蒺藜苜蓿生物钟基因<i>MtTOC1a</i>的克隆及功能验证

段婷婷; 杨明康; 黄可; 黄巍

doi:10.7671/j.issn.1001-411X.202211001

蒺藜苜蓿生物钟基因MtTOC1a的克隆及功能验证

段婷婷^1,,
杨明康¹,
黄可¹,
黄巍^{1, 2, ,}

1.
华南农业大学生命科学学院, 广东广州 510642
2.
广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室/岭南现代农业科学与技术广东省实验室, 广东广州 510642

基金项目: 广东省自然科学基金(2021A1515012148，2019A1515012009)；岭南现代农业科学项目(NZ2021001)

详细信息

作者简介:
段婷婷，硕士研究生，主要从事植物生物钟节律调控机制相关研究，E-mail: t_tingduan@163.com

通讯作者:
黄　巍，教授，博士，主要从事植物生物钟节律调控机制相关研究，E-mail: weihuang@scau.edu.cn

中图分类号: Q78；S542
计量
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出版历程
- 收稿日期: 2022-10-31
- 网络出版日期: 2023-11-12
- 发布日期: 2023-08-27
- 刊出日期: 2023-09-09

Cloning and functional verification of circadian clock gene MtTOC1a in Medicago truncatula

1.
College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
2.
Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Function and Regulation in Agricultural Organisms/ Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture, Guangzhou 510642, China

摘要

摘要:
目的
分析蒺藜苜蓿Medicago truncatula生物钟基因MtTOC1a的蛋白结构，探究MtTOC1a在生物钟系统中的生物学功能，比较其与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtTOC1功能相似性和差异性。
方法
通过生物信息学分析，在全基因组范围内鉴定了TOC1在蒺藜苜蓿中的同源基因。构建MtTOC1a基因的表达载体，利用农杆菌介导法引入到拟南芥野生型Col、及相应的功能丧失突变体toc1-2中，进行遗传互补分析。
结果
MtTOC1a和MtTOC1b均具有保守的功能结构域和三维结构。遗传分析表明，在早期光形态建成中，外源转化的MtTOC1a完全恢复了toc1-2的下胚轴伸长表型，但对toc1-2的提前开花表型没有显著影响。在引入CAB::LUC报告基因的株系中，外源转化MtTOC1a在连续光照下使短周期突变体toc1-2的近日节律周期延长，但仍不能完全恢复至野生型水平。
结论
MtTOC1a和拟南芥AtTOC1的功能存在相似性，但在不同的下游调控途径中所扮演的角色存在差异。本研究结果为进一步探索MtTOC1a基因的功能，利用MtTOC1a基因改造苜蓿的重要性状提供了理论依据。
- 蒺藜苜蓿 /
- 拟南芥 /
- MtTOC1a /
- 生物钟 /
- 生物节律 /
- 农艺性状
Abstract:
Objective
The goal of this study is to analyze the protein structure of Medicago truncatula MtTOC1a, explore the biological function of MtTOC1a in the circadian clock system, and compare its similarities and differences in function with its ortholog AtTOC1 in Arabidopsis thaliana.
Method
The orthologous genes of TOC1 in Medicago were identified through bioinformatics analysis, the expression vector of MtTOC1a gene was constructed and introduced into Arabidopsis wild-type Col and the corresponding loss-of-function mutant toc1-2 by Agrobacterium mediated method for genetic complementation analysis. Both MtTOC1a and MtTOC1b have conserved functional domains and protein structures. The genetic analysis indicated that during early photomorphogenesis, exogenously transformed MtTOC1a fully restored the hypocotyl elongation phenotype of toc1-2, but had no significant effect on the premature flowering phenotype of toc1-2. In the CAB::LUC reporter lines, MtTOC1a lengthened the period of the short period mutant toc1-2 under continuous light conditions, yet the mutant could not fully recover to the wild-type level.
Conclusion
MtTOC1a and AtTOC1 have similar functions, but their roles in drownstream pathways are still different. The results provide a theoretical basis for further exploring the function of MtTOC1a gene and using MtTOC1a gene to modify the important traits in Medicago.
- Medicago truncatula /
- Arabidopsis thaliana /
- MtTOC1a /
- Circadian clock /
- Circadian rhythm /
- Agronomic trait

