Effects of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg production, reproductive hormone, and related gene expression in laying hens
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摘要:目的
研究复方中药超微粉对蛋鸡产蛋性能、生殖激素及相关基因表达的影响。
方法试验选取307日龄的新杨黑羽蛋鸡216只，随机分为3组，每组8个重复，每个重复9只；对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加0.5%丹参Salvia miltiorrhiza+0.25%女贞子Ligustrum lucidum+0.25%蒲公英Taraxacum mongolicum(复方1)、0.3%益母草Leonurus japonicus+0.2%丹参+0.25%女贞子+0.25%蒲公英(复方2)的超微粉，均以质量分数计；预试期7 d，正试期120 d。测定产蛋性能、蛋品质、血浆生殖激素水平，用RT-PCR技术检测蛋品质相关基因表达。
结果与对照组相比，试验1~30、31~60和1~120 d，复方1组产蛋率分别增加7.56%、4.00%和5.31% (P<0.05)；试验1~120 d，复方2组产蛋率增加5.22% (P<0.05)；试验第60天，复方1组血浆雌二醇水平、输卵管PMCA1的mRNA相对表达量分别增加21.45%和77.00%(P < 0.05)，复方2组输卵管 KCNA1的mRNA相对表达量增加70.00% (P < 0.05)；第90天，复方1和2组蛋壳厚度分别增加12.12%和9.09% ( P < 0.05)；第120天，复方1和2组输卵管 CA2的mRNA相对表达量分别增加86.00%和66.00% (P < 0.05)，复方2组输卵管 CDH6、KCNA1和SLC26A9的mRNA相对表达量分别增加99.00%、86.00%和99.00% (P < 0.05)。
结论饲粮添加由益母草、丹参、女贞子和蒲公英组成的复方中药超微粉可增加蛋鸡的产蛋率，改善蛋品质，增加生殖激素水平，上调蛋壳形成相关基因的mRNA表达，且复方1的效果更佳。
Abstract:ObjectiveThis study was aimed to determine the effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg laying performance, reproductive hormone, and related gene expression in laying hens.
MethodA total of 216 Xinyang black-feather laying hens (307-day-old) were selected and randomly divided into three groups with eight replicates in each group and nine in each replicate. The control group was fed the basal diet, and the experimental groups were fed basal diets supplemented with 0.5% Salvia miltiorrhiza (SM) + 0.25% Ligustrum lucidum (LL) + 0.25% Taraxacum mongolicum (TM)(compound 1), and 0.3% Leonurus japonicus (LJ) + 0.2% SM + 0.25% LL + 0.25% TM (compound 2) ultrafine powders, respectively. The pre-trial period was seven days, and the formal trial period was 120 days. Egg production performance, egg quality, and plasma reproductive hormone level were determined. The expressions of genes related to egg quality were detected by RT-PCR technology.
ResultCompared with the control group, during days 1−30, 31−60, and 1−120 of the trial, the egg laying rates of the compound 1 group increased by 7.56%, 4.00%, and 5.31% (P<0.05), respectively, and during 1−120 days the egg laying rate of the compound 2 group increased by 5.22% (P<0.05). On day 60 after treatment the plasma estradiol level and relative expression of oviductPMCA1 mRNA increased by 21.45% and 77.00% (P<0.05), respectively, in the compound 1 group, and the relative expression of oviductKCNA1 mRNA increased by 70.00% (P<0.05) in the compound 2 group. On day 90, the thickness of the eggshells increased by 12.12% and 9.09% (P<0.05), respectively, in the compound 1 and 2 groups. On day 120, the relative expressions of oviductCA2 mRNA increased by 86.00% and 66.00% (P<0.05), respectively, in the compound 1 and 2 groups, and the relative expressions of oviductCDH6,KCNA1 andSLC26A9 mRNA increased by 99.00%, 86.00% and 99.00% (P<0.05), respectively, in the compound 2 group.
ConclusionDietary supplementation with compound Chinese medicine ultrafine powders consisting of LJ, SM, LL, and TM could increase the egg production rate, improve egg quality of laying hen, increase the level of reproductive hormone, and up-regulate mRNA expressions of genes associated with eggshell formation. In addition, compound 1 presents the better effect.
