Effects of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg production, reproductive hormone, and related gene expression in laying hens
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摘要:目的
研究复方中药超微粉对蛋鸡产蛋性能、生殖激素及相关基因表达的影响。
方法试验选取307日龄的新杨黑羽蛋鸡216只，随机分为3组，每组8个重复，每个重复9只；对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加0.5%丹参Salvia miltiorrhiza+0.25%女贞子Ligustrum lucidum+0.25%蒲公英Taraxacum mongolicum(复方1)、0.3%益母草Leonurus japonicus+0.2%丹参+0.25%女贞子+0.25%蒲公英(复方2)的超微粉，均以质量分数计；预试期7 d，正试期120 d。测定产蛋性能、蛋品质、血浆生殖激素水平，用RT-PCR技术检测蛋品质相关基因表达。
结果与对照组相比，试验1~30、31~60和1~120 d，复方1组产蛋率分别增加7.56%、4.00%和5.31% (P<0.05)；试验1~120 d，复方2组产蛋率增加5.22% (P<0.05)；试验第60天，复方1组血浆雌二醇水平、输卵管PMCA1的mRNA相对表达量分别增加21.45%和77.00%(P < 0.05)，复方2组输卵管 KCNA1的mRNA相对表达量增加70.00% (P < 0.05)；第90天，复方1和2组蛋壳厚度分别增加12.12%和9.09% ( P < 0.05)；第120天，复方1和2组输卵管 CA2的mRNA相对表达量分别增加86.00%和66.00% (P < 0.05)，复方2组输卵管 CDH6、KCNA1和SLC26A9的mRNA相对表达量分别增加99.00%、86.00%和99.00% (P < 0.05)。
结论饲粮添加由益母草、丹参、女贞子和蒲公英组成的复方中药超微粉可增加蛋鸡的产蛋率，改善蛋品质，增加生殖激素水平，上调蛋壳形成相关基因的mRNA表达，且复方1的效果更佳。
Abstract:ObjectiveThis study was aimed to determine the effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg laying performance, reproductive hormone, and related gene expression in laying hens.
MethodA total of 216 Xinyang black-feather laying hens (307-day-old) were selected and randomly divided into three groups with eight replicates in each group and nine in each replicate. The control group was fed the basal diet, and the experimental groups were fed basal diets supplemented with 0.5% Salvia miltiorrhiza (SM) + 0.25% Ligustrum lucidum (LL) + 0.25% Taraxacum mongolicum (TM)(compound 1), and 0.3% Leonurus japonicus (LJ) + 0.2% SM + 0.25% LL + 0.25% TM (compound 2) ultrafine powders, respectively. The pre-trial period was seven days, and the formal trial period was 120 days. Egg production performance, egg quality, and plasma reproductive hormone level were determined. The expressions of genes related to egg quality were detected by RT-PCR technology.
ResultCompared with the control group, during days 1−30, 31−60, and 1−120 of the trial, the egg laying rates of the compound 1 group increased by 7.56%, 4.00%, and 5.31% (P<0.05), respectively, and during 1−120 days the egg laying rate of the compound 2 group increased by 5.22% (P<0.05). On day 60 after treatment the plasma estradiol level and relative expression of oviductPMCA1 mRNA increased by 21.45% and 77.00% (P<0.05), respectively, in the compound 1 group, and the relative expression of oviductKCNA1 mRNA increased by 70.00% (P<0.05) in the compound 2 group. On day 90, the thickness of the eggshells increased by 12.12% and 9.09% (P<0.05), respectively, in the compound 1 and 2 groups. On day 120, the relative expressions of oviductCA2 mRNA increased by 86.00% and 66.00% (P<0.05), respectively, in the compound 1 and 2 groups, and the relative expressions of oviductCDH6,KCNA1 andSLC26A9 mRNA increased by 99.00%, 86.00% and 99.00% (P<0.05), respectively, in the compound 2 group.
ConclusionDietary supplementation with compound Chinese medicine ultrafine powders consisting of LJ, SM, LL, and TM could increase the egg production rate, improve egg quality of laying hen, increase the level of reproductive hormone, and up-regulate mRNA expressions of genes associated with eggshell formation. In addition, compound 1 presents the better effect.