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草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda为鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属，该虫源自北美，2019年1月入侵我国云南省，并迅速扩展到全国26个省份^[1-3]。作为联合国粮农组织全球预警的跨国界迁飞性重大害虫，草地贪夜蛾具有寄主范围宽、适生区域广、增殖能力强、扩散速度快、突发危害重等特点^[4-5]。

与其他鳞翅目昆虫一样，草地贪夜蛾主要在幼虫时期为害。目前草地贪夜蛾雌、雄幼虫为害行为性别差异的研究较少，因为缺乏幼虫性别鉴定的快速简便的手段。与许多鳞翅目昆虫一样，草地贪夜蛾在蛹和成虫时期不再取食，因此幼虫时期的取食量对其化蛹、羽化、产卵、迁飞等行为具有重要影响，不同性别的幼虫取食量存在差异。林玉英等^[5]对椰子织蛾Opisina arenosella 1龄幼虫取食量的研究表明，雌虫取食量显著大于雄虫，结合幼虫取食量可作为其龄期的判断依据之一，从而为制定椰子织蛾防控措施奠定基础；同时，大量研究表明，昆虫幼虫在抵抗高温、抗核型多角体病毒等方面有性别差异^[6-8]，成虫在感光、触角结构等方面也存在显著的性别差异^[9]，昆虫在取食、感光、抗病等行为上的性别差异研究，可为农业害虫的精准防控提供理论支持。因此，性别鉴定可以作为研究昆虫雌、雄行为差异的一种便捷有效的工具，有助于制定更加精准高效的农业害虫防控治理策略。

目前，草地贪夜蛾的性别主要是通过蛹期和成虫时期的外露生殖器及翅上的斑纹差异进行区分^[10-11]。草地贪夜蛾入侵中国后，性信息素诱捕、高空灯诱捕在虫情预测预报中发挥了非常重要的作用。由于缺乏对幼虫形态学有效的判断标准，而田间捕捉的草地贪夜蛾成虫非常活跃，鳞羽容易掉落，给性别鉴定造成了困难，影响了测报结果的准确性。对于鳞羽掉落的草地贪夜蛾样本和未经过性别鉴定的DNA样本，也缺乏有效的性别鉴定手段。因此，根据雌、雄虫性信息素结合蛋白(Pheromone-binding protein, PBP)基因的序列差异，开发简便、准确的功能性分子标记，对鉴定幼虫期乃至成虫期的草地贪夜蛾的性别具有理论和实际应用意义。

1. 材料与方法

1.1 供试材料

草地贪夜蛾为实验室饲养种群，饲养条件参考王世英等^[12]方法，温度为(26.0±0.5) ℃；相对湿度为 65%±5%；光周期为16 h光∶8 h暗。

1.2 试验方法

1.2.1 草地贪夜蛾雌、雄虫分子标记引物的设计

通过在线网站( https://pfam.xfam.org)寻找并下载PBP隐马尔科夫模型，使用Bio-Linux软件进行生物信息学分析得到草地贪夜蛾PBP基因家族的氨基酸序列，通过在线网站( http://www.omicsclass.com/article/681)手动确认每个蛋白的结构域，总共筛选得到21个PBP，使用Bio-Linux软件进行生物信息学分析获得对应蛋白的CDS序列等相关信息，所得序列与NCBI上已发表的PBP基因序列进行比对，比对结果为本研究的PBP基因的CDS序列与已发表的4个PBP基因(SfruPBP1、SfruPBP2、SfruPBP3、SfruPBP4)^[13]的CDS序列不存在相似性(结果未显示)。对获得的各基因片段进行PCR测序，结果发现Sf-10911基因序列在雌、雄个体中存在较大差异。通过多个已知雌、雄样本检测后，确认该基因为性别差异基因，针对草地贪夜蛾雌、雄虫Sf-10911基因的差异区段设计了3对引物(表1)，开发雌、雄性别鉴定的特异标记，引物设计见图1。利用设计合成的引物，对鉴别过已知性别的草地贪夜蛾虫蛹样本进行PCR扩增，筛选得到分子标记。