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我国是世界上最大的鸡蛋生产国和消费国，鸡蛋产量约占全球总产量的45%，且呈逐年上升趋势[1]。随着人们对食品安全的关注，畜禽养殖中饲用抗生素引起的副作用日益受到重视，我国于2020年7月1日全面禁止抗生素作为添加剂在饲料中使用。因此，开发和推广能有效替代抗生素类生长促进剂的新型、绿色饲料添加剂已成为当务之急[2]。中药具有无残留、毒副作用小和不易产生耐药性等优点，可促进动物新陈代谢、增加生产性能、改善产品品质，是新一代安全性能较好的饲料添加剂[3]。例如，饲粮添加女贞子Ligustrum lucidum可显著增加产蛋后期蛋鸡产蛋率，显著降低料蛋比、死淘率和破软蛋率[4]；饲粮添加益母草Leonurus japonicus 可在一定程度上延长种鸡的产蛋时间，增加产蛋数量；饲粮添加蒲公英Taraxacum mongolicum可改善家禽的生产性能[5]。目前，复方中药在蛋鸡生产上的应用已有很多研究，但复方中药超微粉对产蛋后期蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响及其机理鲜见报道。益母草可活血调经、清热解毒，蒲公英可清热解毒利尿，女贞子可清热、补益肝肾，丹参Salvia miltiorrhiza可通经、活血祛瘀。本试验以“凉血利尿、祛瘀调经”为组方原则，选用一定比例的益母草、女贞子、蒲公英和丹参等中药材组方后进行超微粉碎，研究其对产蛋后期蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响，并从生殖激素分泌及相关基因表达方面探讨其作用机理，为中药复方超微粉作为新型饲料添加剂用于蛋鸡生产提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验动物、分组及饲养管理
试验选用307日龄的健康新杨黑羽蛋鸡216只，随机分为3组，每组8个重复，每个重复9只。试验开始前各组产蛋率和体质量均无显著差异。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加复方1(0.5%丹参+0.25%女贞子+0.25%蒲公英)、复方2(0.3%益母草+0.2%丹参+0.25%女贞子+0.25%蒲公英)的超微粉(以质量分数计)。试验所用中药购自阜阳药材加工厂。基础饲粮参照蛋鸡饲养标准(NY/T33—2004)[6]产蛋后期蛋鸡营养需要配制，其组成及营养水平见表1。饲养试验在安徽阜阳徽思远生态农业有限公司开展，蛋鸡采用4层阶梯笼饲养。预试期7 d，正试期120 d。试验期间每天光照16 h，自由饮水，每天喂食2次(09:00、15:00)，室温保持在18~23 ℃。
表 1 基础饲粮组成及营养水平1)Table 1. Composition and nutrient levels of the basal diets项目 Item 成分 Ingredient w/% 原料 Ingredient 玉米 Corn 62.69 豆粕 Soybean meal 23.88 石粉 Limestone 7.94 豆油 Soybean oil 0.49 蛋氨酸 Met 0.10 预混料 Premix 5.00 合计 Total 100.00 营养成分 Nutrient 粗蛋白质 Crude protein 14.23 粗脂肪 Crude fat 9.66 钙 Ca 3.51 有效磷 Available P 0.34 赖氨酸 Lys 0.71 蛋氨酸 Met 0.37 代谢能/(MJ·kg−1) Metabolic energy 11.25 1) 风干基础；预混料为每千克饲粮提供：维生素A 1.4×105 IU，维生素D3 5×104 IU，维生素E 480 mg，维生素Κ 3 180 mg，维生素B1 63 mg，维生素B2 200 mg，维生素B6 140 mg，维生素B12 0.7 mg，烟酸胺1 000 mg，D−泛酸500 mg，叶酸50 mg，D−生物素5.0 mg，氯化胆碱900 mg，Fe 2.0 g，Cu 0.3 g，Mn 1.8 g，Zn 2.0 g，I 70 mg，Se 9 mg，植酸酶3 000 IU；粗蛋白质和粗脂肪为实测值，其余均为计算值 1) Air-dry basis; The premix provides the following per kg of diets: Vitamin A 1.4×105 IU, Vitamin D3 5×104 IU, Vitamin E 480 mg, Vitamin Κ 3 180 mg, Vitamin B1 63 mg, Vitamin B2 200 mg, Vitamin B6 140 mg, Vitamin B12 0.7 mg, nicotinic acid 1 000 mg, D-pantothenic acid 500 mg, folic acid 50 mg, D-biotin 5.0 mg, choline chloride 900 mg, Fe 2.0 g, Cu 0.3 g, Mn 1.8 g, Zn 2.0 g, I 70 mg, Se 9 mg, and phytase 3000 IU; Crude protein and crude fat are measured values, while the others are calculated values 1.2 样品采集与处理
分别于试验第30、60、90和120天从每个重复随机选取3枚鸡蛋用于蛋品质测定。试验第60和120天，于每组随机选取8~10只体质量相近且健康状态良好的蛋鸡，禁饲12 h(不禁水)后称质量，翅静脉采集血液10 mL于采血管中，肝素抗凝，4 ℃、3500 r/min离心10 min，获得血浆样品，−20 ℃条件下保存，用于生殖激素含量测定；颈动脉放血处死，解剖采集输卵管子宫部样品，液氮速冻后−80 ℃条件下保存，用于相关基因表达分析。
1.3 产蛋性能测定
试验期间，以重复为单位记录每天的产蛋数和产蛋量，统计各重复蛋鸡试验期间的耗料量，计算产蛋率、平均蛋质量、平均日采食量和料蛋比。
