Design and experiment of adjustable seedling-feeding device for vegetable transplanting machine
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摘要:目的
为扩大移栽机适用性，实现对多种规格蔬菜穴盘苗的自动取喂苗作业，本文设计了一款蔬菜移栽机可调式喂苗装置。
方法设计了带有可调节取喂苗爪的取喂苗臂，优化了喂苗爪的相关参数，并进行了运动学分析。通过调节取喂苗臂上的取喂苗爪数量及间距，选择不同的PLC控制程序，可以配套使用不同穴孔数的穴盘。通过对取喂苗工作过程分析，综合考虑影响喂苗成功率的关键性因素，以苗坨含水率、穴盘苗苗高、苗针入土深度为试验参数，选取72、105、128穴规格的生菜穴盘苗为试验对象，进行单因素试验和多因素正交试验，探究各因素对喂苗成功率的影响。
结果当穴盘苗基质含水率(w)为40%、苗高为50 mm、入土深度为38 mm时，可调式喂苗装置的喂苗成功率最高，72、105、128穴生菜穴盘的喂苗成功率分别为95.83%、96.19%和96.48%。
结论可调式喂苗装置设计符合蔬菜移栽机取喂苗的技术要求，移栽效果较好，可为通用全自动蔬菜移栽机的研制与开发提供参考。
Abstract:ObjectiveIn order to expand the applicability of transplanter and realize the automatic feeding of plug seedlings of various specifications of vegetables, this paper designs a universal automatic seedling-feeding device for vegetable transplanting machine.
MethodThe seedling-feeding arm with an adjustable feeding claw was designed, the key parameters were optimized and kinematic analysis was performed. Plug trays with different number of holes could be used by adjusting the number and distance of feeding claws on the seedling-feeding arm and choosing different PLC control programs. The key factors affecting the success rate of seedling feeding were comprehensively considered by analyzing the working process of seedling feeding. Taking the water content of the plug, the height of plug seedling, and the depth of seedling needle into soil as the test parameters, the plug seedlings of lettuce in 72-, 105- and 128-hole plug as the test objects, single factor experiment and multi-factor orthogonal experiment were carried out to explore the effect of different factor on the success rate of seedling feeding.
ResultThe test results showed that when the water content of plug seedling substrate was 40%, seedling height was 50 mm, and the depth of seedling needle into soil was 38 mm, the success rates of seedling feeding for adjustable seedling feeding device were the highest, and the seedling-feeding success rates of lettuce in 72-, 105- and 128-hole plug trays were 95.83%, 96.19% and 96.48%, respectively.
ConclusionThe design of adjustable seedling-feeding device meets the technical requirements of vegetable transplanting machine for feeding seedlings, and the transplanting effect is good, which can provide a reference for research and development of the universal automatic vegetable transplanting machine.
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Keywords:
- Vegetable /
- Plug seedling /
- Transplanting machine /
- Adjustable feeding claw /
- Orthogonal test
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李斯特菌属Listeria是一类低G+C含量的革兰氏阳性菌，其兼性厌氧，不形成芽孢，无荚膜。狭义上的李斯特菌属包括7个种：单增李斯特菌L. monocytogenes、绵羊李斯特菌L. ivanovii、威尔斯李斯特菌L. welshimeri、格氏李斯特菌L. grayi、默氏李斯特菌L. murrayi、西尔李斯特菌L. seeligeri以及英诺克李斯特菌L. innocua[1]。李斯特菌是机会性病原体，菌株之间的致病趋向性存在差异。其中公认的致病李斯特菌只有2种，即单增李斯特菌和绵羊李斯特菌，前者致病性最强，可导致人和动物患病，而后者仅能导致动物患病。其余的李斯特菌都是营自由生活的腐生性细菌，尽管如此，偶尔仍有非单增李斯特菌在人类的临床病例中被发现，但通常认为它们是非致病菌[2]。单增李斯特菌是危害食品行业和公共卫生安全的一种重要人兽共患致病菌，能引起人和动物患李斯特菌病。其临床表现为胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等，主要发生于孕妇、新生儿、老年人以及患有潜在疾病的免疫功能低下或虚弱的成年人等高危人群中[3]。人们因摄入被单增李斯特菌污染的食物而患病，历史上曾有多起因单增李斯特菌引起的食源性疾病暴发的记录，间接及直接造成巨大的经济损失，并对公共卫生安全形成严重的威胁[4]。相比起其他食源性病原菌如大肠埃希菌、沙门氏菌等，单增李斯特菌拥有更高的致病率和病死率，一些发达国家已将李斯特菌病定位为法定传染病[5]。我国也于2014年开始实施单增李斯特菌在食品中的限量检测标准，并于2021年对李斯特菌在食品中的检测指标和检测限量进行了进一步的调整[6-7]。