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口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的一种急性、烈性传染病，家养和野生型的猪、牛、羊等偶蹄动物是该病常见的易感动物[1]。该病被国际动物卫生组织(OIE)列为世界上最重要的动物疾病之一[2]。FMD典型的临床症状包括发烧和口腔黏膜、乳部皮肤、蹄叉蹄踵等部位出现不同程度的水泡及烂斑[3]。自Loeffler等[4]在1897年发现FMD以来，全球养殖业便不断受到其影响。该病流行范围广、发病率高、破坏力强，已成为目前世界动物产品贸易最重要的障碍之一[5]。
FMDV属于小RNA病毒科Picornaviridae口疮病毒属Aphthovirus，小而无囊膜，分为7个不同的血清型，即O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia 1[6]，其中，O型是目前全球流行范围最广的血清型[7]。FMDV颗粒由1个二十面体的外壳组成，该外壳包含4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和8个非结构蛋白[8-9]。其中，结构蛋白VP1的第140~160位氨基酸处具有1个突出的环结构，称为G-H环[10]，该环具有的RGD结合位点可与易感细胞表面的整合素受体分子相结合，已被鉴定为是引发机体产生中和抗体的主要免疫原性位点[11-12]。VP1还具有一个天然的优势是其同时存在T细胞表位(第16~44位氨基酸)和B细胞表位(第141~160位氨基酸和第200~213位氨基酸)，这些表位已被证实可被动物机体识别并诱导机体产生良好的免疫反应[13-15]。
近十年来，我国流行的FMDV以A型和O型为主，预防监测和免疫扑杀是我国目前防控FMD的主要手段[16]。疫苗免疫是防控FMD的常见手段，当前预防FMD最有效的商业疫苗是用二乙烯亚胺(Binary ethylenimine，BEI)灭活的疫苗[17]。然而，传统的灭活疫苗存在一些不可避免的缺点，如热稳定性较差、需要冷链运输、免疫持续期短等[18]。随着现代分子生物学和免疫学技术的不断进展，以及全球猪肉贸易的日趋频繁，FMD疫苗已逐渐从灭活疫苗、弱毒疫苗等传统疫苗向合成肽疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗和可饲疫苗等新型疫苗的方向发展，研制新型FMD疫苗逐渐成为当前研究的热点[19]。信号肽对蛋白的分泌有着积极的作用，Stern等[20]研究发现高斯荧光素酶(Gaussia luciferase)信号肽有很强的外源蛋白分泌能力。本研究以猪O型FMDV VP1基因序列为基础，重复串联该片段中的T、B细胞表位基因，并引入高斯荧光素酶信号肽序列，设计合成重组基因RP1，表达包含FMDV抗原表位与结构蛋白VP1的融合蛋白，并将表达后的融合蛋白与佐剂等体积混合制成亚单位疫苗。疫苗免疫小鼠后能有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应，为FMD的防控提供了参考。
1. 材料与方法
1.1 菌株、载体与试验动物
人胚肾上皮细胞(HEK-293T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1细胞)、大肠埃希菌DH5α感受态细胞、表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和辅助质粒PLP1、PLP2、PLP3均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存。
1.2 主要试剂
DMEM高糖培养基、F-12K培养基、0.25%(w)胰酶消化液购自美国Thermo Fisher公司；限制性内切酶EcoR I、BamH I购自宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA连接酶、转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Thermo Fisher公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒等购自美国Omega Bio-Tek公司；鼠源His标签单克隆抗体(MAb)、鼠源GAPDH MAb、HRP标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)、FITC标记山羊抗小鼠IgG等购自上海碧云天生物技术有限公司；FMDV VPI Mab由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存；甘氨酸、甲醇、Tris base、NaCl和KCl等化学试剂购自广州豪凯生物技术有限公司；FMDV灭活疫苗Re-O/MYA98/JSCZ/2013株购自金宇保灵生物药品有限公司；FMDV O型IgG抗体检测试剂盒购自深圳芬德生物技术有限公司。
1.3 重组基因RP1的设计与合成
参照GenBank中登录的猪O型FMDV全基因核苷酸序列(JN998085.1)，筛选获得VP1基因序列；以-GG-、-GGSSGG-作为linker将该片段中的T细胞表位和B细胞表位(表1)串联在VP1片段的首尾两端，同时在N端引入高斯荧光素酶信号肽序列，在C端引入His标签序列，设计合成重组基因RP1(图1)。根据合成的RP1基因全序列设计1对引物RP1-F1/RP1-R1，分别在该引物中引入EcoR I和BamH I酶切位点，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为RP1-F1：5′-CG GAATTCGCTACCATGGGAGTGAAGGTGCT-3′，RP1-R1：5′-CG GGATCCTCAGTGGTGGTGATGGTGGTGAGGGGTCA-3′(下划线处为酶切位点)。