1.4 蛋品质测定
利用蛋壳强度测定仪测定蛋壳强度；利用游标卡尺测量蛋样纵径与横径，计算蛋形指数(纵径/横径)；利用多功能蛋品检测仪测定蛋质量、哈氏单位、蛋白高度和蛋黄颜色；利用蛋壳厚度计测定蛋壳厚度；利用电子天平称量蛋黄和蛋壳质量，计算蛋黄、蛋壳和蛋清指数，具体方法参考文献[7]。
1.5 血浆生殖激素水平测定
用ELISA试剂盒(湖南科航生物科技有限公司)检测血浆中促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)、雌二醇 (Estradiol, E2)和促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)等激素水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.6 基因表达水平检测
按照RT-PCR步骤要求，取输卵管子宫部组织液氮研磨，用Trizol法提取总RNA，用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，用Evo M-MLV反转录试剂盒(艾科瑞生物工程有限公司)将总RNA反转录为cDNA，以β-actin基因为内参，用PCR仪(LightCycler® 480II，Roche)检测蛋壳形成相关基因的mRNA表达水平。20 μL反应体系包括：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，40个循环。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表2。用2–△△Ct法计算mRNA的相对表达量。
表 2 实时定量PCR引物序列Table 2. Primer sequences used for RT-PCR基因名称 Gene name 登录号 Accession number 引物序列(5′→3′) Primer sequence 产物大小/bp Product size β−肌动蛋白 β-actin NM_205518.1 F: TGTTACCAACACCCACACCC R: TCCTGAGTCAAGCGCCAAAA 110 血小板反应蛋白2 THBS2 NM_001001755.1 F: TGTATGTGGCGAAAGGGTCC R: TGATTGGCTCCTCTGGCATC 125 钙黏蛋白6 CDH6 NM_001001758.2 F: TGTGCTGTGTGCAACGACTA R: CAGGCCTGGCAACTCTTTCT 245 钾离子通道 KCNA1 XM_004938075.3 F: TGCGGTACTTCGACCCTTTG R: GCTGGTATTCTCCCTCTGGC 243 碳酸酐酶2 CA2 XM_046910455.1 F: CTGACTACTCCACCACTGCA R: GCTCTGACTTCCCTGCTCTT 182 钙离子转运酶Ⅰ PMCA1 XM_046906440.1 F: GCTGTGGTCTGTTTTCCTGG R: ACAAGATCTGACCACGACGT 197 溶质转运蛋白 SLC26A9 XM_040691172.2 F: GACCTACTGCTCACCACTGT R: GTTGGAGAGGCGCTTTCAAA 231 1.7 数据分析与处理
试验数据经Excel 2016整理后，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用Duncan’s法进行多重比较。P < 0.05为差异显著，0.05≤ P < 0.10为有变化趋势，数据结果以“平均值±标准差”表示。
2. 结果与分析
2.1 复方中药超微粉对蛋鸡产蛋性能的影响
由表3可知，与对照组相比，试验1~30 d，复方1组料蛋比降低4.98%(P<0.05)；试验1~30、31~60和1~120 d，复方1组产蛋率分别增加7.56%、4.00%和5.31%(P<0.05)；试验1~120 d，复方2组产蛋率增加5.22%(P<0.05)。饲粮中添加复方中药超微粉对产蛋各期平均蛋质量及平均日采食量均无显著影响(P > 0.05)。
表 3 复方中药超微粉对蛋鸡产蛋性能的影响1)Table 3. Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg-laying performance of laying hen试验期/d Test period 组别 Group 产蛋率/% Laying rate 平均日采食量/g Average daily feed intake 平均蛋质量/g Average egg mass 料蛋比 Feed to egg ratio 1~30 对照 Control 84.26±1.58b 113.06±1.47a 51.71±1.24a 2.61±0.04a 复方1 Compound 1 90.63±0.65a 116.06±1.03a 53.49±1.74a 2.48±0.02b 复方2 Compound 2 86.30±2.12ab 117.48±1.69a 53.74±1.75a 2.55±0.03ab 31~60 对照 Control 84.91±1.32b 105.70±1.20a 49.70±1.83a 2.53±0.07a 复方1 Compound 1 88.31±0.99a 109.23±1.04a 52.05±0.42a 2.37±0.02a 复方2 Compound 2 87.62±0.69ab 108.70±1.61a 52.92±0.29a 2.37±0.03a 61~90 对照 Control 79.36±1.56a 105.50±1.74a 52.28±0.57a 2.36±0.04a 复方1 Compound 1 83.96±2.39a 106.94±1.41a 50.32±0.43a 2.48±0.08a 复方2 Compound 2 85.55±1.81a 107.10±1.58a 51.38±0.58a 2.42±0.06a 91~120 对照 Control 