Changes in milk production and milk composition of dairy cows fed with high starch and oil diet, and screening of differentially expressed genes in mammary glands
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摘要:目的
研究高淀粉高油日粮对奶牛泌乳性能和乳腺组织转录组的影响，探索乳脂下降综合征(Milk fat depression，MFD)的分子机制。
方法选用8头荷斯坦泌乳奶牛，随机分为对照组和处理组(4头/组)，采用2×2反转试验设计，分为2期，每期23 d，期间2组对调。每期的前16 d，对照组奶牛饲喂低淀粉低油的基础饲粮，对照组日粮的泌乳净能为6.78 MJ/kg；处理组奶牛在基础饲粮基础上添加266 g/kg(DM基础)细粉碎玉米和46 g/kg(DM基础)大豆油；后7 d 2组奶牛均喂基础饲粮，处理组日粮的泌乳净能为7.66 MJ/kg。分别于每期的第1、4、7、10、13、16、19和22天测定产奶量和乳成分，第16天采集乳腺组织用于检测转录本的变化。
结果与对照组相比，处理组第13、16天奶牛的干物质采食量和产奶量显著降低(P<0.05)；饲喂高淀粉高油饲粮7 d后乳脂率开始降低，其中，第10、13、16和19天的乳脂率和乳脂产量显著降低(P<0.05)；第13、16和19天的乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量显著提高(P<0.05)。在奶牛乳腺对照组和处理组中共检测到235个显著差异表达的基因，其中，64个上调、171个下调。GO分析表明，差异表达基因主要与炎症反应、α−氨基酸代谢、有机氮化合物代谢、细胞发育、脂质生物合成和脂肪细胞分化等相关；KEGG分析表明，差异表达基因主要与轴突导向、NF-κB信号通路、钙信号通路等相关。结合差异表达基因与泌乳性能的相关性分析，本研究筛选出了部分与脂质调控相关的基因作为研究奶牛MFD状态下脂质代谢的候选基因，包括在乳腺中下调表达的FGFR4、VDR、HTR2B、CCL21和TYRP1。
结论高淀粉高油饲粮饲喂奶牛降低了干物质采食量、产奶量和乳脂率，提高了乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量，下调了奶牛乳腺中脂肪酸合成相关基因的表达。本研究为科学配制日粮和研究MFD的分子机制研究提供了数据参考。
Abstract:ObjectiveThe aim of this experiment was to study the effects of high starch and oil diet on milk performance and mammary gland transcriptome of dairy cows, and explore the molecular mechanism of milk fat depression (MFD).
MethodEight lactation Holstein cows were randomly divided into two groups of the control group and treatment group, four cows in each group with a 2×2 crossover experiment. The test was divided into two periods, each period was 23 days, and two groups were switched in the second period. In the first 16 days of each period, the cows in the control group were fed low starch and oil diet, the net lactation energy of the control diet was 6.78 MJ/kg. For the cows in the treatment group, 266 g/kg fine ground corn and 46 g/kg soybean oil (dry matter basis) were added to the control diet. In the last seven days of each trial period, the cows of two groups were both fed with low starch and oil diet, the net lactation energy of the diet in the treatment group was 7.66 MJ/kg. Milk yield and milk composition were measured on the 1st, 4th, 7th, 10th, 13th, 16th, 19th and 22nd days of each period respectively, and mammary tissues were collected on the 16th day to detect changes in transcripts.
ResultCompared with the cows fed with low starch and oil diet, the dry matter intake and milk yield of cows fed high starch and oil diet decreased on the 13th and 16th days (P<0.05). After feeding high starch and oil diet for seven days, the milk fat percentage began to decrease, and the milk fat rate and milk fat yield decreased significantly on the 10th, 13th, 16th and 19th days (P<0.05). The contents of milk protein, lactose and non-fat solids increased significantly on the 13th, 16th and 19th days (P<0.05). A total of 235 differentially expressed genes (DEGs) were detected in the control and treatment groups, 64 of which were up-regulated and 171 were down regulated. GO analysis showed that the DEGs were mainly related to inflammatory reaction, α-amino acid metabolism, organic nitrogen compound metabolism, cell development, lipid biosynthesis and adipocyte differentiation. KEGG analysis showed that the DEGs were mainly related to axon guidance, NF-κB signaling pathway, calcium signaling pathway and so on. Combined with the correlation analysis between the DEGs and milk performance, this study screened some genes related to lipid regulation as candidate genes for studying lipid metabolism in dairy cows under MFD, including FGFR4, VDR, HTR2B, CCL21 and TYRP1 which were down regulated in mammary glands.
ConclusionFeeding cows with high starch and oil diet can reduce dry matter intake, milk yield and milk fat rate, increase the contents of protein, lactose and non-fat solids, and down-regulate the expression of fatty acid synthesis related genes in mammary glands of dairy cows. The study can provide data references for scientific formulation of diets and investigation of the molecular mechanism of MFD in dairy cows.
