGCAC GGAGCAGCGGAAGTCGACG 
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表 2 番石榴果实的营养成分比较1)
Table 2 Comparison of the nutritional components of guava fruits
品种 Cultivar w/% w/(mg·g−1) 可溶性 固形物 Soluble solid 总酸 Total acid 总糖 Total sugar 还原糖 Reducing sugar 蔗糖 Sucrose 总酚 Total phenol 红宝石 Hongbaoshi 9.40±1.05c 0.14±0.02ab 69.09±7.52c 38.31±1.18a 30.91±1.54d 8.61±0.26b 西瓜红 Xiguahong 8.60±0.92b 0.18±0.04b 60.70±7.08ab 45.15±4.36b 13.38±0.44a 7.83±0.80a 胭脂红 Yanzhihong 8.23±0.31b 0.27±0.02d 65.84±5.12b 40.50±2.21ab 21.06±1.69c 11.25±0.70c 珍珠 Zhenzhu 9.87±0.80c 0.11±0.02a 70.25±2.38c 52.93±1.51c 17.48±0.85b 8.48±1.03b 水晶 Shuijing 8.99±0.79bc 0.23±0.02c 65.55±2.59b 42.41±2.15b 22.74±1.05c 7.67±1.11a 金斗香 Jindouxiang 7.34±0.66a 0.29±0.02d 58.91±2.79a 39.40±1.83a 16.97±0.40b 11.51±0.54c 平均值 Mean 8.74±1.84 0.20±0.01 65.06±7.35 43.12±8.01 18.26±5.89 9.23±3.44 变异系数 Variation coefficient 0.25 0.05 0.12 0.18 0.28 0.37
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品种 Cultivar w/(mg·g−1) w/(μmol·g−1) 类黄酮 Flavonoids 抗坏血酸 Ascorbic acid 单宁 Tannin ABTS DPPH 红宝石 Hongbaoshi 7.73±0.20c 2.42±0.17c 5.22±0.02b 33.70±1.14bc 545.40±32.48b 西瓜红 Xiguahong 6.54±0.18b 1.40±0.10ab 6.17±0.40c 23.98±0.71a 337.77±32.50a 胭脂红 Yanzhihong 10.05±1.90d 1.53±0.15b 4.70±0.35b 36.79±1.60cd 1004.30±95.67e 珍珠 Zhenzhu 6.68±0.36b 1.27±0.31ab 3.80±0.96a 32.17±1.27b 726.83±47.06c 水晶 Shuijing 5.74±0.49a 1.09±0.02a 7.22±0.28d 25.02±3.15a 639.83±34.40c 金斗香 Jindouxiang 9.76±1.78d 1.54±0.14b 4.72±0.32b 38.65±1.81d 875.90±40.25d 平均值 Mean 7.75±4.01 1.54±0.46 5.31±1.21 31.72±5.87 688.34±227.40 变异系数 Variation coefficient 0.46 0.30 0.23 0.19 0.33 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， LSD法) 1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P < 0.05, LSD method)
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表 3 主成分的特征值、方差贡献率和累计方差贡献率
Table 3 Eigenvalue, variance contribution rate and cumulative variance contribution rate of principal components
成分 Component 特征值 Eigenvalue 方差贡献率/% Variance contribution rate 累计方差贡献率/% Cumulative variance contribution rate 1 4.531 41.194 41.194 2 2.854 25.950 67.144 3 1.913 17.389 84.533 4 0.883 8.026 92.560 5 0.358 3.259 95.819 6 0.155 1.413 97.232 7 0.121 1.104 98.336 8 0.076 0.693 99.029 9 0.048 0.437 99.466 10 0.045 0.412 99.878 11 0.013 0.122 100.000
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表 4 番石榴果实主要质地参数相关矩阵的规格化特征向量
Table 4 Normalized eigenvectors of correlation matrix of main textural parameters in guava fruits
品质指标 Quality index 主成分 Principal component 1 2 3 可溶性固形物含量 Soluble solid content 0.736 −0.290 −0.509 总酸含量 Total acid content 0.520 0.654 0.464 总糖含量 Total sugar content 0.417 −0.477 −0.598 蔗糖含量 Sucrose content 0.913 −0.055 0.347 还原糖含量 Reducing sugar content 0.820 0.409 −0.195 类黄酮含量 Flavonoids content 0.206 0.932 0.136 抗坏血酸含量 Ascorbic acid content −0.685 0.382 0.004 总酚含量 Total phenol content 0.853 −0.152 0.167 ABTS清除能力 ABTS removing capacity 0.066 0.833 −0.427 DPPH清除能力 DPPH removing capacity 0.873 0.019 −0.077 单宁含量 Tannin content 0.184 −0.463 0.830
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表 5 不同番石榴品种的主成分得分与综合评价指数