77.18±1.91a 100.52±3.01a 52.15±0.58a 2.50±0.05a 复方1 Compound 1 79.17±2.47a 101.88±2.21a 51.90±0.35a 2.48±0.95a 复方2 Compound 2 83.55±0.98a 100.65±2.33a 52.87±0.33a 2.30±0.44a 1~120 对照 Control 81.62±0.89b 104.58±1.61a 51.32±0.81a 2.50±0.01a 复方1 Compound 1 85.95±1.14a 108.71±0.91a 52.19±0.51a 2.43±0.04a 复方2 Compound 2 85.88±1.00a 108.12±1.68a 52.69±0.58a 2.41±0.04a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same period indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method) 2.2 复方中药超微粉对蛋鸡蛋品质的影响
由表4可知，与对照组相比，试验第30天，各复方组蛋品质指标均无显著变化(P>0.05)；试验第60天，各复方组鸡蛋的哈氏单位呈增加趋势(P=0.056)，复方2组鸡蛋的蛋形指数呈增加趋势(P=0.069)，复方1组鸡蛋的蛋壳相对质量增加5.16% (P<0.05)；试验第90天，复方1组鸡蛋的蛋壳相对质量增加4.05% (P<0.05)，复方2组蛋黄颜色加深5.42% (P < 0.05)，复方1组和2组鸡蛋的蛋壳厚度分别增加12.12%和9.09%，蛋形指数分别降低2.99%和2.24%，蛋壳强度分别增加25.99%和18.38% ( P<0.05)；试验第120天，复方1组鸡蛋的蛋形指数降低2.24%、蛋黄颜色加深2.62%、蛋壳厚度降低13.16% (P<0.05)。
表 4 复方中药超微粉对蛋鸡蛋品质的影响1)Table 4. Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg quality of laying hent/d 组别 Group 蛋形指数 Shape index 蛋壳厚度/mm Eggshell thickness 蛋壳强度/(kg·cm−2) Eggshell strength 蛋白高度/mm Albumen height 哈氏单位 Haugh unit 30 对照组 Control 1.32±0.01a 0.37±0.01a 39.43±1.96a 3.79±0.30a 58.25±3.52a 复方1 Compound 1 1.31±0.01a 0.38±0.01a 44.49±1.71a 4.17±0.31a 65.78±2.82a 复方2 Compound 2 1.31±0.01a 0.38±0.01a 42.81±1.64a 4.27±0.29a 67.23±2.40a 60 对照组 Control 1.31±0.01a 0.37±0.01a 37.68±1.48a 3.80±0.33a 59.02±3.78a 复方1 Compound 1 1.31±0.01a 0.38±0.01a 40.12±1.95a 4.30±0.32a 63.43±3.55a 复方2 Compound 2 1.32±0.01a 0.36±0.01a 42.05±1.82a 3.97±0.26a 60.25±3.25a 90 对照组 Control 1.34±0.01a 0.33±0.01b 30.90±2.15b 3.86±0.25a 60.17±3.16a 复方1 Compound 1 1.30±0.01b 0.37±0.01a 38.93±1.52a 4.41±0.26a 67.84±2.20a 复方2 Compound 2 1.31±0.01b 0.36±0.01a 36.58±1.43a 4.19±0.30a 62.95±2.78a 120 对照组 Control 1.34±0.01a 0.38±0.01a 32.76±1.83a 3.91±0.22a 64.16±2.12a 复方1 Compound 1 1.31±0.01b 0.33±0.01b 35.17±1.84a 4.31±0.20a 65.17±2.13a 复方2 Compound 2 1.32±0.01ab 0.38±0.01a 35.20±1.45a 4.09±0.28a 64.69±2.41a t/d 组别 Group 蛋黄颜色指数 Yolk color index 蛋白相对质量/% Albumen ratio 蛋黄相对质量/% Yolk ratio 蛋壳相对质量/% Eggshell ratio 30 对照组 Control 11.83±0.13a 57.60±0.56a 31.94±0.55a 10.72±0.16a 复方1 Compound 1 11.50±0.12a 56.23±0.33a 32.45±0.39a 10.93±0.13a 复方2 Compound 2 11.71±0.11a 56.59±0.29a 32.37±0.35a 10.94±0.11a 60 对照组 Control 12.27±0.10ab 56.14±0.47a 33.19±0.41a 10.65±0.12b 复方1 Compound 1 12.63±0.16a 55.90±0.33a 32.71±0.33a 11.20±0.13a 复方2 Compound 2 12.08±0.15b 56.65±0.47a 32.34±0.44a 10.91±0.15ab 90 对照组 Control 12.17±0.16b 56.14±0.32a 33.19±0.31a 10.61±0.09b 复方1 Compound 1 12.61±0.16ab 55.70±0.34a 33.04±0.40a 11.04±0.15a 复方2 Compound 2 12.83±0.15a 56.74±0.43a 32.14±0.33a 10.68±0.15ab 120 对照组 Control 12.22±0.09b 56.24±0.50a 33.31±0.42a 10.48±0.11a 复方1 Compound 1 12.54±0.16a 56.05±0.33a 33.39±0.32a 10.49±0.12a 复方2 Compound 2 11.95±0.05b 56.64±0.66a 32.76±0.64a 10.64±0.17a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method) 2.3 复方中药超微粉对蛋鸡生殖激素水平的影响