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Keywords:
- High starch /
- High oil /
- Dairy cow /
- Mammary gland /
- Transcriptome /
- Lactation performance /
- Differentially expressed gene
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近年来，我国奶业发展迅速，奶牛养殖业和乳品加工业逐渐成为国民经济中重要支柱产业之一[1]。乳脂作为牛奶营养的重要物质之一，是衡量牛奶品质优劣的重要指标，其含量直接影响原奶品质和售价。然而，现行生鲜乳国家标准中要求的乳脂率仅为3.1%，我国原奶乳脂率的整体水平为3.69%，远低于欧盟(4.04%)、澳大利亚(4.11%)和新西兰(4.78%)等乳业发达国家生鲜乳中的乳脂率[2]。乳脂率受遗传、饲粮、泌乳阶段等多种因素影响，其中受饲粮组成影响最大。乳脂降低综合征(Milk fat depression，MFD)是指日粮因素造成奶牛乳脂率或乳脂产量明显降低，而对产奶量和乳蛋白产量影响较小的一种现象[3]。我国优质粗饲料资源短缺，为了使奶牛充分发挥产奶性能，生产中不得不饲喂高淀粉高油饲粮来满足奶牛能量需要，造成乳脂合成抑制多发[4]。过去的研究通常采用单独的高精料或高油饲粮来诱导奶牛产生MFD，而给奶牛同时饲喂高精料高油饲粮的研究相对较少。
日粮组成会影响反刍动物乳腺中乳脂肪和乳蛋白的合成。研究表明，在日粮诱导奶牛发生MFD过程中参与脂质合成的关键酶下调，启动子中有一个受固醇反应元件SREBP1调节[5]，表明SREBP1在调节牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成的信号通路中具有重要作用。RNA测序技术(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析的重要手段，Cui等[6]以荷斯坦奶牛乳蛋白和乳脂肪含量作为差异性状，对奶牛的乳腺上皮细胞进行转录组测序，推测出了调控乳中蛋白和脂肪含量的关键基因。因此，利用RNA-seq技术阐明牛乳腺转录组对于确定影响奶牛乳成分性状的候选基因至关重要[7]。
本研究旨在探究同时饲喂高淀粉高油日粮对奶牛生产性能和乳成分的影响，并结合乳腺组织的转录组表达情况，筛选出参与脂质调控的候选基因，为进一步阐述MFD的分子机制和科学配制日粮提供数据支持。
1. 材料与方法
1.1 试验动物和饲养管理
选取来自广东某奶牛场的8头头胎荷斯坦奶牛为试验动物，其泌乳日龄(215±34) d，体质量(575±23) kg。全混合日粮(Total mixed ration, TMR)饲喂，每天饲喂时间为07:00和17:00，挤奶时间为06:30和16:30，自由采食和饮水，保证剩料量(w)5%~10%。试验期间，每头奶牛单独拴系饲养于栏舍内，地面铺有橡胶垫和细沙，每日清粪2次。
1.2 试验设计
试验开始前预饲10 d，奶牛均饲喂低淀粉低油饲粮。试验期将8头奶牛随机分为对照组和处理组(每组4头)，采用2×2反转试验设计，进行两期试验，每期23 d(诱导期16 d，恢复期7 d)，两期间对照组和处理组对调。诱导期时，对照组奶牛饲喂低淀粉低油日粮，精粗比(m:m) 50:50，处理组奶牛在对照组日粮基础上添加了266 g/kg(干物质基础)细粉碎玉米(过1.2~1.5 mm筛)和46 g/kg(干物质基础)的大豆油，精粗比(m:m) 62:38；恢复期，两组奶牛均饲喂低淀粉低油饲粮。诱导组奶牛在每期试验的前4 d进行饲粮过渡。饲粮组成和营养成分见表1。
表 1 试验饲粮组成和营养水平(干物质基础)1)Table 1. Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)项目
Item组成
Componentw/% 对照组
Control
group处理组
Treatment
group原料
Ingredient全株玉米青贮
Whole corn silage10.65 8.12 燕麦干草 Oats hay 7.02 5.35 苜蓿干草 Alfalfa hay 16.71 12.72 高湿玉米
High moisture corn4.65 3.55 蒸汽压片玉米
Steam flaked corn9.31 7.11 粉碎玉米 Ground corn 9.86 27.79 大豆油 Soybean oil 3.51 干酒糟及其可溶物
Distillers dried grains with solubles2.76 2.11 大豆粕 Soybean meal 5.02 3.83 双低菜籽粕
Double low rapeseed meal5.38 4.10 甜菜颗粒粕
Dried beet pellet6.54 4.98 湿啤酒糟
Wet brewer’s grains6.85 5.22 发酵菠萝渣
Fermented pineapple residue2.37 1.80 全棉籽 Whole cottonseed 6.90 5.26 甘蔗糖蜜 Cane molasses 2.45 1.87 过瘤胃脂肪
Rumen bypass fat0.78 0.59 预混料2) Premix 0.46 0.35 磷酸氢钙 CaHPO4 0.36 0.27 石粉 CaCO3 0.72 0.55 小苏打 NaHCO3 0.72 0.55 氧化镁 MgO 0.13 0.10 盐 NaCl 0.36 0.27 营养成分
Nutrient有机物 Organic matter 92.94 94.31 粗蛋白质 Crude protein 16.10 14.12 中性洗涤纤维
Neutral detergent fiber31.43 26.42 酸性洗涤纤维
Acid detergent fiber19.45 15.78 淀粉 Starch 23.77 31.43 粗脂肪 Crude protein 4.55 7.80 泌乳净能/(MJ·kg−1)