表 1 表位肽序列及位置Table 1. Sequence and position of epitope peptides名称
Name氨基酸位点/aa
Amino acid position氨基酸序列
Amino acid sequenceB1 141~160 LPNVRGDLQVLAQKAARPLP B2 200~213 RHKQKIVAPVKQSL T1 21~40 ETQVQRRHHTDVSFILDRFV T2 16~44 ENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTP ![]()
图 1 重组基因RP1多表位串联模式图Figure 1. Multi-epitope tandem pattern map of recombinant gene RP11.4 重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的构建与鉴定
以人工合成的RP1全基因序列为模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1扩增含有酶切位点的目的基因。扩增参数为98 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。对PCR产物回收纯化后通过双酶切将RP1基因克隆到表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，将经PCR及双酶切鉴定后的重组质粒命名为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1。
1.5 重组慢病毒的制备
按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书操作，将转染试剂与1 000 ng的重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1和适量的辅助质粒PLP1、PLP2、PLP3完全混匀，室温孵育15 min后转染6孔细胞板中的HEK-293T细胞，6 h后更换成含2%(φ)胎牛血清的DMEM培养基，连续培养48 h即获得重组慢病毒HIV-RPI。
1.6 重组细胞CHO-K1-RP1的构建与鉴定
当CHO-K1细胞在直径为6 cm的培养皿中贴壁生长至占60%皿底面积左右的数量时，加入收获的重组慢病毒，并添加24 μg聚凝胺促进病毒吸附。待细胞长满后添加32 μg嘌呤霉素筛选慢病毒是否感染成功。提取筛选后生长状态良好的细胞总RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1 进行PCR扩增，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。另将筛选的重组细胞铺满96孔细胞板，用预冷的PBS缓冲液洗涤后固定细胞。向各孔中加入鼠源His标签MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰200稀释)为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰300稀释)为二抗，进行间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay，IFA)鉴定，观察融合蛋白的表达情况。将鉴定正确的重组细胞命名为CHO-K1-RP1。
1.7 CHO-K1-RP1单克隆细胞株的筛选与鉴定
取适量筛选的重组细胞CHO-K1-RP1计数，采用有限稀释法并按照每孔0.5个细胞的量铺满96孔板，筛选单克隆细胞株。观察各孔细胞的生长状况，弃去没有细胞的孔和存在多个单克隆细胞团的孔，并做好标记。将筛选的单克隆细胞株扩大培养后以鼠源His标签MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰200稀释)为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰300稀释)为二抗进行IFA检测融合蛋白的表达。将表达量较高的单克隆细胞株传至30代，每隔5代收获相同数量的细胞样品，以FMDV VP1 MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)、鼠源GAPDH MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为一抗，再以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为二抗对收集到的细胞样品进行Western blot检测，分析筛选的单克隆细胞株中融合蛋白RP1的稳定表达情况。
1.8 融合蛋白的制备与鉴定
将筛选的单克隆细胞株悬浮驯化培养，取适量悬浮培养的细胞，低速离心后弃上清液，细胞沉淀经PBS缓冲液重新悬浮后通过超声波裂解，4 ℃条件下以最大转速离心，收集上清液，即为获得的融合蛋白样品，将样品置于−80 ℃保存。以鼠源His标签MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)、鼠源GAPDH MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为一抗，再以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为二抗，将制备的蛋白样品及已知浓度的His标签蛋白按照预定顺序进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot检测，并通过ImageJ软件进行灰度值分析，计算融合蛋白的质量浓度。