由表5可知，与对照组相比，试验第60天，复方1组血浆E2水平增加21.45% (P<0.05)；试验第120天，复方2组血浆LH水平呈升高趋势(P=0.06)，各复方组血浆FSH和E2水平均无显著变化(P>0.05)。
表 5 复方中药超微粉对蛋鸡血浆生殖激素水平的影响1)Table 5. Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on plasma reproductive hormone level of laying hent/d 组别 Group 促卵泡激素/(IU·L−1) Follicle-stimulating hormone (FSH) 促黄体生成素/(IU·L−1) Luteinizing hormone (LH) 雌二醇/(ng/L−1) Estradiol (E2) 60 对照 Control 18.34±0.35a 17.04±0.29a 401.40±10.37b 复方1 Compound 1 18.07±0.46a 15.78±0.55a 487.05±8.90a 复方2 Compound 2 17.51±0.34a 15.45±0.32a 438.91±18.81b 120 对照 Control 16.79±0.65a 16.75±0.50a 405.59±10.84a 复方1 Compound 1 18.06±0.29a 17.15±0.37a 386.44±10.75a 复方2 Compound 2 17.57±0.20a 17.91±0.36a 417.67±6.78a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method) 2.4 复方中药超微粉对蛋鸡输卵管子宫部相关基因mRNA表达的影响
由表6可知，试验第60天，与对照组相比，复方1组CA2、SLC26A9、PMCA1以及复方2组KCNA1的mRNA相对表达量分别增加64.00%、58.00%、77.00%和70.00% (P < 0.05)；试验第120天，与对照组相比，复方1组和2组 CA2的mRNA相对表达量分别增加86.00%和66.00% (P < 0.05)，复方2组 CDH6、KCNA1和SLC26A9的mRNA相对表达量分别增加99.00%、86.00%和99.00% (P < 0.05)；与复方1组相比，复方2组 KCNA1和SLC26A9的mRNA相对表达量分别增加121.00%和197.00%、CA2的mRNA相对表达量降低10.75% (P < 0.05)。
表 6 复方中药超微粉对蛋鸡输卵管子宫部相关基因mRNA表达量的影响1)Table 6. Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on related gene expression in the uterus of hen oviductt/d 组别 Group 血小板反应蛋白2 THBS2 钙黏蛋白6 CDH6 钾离子通道1 KCNA1 碳酸酐酶2 CA2 钙离子转运酶I PMCA1 溶质转运蛋白 SLC26A9 60 对照 Control 1.00±0.18a 1.00±0.35a 1.00±0.18b 1.00±0.12b 1.00±0.12b 1.00±0.14b 复方1 Compound 1 0.90±0.09a 1.30±0.33a 1.23±0.22ab 1.64±0.12a 1.77±0.07a 1.58±0.12a 复方2 Compound 2 0.80±0.10a 0.87±0.20a 1.70±0.18a 1.13±0.13ab 1.40±0.38ab 1.16±0.14ab 120 对照 Control 1.00±0.20a 1.00±0.22b 1.00±0.11b 1.00±0.15c 1.00±0.11a 1.00±0.05b 复方1 Compound 1 2.17±0.25a 1.66±0.46ab 0.84±0.09b 1.86±0.17a 0.76±0.15a 0.67±0.32b 复方2 Compound 2 2.30±0.25a 1.99±0.21a 1.86±0.12a 1.66±0.14b 0.70±0.09a 1.99±0.32a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method) 3. 讨论与结论
饲粮添加复方中药可促进动物生长发育，增加其生产性能[8]。本试验中，饲粮添加复方1和复方2超微粉可显著增加蛋鸡的产蛋率和平均日采食量，可能是因为生殖激素水平增加，促进了卵泡发育与排卵，从而增加蛋鸡产蛋率[9-10]，有研究表明，饲粮添加益母草和女贞子超微粉可显著增加产蛋后期蛋鸡的产蛋率[7, 11]，这与本试验研究结果一致。
蛋黄颜色是衡量鸡蛋品质的重要指标之一，叶黄素是影响鸡蛋蛋黄颜色的主要因素之一。哈氏单位是评价鸡蛋蛋白质量和新鲜度的指标，数值越大表示鸡蛋品质越好[7]。蛋壳厚度和蛋壳强度是评价蛋壳质量的指标，蛋壳质量优劣对鸡蛋的储存、运输和孵化均十分重要[12]。本试验中，试验第60天复方1组和试验第90天复方2组的鸡蛋蛋黄颜色显著加深，可能是因为蒲公英[13]、女贞子[14]等中药具有良好的抗氧化特性，可清除机体内的多种自由基，防止鸡蛋中胡萝卜素和叶黄素被氧化，从而增加了蛋黄色泽。试验第90天2个中药复方超微粉组鸡蛋的蛋壳厚度均显著增加，可能是因为复方中药超微粉有利于改善肠道环境和功能，促进了肠道钙离子的吸收，从而改善了蛋壳质量[15]。有研究表明，中药饲料添加剂可改变蛋黄色泽和蛋壳质量[16]，饲粮添加蒲公英粉可增加蛋鸡产蛋率，改善蛋品质[17]，饲粮添加女贞子粉可改善蛋黄颜色[18]，益母草、女贞子超微粉可显著改善鸡蛋的哈夫单位和蛋黄颜色[3]，蒲公英等中药与酵母硒锗复合制剂可显著增加鸡蛋的蛋壳厚度[19]，这与本试验研究结果一致。