Net energy of lactation6.78 7.66 1) 泌乳净能为计算值，其余为实测值；2) 每千克预混料(DM基础)含：铜 2 525 mg，铁 4 150 mg，锌 10 025 mg，锰 4 200 mg，钴 60 mg，硒 100 mg，碘 200 mg，维生素A 1100 000 IU，维生素D3 360 000 IU，维生素E 10 000 mg，生物素 200 mg，β−胡萝卜素 300 mg，瘤胃素 3 000 mg
1) Net energy of lactation is a calculated value, while the others are measured values; 2) Each kilogram of premix (DM base) contains: Copper 2 525 mg, iron 4 150 mg, zinc 10 025 mg, manganese 4 200 mg, cobalt 60 mg, selenium 100 mg, iodine 200 mg, vitamin A 1100 000 IU, vitamin D3 360 000 IU, vitamin E 10 000 mg, biotin 200 mg, β-carotene 300 mg, rumenin 3 000 mg
1.3 样品采集
1.3.1 饲料样品采集和测定
饲养过程中每天记录每头牛的TMR饲喂量和剩料量，测定第1、4、7、10、13、16、19和22天的干物质采食量(Dry matter intake, DMI)。于每期的第13~15天采集饲料原料和TMR，65 ℃烘干后粉碎，过18目筛后，参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[8]中的方法测定干物质(Dry matter, DM)、有机物(Organic matter, OM)、粗蛋白质(Crude protein, CP)、粗脂肪(Ether extract, EE)、中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber, ADF)含量，采用比色法测定淀粉含量[9]。
1.3.2 奶样采集和测定
测定每期第1、4、7、10、13、16、19和22 天的产奶量，并采集奶样。将每天采集的早晚奶样按照1:1体积比均匀混合后4 ℃保存，利用多功能乳成分分析仪(LactoStar 3560; FUNKE GERBER，Germany)测定乳脂、乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量。
1.3.3 乳腺组织采集与测定
于饲养期第17天由经过培训的专业兽医人员对奶牛进行乳腺组织的活体采样，其中每期每个处理组随机采集乳腺样本2个(共8个)。采集乳腺组织时，选择奶牛乳房后区上四分之一中点处为采样部位。皮下注射体积分数为1%的盐酸普鲁卡因(每头注射20~30 mL)进行麻醉。麻醉起效后，使用12号活检针移除适量乳腺组织，用生理盐水洗去血液，放入冻存管，存于液氮中待测。观察伤口不再出血时(活检后约5 min)将其缝合。转录组测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，测序文库使用NEBNext®Ultra™Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®(NEB，USA)生成，高通量测序平台为Illumina HiSeq 4000(Illumina，USA)。
1.4 数据统计分析
采用Excel(2016)进行所有数据的基本处理。奶牛的DMI、产奶量和乳成分结果折线图采用GraphPad Prism 7绘制；各指标采用SAS version 9.4的MIXED程序进行统计分析，使用t检验比较差异显著性，根据以下模型进行分析：Yijkl = µ +Si + Tj + Nk(Si) + Pl + εijkl，其中Yijkl为试验牛在不同处理下的因变量值，µ为总体均值，Si为次序i的随机效应(i=1、2)，Tj为日粮j处理效应(j=1、2)，Nk为嵌套次序的试验牛k的随机效应(k=1~8)，Pl为采样时期效应(l=1、2)，εijkl为随机误差。使用Kenward-Rogers语句校正自由度。剔除学生化残差(Studentized residuals)超过±3的数据点。采用的软件方法为GOseq的GO分析，使用KOBAS(2.0)和KEGG数据库对差异表达基因进行通路显著性富集分析，确定差异基因的主要生化代谢途径和信号转导途径。基于皮尔逊相关系数对奶牛的平均泌乳性能与部分乳腺差异表达基因进行相关分析。
2. 结果与分析
2.1 高淀粉高油日粮对奶牛DMI、产奶量及乳成分变化的影响
由于饲粮对奶牛的影响是渐进的过程，因此本试验进行了分阶段采样，以观察饲养期间奶牛相应指标的变化情况(图1)。由图1a可以看出，处理组DMI在诱导期呈波动性变化，整体低于对照组，其中第13、16天显著低于对照组(P<0.05)，恢复期逐渐回升。图1b表明，试验初期处理组产奶量略高于对照组，第4天后处理组逐渐下降，其中第13、16天显著低于对照组(P<0.05)，恢复期有所回升。乳成分方面，与对照组相比，饲喂处理组饲粮7 d后乳脂率和乳脂产量整体呈降低趋势，且第10、13、16和19天显著降低(P<0.05)(图1c、1d)；乳蛋白、乳糖和非脂固形物的含量先升高后降低(图1e、1g、1i)，而产量先降低后回升(图1f、1h、1j)，其中第13、16、19天差异显著(P<0.05)。
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图 1 高淀粉高油日粮对奶牛干物质采食量(DMI)、产奶量及乳成分的影响虚线前后分别为诱导期和恢复期；“*”表示组间差异显著(P<0.05，t检验，n=8)Figure 1. Effects of high starch and oil diet on dry mater intake (DMI), milk yield and milk composition of dairy cowsThe induction period and recovery period are before and after the dashed line; “*” indicates significant difference between groups (P<0.05, t test, n=8)2.2 高淀粉高油日粮对奶牛乳腺组织转录组的影响