目前，对李斯特菌属的研究多集中在单增李斯特菌上。在感染人体后，单增李斯特菌能跨越人体的肠道、血脑和胎盘屏障，对机体造成大范围感染，在多种细胞中存活、繁殖和传播[8]。单增李斯特菌的强致病力主要来自于它基因组上9 kb的毒力岛(LPI-1)，在宿主细胞内生命周期关键步骤所需的6个毒力因子(prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB)都聚集这个毒力岛中，控制单增李斯特菌对宿主细胞的细胞黏附、免疫逃逸、胞内侵染和胞间迁移等功能[9]。除此以外，单增李斯特菌LIP-2内化素岛基因(InlA、InlB、InlC和InlH)所编码的内化素，帮助它侵入非吞噬细胞，其包含的其他内化素蛋白也在这一过程中发挥重要的作用，但是除了InlA、InlB、InlC、InlP和InlK外，大部分的功能尚不清楚[8]。单增李斯特菌其他的毒力因子还包括细胞壁水解酶(p60)、酰胺酶(Ami)、纤连蛋白结合蛋白A(FbpA)、自溶素(Auto)等，这些毒力因子在单增李斯特菌生存和侵染宿主过程中发挥重要的作用。目前，随着分子生物学技术的发展，单增李斯特菌的主要毒力因子的功能已经研究得较为透彻，一些新的毒力因子也陆续被发现。
对单增李斯特菌除了在毒力因子上进行了广泛的挖掘外，在其与宿主的互作上也开展了深入的研究。据报道，单增李斯特菌通过其膜上的内化素(主要为InlA和InlB)与宿主细胞膜受体E−钙黏蛋白结合，诱导宿主细胞膜骨架发生重排而导致其被内化[10]。宿主细胞在接触单增李斯特菌时，也会立即采取相应的免疫措施，例如宿主中的模式识别受体(Toll样和NOD等受体)将识别信号传递至胞内，诱导细胞产生一系列的炎性因子，以激活多种细胞免疫的抗菌作用[11]。此外，对于侵入的细菌宿主细胞还可以将其限制在液泡中，以阻止其在胞质中复制。随后，这些液泡的pH降低，活性增强，并与溶酶体融合以杀灭侵入的细菌[12]。然而，单增李斯特菌发展出较为完善的免疫逃逸策略以应对宿主中上述的免疫机制。侵入细胞后，单增李斯特菌调节自身的代谢水平以防宿主的胞内识别[13]，并窃取细胞营养。而被液泡限制的菌体则通过其毒力因子plcA、plcB和hly介导其从液泡的逃逸[13]。从液泡进入胞质的单增李斯特菌，还可以利用这些毒力因子避免自噬识别、自噬体的捕获和降解[9]。此外，单增李斯特菌还可以影响宿主细胞的细胞器功能、干扰染色质调控来操纵宿主转录、诱导宿主蛋白翻译后修饰等，以利于其胞内生存[14-17]。最后，单增李斯特菌通过毒力因子ActA促进其胞内运动并扩散到邻近细胞，随后重复上述侵染过程[18]。
近几十年来，随着各种测序技术的发展以及组学工具的应用，单增李斯特菌毒力因子的功能及其与宿主免疫的互作机制已获得较为详尽的阐释[19]。然而，由于李斯特菌属中其他菌种对人的低致病性，导致分子生物学研究技术在这些细菌中的应用较少，特别是其与宿主免疫互作机制鲜有详细解析。此外，李斯特菌与宿主免疫互作机制的研究大都选择具有适应性免疫的个体作为模型，而缺少仅依靠先天免疫系统的个体防御单增李斯特菌感染的研究报道。果蝇作为模式生物，拥有一套相对简单但高度保守的先天免疫反应机制，缺乏适应性免疫系统[20]，与哺乳动物的先天免疫系统有许多相似之处，被广泛应用于研究先天免疫和病原−宿主互作。本研究选择果蝇S2细胞作为感染模型，分别以单增李斯特菌、格氏李斯特菌以及威尔斯李斯特菌侵染后，进行转录组测序。通过比较转录组分析宿主细胞被不同李斯特菌侵染后的情况，以揭示李斯特菌属细菌在侵入、定植、生存和传播中所使用的精妙策略，以及宿主对李斯特菌的免疫防御方法。此外，这一研究还可以为李斯特菌病的预防和治疗提供新的靶点。最后，由于李斯特菌属的各个种可能来自于同一个携带有完整毒力岛的祖先，通过比较致病性和非致病性李斯特菌侵染后宿主转录组的差别，将有助于发现它们致病的差异机理、挖掘宿主的抵御机制。
1. 材料与方法
1.1 试验菌株及细胞
单增李斯特菌(ATCC，19116)、格氏李斯特菌(ATCC，25400)和威尔斯李斯特菌(ATCC，43548)均由上海海洋大学惠赠。果蝇S2细胞由中国科学院上海植物生理生态研究所惠赠。
1.2 菌株及细胞的培养
李斯特菌经平板划线培养后，接种于李斯特菌培养基(HB4160，海博生物技术有限公司)中进一步培养和活化，培养温度为37 ℃。果蝇S2细胞在胎牛血清(FBS500-S，AusGeneX，澳大利亚)体积分数为5%的Insect SIM SF培养基(MSF1-1，信和生物公司)中培养，培养温度为28 ℃。
1.3 李斯特菌侵染果蝇S2细胞
将果蝇S2细胞铺至6孔板中培养，当细胞密度达到80%~95%后，每孔细胞添加水溶性胆固醇(
134428 ，BIOBERRY)至终浓度50 nmol/L，然后在28 ℃培养箱中孵育30 min。对照组S2细胞经水溶性胆固醇处理后，不添加李斯特菌悬液，其他处理与试验组相同。试验组处理：S2细胞经水溶性胆固醇处理后，向每孔细胞加入李斯特菌悬液(每个细胞约20个细菌)，然后在28 ℃培养箱中孵育1.5 h。随后，每个培养孔的细胞以1 mL PBS缓冲液(pH=7.4)润洗2次，再向各孔补充含100 μmol/L CuSO4、10 μg/mL庆大霉素及体积分数为5%胎牛血清的Insect SIM SF培养基。继续培养3 h后，分别收集对照组和各处理组的S2细胞进行后续试验。
1.4 RNA抽提及转录组测序
使用TRlzol试剂分别抽提对照组、单增李斯特菌侵染组、格氏李斯特菌侵染组和威尔斯李斯特菌侵染组果蝇S2细胞的总RNA。每个样品总RNA模板的浓度使用2100 Bioanalyze(Agilent Technologies，美国)进行定量，并通过琼脂糖凝胶电泳来确定其完整性。然后，使用Illumina Novaseq 6000对检验合格的总RNA样本进行测序，并将其用于文库的制备。测序结果使用fastp 0.19.5软件(https://github.com/OpenGene/fastp)对原始测序数据进行质量评估和控制。随后，使用HISAT2软件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)将质控后的数据与参考基因组比对，获得用于后续转录本组装、表达量计算等的Mapped data(reads)，同时使用分析R包RSeQC-2.3.6(https://rseqc.sourceforge.net/)对比对结果进行质量评估。再基于所选参考基因组序列，使用StringTie软件(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)对Mapped reads进行拼接，并使用gffcompare软件(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml)将其与原有的基因组注释信息比较，发掘该物种的新转录本和新基因。接着，将基因和转录本与六大数据库(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)进行比对，以获得基因和转录本的全面注释信息，同时使用BLAST2GO 2.5(https://www.blast2go.com/)与GO数据库进行序列比对，以及使用KOBAS 2.1.1(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)获得KEGG Orthology结果。最后，利用表达定量软件RSEM(http://deweylab.github.io/RSEM/)并以TPM为定量指标分别对基因和转录本的表达水平进行定量分析，并使用DESeq2 1.24.0、DEGseq 1.38.0、edgeR 3.24.3、Limma 3.38.3和NOIseq 2.18.0(https://www.bioconductor.org/packages/stats/index.html)分析软件或R包进行基因差异表达分析。
