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广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析

贾荣荣, 汪祥斌, 贾坤

贾荣荣, 汪祥斌, 贾坤. 广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(3): 382-390. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202204028
引用本文: 贾荣荣, 汪祥斌, 贾坤. 广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(3): 382-390. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202204028
JIA Rongrong, WANG Xiangbin, JIA Kun. Whole genome sequencing and evolutionary analysis of bovine ephemeral fever virus isolate JM 2020 in Guangdong Province[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 382-390. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202204028
Citation: JIA Rongrong, WANG Xiangbin, JIA Kun. Whole genome sequencing and evolutionary analysis of bovine ephemeral fever virus isolate JM 2020 in Guangdong Province[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 382-390. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202204028

广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析

基金项目: 广州市科技计划项目(202206010131)
详细信息
    作者简介:

    贾荣荣,硕士研究生,主要从事牛流行热病毒研究,E-mail: 1845234644@qq.com

    通讯作者:

    贾 坤,副教授,博士,主要从事奶牛疾病研究,E-mail: Jiakun@scau.edu.cn

  • 中图分类号: S852.618

Whole genome sequencing and evolutionary analysis of bovine ephemeral fever virus isolate JM 2020 in Guangdong Province

  • 摘要:
    目的 

    分析广东省牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)分离株JM 2020与其他地区毒株的进化关系,阐明遗传进化与全基因组的特征,为中国乃至世界对牛流行热疾病的流行情况以及预防该疾病提供有用信息。

    方法 

    根据从GenBank下载的BEFV毒株的全基因组序列信息,设计引物PCR扩增糖蛋白(Glycoprotein,G)基因;另设计10对引物用于扩增全基因组,送测序得到10个片段的基因序列,运用DNAStar软件中的EditSeq手动编辑和拼接获得全基因组序列。运用MEGA 6.0分别构建G基因和全基因组进化树进行进化分析。

    结果 

    JM 2020毒株的G基因和全基因组与泰国毒株的核苷酸序列相似性均最高,分别为94.9%~99.3%和99.0%,进化分析表明JM 2020与2013—2017年泰国毒株处于同一小分支,而与JB76H、JT02L等国内毒株有一定进化距离。全基因组测序结果表明,JM 2020全基因组长度为14 902个核苷酸(nt),包括50 nt的前导序列,1 296 nt的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因,837 nt的磷蛋白(Phosphoprotein,P)基因,672 nt的基质蛋白(Matrixprotein,M)基因,1 872 nt的G基因,1 812 nt的非结构糖蛋白II (Non-structural glycoprotein II,GNS)基因,618 nt的α1α2基因,444 nt的β基因,345 nt的γ基因,444 nt的RNA依赖性聚合酶(Large multi-functional enzyme,L)基因和73 nt的尾随序列,且分别被21、47、68、67、23、64、59、79和35 nt的区域隔开。JM 2020、qy2017及泰国毒株均出现P′基因(P基因多顺反子产物)截断的特征。

    结论 

    JM 2020毒株与2017年分离毒株qy2017序列相似性高且均与泰国毒株进化关系较近,与JB76H等我国其他地区毒株有一定进化距离。该研究丰富了中国BEFV流行株的基因组信息,为牛流行热疫病综合防控及开发新疫苗奠定了基础。

    Abstract:
    Objective 

    The purpose of this study was to analyze the evolutionary relationship between bovine ephemeral fever virus (BEFV) isolate JM 2020 in Guangdong Province and other strains from other regions, and clarify the characteristics of genetic evolution and whole genome, so as to provide information for the epidemic situation and prevention of bovine ephemeral fever disease in China and the world.

    Method 

    According to the whole genome sequence information of BEFV strain downloaded from GenBank, primers were designed to amplify glycoprotein (G) gene by PCR. The 10 pairs of primers were designed to amplify the whole genome, and the gene sequences of 10 fragments were obtained by sequencing. The whole genome sequences were manually edited and spliced by EditSeq in DNAStar software. Using MEGA 6.0 to construct G gene and whole genome evolutionary tree respectively for evolutionary analysis.