Table 5 Scores of principal components and synthetic analysis indexes for different guava cultivars
品种 Cultivar 主成分得分 Score of principal component 综合评价指数 Synthetic analysis index Y1 Y2 Y3 红宝石 Hongbaoshi 1.424 −1.133 0.943 0.450 西瓜红 Xiguahong 0.110 −0.829 −1.939 −0.500 胭脂红 Yanzhihong 0.369 1.230 0.078 0.484 珍珠 Zhenzhu −1.079 −0.671 0.852 −0.472 水晶 Shuijing −1.397 0.140 0.135 −0.513 金斗香 Jindouxiang 0.572 1.262 −0.068 0.551
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表 6 番石榴果实差异表达基因(DEG)的KEGG 信号通路富集分析
Table 6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs) in guava fruit
类别 Term DEG个数 DEG number 基因总数 Total gene number P 苯丙烷的生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis 42 111 0.000 角质、亚硫酸和蜡的生物合成 Cutin, suberine and wax biosynthesis 11 18 0.004 淀粉和蔗糖的代谢 Starch and sucrose metabolism 46 158 0.011 花青素生物合成 Anthocyanin biosynthesis 7 12 0.025 乙醛酸酯和二羧酸酯代谢 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 27 87 0.026 ABC转运蛋白 ABC transporters 13 37 0.054 类黄酮生物合成 Flavonoid biosynthesis 10 26 0.057 半乳糖代谢 Galactose metabolism 20 66 0.059 不饱和脂肪酸的生物合成 Biosynthesis of unsaturated fatty acids 10 27 0.068 脂肪酸降解 Fatty acid degradation 14 43 0.071 氰基氨基酸代谢 Cyanoamino acid metabolism 14 43 0.071 二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣酚的生物合成 Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis 6 13 0.075 植物激素信号转导 Plant hormone signal transduction 48 197 0.096 色氨酸代谢 Tryptophan metabolism 9 26 0.105 柠檬烯和蒎烯的降解 Limonene and pinene degradation 5 11 0.105 油菜素内酯生物合成 Brassinosteroid biosynthesis 4 8 0.118 α−亚麻酸代谢 α-Linolenic acid metabolism 11 35 0.118 苯丙氨酸代谢 Phenylalanine metabolism 14 48 0.124 脂肪酸生物合成 Fatty acid biosynthesis 12 40 0.131 戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化 Pentose and glucuronate interconversions 18 66 0.132
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表 7 番石榴果实差异表达基因(DEG)的GO 生物功能分析
Table 7 GO biofunctional analysis of differentially expressed genes (DEG) in guava fruit
类型 Type GO 名称 GO name DEG个数 DEG number 校正P Corrected P 生物学过程 Biological process 多细胞生物过程 Multi-cellular organism process 34 0.0008 授粉 Pollination 30 0.0016 花粉−雌蕊相互作用 Pollen-pistil interaction 30 0.0016 花粉识别 Recognition of pollen 30 0.0016 防御反应 Defense response 100 0.0019 细胞识别 Cell recognition 30 0.0019 生物刺激反应 Response to biotic stimulus 67 0.0019 细胞学组分 Cellular component 细胞外基质 Extracellular matrix 39 0.0029 蛋白质的细胞外基质 Proteinaceous extracellular matrix 35 0.0184 分子功能 Molecular function 血红素的结合 Heme binding 92 0.0003 四吡咯的结合 Tetrapyrrole binding 93 0.0008 催化活性 Catalytic activity 2073 0.0008 氧化还原酶活性、作用于配对供体、合并或还原分子氧 Oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen 87 0.0037 水解酶活性、水解邻糖基化合物 Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds 130 0.0037 作用于糖基键的水解酶活性 Hydrolase activity, acting on glycosyl bonds 139 0.0047 碳水化合物结合 Carbohydrate binding 53 0.0278 核酸结合转录因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity 194 0.0335 转录因子活性、序列特异性DNA结合 Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding 194 0.0335
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