1.9 重组亚单位疫苗的制备
根据“1.8”计算所得的重组蛋白质量浓度，将表达的重组蛋白稀释为80 µg/mL，并将其与ISA 201 VG佐剂按1︰1的体积比混合乳化，制备终质量浓度为40 µg/mL的重组亚单位疫苗，4 ℃保存备用。
1.10 小鼠免疫及抗体效价的测定
将30只4~6周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分为3组(I~III组)，每组10只。第I组接种制备的重组亚单位疫苗，第II组接种FMD商品化灭活疫苗，第III组接种PBS缓冲液作为对照，每只小鼠的免疫剂量均为200 µL。每次免疫间隔2周，共免疫3次，均采用皮下多点注射方式接种。分别在一次、二次和三次免疫后7 d经尾静脉采血，分离血清，利用ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清特异性抗体。
2. 结果与分析
2.1 重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的构建与鉴定
由图2可知，以构建的重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1为模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1扩增出约1 500 bp的目的条带，与目的基因片段大小相符；双酶切重组质粒后，在约1 500 bp处有一特异性条带，与目的基因大小一致，表明正确构建了重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1。
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图 2 重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的鉴定结果M1：DL2000 DNA marker，M2：DL15000 DNA marker，M3：DL2000 DNA marker，1：EcoR I酶切产物pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1，2：BamH I酶切产物pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1；3：目的基因RP1Figure 2. Identification result of recombinant plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1M1: DL2000 DNA marker, M2: DL15000 DNA marker, M3: DL2000 DNA marker, 1: Digested product of pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1 by EcoR I, 2: Digested product of pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1 by BamH I, 3: Target gene RP12.2 重组细胞CHO-K1-RP1的鉴定
提取重组细胞CHO-K1-RP1的总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，用特异性引物RP1-F1/RP1-R1进行扩增，结果显示在约1 500 bp处有目的条带(图3)，与预期相符。表明在转录水平上检测到重组细胞CHO-K1-RP1中RP1基因的表达。
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图 3 重组细胞CHO-K1-RP1的RT-PCR鉴定结果M：DL2000 DNA marker；1、2：RP1基因；3：空白对照Figure 3. Identification result of recombinant cell CHO-K1-RP1 by RT-PCRM: DL2000 DNA marker; 1, 2: RP1 gene; 3: Blank control2.3 CHO-K1-RP1单克隆细胞株的鉴定
将筛选的CHO-K1-RP1单克隆细胞扩大培养，通过IFA及Western blot鉴定重组基因RP1的表达。IFA结果显示，部分单克隆细胞株可发出绿色荧光，而对照细胞无绿色荧光(图4)；Western blot结果显示，不同代次细胞样品均能在55 kU处观察到特异性条带(图5)。表明筛选获得的部分CHO-K1-RP1单克隆细胞株可稳定表达融合蛋白RP1。
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图 4 单克隆细胞株的间接免疫荧光试验鉴定a~o：部分阳性单克隆细胞系；p：空白对照；标尺=20 μmFigure 4. Indirect immunofluorescence assay identification of monoclonal cell linea−o: Partially positive monoclonal cell lines; p: Blank control; Bar=20 μm![]()
图 5 融合蛋白在不同代次细胞中表达的鉴定CK：空白对照 Blank controlFigure 5. Identification of the expression of fusion protein in different generations of cells2.4 融合蛋白的Western blot鉴定及半定量结果