1.5 实时定量PCR检测
转录组中差异基因的验证：使用TRIzol法分别提取对照组与试验组果蝇S2细胞的总RNA，然后参照PrimeScriptTM RT反转录试剂盒(RR047A，Takara，日本)说明书的操作合成cDNA。随后对5个Toll和Imd通路相关的抗菌肽基因利用相对定量qPCR技术进行验证，以果蝇Dmrp49基因作为内参基因。
李斯特菌在果蝇S2细胞中增殖的检测：用基因组提取试剂盒(D3129-01，Magen)提取被李斯特菌侵染1~6 h后的果蝇S2细胞的总基因组。以果蝇Dmrp49基因作为内参基因，以本研究中的3种李斯特菌各自的特异性基因LMHG421741.1(Putative oxidoreductase)、LGAY643839.1(Species-Specific Oxidoreductase-Coding)和LWAY445081.1(ScrA)作为3种李斯特菌的检测靶基因，用相对定量qPCR技术分别定量单增李斯特菌、格氏李斯特菌及威尔斯李斯特菌在果蝇S2细胞中的增殖情况。
参考NCBI的果蝇及3种李斯特菌相关基因序列，并利用Oligo7引物设计软件进行引物设计(表1)。
表 1 qRT-PCR检测基因引物Table 1. Primers for qRT-PCR detection基因
Gene正向引物序列(5′→3′)
Forward primer sequence反向引物序列(5′→3′)
Reverse primer sequence产物长度/bp
Product lengthPutative oxidoreductase GGATAAAGGCATTATTGAACGT CAACTACTGGGTGCGGGAT 227 Species-specific
Oxidoreductase-codingAACTCCGTCCATCCATCACC TCGTCCGAGGCTAGGAATAAG 173 ScrA ACCACCAAGACAAGCAGTTAGA CATGTAGAAATGATTGCCCAAA 237 DmRp49 GACAGTATCTGATGCCCAACA CTTCTTGGAGGAGACGCCGT 170 DmAttD AATAACGCCGCTCTGAATG ATTGAGTCCTCCGCCAAA 75 DmDptA ACTGAATGGAGGATATGG AATCTGTAGGTGTAGGTG 90 DmDef ATGAAGTTCTTCGTTCTC CATGATCCTCTGGAATTG 100 DmDptB TTCACCGCTAGTCTTCTA GGGATCAGGATAGGGATAA 75 DmDro TCCTGCTGCTTGCTTGCG ATGGGTGGTGGCCTGATGG 163 DmDrs ATGATGCAGATCAAGTAC AGGGACCCTTGTATCTTC 109 DmMtk TACATCAGTGCTGGCAGAG TTGGTTGGTTAGGATTGAAGG 83 1.6 数据分析
本研究涉及的所有试验组均进行了至少3次生物学重复，并以其中3次重复试验的数据进行统计分析。通过数据分析软件Microsoft Office Excel 2016对数据整理统计后，使用科研绘图软件GraphPad Prism 9进行科研绘图。涉及显著性分析的数据，均进行正态分布检验及方差齐性检验，在满足正态分布及方差齐性的前提下，对各试验组的数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并采用LSD法进行数据间的两两比较。
2. 结果与分析
2.1 李斯特菌在果蝇S2细胞内的增殖情况
利用qRT-PCR技术检测单增李斯特菌、格氏李斯特菌及威尔斯李斯特菌在果蝇S2细胞中1~6 h的增殖情况。结果显示，随着侵染时间的延长，这3种李斯特菌在S2细胞中的基因拷贝数呈现出递增的趋势，并在5~6 h达到峰值，其中单增李斯特菌在3 h达到峰值(图1)。为了进一步探究这3种李斯特菌侵染S2细胞初期的宿主防御及病原侵染机制，我们在它们分别侵染S2细胞3 h后，对S2细胞进行了转录组测序。
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图 1 单增李斯特菌、格氏李斯特菌和威尔斯李斯特菌侵染果蝇S2细胞后的增殖情况各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著（P<0.05，LSD法）。Figure 1. The proliferation of Listeria monocytogenes, L. grayi and L. welshimeri after their infection in Drosophila S2 cellsIn each figure, different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, LSD method).2.2 李斯特菌侵染果蝇S2细胞后的转录组测序数据质控与评估
转录组质控数据显示，对照组、单增李斯特菌浸染组、格氏李斯特菌浸染组和威尔斯李斯特菌浸染组的原始测序数据分别产生了
59125671 、67968295 、63763563 和57027880 条。测序碱基平均错误率都位于0.1%以下。对照组和浸染组的转录组测序序列GC含量都在51%左右。测序质量在99%(Q20)和99.9%(Q30)以上的碱基占总碱基的百分比均在80%以上。以上结果反映，转录组测序数据质量较高并具有较强的可靠性，可进行下一步的序列比对、转录本组装和表达量估计。2.3 李斯特菌侵染果蝇S2细胞的转录组变化情况
3种李斯特菌分别侵染果蝇S2细胞3 h后的转录组测序结果(图2)显示，相比对照组，单增李斯特菌侵染组共产生155个差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)(上/下调倍数≥2)，其中24个上调、131个下调；格氏李斯特菌侵染组产生54个DEGs，其中36个上调、18个下调；威尔斯李斯特菌侵染组产生86个DEGs，其中13个上调、73个下调。
