脂肪肝综合征是一种代谢性疾病，受到营养、遗传和环境等多方面因素的影响。在集约化饲养条件下，蛋鸡脂肪肝呈高发趋势，尤其是产蛋高峰期时，脂肪肝综合征会导致蛋鸡死亡、产蛋率下降，给养殖业造成巨大经济损失^[1]。已有研究表明，蛋鸡日粮中能量较高而蛋白含量较低是诱发鸡脂肪肝综合征的主要因素之一。由于鸡的淋巴系统不够完善，肠道中的脂肪酸直接通过肝门静脉进入肝脏，并且鸡的肝脏中脂肪合成的速度远胜于哺乳动物^[2]。此外，日粮中蛋白含量较低导致鸡载脂蛋白合成不足，过剩的脂质无法运出肝脏，进一步加剧脂肪在肝脏中堆积^[3]。

甘露寡糖(Mannan oligosaccharides，MOS)是由几个甘露糖分子或甘露糖与葡萄糖通过α−1，2、α−1，3和α−1，6糖苷键组成的寡聚糖，聚合度在2~10之间，是一类不易消化的低分子碳水化合物。甘露寡糖不能被胰淀粉酶水解，但可以被肠道菌群产生的酶降解。因此，甘露寡糖没有直接的营养价值，但已被证明能够对人类和动物的健康产生积极影响^[4]。目前，甘露寡糖广泛用于畜禽养殖。一方面，甘露寡糖可以通过缓解热应激条件下肉鸡的氧化应激来提高其生产性能^[5-6]。另一方面，甘露寡糖可以通过改善断奶仔猪的肠道形态以提高消化吸收功能，并且甘露寡糖可以促进抗原呈递来增强仔猪的抗病性^[7-8]。但关于甘露寡糖是否能够缓解动物脂肪肝的研究较少，机制尚不明确。

本研究以罗曼粉蛋鸡为试验对象，饲喂高脂日粮以构建蛋鸡脂肪肝模型，在日粮中添加不同质量分数的甘露寡糖，通过对蛋鸡血清、肝脏和肠道菌群相关指标的检测，探讨甘露寡糖对蛋鸡脂肪肝的影响，并确定最适添加剂量。本研究可望为预防或缓解蛋鸡脂肪肝提供有效的营养干预策略。

1.   材料与方法

1.1   试验动物与试验设计

试验设置4组，普通日粮组(CK组)饲喂普通日粮，高脂低蛋白日粮组(简称高脂日粮组，即HFD组)饲喂高脂日粮，0.1% MOS组在高脂低蛋白日粮中添加0.1%(w)甘露寡糖， 0.5% MOS组在高脂低蛋白日粮中添加0.5%(w)甘露寡糖。试验日粮组成见表1。 选取80只230日龄的罗曼粉蛋鸡，将80只蛋鸡称质量，体质量从低到高排序，按照CK组、HFD组、0.1% MOS组、0.5% MOS组、0.5% MOS组、0.1% MOS组、HFD组、CK组的顺序依次分入各组，直至每组20只。每只鸡单笼饲养。试验持续9周，每周称取并记录采食量和体质量，试验结束时，每组随机选取8只蛋鸡翅静脉采血，室温放置30 min，待血液凝固后3 000 r/min 离心15 min 制备血清，分装备用。屠宰后采集蛋鸡肝脏、腹脂和盲肠内容物，并于−80 ℃保存。