2.2.1 RNA 抽提结果与质量检测
共提取了泌乳奶牛8个乳腺组织RNA以供建库使用。乳腺处理组和对照组每组各取4个样本，通过Nanodrop和Agilent 2100检测总RNA的质量浓度、纯度和完整性，结果表明，乳腺样本RNA完整值(RNA integrity number，RIN)≥6.8，质量浓度、纯度和完整性较好，检测结果为A级，达到测序样品质量要求，可用于后续转录组测序。
2.2.2 测序数据总体分析
在本研究中，8个乳腺测序文库共计得到477.47 M Raw reads，每个样品的Raw reads总数均达47 M以上，每个样品保留下来的Clean reads 最少约占总数的97.33%。每个乳腺组织样的Clean bases总数均大于7.76 G，检测碱基含量分布发现，GC含量为49.3%~52.23%，Q20≥97.14%，Q30≥92.24%，说明测序质量较高，可进行后续分析。
2.2.3 差异表达分析
通过Cuffdiff同种组织各组间差异表达基因进行筛选，发现乳腺组织共筛选出235个显著差异表达的mRNA，其中上调表达的有64个，下调表达的有171个。筛选条件为P<0.05，|log2(Fold change)|>1（Fold change 表示差异倍数），乳腺组织差异基因火山图如图2所示。
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图 2 乳腺组织差异表达基因火山图蓝色的点代表没有差异表达的基因Figure 2. Volcanic map of differentially expressed genes in mammary gland tissueThe blue dots represent genes that are not differentially expressed对乳腺235个差异表达基因的表达量做FPKM(Fragments per kb per million reads)层次聚类(Hierarchical clustering)分析后得到差异基因聚类图，FPKM指每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目，同时考虑了测序深度和基因长度对fragments计数的影响。如图3所示，可以看出饲粮处理后乳腺组间差异基因的聚类明显分开，8个样本聚成2个类别，对照组样本和处理组样本分别聚为一类，说明这些聚集基因可能具有相似的功能注释或处于相同的代谢通路，各组组内样本之间也有明显的差异。
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图 3 乳腺组织差异表达基因热图TG为处理组，CG为对照组Figure 3. Heat map of differentially expressed genes in mammary gland tissueTG is the treatment group, CG is the control group2.2.4 测序结果的qPCR验证
对差异表达mRNA进行荧光定量PCR，以验证测序结果的准确性。选取乳腺中参与脂质调控的关键基因包括FASN(脂肪酸合成酶)、SREBF1(固醇调节元件结合转录因子)，另外又随机选取4个基因在乳腺中进行验证，包括SCGB1D、PLA2G16、 RNASE1和BICDL1。如图4所示，实时荧光定量PCR结果与测序结本基本一致，说明测序结果可靠性较高。
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图 4 乳腺组织部分差异表达mRNA荧光定量PCR验证Figure 4. Fluorescence quantitative PCR validation of partial differentially expressed mRNA in mammary gland tissue2.2.5 mRNA功能富集分析
GO分析结果表明，筛选出的乳腺差异表达基因显著富集到609个GO 条目(P<0.05)，其中包含454个生物学过程条目、111个分子功能条目和44个细胞成分条目。图5为乳腺差异mRNA显著富集的前30个GO条目。对差异表达基因进一步富集分析发现，上调基因主要与炎症反应、氨基酸代谢和有机氮化合物代谢等过程有关。下调基因主要与脂质代谢、脂质生物合成、脂肪细胞分化、信号调节以及细胞的增殖、分化、发育等过程有关。
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图 5 乳腺差异mRNA显著富集的前30个GO条目Figure 5. The first 30 GO terms with significant enrichment of differential mRNAs in mammary glands对差异表达基因进行KEGG通路分析(图6)发现，共有20个基因之间有互作关系，而乳腺上调差异基因显著富集到6条通路上(P<0.05)，包括核糖体、亚油酸代谢和花生四烯酸代谢等；下调差异基因显著富集到14条通路上(P<0.05)，包括轴突导向、钙信号通路、原发性免疫缺陷、NF-κB信号通路、泛酸和CoA生物合成以及用于IgA生成的肠道免疫网络等。
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图 6 乳腺差异表达基因KEGG富集图Figure 6. KEGG enrichment map of differentially expressed genes in mammary glands筛选出的差异显著基因中，FCGR1A、SAA3、NLRC4和CATHL5参与炎症反应和免疫反应；CD40LG和CCL21参与NF-κB信号非经典通路；FASN、SREBF1、MLXIPL、HTR2B、ETNK2、FGFR4和VDR参与脂质生物合成过程；CCL21、CYP1A2、LRAT和TYRP1参与脂质代谢过程调节；SREBF1、VDR和FGFR4参与调节类固醇代谢过程；AGAP2、NEURL1、IGFBP5、FASN和VDR参与乳腺发育过程；HTR2B、ETNK2和SREBF1参与甘油脂合成过程。