收集扩大培养的单克隆细胞株样品，通过Western blot进行鉴定，使用ImageJ软件对所得条带进行灰度值分析。结果显示，部分细胞样品在约55 kU处出现特异性条带(图6)，与预期蛋白分子量大小相符；与空白对照细胞相比，不同细胞株融合蛋白的表达量有显著差异(图7)；表明该单克隆细胞株可成功表达融合蛋白RP1。挑选表达量最高的样品，使用ImageJ软件对其条带(图8)进行灰度值分析后测得融合蛋白的质量浓度最高可达110 µg/mL。
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图 6 单克隆细胞株的Western blot 鉴定M：蛋白分子量标准；1~32：不同单克隆细胞株；CK：空白对照Figure 6. Western blot identification of monoclonal cell lineM: Protein molecular weight standard; 1−32: Different monoclonal cell lines; CK: Blank control![]()
图 7 不同单克隆细胞株融合蛋白的相对表达量1~32：不同单克隆细胞株；“*”、“**”和“***”分别表示细胞株和空白对照在 P<0.05、P<0.01 和 P<0.001 水平差异显著 (单因素方差分析)Figure 7. Relative expression levels of fusion protein in different monoclonal cell lines1−32: Different monoclonal cell lines; “*”, “**” and “***” indicate significant differences between the cell line and the blank control at P<0.05, P<0.0l and P<0.001 levels (One-way ANOVA)![]()
图 8 融合蛋白的半定量结果1~4分别表示质量浓度为100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL的标准蛋白样品；5~6为CHO-K1-RP1单克隆细胞株样品Figure 8. Semi-quantitative results of fusion protein1−4: Standard protein samples of 100.0, 50.0, 25.0 and 12.5 μg/mL；5−6: Samples of monoclonal cell line CHO-K1-RP12.5 免疫后小鼠血清中特异性抗体的检测
采用ELISA试剂盒检测免疫后小鼠血清中特异性抗体水平。结果显示，一次免疫后，所有小鼠血清中的特异性抗体水平均较低；二次免疫后，除对照组外，其余各试验组小鼠血清中特异性抗体均出现不同程度的升高(P<0.05)；三次免疫后，除对照组外，其余各试验组小鼠血清中特异性抗体水平均较高(P<0.05)，其中FMD亚单位疫苗组与FMD商品化灭活疫苗组小鼠抗体水平无显著差异(P>0.05)(图9)。表明本研究制备的FMD亚单位疫苗能够有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应。
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图 9 免疫后小鼠血清特异性抗体检测结果相同免疫次数柱子上方的不同小写字母表示不同组间具有显著差异(P<0.05，双因素方差分析)Figure 9. Results of the serum specific antibody titer identification in immunized miceDifferent lowercase letters on the columns of the same immunization time represent significant differences among different groups (P<0.05, two-way ANOVA)3. 讨论与结论
FMD是一种极具传染性的偶蹄类动物病毒病，虽然大多数易感动物可以在感染后幸存下来，但病灶常造成动物群体的生产率低下，严重制约全球养殖业发展[21]。随着国际贸易的日益密切，FMD的防治日趋困难。英国于1892年率先制定了控制FMD的基本程序，包括杀死并销毁所有受感染和接触病原的易感动物，对受影响的场所进行彻底清洁和消毒等[22]。直到19世纪50年代，法国学者Frenkel[23]从在屠宰场收集的牛舌上皮中分离出FMDV并对其进行了体外培养，才使得大规模生产疫苗成为可能。目前，接种疫苗仍然是多数国家和地区防控该病的常见方法，灭活疫苗因免疫程序简单被广泛使用，但我们也要正确认识灭活疫苗存在的一些缺点。因此，研究者们需要开拓创新，研制出安全且高效的FMD新型疫苗，为在世界范围内控制甚至消灭FMD提供新的解决途径。
结构蛋白VP1不仅是病毒粒子识别受体细胞的关键蛋白，还包含多个重要的抗原表位，是研制FMD新型疫苗时的首选蛋白[24]。Cao等[25]研制出不同亚型的含有VP1 G-H环和Th表位的B4疫苗，并将其与Ploy(I︰C)联合免疫动物，结果发现该疫苗可使动物机体获得抵抗多个亚型毒株的交叉保护。高明等[26]设计并合成了FMDV VP1上的优势抗原表位基因串联表达盒，与猪IgG重链恒定区基因在大肠埃希菌中实现共表达，纯化后的蛋白与佐剂混合制成亚单位疫苗，免疫小鼠后能检测到高水平中和抗体。本研究根据近年来我国猪FMD的流行特点，以猪O型FMDV的结构蛋白VP1为基础，重复串联该片段上的优势抗原表位(第16~44、141~160和200~213位氨基酸)基因，以linker进行连接后，人工合成重组基因RP1，以期通过CHO-K1细胞表达获得高免疫原性抗原蛋白。