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图 2 单增李斯特菌(LM)、格氏李斯特菌(LG)和威尔斯李斯特菌(LW)侵染3 h后果蝇S2细胞中差异表达的基因数量Figure 2. Number of DEGs in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes (LM), L. grayi (LG) and L. welshimeri (LW) infection for 3 h对这3个组别产生的DEGs做韦恩图分析。结果显示，单增李斯特菌侵染组有104个特有的DEGs(17个上调，87个下调)，格氏李斯特菌侵染组有28个特有的DEGs(24个上调，4个下调)，威尔斯李斯特菌侵染组有33个特有的DEGs(3个上调，30个下调)。而这3组共有18个DEGs(5个上调，13个下调)，表明这3种李斯特菌侵染S2细胞引起不同的转录水平变化，暗示宿主与这些李斯特菌的互作模式存在一定的差异。
2.4 不同李斯特菌侵染后果蝇S2细胞中DEGs的鉴定与功能注释
分别对上述不同李斯特菌侵染组所产生的DEGs进行GO注释分析。结果显示，在单增李斯特菌侵染组，产生了特有的104个DEGs，其中上调的17个DEGs中有6个被注释到，涉及9个GO条目，主要包括细胞膜部分、细胞膜和代谢过程等，其中细胞膜和细胞膜部分条目富集的基因较多，分别占李斯特菌侵染组产生特有的DEGs总数的2.88%以上；下调的87个DEGs有59个被注释到，共涉及29个GO条目，主要包括催化活性、结合、转运蛋白活性、细胞膜部分、细胞膜、细胞部分、细胞、细胞过程、代谢过程、单一生物过程、定位等，其中也是细胞膜部分和细胞膜条目富集的基因最多，分别占单增李斯特菌侵染组产生特有的DEGs总数的30%以上(图3)。
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图 3 单增李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有DEGs的GO注释分析Figure 3. GO annotation of unique DEGs in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes infection在格氏李斯特菌侵染组特有的28个DEGs中，上调的24个DEGs中有16个被注释到，涉及10个GO条目，主要包括催化活性、结合、细胞外区域、免疫系统过程、对刺激的反应、代谢过程等，其中细胞外区域和对刺激的反应条目注释的基因最多，分别占格氏李斯特菌侵染组产生特有的DEGs总数的25%及以上；下调的4个DEGs有1个被注释到5个GO条目，包括催化活性、结合、细胞过程、代谢过程以及单一生物体过程(图4)。
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图 4 格氏李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有DEGs的GO注释分析Figure 4. GO annotation of unique DEGs in Drosophila S2 cells after Listeria grayi infection在威尔斯李斯特菌侵染组特有的33个DEGs中，上调的3个DEGs中有1个被注释到3个GO条目，包括催化活性、细胞过程和代谢过程；下调的30个DEGs中有17个被注释到，涉及19个GO条目，主要包括催化活性、结合、细胞膜部分、细胞膜、代谢过程、单一生物体过程等，其中催化活性、结合、细胞膜部分、细胞膜和代谢过程条目所注释到DEGs的数量居于前5位，分别占威尔斯李斯特菌侵染组产生特有的DEGs总数的18%以上(图5)。
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图 5 威尔斯李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有DEGs的GO注释分析Figure 5. GO annotation of unique DEGs in Drosophila S2 cells after Listeria welshimeri infection这3个不同李斯特菌侵染组产生18个共有的DEGs，上调的5个DEGs中有2个被注释到，涉及6个GO条目，包括催化活性、结合、代谢过程、单一生物体过程、免疫系统过程和对刺激的反应，其中催化活性、结合以及代谢过程条目注释的基因最多，分别占3个不同李斯特菌侵染组共有DEGs总数的10%以上；下调的15个DEGs有8个被注释到，涉及19个GO条目，包括转运蛋白活性、催化活性、结合、细胞膜部分、细胞膜、细胞部分、细胞器部分、细胞器、细胞、细胞过程、定位、代谢过程和单一生物体过程等，其中催化活性、细胞过程、代谢过程和单一生物体过程条目注释的基因最多，分别占3个不同李斯特菌侵染组共有DEGs总数的20%以上(图6)。
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图 6 单增李斯特菌、格氏李斯特菌以及威尔斯李斯特菌侵染后果蝇S2细胞共有DEGs的GO注释分析Figure 6. GO annotation of common DEGs in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes, L. grayi and L. welshimeri infection2.5 李斯特菌侵染果蝇S2细胞DEGs的富集分析
为了更深入探究这3种李斯特菌与S2细胞的免疫互作机制，对不同李斯特菌侵染组所产生的DEGs进行KEGG功能富集分析。结果显示，单增李斯特菌侵染组产生特有的104个DEGs，其中上调的17个DEGs中有2个被注释到8个KEGG通路，除了MAPK信号传导路径——果蝇和流体剪切应力和动脉粥样硬化的KEGG通路没有被显著注释外(P > 0.05)，其他6个通路均被显著注释(P < 0.05)(表2)；而下调的87个DEGs中有14个被注释到39个KEGG通路，除了Hippo信号传导途径——多种物种、酪氨酸代谢以及致心律失常的右心室型心肌病等36个KEGG通路没有被显著注释外，其他3个通路均被显著注释(表3)。格氏李斯特菌侵染组产生特有的28个DEGs，其中上调的24个DEGs中有7个被注释到6个KEGG通路，除了血小板激活、焦点黏附以及PI3K-Akt信号传导途径的KEGG通路没有被显著注释外，其他3个通路均被显著注释(表4)；而下调的4个DEGs有1个被显著注释到7个KEGG通路(表5)。威尔斯李斯特菌侵染组产生特有的33个DEGs，其中上调的3个DEGs中的DmCR45175被注释到甘醛酸和二羧酸代谢的KEGG通路，而下调的30个DEGs中有8个被注释到22个KEGG通路，除了其他类型的O−糖原生物合成、色氨酸代谢以及Notch信号传导途径等11个KEGG通路没有被显著注释外，其他11个通路均被显著注释(表6)。这3个李斯特菌侵染组共有18个DEGs，其中上调的5个DEGs中的DmDptB被注释到Toll和Imd信号的KEGG通路，而下调的13个DEGs有7个则被注释到22个KEGG通路，除了NOD样受体信号传导途径、药物代谢——其他酶以及突触囊泡循环等15个KEGG通路没有被显著注释外，其他7个通路均被显著注释(表7)。