2.2.6 奶牛泌乳性能与差异基因表达的相关分析
本研究选取了差异显著性TOP 10的基因，并根据功能富集分析筛选了与氨基酸代谢、脂质代谢、炎症反应等过程相关的差异表达基因，将乳腺中筛选出的差异基因分别与奶牛的平均泌乳性能数据做了相关性分析，由表2可知，乳腺中，RNASE1、Novel02780和TECTB表达与乳脂率和乳脂产量呈显著负相关(P<0.05或P<0.01)；GSTA2、FCGR1A、SAA3、RNASE1、Novel02780和NLRC4表达与DMI呈极显著负相关(P<0.01)，其中FCGR1A、SAA3和NLRC4参与炎症与免疫反应；GPA33、LRRC75A、GPR37L1、COL26A1、APLN、SREBF1、VDR、 FGFR4、CCL21和NEURL1表达与产奶量和乳脂产量呈显著正相关(P<0.05)；FBXO10、HTR2B、TYRP1、CD40LG、AGAP2和IGFBP5表达与乳脂产量呈显著正相关(P<0.05)。
表 2 奶牛泌乳性能与部分乳腺差异基因表达的相关分析1)Table 2. Correlation analysis of lactation performance and expression of selected differential genes in mammary glands of dairy cows基因
Gene干物质采食量
Dry mattter intake产奶量
Milk yield乳脂率
Milk fat rate乳脂产量
Milk fat yield乳蛋白含量
Milk protein content乳蛋白产量
Milk protein yieldGSTA2 −0.925** −0.259 −0.562 −0.508 0.717* 0.007 FCGR1A −0.945** −0.198 −0.463 −0.360 0.687 0.064 SAA3 −0.929** −0.210 −0.522 −0.433 0.717* 0.064 RNASE1 −0.933** −0.584 −0.757* −0.774* 0.829* −0.343 Novel02780 −0.533** −0.658 −0.976** −0.862** 0.655 −0.512 TECTB −0.636 −0.567 −0.771* −0.869** 0.851** −0.304 NLRC4 −0.889** −0.624 −0.584 −0.754* 0.893** −0.356 VTN 0.507 0.389 0.807* 0.508 −0.627 0.203 GPA33 0.691 0.767* 0.597 0.904** −0.798* 0.567 LRRC75A 0.612 0.732* 0.856** 0.790* −0.770* 0.550 EPOP 0.595 0.683 0.872** 0.788* −0.694 0.522 GPR37L1 0.711* 0.786* 0.749* 0.813* −0.871** 0.566 COL26A1 0.462 0.876** 0.533 0.788* −0.562 0.806* APLN 0.606 0.848** 0.775* 0.851** −0.737* 0.700 FBXO10 0.595 0.669 0.825* 0.861** −0.687 0.506 FASN 0.556 0.353 0.622 0.660 −0.826* 0.061 SREBF1 0.648 0.820 * 0.782* 0.817* −0.772* 0.653 MLXIPL 0.369 0.476 0.608 0.614 −0.748* 0.248 HTR2B 0.406 0.537 0.472 0.777* −0.739* 0.314 VDR 0.532 0.948** 0.598 0.845** −0.750* 0.813* FGFR4 0.516 0.847** 0.655 0.874** −0.836** 0.651 CCL21 0.426 0.821* 0.350 0.830* −0.712* 0.667 TYRP1 0.449 0.534 0.406 0.749** −0.789* 0.285 CD40LG 0.549 0.653 0.600 0.857** −0.739* 0.455 AGAP2 0.598 0.561 0.593 0.759* −0.804* 0.321 NEURL1 0.242 0.905** 0.599 0.808* −0.647 0.807* IGFBP5 0.395 0.693 0.438 0.833* −0.660 0.538 1) 表中数值为皮尔逊相关系数；“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01
1) Values in the form are Pearson’s correlation coefficients; “*” indicates P<0.05, “**” indicates P<0.013. 讨论与结论
3.1 高淀粉高油日粮对奶牛DMI和泌乳性能的影响
DMI受日粮适口性、能量水平等多种因素影响。本研究得出，处理组奶牛的DMI和产奶量在13和16 d显著降低。早期研究显示，每天采食高浓度油时，DMI较低，产奶量也有所下降[10]。但Boerman等[11]饲喂添加大豆油或大豆脂肪酸馏出物饲粮时发现，奶牛的DMI下降，产奶量却提高。此外，Oba等[12]研究发现，在奶牛瘤胃中灌注丙酸来替代乙酸可导致奶牛DMI下降。本试验处理组日粮中添加了粉碎玉米，较高的淀粉含量可在瘤胃中产生较多的丙酸，参与到肝脏的氧化代谢，抑制动物机体采食，进而导致奶牛DMI下降。