截至2012年，哺乳动物蛋白表达系统已经成为临床应用上的主要重组蛋白生产系统，生产了市场上将近一半份额的生物制药产品[27]。该系统首选的CHO细胞具有高效的翻译后修饰能力，其产生的糖基化蛋白与人体相容并具有显著的生物活性[28]。另外，CHO细胞具有在生物反应器中生长至高密度的能力，且对病毒的传播具有较低的风险[29]。由疏水性氨基酸构成的信号肽序列具有很强的外源蛋白分泌能力，在蛋白分泌表达中扮演着重要角色[30]。根据已有的报道[20]，我们在设计重组基因RP1序列时引入了高斯荧光素酶信号肽，以期获得高分泌型融合蛋白。但是，只有极少量的RP1蛋白能分泌到细胞上清液中，以至于需要对上清液进行多倍浓缩才能检测到微量的目的蛋白。我们推测信号肽要与目的蛋白相适应才有助于提高外源蛋白的分泌表达水平，因此在进行蛋白分泌表达研究时要综合考虑目的蛋白的理化特性，选择与之适应的信号肽来提高蛋白的分泌水平。本研究表达的融合蛋白RP1可作为FMD亚单位疫苗研制的候选蛋白，在后续的工作中，我们还需进一步优化表达条件以提高蛋白的表达水平和分泌水平。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平1)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets
项目 Item 成分 Ingredient w/% 原料 Ingredient 玉米 Corn 62.69 豆粕 Soybean meal 23.88 石粉 Limestone 7.94 豆油 Soybean oil 0.49 蛋氨酸 Met 0.10 预混料 Premix 5.00 合计 Total 100.00 营养成分 Nutrient 粗蛋白质 Crude protein 14.23 粗脂肪 Crude fat 9.66 钙 Ca 3.51 有效磷 Available P 0.34 赖氨酸 Lys 0.71 蛋氨酸 Met 0.37 代谢能/(MJ·kg−1) Metabolic energy 11.25 1) 风干基础；预混料为每千克饲粮提供：维生素A 1.4×105 IU，维生素D3 5×104 IU，维生素E 480 mg，维生素Κ 3 180 mg，维生素B1 63 mg，维生素B2 200 mg，维生素B6 140 mg，维生素B12 0.7 mg，烟酸胺1 000 mg，D−泛酸500 mg，叶酸50 mg，D−生物素5.0 mg，氯化胆碱900 mg，Fe 2.0 g，Cu 0.3 g，Mn 1.8 g，Zn 2.0 g，I 70 mg，Se 9 mg，植酸酶3 000 IU；粗蛋白质和粗脂肪为实测值，其余均为计算值 1) Air-dry basis; The premix provides the following per kg of diets: Vitamin A 1.4×105 IU, Vitamin D3 5×104 IU, Vitamin E 480 mg, Vitamin Κ 3 180 mg, Vitamin B1 63 mg, Vitamin B2 200 mg, Vitamin B6 140 mg, Vitamin B12 0.7 mg, nicotinic acid 1 000 mg, D-pantothenic acid 500 mg, folic acid 50 mg, D-biotin 5.0 mg, choline chloride 900 mg, Fe 2.0 g, Cu 0.3 g, Mn 1.8 g, Zn 2.0 g, I 70 mg, Se 9 mg, and phytase 3000 IU; Crude protein and crude fat are measured values, while the others are calculated values 
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表 2 实时定量PCR引物序列
Table 2 Primer sequences used for RT-PCR
基因名称 Gene name 登录号 Accession number 引物序列(5′→3′) Primer sequence 产物大小/bp Product size β−肌动蛋白 β-actin NM_205518.1 F: TGTTACCAACACCCACACCC R: TCCTGAGTCAAGCGCCAAAA 110 血小板反应蛋白2 THBS2 NM_001001755.1 F: TGTATGTGGCGAAAGGGTCC R: TGATTGGCTCCTCTGGCATC 125 钙黏蛋白6 CDH6 NM_001001758.2 F: TGTGCTGTGTGCAACGACTA R: CAGGCCTGGCAACTCTTTCT 245 钾离子通道 KCNA1 XM_004938075.3 F: TGCGGTACTTCGACCCTTTG R: GCTGGTATTCTCCCTCTGGC 243 碳酸酐酶2 CA2 XM_046910455.1 F: CTGACTACTCCACCACTGCA R: GCTCTGACTTCCCTGCTCTT 182 钙离子转运酶Ⅰ PMCA1 XM_046906440.1 F: GCTGTGGTCTGTTTTCCTGG R: ACAAGATCTGACCACGACGT 197 溶质转运蛋白 SLC26A9 XM_040691172.2 F: GACCTACTGCTCACCACTGT R: GTTGGAGAGGCGCTTTCAAA 231
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表 3 复方中药超微粉对蛋鸡产蛋性能的影响1)