表  1  各组日粮配方及营养水平¹⁾

Table  1.  Diet composition and nutrient levels of different groups w/%

项目 Item	组成 Component	CK	HFD	0.1% MOS	0.5% MOS
原料 Ingredient	玉米 Corn	56.16	64.29	64.29	64.29
	豆粕 Soybean	27.80	16.00	16.00	16.00
	石粉 Limestone	9.60	9.70	9.70	9.70
	豆油 Bean oil	3.00	0.00	0.00	0.00
	牛油 Beef tallow	0.00	6.48	6.48	6.48
	磷酸氢钙 Calcium hydrogen phosphate	1.71	1.78	1.78	1.78
	甘露寡糖 Mannan oligosaccharide	0.00	0.00	0.10	0.50
	预混料2) Premix	1.73	1.75	1.65	1.25
	合计 Total	100.00	100.00	100.00	100.00
营养成分 Nutrient content	粗蛋白质 Crude protein	17.52	13.01	13.01	13.01
	粗脂肪 Crude fat	5.04	8.56	8.56	8.56
	粗纤维 Crude fiber	2.34	1.86	1.86	1.86
	总磷 Total phosphorus	0.61	0.58	0.58	0.58
	钙 Ca	4.00	4.00	4.00	4.00
	赖氨酸 Lys	0.90	0.67	0.67	0.67
	蛋氨酸 Met	0.53	0.39	0.39	0.39
代谢能/(MJ·kg−1) Metabolic energy		11.30	12.61	12.61	12.61
1)表中数据均为计算值；2) 预混料为每千克饲粮提供：维生素A 14700 IU，维生素B1 3 mg，维生素B2 9.6 mg，维生素B6 6 mg，维生素B12 0.03 mg，维生素D3 3300 IU，维生素E 22. 5 mg，维生素K3 3.9 mg，烟酸 60 mg，泛酸钙 18 mg，叶酸 1.5 mg，生物素 0.06 mg，铜 6 mg，铁 60 mg，锌 55 mg，锰 65 mg，碘 0.35 mg，硒 0.24 mg，钴 0.20 mg 　1) Data in the table are calculated values; 2) Premix provided per kilogram of diet: Vitamin A 14700 IU, vitamin B1 3 mg, vitamin B2 9.6 mg, vitamin B6 6 mg, vitamin B12 0.03 mg, vitamin D3 3300 IU, vitamin E 22. 5 mg, vitamin K3 3.9 mg, nicotinic 60 mg, calcium pantothenate 18 mg, folic acid 1.5 mg, biotin 0.06 mg, Cu 6 mg, Fe 60 mg, Zn 55 mg, Mn 65 mg, I 0.35 mg, Se 0.24 mg, Co 0.20 mg

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1.2   主要试验材料

罗曼粉蛋鸡由广东壹号食品股份有限公司惠赠。甘露寡糖购自陕西森弗天然制品有限公司，其中甘露二糖−甘露十糖质量分数为95.2%，甘露二糖−甘露六糖质量分数为61.3%。甘油三酯(A110-1-1)、谷丙转氨酶(C009-2-1)和谷草转氨酶(C010-2-1)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。RNA提取试剂盒(R4011-02)购自广州美基生物科技有限公司。RNA反转录试剂盒(A0010CGQ)购自美国EZBioscience公司。

1.3   测定指标及方法

1.3.1   血清和肝脏甘油三酯检测

蛋鸡血清和肝脏甘油三酯的检测参照试剂盒说明书进行。

1.3.2   血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的检测

蛋鸡血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的测定参照试剂盒说明书进行。

1.3.3   肝脏切片及染色

取1 cm×1 cm×1 cm大小的肝脏样品保存于40 g/L多聚甲醛溶液中，委托武汉赛维尔生物科技有限公司进行切片，并进行苏木精−伊红(HE)和油红O染色。

1.3.4   肝脏RNA的提取和qPCR检测

总RNA提取参照试剂盒说明书进行。然后，按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。将cDNA稀释5倍，将0.5 μL引物、3 μL稀释后的cDNA、6.5 μL无核酸酶水和10 μL SYBR依次加入定量板中。于荧光定量PCR仪中进行检测，最后以β-actin作为内参基因，根据2^−ΔCt计算各目的基因mRNA相对表达水平。引物序列参照文献[9]。

1.3.5   肠道微生物的测序及分析

使用无菌管收集蛋鸡盲肠内容物100 μg左右，并于−80 ℃保存，随后送至上海麦特绘谱生物科技有限公司进行16sRNA测序分析。

1.4   数据处理与统计分析

数据结果均以平均值±标准误表示，并采用单因素方差分析及Sidak多重比较进行显著性分析。数据分析及作图用GraphPad Prism 8软件完成。肠道菌群首先使用韦恩图分析，在门水平上，统计每个区域相应扩增子序列变异/可操作分类单元(ASV/OTU)的丰度，并使用柱状图进行展示。其次使用LEfSe分析，根据其线性判别分析值制作显著差异物种分布柱状图，用以展示每个组内显著富集的物种及其重要程度。