产奶量受生理、环境、营养、疾病等多种因素影响。在瘤胃健康时，高精料饲粮通常可提高奶牛的产奶量，但是当瘤胃健康受损时，高精料饲喂则会降低奶牛的产奶量[13]。另一方面，泌乳后期奶牛在妊娠过程中食欲较差，采食量下降，产奶量也会降低[14]。本试验得出，诱导初期处理组奶牛的产奶量略高于对照组，之后呈下降趋势，可能与DMI的显著降低及瘤胃健康有关。
本试验处理组奶牛饲粮添加粉碎玉米和大豆油饲喂7 d后，乳脂率和乳脂产量开始下降且差异显著。研究表明，用高精料诱导奶牛MFD时乳脂率显著降低了25%，乳脂产量显著降低了27%[15]；饲粮中添加4%(w)豆油或4%(w)胡麻油后，奶牛均出现了乳脂降低现象[16]；高淀粉饲粮添加600 g葵花籽油饲喂2周以上，可引起奶牛的乳脂合成抑制[17]，说明高淀粉高油饲粮可降低乳脂合成，与本试验结果一致。本试验处理组奶牛第13、16和19天的乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量显著提高。然而部分研究显示，饲喂高精料植物油饲粮时并未观察到乳糖、乳蛋白和非脂固形物有显著影响[18]，与本试验结果不一致，这可能与引起乳脂降低的饲粮组成及其对产奶量的影响不同有关。有研究表明，乳蛋白含量与饲粮的能量水平有关，适当增加饲粮精粗比可以提高乳蛋白含量[19]。乳糖含量增加，可能是由于奶牛采食高淀粉日粮后，饲粮中的过瘤胃淀粉进入肠道生成葡萄糖量相应增加[20]。
3.2 高淀粉高油日粮对奶牛乳腺组织脂代谢相关基因表达的影响
对乳腺差异mRNA进行富集分析后发现，上调mRNA显著富集到的GO条目主要与炎症反应和免疫反应、氨基酸代谢和有机氮化合物代谢有关；下调mRNA显著富集到的GO条目主要与脂质生物合成与脂质代谢、细胞增殖分化与细胞发育以及乳腺发育有关。
3.2.1 高淀粉高油日粮影响奶牛乳腺脂质代谢的作用机制
通过筛选得到与炎症反应和免疫反应相关的基因有FCGR1A、SAA3、NLRC4和CATHL5。FCGR1A是免疫球蛋白FcγR受体家族的主要成员之一，可参与调节免疫反应，它可通过激活NF-κB信号传导增加NLRP3炎症小体的形成以及炎性细胞因子(IL-1β和IL-18)的释放，从而加剧免疫炎症[21]。SAA3(血清淀粉样蛋白A3)是奶牛乳腺上皮细胞(Mammary epithelial cell，MEC)分泌的主要血清淀粉样蛋白A ( Serum amyloid A， SAA)亚型，在炎症期间于大多数MEC中高水平表达，能在宿主防御中发挥作用。此外，研究表明，SAA3也能由脂肪细胞产生，且SAA3参与奶牛分娩前后的炎症反应调节[22]。NLRC4在幽门螺杆菌感染中，可通过控制IL-18的产生来降低宿主的免疫反应，从而导致炎症[23]。CATHL5是抗菌肽家族的成员，具有抗菌活性和炎症反应调节功能，还可触发宿主的特定防御反应，对哺乳动物的免疫反应有重要作用[24]。除此之外，CD40LG和CCL21基因表达下调并显著富集到NF-κB信号非经典通路，CD40LG在免疫应答中起主要作用，能诱导激活NF-κB[25]；CCL21是一种趋化因子，对淋巴组织内原始淋巴细胞的返回和运输具有重要作用[26]。本研究中，CCL21表达与乳脂产量之间具有高度正相关性，因此CCL21表达量的减少可能是乳脂产量降低的影响因素之一。
3.2.2 高淀粉高油日粮影响奶牛乳腺的脂质调控
本试验结果显示，多个基因参与脂质合成、代谢等生物学过程。
奶牛饲喂高淀粉高油饲粮后，乳脂合成降低与关键脂质合成基因(FASN)和转录因子(SREBF1、MLXIPL)的表达下调有关。FASN是参与脂肪酸合成的关键酶，其转录本显著降低直接影响乳腺脂肪酸的从头合成。SREBF1可通过调控涉及胆固醇和脂肪代谢的众多基因的转录来调节脂质的生物合成和脂肪形成[27]。MLXIPL又被称为碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)，是乳腺中调节脂肪生成的另一个转录因子；研究表明MLXIPL对脂肪生成有积极作用，对于脂肪酸和体内甘油三酯合成的协调控制至关重要[28]。本研究发现HTR2B、ETNK2均富集到磷脂合成、甘油磷脂合成的GO条目中。HTR2B(5−羟色胺受体2B)被发现于研究人类脂肪形成和脂肪储存的新基因中，当HTR2B表达显著下调12.25倍时，脂肪细胞表现出脂质积累增加；用HTR2B拮抗剂处理过的细胞进行验证发现，细胞中性脂质水平显著增加[29]。ETNK2(乙醇胺激酶2)是乙醇胺激酶(EKI)家族成员，EKI通过二磷酸胞苷(CDP)乙醇胺途径催化磷脂酰乙醇胺(PE)生物合成的第1步，该酶参与甘油磷脂代谢。FGFR4是跨膜酪氨酸激酶受体，在调节肝胆汁酸、全身脂质代谢、葡萄糖稳态以及细胞信号传导中起重要作用[30]。VDR(维生素D3受体)是配体诱导型转录因子的核激素受体超家族的成员，VDR直接与NLRP3相互作用，抑制NLRP3炎症细胞的组装，减少NLRP3介导的IL-1β和IL-18的分泌[31]，提示VDR可能是一种潜在的抗炎因子。
LRAT(卵磷脂视黄醇酰基转移酶)催化视黄醇转化为视黄酯，在人乳腺组织中的研究表明LRAT在人的乳房生理中起重要作用[32]。CYP1A2是细胞色素P450酶超家族的成员之一，CYP1A2可存在于内质网囊泡产生的脂质微区中但似乎并不影响其形成。TYRP1(酪氨酸酶相关蛋白1)参与黑色素生物合成途径，Randhawa等[33]研究发现黑色素生成相关基因在内脏脂肪组织中的表达，首次证明了黑色素的生物合成途径在脂肪组织中起作用。此外，本试验相关性分析结果显示TYRP1表达与乳脂产量之间有极显著的正相关性。
本研究中AGAP2、NEURL1和IGFBP5参与了乳腺发育过程，说明高淀粉高油饲粮对奶牛乳腺发育有一定的影响。AGAP2参与细胞凋亡、细胞存活和受体运输相关的信号通路[34]。NEURL1(神经化E3泛素蛋白连接酶1)能通过泛素的赖氨酸残基K27导致其蛋白酶体介导的降解来调节PDE9A蛋白水平，从而可能对细胞cGMP水平产生积极影响。IGFBP5(胰岛素样生长因子结合蛋白5)对调节乳腺发育和泌乳后复性过程中的细胞凋亡和细胞增殖有重要作用[35]。