Table 3 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg-laying performance of laying hen
试验期/d Test period 组别 Group 产蛋率/% Laying rate 平均日采食量/g Average daily feed intake 平均蛋质量/g Average egg mass 料蛋比 Feed to egg ratio 1~30 对照 Control 84.26±1.58b 113.06±1.47a 51.71±1.24a 2.61±0.04a 复方1 Compound 1 90.63±0.65a 116.06±1.03a 53.49±1.74a 2.48±0.02b 复方2 Compound 2 86.30±2.12ab 117.48±1.69a 53.74±1.75a 2.55±0.03ab 31~60 对照 Control 84.91±1.32b 105.70±1.20a 49.70±1.83a 2.53±0.07a 复方1 Compound 1 88.31±0.99a 109.23±1.04a 52.05±0.42a 2.37±0.02a 复方2 Compound 2 87.62±0.69ab 108.70±1.61a 52.92±0.29a 2.37±0.03a 61~90 对照 Control 79.36±1.56a 105.50±1.74a 52.28±0.57a 2.36±0.04a 复方1 Compound 1 83.96±2.39a 106.94±1.41a 50.32±0.43a 2.48±0.08a 复方2 Compound 2 85.55±1.81a 107.10±1.58a 51.38±0.58a 2.42±0.06a 91~120 对照 Control 77.18±1.91a 100.52±3.01a 52.15±0.58a 2.50±0.05a 复方1 Compound 1 79.17±2.47a 101.88±2.21a 51.90±0.35a 2.48±0.95a 复方2 Compound 2 83.55±0.98a 100.65±2.33a 52.87±0.33a 2.30±0.44a 1~120 对照 Control 81.62±0.89b 104.58±1.61a 51.32±0.81a 2.50±0.01a 复方1 Compound 1 85.95±1.14a 108.71±0.91a 52.19±0.51a 2.43±0.04a 复方2 Compound 2 85.88±1.00a 108.12±1.68a 52.69±0.58a 2.41±0.04a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same period indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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表 4 复方中药超微粉对蛋鸡蛋品质的影响1)
Table 4 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on egg quality of laying hen
t/d 组别 Group 蛋形指数 Shape index 蛋壳厚度/mm Eggshell thickness 蛋壳强度/(kg·cm−2) Eggshell strength 蛋白高度/mm Albumen height 哈氏单位 Haugh unit 30 对照组 Control 1.32±0.01a 0.37±0.01a 39.43±1.96a 3.79±0.30a 58.25±3.52a 复方1 Compound 1 1.31±0.01a 0.38±0.01a 44.49±1.71a 4.17±0.31a 65.78±2.82a 复方2 Compound 2 1.31±0.01a 0.38±0.01a 42.81±1.64a 4.27±0.29a 67.23±2.40a 60 对照组 Control 1.31±0.01a 0.37±0.01a 37.68±1.48a 3.80±0.33a 59.02±3.78a 复方1 Compound 1 1.31±0.01a 0.38±0.01a 40.12±1.95a 4.30±0.32a 63.43±3.55a 复方2 Compound 2 1.32±0.01a 0.36±0.01a 42.05±1.82a 3.97±0.26a 60.25±3.25a 90 对照组 Control 1.34±0.01a 0.33±0.01b 30.90±2.15b 3.86±0.25a 60.17±3.16a 复方1 Compound 1 1.30±0.01b 0.37±0.01a 38.93±1.52a 4.41±0.26a 67.84±2.20a 复方2 Compound 2 1.31±0.01b 0.36±0.01a 36.58±1.43a 4.19±0.30a 62.95±2.78a 120 对照组 Control 1.34±0.01a 0.38±0.01a 32.76±1.83a 3.91±0.22a 64.16±2.12a 复方1 Compound 1 1.31±0.01b 0.33±0.01b 35.17±1.84a 4.31±0.20a 65.17±2.13a 复方2 Compound 2 1.32±0.01ab 0.38±0.01a 35.20±1.45a 4.09±0.28a 64.69±2.41a t/d 组别 Group 蛋黄颜色指数 Yolk color index 蛋白相对质量/% Albumen ratio 蛋黄相对质量/% Yolk ratio 蛋壳相对质量/% Eggshell ratio 30 