表 1 引物序列表

Table 1. List of primer sequence

引物名称¹⁾ Primer name	引物序列(5′→3′) Primer sequence
Sf-F	TAGCCGTGAGTTTGAATAGGGT
Sf-female-R-1	CCTGCCAGTGCCTTATTAATTAA
Sf-male-R-1	TTTTGGCAGTGCCTTATTGATTA
Sf-female-R-2	CTCAGAGGTTTTTGATATGGTTT
Sf-male-R-2	TGTATTCTTCTCAGTGCGAAGAC
Sf-female-R-3	TTAACAACGCTCCATAATAACCT
Sf-male-R-3	TAAGAACCAGTTCTTATAAACAC
1) F、R分别表示正、反向引物　1) F and R respectively represents forward and reverse primers

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图 1 草地贪夜蛾性别鉴定引物设计

深蓝色表示相同的核苷酸序列，浅蓝色表示差异位点，黑点表示缺失位点；Sf-male-R：雄虫基因差异区段；Sf-female-R：雌虫基因差异区段；Sf-F：正向引物；Sf-R：反向引物

Figure 1. Primers design for sexual identification of Spodoptera frugiperda

Dark blue represents the same nucleotide sequence, light blue represents the differencial sites and black dots represent the missing sites; SF-male-R: Differential gene segment of male; Sf-female-R: Differential gene segment of female; Sf-F: Forward primer; Sf-R: Reverse primer

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1.2.2 草地贪夜蛾蛹期DNA提取及PCR扩增

根据草地贪夜蛾蛹期雌、雄虫形态差异区分出雌、雄后(图2)，利用微量样品基因组DNA 提取试剂盒进行DNA的提取。采用雌、雄特异性引物对提取的DNA样本进行PCR扩增。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，筛选分子标记。PCR 扩增的体系为：PrimerSTAR Max 6.25 μL，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板0.5 μL，加 ddH₂O至15 μL。PCR 扩增的反应程序为：98 ℃ 预变性2 min；98 ℃变性 10 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。

图 2 草地贪夜蛾蛹期雌、雄虫腹部末端差异对比

a：臀刺；b：肛门；c：第10腹节；d：第9腹节e：半圆形瘤状突起；f：第8腹节；g：产卵孔；h：生殖孔

Figure 2. Distinction between abdomen ends of male and female of Spodoptera frugiperda at pupal stage

a: Buttocks stab; b: Anus; c: The 10th abdominal segment; d: The 9th abdominal segment; e: Semicircular tumor-like protrusion; f: The 8th abdominal segment; g: Spawning hole; h: Genital hole

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2. 结果与分析

2.1 草地贪夜蛾性别鉴定引物的开发及筛选

针对草地贪夜蛾雌、雄虫Sf-10911基因的性别差异区段设计了3对引物，开发性别鉴定的特异标记。利用设计合成的3对引物，对已知性别的草地贪夜蛾样本进行PCR扩增，筛选得到分子标记，该分子标记可以扩增出450 bp左右的条带。之后，利用筛选出的分子标记对经过形态鉴定的雌、雄虫样本再次进行PCR扩增。

首先，利用3对标记引物扩增草地贪夜蛾的雌、雄虫DNA样本，所用样本为经过测序鉴定的雌、雄虫DNA样本；图3表明，引物Sf-female-R-1、Sf-male-R-3搭配Sf-F均不能扩增出特异条带；搭配引物Sf-F扩增时，其中雄性样本可以用雄性特异性引物Sf-male-R-2扩增得到特异条带，而雌性样本只有雌性特异性引物Sf-female-R-2可以扩增得到特异条带，与测序结果一致。因此，选择Sf-female-R-2和Sf-male-R-2作为草地贪夜蛾雌、雄虫特异性引物。

图 3 3对引物对草地贪夜蛾雌、雄虫样本的扩增

M：2000 DNA marker; m1: Sf-F/ Sf-male-R-1; m2: Sf-F/Sf-male-R-2; m3: Sf-F/Sf-male-R-3; f1: Sf-F/Sf-female-R-1; f2: Sf-F/Sf-female-R-2; f3: Sf-F/Sf-female-R-3

Figure 3. Amplification of different sexual samples of Spodoptera frugiperdaby three pairs of primers