表 2 单增李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有上调基因的KEGG富集分析Table 2. KEGG enrichment of unique up-regulated genes in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes infection通路
PathwayP 所含基因
Contained gene背腹轴形成 Dorso-ventral axis formation 0.019 aos 铂类药物抗药性 Platinum drug resistance 0.041 GstE9 化学诱发癌变 Chemical carcinogenesis 0.042 GstE9 药物代谢−细胞色素 P450 Drug metabolism-cytochrome P450 0.042 GstE9 细胞色素 P450代谢异物质 Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 0.042 GstE9 谷胱甘肽代谢 Glutathione metabolism 0.049 GstE9 表 3 单增李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有下调基因的KEGG富集分析Table 3. KEGG enrichment of unique down-regulated genes in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes infection通路
PathwayP 所含基因
Contained gene苯丙氨酸代谢 Phenylalanine metabolism 0.042 CG11796 泛醌和其他萜类醌的生物合成 Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis 0.047 CG11796 胰液分泌 Pancreatic secretion 0.050 iotaTry, RyR 表 4 格氏李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有上调基因的KEGG富集分析Table 4. KEGG enrichment of unique up-regulated genes in Drosophila S2 cells after Listeria grayi infection通路
PathwayP 所含基因
Contained geneToll和Imd信号传导途径 Toll and Imd signaling pathway 0.000 Def, Drs, CecC, CecB, CecA1, pirk 补体和凝血级联反应 Complement and coagulation cascades 0.003 Hml 细胞外基质−受体相互作用 ECM-receptor interaction 0.016 Hml 表 5 格氏李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有下调基因的KEGG富集分析Table 5. KEGG enrichment of unique down-regulated genes in Drosophila S2 cells after Listeria grayi infection通路
PathwayP 所含基因
Contained gene2型糖尿病 Type II diabetes mellitus 0.010 CG7069 癌细胞中的中心碳代谢 Central carbon metabolism in cancer 0.012 CG7069 丙酮酸代谢 Pyruvate metabolism 0.015 CG7069 糖酵解/糖异生 Glycolysis/gluconeogenesis 0.017 CG7069 胰高血糖素信号传导途径 Glucagon signaling pathway 0.021 CG7069 病毒致癌 Viral carcinogenesis 0.043 CG7069 嘌呤代谢 Purine metabolism 0.046 CG7069 表 6 威尔斯李斯特菌侵染后果蝇S2细胞特有下调基因的KEGG富集分析Table 6. KEGG enrichment of unique down-regulated genes in Drosophila S2 cells after Listeria welshimeri infection通路
PathwayP 所含基因
Contained gene抗原处理与呈递 Antigen processing and presentation 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 军团菌病 Legionellosis 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 甲型流感 Influenza A 0.000 Hsp70Bbb, deltaTry, Hsp70Bc, Hsp68, Hsp70Bb 弓形虫感染 Toxoplasmosis 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 寿命调控途径−多个物种 Longevity regulating pathway-multiple species 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 雌激素信号传导途径 Estrogen signaling pathway 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 麻疹 Measles 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb MAPK信号传导途径 MAPK signaling pathway 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 剪接体 Spliceosome 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 内吞作用 Endocytosis 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 内质网蛋白加工 Protein processing in endoplasmic reticulum 0.000 Hsp70Bbb, Hsp68, Hsp70Bc, Hsp70Bb 表 7 单增李斯特菌、格氏李斯特菌以及威尔斯李斯特菌侵染后果蝇S2细胞共有下调基因的KEGG富集分析Table 7. KEGG enrichment of common down-regulated genes in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes, L. grayi and L. welshimeri infection通路
PathwayP 所含基因