2.   结果与分析

2.1   日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡肝脏和腹脂质量的影响

HFD组的蛋鸡体质量、肝脏质量、肝脏指数、腹脂质量和腹脂指数均显著高于CK组，分别升高了5.84%、13.01%、15.88%、65.49%和56.93%(P<0.05)；与HFD组相比，0.1% MOS组蛋鸡体质量、肝脏质量、肝脏指数、腹脂质量和腹脂指数分别降低了4.29%、5.76%、7.26%、25.36%和20.00%，差异显著(P<0.05)；而0.5% MOS组蛋鸡体质量、肝脏质量、肝脏指数、腹脂质量和腹脂指数分别降低了9.82%、8.33%、2.80%、33.41%和24.18%，减质量效果更显著(P<0.05)。综上所述，高脂日粮能够显著提升蛋鸡的体质量、肝脏和腹脂的质量，在日粮中加入适量甘露寡糖能够有效降低蛋鸡体质量、肝脏和腹脂的质量，并且添加0.5%(w)甘露寡糖的效果优于0.1%(w)甘露寡糖(表2)。

表  2  日粮添加甘露寡糖对蛋鸡肝脏和腹脂质量的影响¹⁾

Table  2.  Effects of dietary supplementation of mannose oligosaccharide on liver weight and abdominal fat weight of hens

组别 Group	初始体质量/kg Initial body weight	终末体质量/kg Final body weight	肝脏质量/g Liver weight	肝脏指数/% Liver index	腹脂质量/g Abdominal fat weight	腹脂指数/% Abdominal fat index
CK	1.60±0.02a	1.54±0.37b	34.52±2.18b	2.14±0.10b	21.27±2.92c	1.37±0.21c
HFD	1.60±0.02a	1.63±0.53a	39.01±1.04a	2.48±0.10a	35.20±5.23a	2.15±0.32a
0.1% MOS	1.60±0.02a	1.56±0.24b	36.76±2.21b	2.30±0.10b	26.27±2.50b	1.72±0.17b
0.5% MOS	1.60±0.02a	1.47±0.31c	35.76±1.30b	2.41±0.07b	23.44±4.26c	1.63±0.31b
1) 同列数据后不同小写字母表示组间差异显著(P < 0.05，Sidak法) 　1) Different lowercase letters of the same column indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, Sidak test)

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2.2   日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡脂肪肝的影响

经检测发现，HFD组蛋鸡血清和肝脏中的甘油三酯浓度均高于CK组，而日粮中添加甘露寡糖显著降低了蛋鸡血清和肝脏中的甘油三酯浓度(图1A、1B)(P<0.05)。为了进一步研究甘露寡糖对蛋鸡脂肪肝的影响，接下来对蛋鸡肝脏进行了切片染色，结果(图2)显示，HFD显著提高了蛋鸡肝脏中脂滴的分布，而甘露寡糖可以显著降低蛋鸡肝脏中脂滴的分布，使其回归正常水平。为了验证甘露寡糖是否能够缓解蛋鸡的肝脏损伤，我们进一步检测了蛋鸡血清中的谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性。结果(图1C、1D)显示，HFD组蛋鸡血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著高于CK组(P<0.05)，添加甘露寡糖可以显著降低蛋鸡血清中的谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性。以上结果说明，甘露寡糖可以有效减少蛋鸡肝脏中脂肪的沉积，缓解了高脂日粮引起的蛋鸡肝脏损伤。

图  1  日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡脂肪肝的影响

各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05，Sidak法)

Figure  1.  Effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on fatty liver of Roman hens

In each figure , different lowercase letters on bars indicate significant differences (P < 0.05, Sidak test)

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图  2  切片染色检测日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡肝脏中脂滴分布的影响

Figure  2.  Slice staining detection of the effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on lipid droplet distribution in the liver of Roman hens

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2.3   日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡肝脏脂代谢相关基因mRNA表达水平的影响

蛋鸡肝脏中脂代谢相关基因的mRNA表达水平的统计结果见图3。结果(图3)显示，HFD显著提升了蛋鸡肝脏中脂肪合成相关基因如乙酰辅酶A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，FAS)和固醇调节元件结合蛋白1c(Sterol-regulatory element binding proteins-1c，SREBP-1c)的mRNA表达水平(P<0.05)，而甘露寡糖能够显著降低蛋鸡肝脏中以上基因的表达水平(图3A)(P<0.05)。对于蛋鸡肝脏中脂肪分解相关基因如脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase，LPL)、肉碱棕榈酰转移酶−1(Carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triacyl glyceride lipase，ATGL)的mRNA表达水平的检测结果显示，各组间均无显著差异(图3B)。此外，蛋鸡肝脏中脂肪转运相关基因如载脂蛋白B(Apolipoprotein B，ApoB)和微粒体甘油三酯转运蛋白(Microsomal triglyceride transfer protein，MTP)的mRNA表达水平各组间也无显著差异(图3C)。以上结果表明，高脂日粮中添加甘露寡糖后能够显著抑制蛋鸡肝脏中脂肪合成相关基因的mRNA表达水平。