以上基因中，CCL21既参与脂质代谢调节也参与了炎症调节，而由于之前在SREBP1的启动子区域中发现了NF-κB的结合位点[36]，因此推测炎症信号通路可能影响了脂质代谢的调节，有待进一步验证。结合差异表达基因与泌乳性能的相关性分析，基因FGFR4、VDR、HTR2B、CCL21和TYRP1虽不在常规的脂肪代谢过程中，但其表达量与乳脂产量具有较高的正相关，对乳腺发育和乳腺脂质代谢具有重要调控作用，上述基因表达量的下调可能是引起乳脂含量降低的重要因素，因此可作为研究奶牛MFD脂质代谢调控的候选基因。
3.3 结论
通过饲喂高淀粉高油日粮，降低了奶牛的DMI、产奶量、乳脂率，提高了乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量。测序结果显示，乳腺中参与脂肪合成的mRNA的表达下调是造成乳脂率和乳脂产量降低的主要因素。结合差异表达基因与泌乳性能的相关性分析，筛选出了乳腺中可能与脂质代谢调控存在紧密联系的基因FGFR4、VDR、HTR2B、CCL21和TYRP1作为研究MFD的候选基因，可为研究荷斯坦奶牛MFD的分子机制奠定基础。
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图 1 高淀粉高油日粮对奶牛干物质采食量(DMI)、产奶量及乳成分的影响
虚线前后分别为诱导期和恢复期；“*”表示组间差异显著(P<0.05，t检验，n=8)
Figure 1. Effects of high starch and oil diet on dry mater intake (DMI), milk yield and milk composition of dairy cows
The induction period and recovery period are before and after the dashed line; “*” indicates significant difference between groups (P<0.05, t test, n=8)
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图 2 乳腺组织差异表达基因火山图
蓝色的点代表没有差异表达的基因
Figure 2. Volcanic map of differentially expressed genes in mammary gland tissue
The blue dots represent genes that are not differentially expressed
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图 3 乳腺组织差异表达基因热图
TG为处理组，CG为对照组
Figure 3. Heat map of differentially expressed genes in mammary gland tissue
TG is the treatment group, CG is the control group
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图 4 乳腺组织部分差异表达mRNA荧光定量PCR验证
Figure 4. Fluorescence quantitative PCR validation of partial differentially expressed mRNA in mammary gland tissue
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图 5 乳腺差异mRNA显著富集的前30个GO条目
Figure 5. The first 30 GO terms with significant enrichment of differential mRNAs in mammary glands
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图 6 乳腺差异表达基因KEGG富集图
Figure 6. KEGG enrichment map of differentially expressed genes in mammary glands
表 1 试验饲粮组成和营养水平(干物质基础)1)
Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)
项目
Item组成
Componentw/% 对照组
Control
group处理组
Treatment
group原料
Ingredient全株玉米青贮
Whole corn silage10.65 8.12 燕麦干草 Oats hay 7.02 5.35 苜蓿干草 Alfalfa hay 16.71 12.72 高湿玉米
High moisture corn4.65 3.55 蒸汽压片玉米
Steam flaked corn9.31 7.11 粉碎玉米 Ground corn 9.86 27.79 大豆油 Soybean oil 3.51 干酒糟及其可溶物
Distillers dried grains with solubles2.76 2.11 大豆粕 Soybean meal 5.02 3.83 双低菜籽粕
Double low rapeseed meal5.38 4.10 甜菜颗粒粕
Dried beet pellet6.54 4.98 湿啤酒糟
Wet brewer’s grains6.85 5.22 发酵菠萝渣
Fermented pineapple residue2.37 1.80 全棉籽 Whole cottonseed 6.90 5.26 甘蔗糖蜜 Cane molasses 2.45 1.87 过瘤胃脂肪
Rumen bypass fat0.78 0.59 预混料2) Premix 0.46 0.35 磷酸氢钙 CaHPO4 0.36 0.27 石粉 CaCO3 0.72 0.55 小苏打 NaHCO3 0.72 0.55 氧化镁 MgO 0.13 0.10 盐 NaCl 0.36 0.27 营养成分