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2.2 性别分子标记引物对草地贪夜蛾的鉴定

为进一步验证筛选出的标记引物的准确性，对经过形态鉴定的雌、雄虫蛹进行PCR检测(图4)。从图4可以看出，利用雌虫标记引物Sf-female-R-2扩增雌、雄虫DNA样本时，只有雌虫才能扩增出450 bp左右的特异性条带；用雄虫标记引物Sf-male-R-2扩增雌、雄虫DNA样本时，只有雄虫才能扩增出450 bp左右的特异性条带。检测结果与形态鉴定结果一致，说明筛选出的引物适用于草地贪夜蛾的性别鉴定。

图 4 基于PCR扩增对草地贪夜蛾雌、雄虫蛹性别鉴定

F1~F5：雌虫蛹DNA；M1~M5：雄虫蛹DNA；a、c：雌虫标记引物对 Sf-F/Sf-female-R-2；b、d：雄虫标记引物对Sf- F/Sf-male-R-2

Figure 4. Sex identification of male and female pupae of Spodoptera frugiperdabased on PCR amplification

F1−F5: DNA of female pupae; M1−M5: DNA of male pupae; a and c: Pair of female marker primers of Sf-F/Sf-female-R-2; b and d: Pair of male marker primers of Sf-F/Sf-male-R-2

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3. 讨论与结论

农业害虫的性别鉴定对于害虫的有效防治和农业生产具有重要意义。不同性别的昆虫在虫体形态上往往存在差异，甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner、桉袋蛾Acanthopsyche subferalbata Hampson以及凤凰木夜蛾Pericyma cruegri在其蛹及成虫时期的形态存在明显的性别差异^[14-16]，利用这种形态上的差异，研究人员可以快速简便地鉴定雌、雄虫，及时为田间种群动态的监测和预测预报提供数据。

利用雌、雄虫形态差异鉴定性别的方法虽然简单快捷，但却无法对一些不存在性别形态差异或是生长发育早期无形态差异的昆虫进行鉴定。牛宝龙等^[17]以棉铃虫Helicoverpa armigera雌、雄虫基因组DNA为模板，筛选了1条雌特异随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)，根据该特异性分子标记的核苷酸序列设计雌性特异引物，并对棉铃虫基因组DNA进行PCR扩增，雌性棉铃虫可以扩增出目的条带，可将此标记用于棉铃虫幼虫乃至胚胎的性别鉴定；王慧超等^[18]也早在2004年运用RADP技术对家蚕Bombyx mori Linnaeus上得到的雌特异性片段设计引物并进行了PCR验证。此外，张利娜^[19]从外部形态学、血清生化指标建立了鳗鲡Anguilla japonica的性别判定函数，用SRAP分子标记获得F5R2雌性特异DNA序列，根据测序结果设计序列特定扩增区域(Sequence characterized amplified regions，SCAR)特异引物并进行性别鉴定；Masaru等^[20]用日本青鳉Oryzias latipes的雄性Y特异性DM结构域基因开发引物鉴定了弓背青鳉Oryzias curvinotus的遗传性别；中国大鲵Andrias davidianus、双须骨舌鱼Osteoglossum bicirrhosum的性别鉴定也利用雌、雄虫基因差异序列开发分子标记引物并进行了有效的验证^[21-22]。

PBP在草地贪夜蛾的信息素识别过程中发挥着重要作用，雄虫通过触角感受雌虫性腺释放的性信息素，寻找合适的交配对象。PBP的功能特征决定了其基因序列以及表达模式在雌、雄虫之间必然存在差异，具有明显的性二型性^[23]。牛小慧^[24]对甜菜夜蛾的不同PBP进行RT-PCR检测发现，PBP在雌、雄虫之间的表达量存在显著差异；刘苏等^[13]通过对草地贪夜蛾4个PBP基因的克隆及表达模式分析发现，定位于成虫触角上的SfruPBP1和SfruPBP2蛋白在雄虫中具有更高的表达量。本研究发现草地贪夜蛾雌、雄虫中的PBP基因Sf-10911存在核苷酸序列差异，进而根据该差异设计了针对雌、雄虫扩增的引物对，通过琼脂糖凝胶电泳检测出450 bp左右的特异条带，作为其性别鉴定的分子标记，以期为研究草地贪夜蛾某些性状可能存在的性别差异提供快速有效的手段。