FSH、LH和E2等生殖激素是调控家禽卵泡发育和排卵过程的主要激素[20]。E2作为禽类主要的雌激素，可促进肠道对营养物质的吸收，使血液中钙、磷和蛋白质水平增加，同时刺激输卵管的生长[21]。本研究显示，试验第60天，复方1组蛋鸡血浆E2水平显著增加；试验第120天，复方2组蛋鸡血浆LH水平呈升高趋势，这与本研究中产蛋率升高的结果一致。血浆中生殖激素的变化可能是由于复方中药超微粉激活了下丘脑−垂体−性腺轴，促进了生殖激素的分泌[22]。
蛋鸡的蛋壳在输卵管子宫部形成，钙对蛋鸡的蛋壳形成非常重要[23]；CABP-28K在输卵管子宫部表达，并在蛋壳形成过程中负责运输钙离子[24]，钙泵内的质膜钙转运酶PMCA1和PMCA2负责细胞内钙离子释放到子宫腔。碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase，CA2)将H2CO3脱水成HCO3−，HCO3−转运蛋白SLC26A9将HCO3−释放到子宫腔，HCO3−被CA2进一步脱水为CO32−。Ca2+和CO32−从黏膜组织中释放出来，形成碳酸钙沉淀在蛋壳膜表面[25]。目前关于中药添加剂影响家禽蛋壳形成相关基因表达的报道并不多见。本试验对蛋鸡输卵管子宫部相关基因表达分析发现，试验第60天，复方1组CA2、SLC26A9、PMCA1以及复方2组KCNA1的mRNA相对表达量显著增加；试验第120天，复方2组CDH6、KCNA1和SLC26A9以及复方1组和2组CA2的mRNA相对表达量均显著增加。这说明饲粮添加由益母草、丹参、女贞子和蒲公英组成的复方中药超微粉可上调与蛋壳形成相关基因mRNA的表达量，对蛋品质的改善有一定促进作用。
综上所述，在本试验条件下，饲粮添加由益母草、丹参、女贞子和蒲公英组成的复方中药超微粉可增加蛋鸡的产蛋率和生殖激素水平，上调与蛋壳形成相关基因的表达，进而改善蛋品质，且复方1的效果更佳。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平1)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets
项目 Item 成分 Ingredient w/% 原料 Ingredient 玉米 Corn 62.69 豆粕 Soybean meal 23.88 石粉 Limestone 7.94 豆油 Soybean oil 0.49 蛋氨酸 Met 0.10 预混料 Premix 5.00 合计 Total 100.00 营养成分 Nutrient 粗蛋白质 Crude protein 14.23 粗脂肪 Crude fat 9.66 钙 Ca 3.51 有效磷 Available P 0.34 赖氨酸 Lys 0.71 蛋氨酸 Met 0.37 代谢能/(MJ·kg−1) Metabolic energy 11.25 1) 风干基础；预混料为每千克饲粮提供：维生素A 1.4×105 IU，维生素D3 5×104 IU，维生素E 480 mg，维生素Κ 3 180 mg，维生素B1 63 mg，维生素B2 200 mg，维生素B6 140 mg，维生素B12 0.7 mg，烟酸胺1 000 mg，D−泛酸500 mg，叶酸50 mg，D−生物素5.0 mg，氯化胆碱900 mg，Fe 2.0 g，Cu 0.3 g，Mn 1.8 g，Zn 2.0 g，I 70 mg，Se 9 mg，植酸酶3 000 IU；粗蛋白质和粗脂肪为实测值，其余均为计算值 1) Air-dry basis; The premix provides the following per kg of diets: Vitamin A 1.4×105 IU, Vitamin D3 5×104 IU, Vitamin E 480 mg, Vitamin Κ 3 180 mg, Vitamin B1 63 mg, Vitamin B2 200 mg, Vitamin B6 140 mg, Vitamin B12 0.7 mg, nicotinic acid 1 000 mg, D-pantothenic acid 500 mg, folic acid 50 mg, D-biotin 5.0 mg, choline chloride 900 mg, Fe 2.0 g, Cu 0.3 g, Mn 1.8 g, Zn 2.0 g, I 70 mg, Se 9 mg, and phytase 3000 IU; Crude protein and crude fat are measured values, while the others are calculated values 
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表 2 实时定量PCR引物序列
Table 2 Primer sequences used for RT-PCR
基因名称 Gene name 登录号 Accession number 引物序列(5′→3′) Primer sequence 产物大小/bp Product size β−肌动蛋白 β-actin NM_205518.1 F: TGTTACCAACACCCACACCC R: TCCTGAGTCAAGCGCCAAAA 110 血小板反应蛋白2 THBS2 NM_001001755.1 F: TGTATGTGGCGAAAGGGTCC R: TGATTGGCTCCTCTGGCATC 125 钙黏蛋白6 CDH6 NM_001001758.2 F: TGTGCTGTGTGCAACGACTA R: CAGGCCTGGCAACTCTTTCT 245 钾离子通道 KCNA1 XM_004938075.3 F: TGCGGTACTTCGACCCTTTG R: GCTGGTATTCTCCCTCTGGC 243 碳酸酐酶2 CA2 XM_046910455.1 F: CTGACTACTCCACCACTGCA R: GCTCTGACTTCCCTGCTCTT 182 钙离子转运酶Ⅰ PMCA1 XM_046906440.1 F: GCTGTGGTCTGTTTTCCTGG R: ACAAGATCTGACCACGACGT 197 溶质转运蛋白 SLC26A9 XM_040691172.2 F: GACCTACTGCTCACCACTGT R: GTTGGAGAGGCGCTTTCAAA 231