    Result 

    The G gene and whole genome of the JM 2020 strain had the highest nucleotide sequence similarity with the Thai strain, which were 94.9%−99.3% and 99.0% respectively. The evolutionary analysis showed that JM 2020 was in the same small branch with the 2013 to 2017 Thai strains, while there was a certain evolutionary distance from domestic virus strains such as JB76H and JT02L. Whole genome sequencing results showed that whole genome of JM 2020 was 14 902 nucleotides (nt) in length, including 50 nt leader sequence, 1 296 nt nucleoprotein (N) gene, and 837 nt phosphoprotein (P) gene, 672 nt matrixprotein (M) gene, 1 872 nt G gene, 1 812 nt non-structural glycoprotein II (GNS) gene, 618 nt α1 and α2 gene, 444 nt β gene, 345 nt γ gene, 6 444 nt large multi-functional enzyme (L) gene and tail sequence of 73 nt, which was separated by 21, 47, 68, 67, 23, 64, 59, 79 and 35 nt intergenic regions. The P′ gene (polycistronic product of P gene) of JM 2020 was truncated like qy2017 and the Thai strain.

    Conclusion 

    The JM 2020 strain is highly similar with the qy2017 strain isolated in 2017 and they are closely related to the evolution of the Thai strain. They have some evolutionary distance with JB76H strain etc. from other regions of China. This study enriches the genome information of BEFV epidemic strains in China and lays a foundation for the prevention and control of bovine ephemeral fever and the research of new vaccines.

  • 牛流行热(Bovine ephemeral fever)为虫媒介疾病,主要由库蚊属蚊子传播,可引起奶牛、水牛突发高热、肺炎、产奶产肉量下降、僵硬、跛、瘫、母牛流产等[1-2];最主要的特点是来势迅猛,突发高热,一般为双相热,可长达5 d左右,症状较轻者可自行恢复,重者致残、引起肺气肿导致死亡[3];呈现明显的季节性和周期性,在温暖潮湿的、适合蚊虫生长繁殖的热带和亚热带地区,约3~5年大流行1次,近年有周期缩短的趋势,在华南地区奶牛场几乎每年都会流行[4];发病率高达100%,青壮年牛易染病,死亡率1%~10%,最高可达到20%[5];对广东省畜牧经济影响重大,同时严重影响活体贸易[6]

    牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)为弹状病毒科,暂时热病毒属成员,外形呈子弹状,病毒体的大小为85 nm×180 nm左右[7]。目前为止,仅鉴定出1种血清型。病毒基因组约为14 900个核苷酸(nt),按3'-N-P-M-G-[GNS-α1-α2-β-γ]-L-5'的顺序编码10个转录单位,目前已经确定了其中5种主要结构蛋白,包括核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和RNA依赖性聚合酶(Large multi-functional enzyme,L),还有1个比较特殊的非结构糖蛋白II(Non-structural glycoprotein II,GNS),其基因为位于G基因下游的第2个糖蛋白基因,但在病毒粒子中并未发现该蛋白,可能在自然感染宿主的过程中发挥作用[8]

    在我国,牛流行热于1934年首次在江苏省被报道。自1955年以来,该病迅速传播扩散到我国的25个省份,其中,包括平均海拔超过4 000 m的西藏地区[9]。1991年8月位于我国44°N的吉林省某些地区报道出现了牛流行热。2011—2014年,对奶牛、水牛和耗牛进行血清学调查,在全国19个省、5个自治区和2个直辖市均检测到了BEFV中和抗体,其中,包括东北部的黑龙江[10]。这些发现表明中国的BEFV感染范围可能比临床观察的要广。因此,本研究对近年流行的病毒进行连续监视,对了解流行病学模式、遗传进化以及病毒之间的抗原关系至关重要。

    JM 2020病毒原液分离于广东省江门市疑似牛流行热病牛全血,将牛全血样品接种入乳鼠脑内盲传3代,每代乳鼠脑组织都进行RT-qPCR检测[11]。将第3代检测结果为阳性的脑组织匀浆处理后,用高速冷冻低温离心机在4 ℃条件下,6 000 r/min离心10 min,取上清液接种于BHK-21细胞,传代培养有明显病变后收集病毒液。采集的全血和冻存的病毒液均保存于华南农业大学兽医学院外科实验室。

    通用RNA提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司,RNA反转录试剂盒购自TaKaRa有限公司,DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒购自全式金试剂公司,细胞用DMEM、PBS以及预染蛋白Marker购自赛默飞世尔科技有限公司。

    从GenBank下载已发表的BEFV全长基因组序列[12],使用Primer Premier 5.0软件设计G基因以及10个片段引物(表1)。所有引物均合成于广州天一辉远基因科技有限公司。