对照组 Control 11.83±0.13a 57.60±0.56a 31.94±0.55a 10.72±0.16a 复方1 Compound 1 11.50±0.12a 56.23±0.33a 32.45±0.39a 10.93±0.13a 复方2 Compound 2 11.71±0.11a 56.59±0.29a 32.37±0.35a 10.94±0.11a 60 对照组 Control 12.27±0.10ab 56.14±0.47a 33.19±0.41a 10.65±0.12b 复方1 Compound 1 12.63±0.16a 55.90±0.33a 32.71±0.33a 11.20±0.13a 复方2 Compound 2 12.08±0.15b 56.65±0.47a 32.34±0.44a 10.91±0.15ab 90 对照组 Control 12.17±0.16b 56.14±0.32a 33.19±0.31a 10.61±0.09b 复方1 Compound 1 12.61±0.16ab 55.70±0.34a 33.04±0.40a 11.04±0.15a 复方2 Compound 2 12.83±0.15a 56.74±0.43a 32.14±0.33a 10.68±0.15ab 120 对照组 Control 12.22±0.09b 56.24±0.50a 33.31±0.42a 10.48±0.11a 复方1 Compound 1 12.54±0.16a 56.05±0.33a 33.39±0.32a 10.49±0.12a 复方2 Compound 2 11.95±0.05b 56.64±0.66a 32.76±0.64a 10.64±0.17a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method)
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表 5 复方中药超微粉对蛋鸡血浆生殖激素水平的影响1)
Table 5 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on plasma reproductive hormone level of laying hen
t/d 组别 Group 促卵泡激素/(IU·L−1) Follicle-stimulating hormone (FSH) 促黄体生成素/(IU·L−1) Luteinizing hormone (LH) 雌二醇/(ng/L−1) Estradiol (E2) 60 对照 Control 18.34±0.35a 17.04±0.29a 401.40±10.37b 复方1 Compound 1 18.07±0.46a 15.78±0.55a 487.05±8.90a 复方2 Compound 2 17.51±0.34a 15.45±0.32a 438.91±18.81b 120 对照 Control 16.79±0.65a 16.75±0.50a 405.59±10.84a 复方1 Compound 1 18.06±0.29a 17.15±0.37a 386.44±10.75a 复方2 Compound 2 17.57±0.20a 17.91±0.36a 417.67±6.78a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method)
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表 6 复方中药超微粉对蛋鸡输卵管子宫部相关基因mRNA表达量的影响1)
Table 6 Effect of compound Chinese medicine ultrafine powders on related gene expression in the uterus of hen oviduct
t/d 组别 Group 血小板反应蛋白2 THBS2 钙黏蛋白6 CDH6 钾离子通道1 KCNA1 碳酸酐酶2 CA2 钙离子转运酶I PMCA1 溶质转运蛋白 SLC26A9 60 对照 Control 1.00±0.18a 1.00±0.35a 1.00±0.18b 1.00±0.12b 1.00±0.12b 1.00±0.14b 复方1 Compound 1 0.90±0.09a 1.30±0.33a 1.23±0.22ab 1.64±0.12a 1.77±0.07a 1.58±0.12a 复方2 Compound 2 0.80±0.10a 0.87±0.20a 1.70±0.18a 1.13±0.13ab 1.40±0.38ab 1.16±0.14ab 120 对照 Control 1.00±0.20a 1.00±0.22b 1.00±0.11b 1.00±0.15c 1.00±0.11a 1.00±0.05b 复方1 Compound 1 2.17±0.25a 1.66±0.46ab 0.84±0.09b 1.86±0.17a 0.76±0.15a 0.67±0.32b 复方2 Compound 2 2.30±0.25a 1.99±0.21a 1.86±0.12a 1.66±0.14b 0.70±0.09a 1.99±0.32a 1) 相同时期同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) Different lowercase letters in the same column of the same time indicate significant differences(P<0.05，Duncan’s method)
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