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表 3 复方中药超微粉对蛋鸡产蛋性能的影响1)
Table 3 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg-laying performance of laying hen
试验期/d Test period 组别 Group 产蛋率/% Laying rate 平均日采食量/g Average daily feed intake 平均蛋质量/g Average egg mass 料蛋比 Feed to egg ratio 1~30 对照 Control 84.26±1.58b 113.06±1.47a 51.71±1.24a 2.61±0.04a 复方1 Compound 1 90.63±0.65a 116.06±1.03a 53.49±1.74a 2.48±0.02b 复方2 Compound 2 86.30±2.12ab 117.48±1.69a 53.74±1.75a 2.55±0.03ab 31~60 对照 Control 84.91±1.32b 105.70±1.20a 49.70±1.83a 2.53±0.07a 复方1 Compound 1 88.31±0.99a 109.23±1.04a 52.05±0.42a 2.37±0.02a 复方2 Compound 2 87.62±0.69ab 108.70±1.61a 52.92±0.29a 2.37±0.03a 61~90 对照 Control 79.36±1.56a 105.50±1.74a 52.28±0.57a 2.36±0.04a 复方1 Compound 1 83.96±2.39a 106.94±1.41a 50.32±0.43a 2.48±0.08a 复方2 Compound 2 85.55±1.81a 107.10±1.58a 51.38±0.58a 2.42±0.06a 91~120 对照 Control 77.18±1.91a 100.52±3.01a 52.15±0.58a 2.50±0.05a 复方1 Compound 1 79.17±2.47a 101.88±2.21a 51.90±0.35a 2.48±0.95a 复方2 Compound 2 83.55±0.98a 100.65±2.33a 52.87±0.33a 2.30±0.44a 1~120 对照 Control 81.62±0.89b 104.58±1.61a 51.32±0.81a 2.50±0.01a 复方1 Compound 1 85.95±1.14a 108.71±0.91a 52.19±0.51a 2.43±0.04a 复方2 Compound 2 85.88±1.00a 108.12±1.68a 52.69±0.58a 2.41±0.04a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same period indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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表 4 复方中药超微粉对蛋鸡蛋品质的影响1)
Table 4 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg quality of laying hen
t/d 组别 Group 蛋形指数 Shape index 蛋壳厚度/mm Eggshell thickness 蛋壳强度/(kg·cm−2) Eggshell strength 蛋白高度/mm Albumen height 哈氏单位 Haugh unit 30 对照组 Control 1.32±0.01a 0.37±0.01a 39.43±1.96a 3.79±0.30a 58.25±3.52a 复方1 Compound 1 1.31±0.01a 0.38±0.01a 44.49±1.71a 4.17±0.31a 65.78±2.82a 复方2 Compound 2 1.31±0.01a 0.38±0.01a 42.81±1.64a 4.27±0.29a 67.23±2.40a 60 对照组 Control 1.31±0.01a 0.37±0.01a 37.68±1.48a 3.80±0.33a 59.02±3.78a 复方1 Compound 1 1.31±0.01a 0.38±0.01a 40.12±1.95a 4.30±0.32a 63.43±3.55a 复方2 Compound 2 1.32±0.01a 0.36±0.01a 42.05±1.82a 3.97±0.26a 60.25±3.25a 90 对照组 Control 1.34±0.01a 0.33±0.01b 30.90±2.15b 3.86±0.25a 60.17±3.16a 复方1 Compound 1 1.30±0.01b 0.37±0.01a 38.93±1.52a 4.41±0.26a 67.84±2.20a 复方2 Compound 2 1.31±0.01b 0.36±0.01a 36.58±1.43a 4.19±0.30a 62.95±2.78a 120 对照组 Control 1.34±0.01a 0.38±0.01a 32.76±1.83a 3.91±0.22a 64.16±2.12a 复方1 Compound 