图  3  日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡肝脏脂代谢相关基因mRNA表达水平的影响

A：脂肪合成相关基因，ACC：乙酰辅酶A 羧化酶，FAS：脂肪酸合成酶，SREBP-1c：固醇调节元件结合蛋白；B：脂肪分解相关基因，LPL：脂蛋白酯酶，CPT-1：肉碱棕榈酰转移酶−1，ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶；C：脂肪转运相关基因，ApoB：载脂蛋白B，MTP：微粒体甘油三酯转运蛋白；相同基因柱子上方的不同小写字母表示处理组间差异显著(P < 0.05， Sidak法)

Figure  3.  Effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on mRNA expression levels of liver lipid metabolism genes in Roman hens

A: Fat synthesis related genes, ACC: Acetyl CoA carboxylase, FAS: Fatty acid synthase, SREBP-1c: Sterol-regulatory element binding protein; B: Lipolysis related genes, LPL: Lipoprotein lipase, CPT-1: Carnitine palmitoyl transferase 1, ATGL: Adipose triacyl glyceride lipase; C: Fat transport related genes, ApoB: Apolipoprotein B, MTP: Microsomal triglyceride transfer protein; Different lowercase letters on bars of the same gene indicate significant differences among different treatment groups (P < 0.05, Sidak test)

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2.4   日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡肠道菌群的影响

由于甘露寡糖不能够被直接吸收，主要起到调节肠道菌群的作用，我们对HFD组和0.5% MOS组的蛋鸡盲肠内容物进行了16sRNA测序分析。结果(图4)显示， 在门水平上，甘露寡糖显著提高了拟杆菌门Bacteroidetes的相对丰度，显著降低了厚壁菌门Firmicutes的相对丰度。通过使用LEfSe分析以找寻2组间属水平的生物标志物，0.5% MOS组LDA对数值升高最为明显的菌群为红蝽菌纲Coriobacteriia红蝽菌目Coriobacteriales和红蝽菌科Coriobacteriaceae。

图  4  日粮添加甘露寡糖对罗曼蛋鸡肠道菌群物种组成的影响

A：门水平上主要物种的相对丰度；B：肠道菌群的LDA对数值，图中各类别名称前面的字母c、o、f和g分别表示纲、目、科和属

Figure  4.  Effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on gut microbiome species composition of Roman hens

A: Relative abundance of gut microbiota at the phylum level; B: LDA logarithmic value of gut microbiota, the letters c, o, f, and g before the names of each category in the figure represent class, order, family and genus, respectively

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3.   讨论与结论

3.1   蛋鸡脂肪肝模型的特点

根据脂肪肝的发病机理，研究人员一般采用饲喂特殊日粮、基因编辑和药物处理等方式诱导动物脂肪肝。日粮诱导模型操作简单，为最常用诱导动物脂肪肝的方式。针对蛋鸡的研究中，研究人员一般使用高脂日粮或高能低蛋白日粮诱发其形成脂肪肝^[10]。此外，由于蛋鸡产蛋期内雌激素大量分泌，刺激肝脏合成脂肪，导致肝脏脂质沉积增多，也可使用注射外源雌激素的方式诱导蛋鸡形成脂肪肝^[11]。使用高脂日粮和高能低蛋白日粮饲喂蛋鸡后，蛋鸡血清和肝脏中脂肪沉积增多，肝脏受损，大量的谷草转氨酶和谷丙转氨酶进入血液^[12-13]。本研究使用高脂日粮饲喂罗曼蛋鸡9周后，蛋鸡体质量、肝脏质量和腹脂质量显著上升，血清和肝脏中脂肪沉积增多，血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著上升，与上述结果一致，说明本研究使用高脂日粮成功构建了蛋鸡脂肪肝模型。