图 1 蒺藜苜蓿和拟南芥PRR家族基因的系统发育树分析和保守结构域预测

Figure 1. Phylogenetic tree analysis and domain prediction of PRR family genes in Arabidopsis thaliana and Medicago truncatula

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图 2 AlphaFold项目所预测的MtTOC1a、MtTOC1b和AtTOC1的蛋白三维结构

PR结构域与置信得分(pLDDT)≥90的深蓝色区域重合，呈多股α螺旋和β折叠构成的桶状结构；CCT结构域与90> pLDDT≥50的浅蓝色/黄色区域重合，由两条α螺旋构成类似剪刀状的结构

Figure 2. 3D protein structures of MtTOC1a, MtTOC1b and AtTOC1 predicted by the AlphaFold project

The PR domain overlaps with the dark blue region with a confidence score of (pLDDT) ≥90, showing a barrel-like structure composed of multiple strands of α helices and β folds; The CCT domain overlaps with the light blue/yellow region with 90> pLDDT≥50, forming a scissor-like structure with two α helices

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图 3 MtTOC1a表达载体的构建

A：MtTOC1a互补表达载体的T-DNA区域示意图；B：苜蓿MtTOC1a基因的克隆；C：MtTOC1a载体的菌落PCR结果，“*”表示阳性菌落

Figure 3. Construction of MtTOC1a expression vector

A: Schematic diagram of the T-DNA region of MtTOC1a expression vector; B: Cloning of MtTOC1a gene in Medicago; C: Colony PCR results of MtTOC1a expression vector, “*” indicates positive colony

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图 4 MtTOC1a相关转基因植株表型

A：苗龄7 d的下胚轴长度表型；B：在短日照条件下的开花时间表型

Figure 4. Phenotypes of transgenic plants with MtTOC1a

A: The hypocotyl length phenotypes of 7-day-old seedlings; B:The flowering time phenotypes under short-day conditions

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图 5 MtTOC1a相关转基因植株的表型量化分析

A：苗龄7 d的下胚轴长度，n≥30；B：在短日照条件下植株抽薹时莲座叶的数量, n≥15；柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，LSD法)

Figure 5. Quantification analysis of the phenotypes of transgenic plants with MtTOC1a

A: The hypocotyl lengths of 7-day-old seedlings, n≥30; B: The number of rosette leaves during bolting of plants under short-day conditions, n≥15; Different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, LSD test)

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图 6 MtTOC1a相关转基因植株的近日节律周期分析

A：持续光照条件下的MtTOC1a相关转基因拟南芥植株生物发光节律，n≥16，图中所有植株均带有CAB：：LUC荧光素酶报告基因，括号内表示相应植株的近日节律周期，浅灰色表示主观黑夜； B： A图中植株的近日节律周期和相对振幅误差的量化，相对振幅误差数值越小表示植株的节律性越强

Figure 6. Circadian rhythm analysis of transgenic plants with MtTOC1a

A: The bioluminescence rhythm of transgenic Arabidopsis plants with MtTOC1a under continuous light condition, n≥16, all plants in the figure carried a CAB:: LUC reporter gene, the daily rhythm cycle of corresponding plants was indicated in parentheses, light gray represents subjective night; B: Quantification of the circadian rhythm period and relative amplitude error of plants in A, and the smaller the relative amplitude error value, the stronger the rhythmicity of the plant

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表 1 克隆载体的构建引物序列

Table 1 The primers used for cloning vector construction

基因 Gene	引物名称 Primer name	引物序列 (5′→3′) Primer sequence
MtTOC1a	MtTOC1a-F	CTGATCATGGAGAGTGAAGGGTTTGATTTG
	MtTOC1a-R	TTGCTCACCATAGCATCCCTCGGAGAGTAATCTC
AtTOC1	AtTOC1pro-F	CTCGGTACCCGGGGATCCGAGATCGCTCGGCTCAACAA
	AtTOC1pro-R	TTCACTCTCCATGATCAGATTAACAACTAAACCCACACA

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