1 1.31±0.01b 0.33±0.01b 35.17±1.84a 4.31±0.20a 65.17±2.13a 复方2 Compound 2 1.32±0.01ab 0.38±0.01a 35.20±1.45a 4.09±0.28a 64.69±2.41a t/d 组别 Group 蛋黄颜色指数 Yolk color index 蛋白相对质量/% Albumen ratio 蛋黄相对质量/% Yolk ratio 蛋壳相对质量/% Eggshell ratio 30 对照组 Control 11.83±0.13a 57.60±0.56a 31.94±0.55a 10.72±0.16a 复方1 Compound 1 11.50±0.12a 56.23±0.33a 32.45±0.39a 10.93±0.13a 复方2 Compound 2 11.71±0.11a 56.59±0.29a 32.37±0.35a 10.94±0.11a 60 对照组 Control 12.27±0.10ab 56.14±0.47a 33.19±0.41a 10.65±0.12b 复方1 Compound 1 12.63±0.16a 55.90±0.33a 32.71±0.33a 11.20±0.13a 复方2 Compound 2 12.08±0.15b 56.65±0.47a 32.34±0.44a 10.91±0.15ab 90 对照组 Control 12.17±0.16b 56.14±0.32a 33.19±0.31a 10.61±0.09b 复方1 Compound 1 12.61±0.16ab 55.70±0.34a 33.04±0.40a 11.04±0.15a 复方2 Compound 2 12.83±0.15a 56.74±0.43a 32.14±0.33a 10.68±0.15ab 120 对照组 Control 12.22±0.09b 56.24±0.50a 33.31±0.42a 10.48±0.11a 复方1 Compound 1 12.54±0.16a 56.05±0.33a 33.39±0.32a 10.49±0.12a 复方2 Compound 2 11.95±0.05b 56.64±0.66a 32.76±0.64a 10.64±0.17a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method)
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表 5 复方中药超微粉对蛋鸡血浆生殖激素水平的影响1)
Table 5 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on plasma reproductive hormone level of laying hen
t/d 组别 Group 促卵泡激素/(IU·L−1) Follicle-stimulating hormone (FSH) 促黄体生成素/(IU·L−1) Luteinizing hormone (LH) 雌二醇/(ng/L−1) Estradiol (E2) 60 对照 Control 18.34±0.35a 17.04±0.29a 401.40±10.37b 复方1 Compound 1 18.07±0.46a 15.78±0.55a 487.05±8.90a 复方2 Compound 2 17.51±0.34a 15.45±0.32a 438.91±18.81b 120 对照 Control 16.79±0.65a 16.75±0.50a 405.59±10.84a 复方1 Compound 1 18.06±0.29a 17.15±0.37a 386.44±10.75a 复方2 Compound 2 17.57±0.20a 17.91±0.36a 417.67±6.78a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method)
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表 6 复方中药超微粉对蛋鸡输卵管子宫部相关基因mRNA表达量的影响1)
Table 6 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on related gene expression in the uterus of hen oviduct
t/d 组别 Group 血小板反应蛋白2 THBS2 钙黏蛋白6 CDH6 钾离子通道1 KCNA1 碳酸酐酶2 CA2 钙离子转运酶I PMCA1 溶质转运蛋白 SLC26A9 60 对照 Control 1.00±0.18a 1.00±0.35a 1.00±0.18b 1.00±0.12b 1.00±0.12b 1.00±0.14b 复方1 Compound 1 0.90±0.09a 1.30±0.33a 1.23±0.22ab 1.64±0.12a 1.77±0.07a 1.58±0.12a 复方2 Compound 2 0.80±0.10a 0.87±0.20a 1.70±0.18a 1.13±0.13ab 1.40±0.38ab 1.16±0.14ab 120 对照 Control 1.00±0.20a 1.00±0.22b 1.00±0.11b 1.00±0.15c 1.00±0.11a 1.00±0.05b 复方1 Compound 1 2.17±0.25a 1.66±0.46ab 0.84±0.09b 1.86±0.17a 0.76±0.15a 0.67±0.32b 复方2 Compound 2 2.30±0.25a 1.99±0.21a 1.86±0.12a 1.66±0.14b 0.70±0.09a 1.99±0.32a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method)
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