Contained gene咖啡因代谢 Caffeine metabolism 0.007 AOX2 维生素B6代谢 Vitamin B6 metabolism 0.007 CG14212 牛磺酸和低牛磺酸代谢 Taurine and hypotaurine metabolism 0.010 Ggt-1 花生四烯酸代谢 Arachidonic acid metabolism 0.020 Ggt-1 矿物质吸收 Mineral absorption 0.024 Ctr1B 集合管酸分泌 Collecting duct acid secretion 0.037 Vha100-4 类风湿性关节炎 Rheumatoid arthritis 0.050 Vha100-4 2.6 李斯特菌侵染果蝇S2细胞后Toll/Imd信号通路调控的抗菌肽转录验证
KEGG富集分析结果显示，3种李斯特菌诱导果蝇S2细胞的DEGs均富集到了Toll/Imd信号通路。有研究表明，李斯特菌侵染果蝇后会引起果蝇体内产生一些特殊的抗菌肽，如Diptericin、Drosocin等，从而发挥杀灭细菌的作用。而这些抗菌肽主要受Toll/Imd信号通路调控[21]。因此，我们在3种李斯特菌侵染S2细胞的转录组中挑选了5个受Toll/Imd信号通路调控、并且变化显著的抗菌肽进行qRT-PCR验证，这些抗菌肽包括：DmAttD(DmAttacin D)、DmDptA(Diptericin A)、DmDef(Defensin)、DmDptB(Diptericin B)、DmDro(DmDrosocin)、DmDrs(Drosomycin)以及DmMtk(DmMetchnikowin)。结果显示，上述抗菌肽基因的转录水平均被李斯特菌的侵染诱导上调，和转录组结果基本一致(图7、8、9)。
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图 7 单增李斯特菌侵染3 h后果蝇S2细胞差异表达抗菌肽基因的 qRT-PCR 验证Figure 7. qRT-PCR identification of differentially expressed antibacterial peptide genes in Drosophila S2 cells after Listeria monocytogenes infection for 3 h![]()
图 8 格氏李斯特菌侵染3 h后果蝇S2细胞差异表达抗菌肽基因的 qRT-PCR 验证Figure 8. qRT-PCR identification of differentially expressed antibacterial peptide genes in Drosophila S2 cells after Listeria grayi infection for 3 h![]()
图 9 威尔斯李斯特菌侵染3 h后果蝇S2细胞差异表达抗菌肽基因的 qRT-PCR 验证Figure 9. qRT-PCR identification of differentially expressed antibacterial peptide genes in Drosophila S2 cells after Listeria welshimeri infection for 3 h3. 结论与讨论
本研究从李斯特菌属的系统发育分析结果中[22]，选择各个谱系中占据最深分支的李斯特菌种和格氏李斯特菌作为代表性菌株侵染果蝇S2细胞，然后采用高通量测序技术进行转录组测序，并对筛选出来的DEGs进行生物信息学分析，以此探究S2细胞对这3种李斯特菌响应的差异，为解析宿主应对不同李斯特菌的先天免疫反应以及不同种李斯特菌的致病机制提供一定的依据。作为一种兼性厌氧型的胞内寄生菌，李斯特菌通过影响宿主细胞的多种功能在其中增殖和传播，包括：受体信号传导、细胞骨架重排、膜运输、细胞器动力学、维持DNA稳定、蛋白翻译后修饰以及调控基因转录等[23]。在本研究中，3种李斯特菌侵染果蝇S2细胞，所触发细胞产生的共有DEGs被注释到了代谢过程、细胞过程、细胞器、细胞膜、催化活性、转运体活动、对刺激反应以及免疫系统过程等GO条目中，这暗示李斯特菌可能对宿主S2细胞多种生命功能产生了影响。
单增李斯特菌作为这3种细菌中唯一的致病种，拥有大约9 kb的毒力基因簇，来帮助其侵入、有效的生态位定植、免疫逃逸、胞内运动及胞间传播等[24]，能够影响宿主细胞宽泛的功能，我们的转录组分析结果印证了这一点。我们注意到相比于其他2种李斯特菌，单增李斯特菌使S2细胞产生了更多数量的DEGs，这些特有的DEGs被注释到广泛的GO条目中。其中，催化活性、结合、细胞膜部分、细胞膜、代谢过程和单一生物体过程条目被注释到的基因数最多。同时，单增李斯特菌侵染组中特有的DEGs还被注释到一些没有被其他李斯特菌侵染组的特有DEGs注释到的GO条目，如：生物黏附、参与化学突触传递的突触前过程、生物过程的负调节、信号传导、核酸结合转录因子活性、信号转导器活性及营养物储存器等。除此以外，其他2个李斯特菌侵染组我们也发现了一些有趣的结果，例如：格氏李斯特菌侵染组产生的特有DEGs数量最少，其中一些特有DEGs被注释到了细胞外区域及细胞外区域部分的特有GO条目，我们注意到这些基因都是抗菌肽基因。威尔斯李斯特菌侵染组产生的特有DEGs数量居于中等，其中一些特有DEGs被注释到发育过程及膜包腔的特有GO条目。这表明不同种李斯特菌对果蝇S2细胞的影响差异性较大，宿主S2细胞这些特异性的反应可能与不同细菌的毒力因子有关。
Toll和Imd通路负责大多数在细菌和真菌感染时激活的免疫应答基因的转录[25]。在KEGG富集分析中发现，3种李斯特菌共有激活果蝇S2细胞上调的DEGs被富集到Toll和Imd信号通路中，尤其是这些通路调控的下游抗菌肽，这提示Toll和Imd信号通路可能是果蝇抗李斯特菌感染的关键途径。然而，其中有些抗菌肽如DmDptA被报道参与对革兰氏阴性菌的防御反应，具有抗革兰氏阴性菌的活性[26]，而该抗菌肽是否对李斯特菌有抑制效果仍需验证。此外，Toll和Imd信号通路与NF-kB通路具有一定的关联性，因此推测李斯特菌侵染后S2细胞的NF-kB通路可能也被激活，这一结果与Baldwin等[27]在肠上皮细胞系Caco-2中单增李斯特菌侵染后的转录组学研究结果一致。与此同时，我们也注意到了1个共有下调的基因DmVha100-4，它在英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞的转录组中也被检测到下调[28]，与我们的结果相吻合。DmVha100-4具有质子跨膜转运和维持液泡酸化的功能[29]，液泡的酸化有利于对侵入胞内病原体的降解。DmVha100-4的下调暗示细胞液泡的酸化可能发生紊乱，胞内病原体的降解途径可能受阻。然而，单增李斯特菌在胞内增殖、逃逸扩散以及毒力因子LLO正常发挥作用需要依赖于液泡的酸性环境[30]。因此，该基因下调是S2细胞抵御单增李斯特菌增殖的免疫策略还是被非单增李斯特菌所利用的逃逸策略是一个值得深入探究及思考的问题。与英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞的转录组分析结果[28]相似的是，我们注意到另一个具有质子跨膜转运和维持液泡酸化的功能的基因DmVha36-3在单增李斯特菌侵染组中被下调(数据未展示)，考虑到这2个细菌在系统发育分析中被归于同一个谱系[22]，因此这2种细菌对S2细胞的侵染策略在某种程度上可能存在相似性。