    表  1  扩增G基因以及JM 2020全基因组序列引物
    Table  1.  Primers employed for the amplication of G gene and whole genome of JM 2020 strain
    扩增片段 Amplified fragment 名称 Name 序列(5′→3′) Sequence 位置/bp Location 产物大小/bp Size of product
    G BEFV G F ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACC 3 059~3 082 1 872
    BEFV G R TTAATGATCAAAGAACCTATCATCACCGATTGGTTTAC 4 893~4 930
    1 BEFV1F ACGAGAAAAAACAAAAAAAC 1~20 820
    BEFV1R GATACAAAAATCCAATCAAG 801~820
    2 BEFV2F ACAAGGATGCCGCAGGAC 730~747 2 120
    BEFV2R TTCCCTCTTCTTTTGCTC 2 832~2 849
    3 BEFV3F ATTCATCCTAGAGATCAGG 2 737~2 752 1 455
    BEFV3R ACCATTCCCCCTCTTGTTG 4 173~4 191
    4 BEFV4F CTCTGTTTGTCCTTACCAG 4 112~4 127 2 066
    BEFV4R AATGACAGTATCTTCATCAG 6 158~6 177
    5 BEFV5F TAGCCAGGCAAGCATCCTG 6 002~6 019 2 196
    BEFV5R TGGATTACTCTCTTGATCAAACATGC 8 170~8 197
    6 BEFV6F AGTGAGATAGATATATGTGATATTCC 7 898~7 823 864
    BEFV6R TGCAAATATATGATGAGAATCTTC 8 738~8 761
    7 BEFV7F ATGAAGAGGAGTCCATGGAC 8 520~8 539 1 275
    BEFV7R TGGGCCAAGTATTATGACTG 9 775~9 794
    8 BEFV8F ATTTGGACATAAGTGGACGGTG 9 099~9 120 1 904
    BEFV8R TCCATTAATTGCATCATGGGGTC 10 980~11 002
    9 BEFV9F CAGACAATCAGCATGTG 10 643~10 659 2 181
    BEFV9R TACAGTTCCTTGAAGTGC 12 806~12 823
    10 BEFV10F AAACTTGACTCATCGCAG 12 758~12 775 2 185
    BEFV10R ACGAAGAAAAACAAATAAAATAC 14 920~14 942
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    根据通用RNA提取试剂盒说明书提取病毒液样品总RNA,取200 μL病毒液样品至无RNA酶的离心管中,避光加入1 mL RL溶液,涡旋震荡15 s后室温静置5 min;加入200 μL三氯甲烷,涡旋震荡15 s后室温静置3 min;高速低温离心机4 ℃、12 000 r/min离心10 min,样品将分为3层,取第1层水相层到新的无RNA酶的离心管中;加入水相层50%体积的无水乙醇,混匀后将溶液转移到纯化柱中,4 ℃、12 000 r/min,离心30 s,弃废液;加入500 μL RPI溶液,4 ℃、12 000 r/min离心30 s,弃废液;加入500 μL RW溶液,室温静置2 min,4 ℃、12 000 r/min离心30 s,弃废液;加入500 μL RW溶液,室温静置2 min,4 ℃、12 000 r/min离心30 s,弃废液;4 ℃、12 000 r/min离心2 min,充分晾干;将纯化柱转移到新的无RNA酶的离心管中,加入30 μL RNase-free ddH2O室温静置2 min,4 ℃、12 000 r/min离心2 min,得到总RNA,储存于−80 ℃冰箱备用。

    PCR扩增G基因及有重叠序列的10个片段,反应条件为95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 5 min。PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳,结束后使用凝胶成像系统拍照观察;切下目的胶块用于纯化回收DNA片段;连接pEasy®-Blunt载体后,转化Trans1-T1感受态细胞,挑取单克隆菌落经PCR鉴定为阳性菌落后测序。

    对JM 2020毒株G基因全长序列、疫苗株JB76H、JT02L、LS11 2011等以及不同地区野毒株共70株毒株进行系统进化分析,使用DNAStar中Editseq和Megalign对G基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行编辑和相似性比较,并使用MEGA 6.0绘制BEFV G基因系统发育进化树,分析获得的野毒株G基因与其他地理株之间的差异。选取分支代表序列,先用邻近法构建初步进化树,然后用最大似然法重复计算构建进化树。

    以反转录的cDNA为模板,使用设计的引物分别对G基因(图1)及10个片段(图2)进行全基因组扩增,电泳结合测序结果显示在1 872、820、2 120、1 455、2 066、2 196、864、1 275、1904、2 181、2 185 bp处有明亮条带,与预期结果相符。将测序结果比对后进行拼接,JM 2020全长为14 902 nt。