Nutrient有机物 Organic matter 92.94 94.31 粗蛋白质 Crude protein 16.10 14.12 中性洗涤纤维
Neutral detergent fiber31.43 26.42 酸性洗涤纤维
Acid detergent fiber19.45 15.78 淀粉 Starch 23.77 31.43 粗脂肪 Crude protein 4.55 7.80 泌乳净能/(MJ·kg−1)
Net energy of lactation6.78 7.66 1) 泌乳净能为计算值，其余为实测值；2) 每千克预混料(DM基础)含：铜 2 525 mg，铁 4 150 mg，锌 10 025 mg，锰 4 200 mg，钴 60 mg，硒 100 mg，碘 200 mg，维生素A 1100 000 IU，维生素D3 360 000 IU，维生素E 10 000 mg，生物素 200 mg，β−胡萝卜素 300 mg，瘤胃素 3 000 mg
1) Net energy of lactation is a calculated value, while the others are measured values; 2) Each kilogram of premix (DM base) contains: Copper 2 525 mg, iron 4 150 mg, zinc 10 025 mg, manganese 4 200 mg, cobalt 60 mg, selenium 100 mg, iodine 200 mg, vitamin A 1100 000 IU, vitamin D3 360 000 IU, vitamin E 10 000 mg, biotin 200 mg, β-carotene 300 mg, rumenin 3 000 mg
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表 2 奶牛泌乳性能与部分乳腺差异基因表达的相关分析1)
Table 2 Correlation analysis of lactation performance and expression of selected differential genes in mammary glands of dairy cows
基因
Gene干物质采食量
Dry mattter intake产奶量
Milk yield乳脂率
Milk fat rate乳脂产量
Milk fat yield乳蛋白含量
Milk protein content乳蛋白产量
Milk protein yieldGSTA2 −0.925** −0.259 −0.562 −0.508 0.717* 0.007 FCGR1A −0.945** −0.198 −0.463 −0.360 0.687 0.064 SAA3 −0.929** −0.210 −0.522 −0.433 0.717* 0.064 RNASE1 −0.933** −0.584 −0.757* −0.774* 0.829* −0.343 Novel02780 −0.533** −0.658 −0.976** −0.862** 0.655 −0.512 TECTB −0.636 −0.567 −0.771* −0.869** 0.851** −0.304 NLRC4 −0.889** −0.624 −0.584 −0.754* 0.893** −0.356 VTN 0.507 0.389 0.807* 0.508 −0.627 0.203 GPA33 0.691 0.767* 0.597 0.904** −0.798* 0.567 LRRC75A 0.612 0.732* 0.856** 0.790* −0.770* 0.550 EPOP 0.595 0.683 0.872** 0.788* −0.694 0.522 GPR37L1 0.711* 0.786* 0.749* 0.813* −0.871** 0.566 COL26A1 0.462 0.876** 0.533 0.788* −0.562 0.806* APLN 0.606 0.848** 0.775* 0.851** −0.737* 0.700 FBXO10 0.595 0.669 0.825* 0.861** −0.687 0.506 FASN 0.556 0.353 0.622 0.660 −0.826* 0.061 SREBF1 0.648 0.820 * 0.782* 0.817* −0.772* 0.653 MLXIPL 0.369 0.476 0.608 0.614 −0.748* 0.248 HTR2B 0.406 0.537 0.472 0.777* −0.739* 0.314 VDR 0.532 0.948** 0.598 0.845** −0.750* 0.813* FGFR4 0.516 0.847** 0.655 0.874** −0.836** 0.651 CCL21 0.426 0.821* 0.350 0.830* −0.712* 0.667 TYRP1 0.449 0.534 0.406 0.749** −0.789* 0.285 CD40LG 0.549 0.653 0.600 0.857** −0.739* 0.455 AGAP2 0.598 0.561 0.593 0.759* −0.804* 0.321 NEURL1 0.242 0.905** 0.599 0.808* −0.647 0.807* IGFBP5 0.395 0.693 0.438 0.833* −0.660 0.538 1) 表中数值为皮尔逊相关系数；“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01
1) Values in the form are Pearson’s correlation coefficients; “*” indicates P<0.05, “**” indicates P<0.01
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