谷胱甘肽是细胞内一种丰富的肽，可维持宿主细胞质中的氧化还原平衡。单增李斯特菌的毒力因子PrfA受到谷胱甘肽的调节，高外源性和内源性谷胱甘肽可使PrfA活性增加150倍[31]，有助于它快速适应其细胞内的生态位。我们注意到在单增李斯特菌侵染组中特有的上调基因DmGstE9，它编码一种参与谷胱甘肽代谢过程的酶[32]。这提示单增李斯特菌侵染后，单增李斯特菌可能利用果蝇S2细胞内的谷胱甘肽来帮助其快速定植，从而导致细胞内氧化平衡状态被打破。在另外的一个方面，我们也注意到1个下调的基因DmHis2A:CG33808(数据未展示)。它编码组蛋白的一种，组蛋白在转录调控、DNA修复、DNA复制和染色体稳定性中起着核心作用[33]。DmHis2A:CG33808的下调暗示单增李斯特菌侵染后S2细胞的染色质调控发生了紊乱，从而影响了宿主基因的转录。
在其他的2个李斯特菌侵染组中我们也观察到一些特殊的现象。在格氏李斯特菌侵染组中，我们注意到被预测具有丙酮酸激酶活性并可能参与糖酵解过程的基因CG7069[34]发生下调，而Toll和Imd信号传导途径的相关基因DmDef、DmDrs、DmCecC、DmCecB、DmCecA1、Dmpirk，以及编码一种由血细胞产生并参与凝血反应的大型多结构域蛋白的血凝集素基因DmHml[35]发生上调。这暗示格氏李斯特菌的侵染可能干扰了S2细胞的糖酵解途径，而宿主细胞也在通过Toll和Imd信号传导途径以及凝血反应来抑制格氏李斯特菌的侵染。热激蛋白通常在细胞受到热激、氧化应激、感染等条件下被诱导表达，并具有重要的细胞保护功能。在威尔斯李斯特菌侵染组中，我们注意到一系列的热休克蛋白基因DmHsp70Bbb、DmHsp68、DmHsp70Bc、DmHsp70Bb发生下调，这与单增李斯特菌侵染后斑马鱼胚胎的热休克蛋白上调的转录组结果不同[36]，暗示威尔斯李斯特菌可能具有一些调控宿主细胞的免疫反应的机制，并提示不同种的李斯特菌对不同物种的细胞具有不同的互作模式。组蛋白编码基因His2B:CG33868(数据未展示)在威尔斯李斯特菌侵染组的下调暗示威尔斯李斯特菌可能具有和单增李斯特菌相似的机制，能够干扰染色质调控来操纵宿主转录，导致宿主细胞转录调控发生紊乱。
从转录组的结果上看，我们的研究表明，果蝇S2细胞对单增李斯特菌、格氏李斯特菌和威尔斯李斯特菌侵染后的转录响应存在差异性，这种差异性的根源可能来自于各个李斯特菌菌株毒力因子的不同。与本研究其他的2种李斯特菌相比，单增李斯特菌拥有它们所缺少的大约9 kb的毒力基因簇。在这个前提下，单增李斯特菌能够更容易地侵入宿主细胞，并在其中定植、繁殖、逃逸及传播，可以影响宿主宽泛的细胞功能。我们的转录组分析结果也证实了这一点。同时，我们通过生物信息学分析鉴定出这3种李斯特菌分别侵染后，宿主S2细胞出现的一些DEGs及其富集到的通路。这些基因和通路可以成为开发预防和治疗李斯特菌病的靶标和策略的潜在候选，并且这些标志物还可以用于诊断、预测李斯特菌病的进展和评估治疗效果，然而这些靶标是否能够发挥作用还需要进一步的试验检验。总而言之，我们的研究比较了致病性和非致病性李斯特菌侵染后宿主S2细胞转录组的差别，这些结果为探究致病性和非致病性李斯特菌引起疾病的机制提供一定的研究基础。同时，这些结果将有助于我们理解先天免疫对抗致病性李斯特菌的免疫策略，从而为免疫治疗和疫苗研发提供一些有益的信息。
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图 1 可调式喂苗装置整机结构示意图
1：取喂苗爪；2：控制箱；3：水平传动部件；4：换盘机构；5：穴苗盘；6：垂直传动部件；7：电动推杆；8：压板；9：取喂苗臂；10：电池；11：机架
Figure 1. Structure diagram of adjustable seedling-feeding device
1: Seedling picking claw; 2: Control cabinet; 3: Horizontal driving unit; 4:Tray changing device; 5: Tray; 6: Vertical driving unit; 7: Linear actuator; 8: Pressure plate; 9: Arm for seedlings picking; 10: Battery; 11: Frame
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图 2 可调式喂苗装置工作过程图
A~E表示不同位置
Figure 2. Working process diagram of adjustable seedling feeding device
A−E indicate different positions
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图 3 取喂苗臂结构示意图
1：步进电机；2：联轴器 ；3：带轮箱；4：齿形带；5：安装板； 6：导轨； 7： 滚子链；8：固定板；9：传感器感应元件
Figure 3. Schematic diagram of seedling-feeding arm structure
1: Stepper motor; 2: Coupling ; 3: Belt wheel box; 4: Cog belt; 5: Mounting plate; 6: Guide rail; 7: Roller chain; 8: Fixed block; 9: Sensor-sensing element
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图 4 取苗受力分析图
${F_{{\rm{f}}0}}$：穴盘对苗坨的摩擦力；G：苗坨重力；${F_{{\rm{f}}1}} $、$ {F_{{\rm{f}}2}} $苗针对苗坨产生的静摩擦力；$ {F_{{\rm{J}}1}}$、${F_{{\rm{J}}2}} $：苗针对苗坨产生两侧的夹持力
Figure 4. Stress analysis diagram of seedling picking
$ {F_{{\rm{f}}0}}$: Friction of seedling; G: Seedling gravity; $ {F_{{\rm{f}}1}}$、$ {F_{{\rm{J}}2}}$ Static friction force produced between seedling and seedling needle; $ {F_{{\rm{J}}1}}$、$ {F_{{\rm{J}}2}}$: Seedling clamping force produced by both sides of seedling
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图 5 喂苗爪结构图
a图中，X：苗安装板转动中心之间的距离；Y：苗针下降到最低点的距离；Z：苗针和苗针连接板的长度；H：苗针下降到最低点后安装板和固定板之间的距离；L：固定板下方孔中心距；M：安装板和穴盘之间的距离；N：苗针在最上方时苗针离安装板的距离；A：苗针下降到最低点后针尖之间的距离；β：苗针在最低处时与竖直方向的夹角；b图中，1：固定板；2：限位螺栓；3：推杆；4：直线轴承；5：连接板；6：苗针安装板；7：苗针