3.2   甘露寡糖对蛋鸡脂肪肝的影响及作用机制

脂肪肝综合征作为现阶段蛋鸡养殖中主要面临的问题之一，严重影响蛋鸡产业发展。患病蛋鸡主要出现过度肥胖、肝脏脂肪沉积过多以及肝脂肪变性等症状，最终导致蛋鸡产蛋率下降，严重时可导致死亡，给养殖业带来严重经济损失^[14]。由于现今蛋鸡养殖多为集约化养殖，并且对于其生长速度和产蛋量的高需求，使用日粮多为高能日粮，而笼养又限制了蛋鸡的活动，导致其体内的脂肪过度沉积，使得蛋鸡的脂肪肝发病率进一步提高。因此在蛋鸡养殖中通过营养干预的手段预防蛋鸡脂肪肝发生至关重要。

甘露寡糖作为益生元添加剂在畜禽生产中发挥重要作用，已有研究表明甘露寡糖能够显著提升肉鸡的生长和免疫性能，保护其肠道屏障^[15-16]。此外甘露寡糖还能够降低黄玉肉鸡种鸡的血清甘油三酯水平，提高对日粮中粗脂肪的代谢，并能在一定程度上改善种鸡的产蛋性能^[17]。这与我们的研究结果一致，甘露寡糖显著降低了脂肪肝蛋鸡血清和肝脏中的甘油三酯浓度。肝脏中脂质堆积过多，进一步导致肝脏损伤，肝脏中大量的谷丙转氨酶和谷草转氨酶进入血液。而类似的研究也表明，其他功能性添加剂如女贞子提取物、甜菜碱等可以降低脂肪肝蛋鸡肝脏中的的脂肪沉积，血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著降低，从而缓解蛋鸡的肝脏损伤^[18-19]。本研究结果同样显示，甘露寡糖降低了脂肪肝蛋鸡肝脏中的脂肪沉积，蛋鸡血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著降低，蛋鸡肝脏损伤得以缓解。

肝脏是家禽和哺乳动物脂肪代谢的主要场所，其代谢过程也较为相似。ACC和FAS作为脂肪合成的关键限速酶，在脂肪合成中发挥重要作用。SREBP-1c是核转录因子家族成员之一，通过调节如FAS等脂肪代谢相关酶来调控体内的脂质合成^[20]。已有大量研究表明，不论是家禽还是哺乳动物，通过抑制ACC和FAS等酶的活性，可以降低肝脏中脂肪合成^[21-22]。此外，还有研究表明，ACC抑制剂抑制肝脏脂肪生成，减少肝脏脂肪变性，并可以作为非酒精性脂肪肝的潜在治疗药物^[23]。在海兰褐蛋鸡日粮中添加共轭亚油酸可以抑制蛋鸡肝脏中ACC、FAS和SREBP-1c的mRNA表达水平，从而调节肝脏脂质代谢^[24]。这与我们的结果类似，甘露寡糖显著抑制了蛋鸡肝脏中ACC、FAS和SREBP-1c的mRNA表达水平，我们推测这可能是甘露寡糖能够缓解蛋鸡脂肪肝的原因。

拟杆菌门和厚壁菌门是肠道内最多的2类细菌。在人类和小鼠等哺乳动物的研究中，肥胖或代谢紊乱个体的厚壁菌门/拟杆菌门水平远高于正常个体^[25]。此外γ−氨基丁酸、石斛多酚和桑椹多糖可以改善糖尿病小鼠的糖代谢紊乱和肥胖，厚壁菌门/拟杆菌门的水平也随之降低^[26-28]。本研究也得到了类似的结果，甘露寡糖显著降低了蛋鸡肠道中厚壁菌门的相对丰度，并提高了拟杆菌门的相对丰度。此外还有研究表明，高胆固醇血症的个体中红蝽菌纲的肠道菌群丰度显著降低^[29]。同样与本研究的结果类似，甘露寡糖显著提升了蛋鸡肠道中红蝽菌纲的相对丰度。因此肠道菌群的变化可能也是甘露寡糖缓解蛋鸡脂肪肝的原因之一。

3.3   结论

综上所述，甘露寡糖通过改善蛋鸡肠道菌群，抑制肝脏中脂肪合成相关基因的mRNA表达水平，抑制蛋鸡的脂肪沉积，从而缓解蛋鸡脂肪肝。