Figure 5. Structure of seedling-feeding claw
In figure a, X: Distance between rotation centers of seedling mounting plate; Y: Distance of needle dropping to the lowest point; Z: Length of plate connecting seedling needles; H: Distance between mounting plate and fixed plate after seedling needle dropping to the lowest point; L: Center distance of the square hole under the fixed plate; M: Distance between mounting plate and tray; N: Distance from seedling needle to the mounting plate at the top of the seedling needle; A: Distance between tip of the needle after needle dropping to the lowest point; β: Angle between seedling needle at the lowest point and vertical direction; In figure b, 1: Fixed block; 2: Limit bolt; 3: Push rod; 4: Linear bearing; 5: Junction plate; 6: Seedling needle mounting plate; 7: Seedling needle
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图 7 3种取喂苗爪安装效果图
Figure 7. Installation effect diagram of three kinds of seedling picking and feeding claws
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图 11 各单因素对喂苗成功率的影响
Figure 11. Effects of single factors on success rate of seedling feeding
表 1 取喂苗爪不同参数的设计尺寸1)
Table 1 Dimensions of different parameters of seedling feeding claw
β/(°) Z/mm H/mm L/mm 10 74.86 74.86 74.86 9 83.10 83.10 83.10 8 93.41 93.41 93.41 7 106.67 106.67 106.67 6 124.37 124.37 124.37 1) β为苗针在最低处时与竖直方向的夹角；Z为苗针和苗针连接板的长度；H为苗针下降到最低点后安装板和固定板之间的距离；L为固定板下方孔中心距 1) β is angle ketneen seedling needle at the lowest point and vertical direction; Z is the length of the connecting plate between the needles; H is the distance between the mounting plate and the fixed plate after the needle drops to the lowest point; L is the center distance of the square hole under the fixed plate 
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表 2 正交试验因素水平表
Table 2 Factors and levels of orthogonal test
水平 Level 育苗盘规格/穴 Seedling tray specification (A) 基质含水率(w)/% Matrix moisture (B) 苗高/mm Seedling height (C) 入土深度/mm Depth of penetration (D) 1 72 30 40 36 2 105 40 50 38 3 128 50 60 40
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表 3 正交试验方案及结果
Table 3 Experiment scheme and results of orthogonal test
序号 No. 因素及水平 Factors and levels 喂苗成功数/株 No. of successful seedling picking 喂苗成功率(η)/% Success rate of seedling feeding A B C D 1 1 1 1 1 115 79.86 2 1 2 3 2 129 89.58 3 1 3 2 3 126 87.50 4 2 1 3 3 189 90.00 5 2 2 2 1 176 83.81 6 2 3 1 2 193 91.90 7 3 1 2 2 239 93.36 8 3 2 1 3 233 91.02 9 3 3 3 1 216 84.38
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表 4 极差分析
Table 4 Range analysis
因素 Factor K1 K2 K3 极差 Range 最优方案 Optimal scheme A 256.94 265.71 268.75 11.81 A3 B 263.22 264.41 263.78 1.19 B2 C 262.78 264.67 263.78 1.89 C2 D 248.05 274.85 268.52 26.80 D2 主次 Primary and secondary $ D > A > C > B $
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表 5 方差分析
Table 5 Variance analysis
来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F 显著性1)Significance A 25.06 2 12.52 106.40 * * B 0.24 2 0.12 C 0.61 2 0.30 2.57 D 130.83 2 65.41 555.56 * * 总和 Sum 156.74 8 1)“**”表示0.01水平差异显著 1)“**” means significant difference at the level of 0.01
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