    图  1  PCR扩增G基因
    Figure  1.  PCR amplification of G gene
    M: DS5000 DNA marker
    图  2  全基因组(G基因及10个片段)PCR扩增结果
    Figure  2.  Results of whole genome (G gene and 10 fragments) amplification by PCR

    为了更详细地研究广东BEFV毒株的遗传进化关系和分子流行病学,使用MEGA 6.0软件对测序所得的BEFV G基因与Genbank下载的国内外共70株毒株G基因进行分析并构建遗传进化树,结果显示,BEFV感染区域主要分为东亚、澳大利亚及中东3个地区;本毒株与中国、日本及泰国流行的毒株处于一大分支,与qy2017/China/2017、TH/NMA0012/2015/Thailand/2015、TH/NMA0025/2015/Thailand/2015、TH/NMA0076/2013/Thailand/2013、TH/NM0072/2017/Thailand/2017关系较近,JM 2020与疫苗株JB76H处于不同小分支,关系较远(图3)。

    图  3  JM 2020 G基因进化树
    “●”为JM 2020毒株;“○”为本研究检测到的毒株
    Figure  3.  Phylogenetic tree of JM 2020 G gene
    “●” is the JM 2020 strain; “○” is the strain detected in this study

    核苷酸序列相似性比对发现,JM 2020 G基因和全球BEFV G基因之间的核苷酸序列相似性为90.1%~99.3%;其中,与澳大利亚毒株的相似性最低,为90.1%~91.1%,与中东毒株相似性为92.0%~92.4%,与国内流行株相似性为95.5%~98.9%,与泰国地区毒株相似性为94.9%~99.3% (图4)。

    图  4  JM 2020毒株G基因核苷酸相似性分析(部分)
    Figure  4.  Nucleotide similarity analysis of G gene of JM 2020 strain (part)

    G蛋白相对分子质量为72 300,含有特异的中和抗原位点,是诱导牛保护性免疫的主要抗原蛋白[13]。G蛋白包括4个抗原位点:G1(第487~503 aa),G2(第168~189 aa),G3(第49~63 aa、第215~231 aa和第262~271 aa)和G4(第455~482 aa);G基因序列有较高的保守性,在毒株之间具有超过90%的相似性;G蛋白抗原位点分析发现,在高保守性抗原蛋白的G2(T170N)、G3(K53N、G263E)及G4(K461E、I475M)出现5个氨基酸位点突变(图5),这可作为近年来JB76H疫苗对广东地区保护效果差的原因之一。

    图  5  JM 2020毒株G蛋白抗原位点分析
    “.”为与对照组毒株氨基酸相同;“-”为该位置氨基酸缺失
    Figure  5.  Antigenic sites of G protein of JM 2020 strain
    “.” is the same amino acid as the control group; “-” is the amino acid deletion at this position

    应用MEGA 6.0软件构建JM 2020毒株全基因组系统进化树,结果显示,JM 2020毒株与泰国毒株TH/LRI0045/East Asia/2016亲缘关系最近,与南非毒株RSA/OBP/BEF2008/South Africa/2008亲缘关系最远(图6)。

    图  6  JM 2020毒株全基因组进化树
    “●”为JM 2020毒株
    Figure  6.  Phylogenetic tree of whole genome of JM 2020 strain
    “●” is the JM 2020 strain

    JM 2020病毒全基因组的GC含量为33.35%,包括1个50 nt的前导序列、1 296 nt的N基因、837 nt的P基因、672 nt的M基因、1 872 nt的G基因、1 812 nt的GNS基因、618 nt的α1、α2基因、444 nt的β蛋白基因、345 nt的γ蛋白基因、6 444 nt的L基因和73 nt的尾随序列(表2)。每个基因的转录起始信号和转录终止信号序列保守,分别为AACAGG和CATGAAAAAAA,而α1、α2基因的转录终止信号序列为CTTGAAAAAAA。

    表  2  JM 2020单个基因编码区之间的起始信号和终止信号
    Table  2.  Initiation signal and termination signal between individual gene coding region of JM 2020 strain
    基因 Gene 起始信号序列 Initiation signal sequence 终止信号序列 Termination signal sequence 编码氨基酸数/aa Number of coded amino acids ORF位置/bp ORF position 基因间隔核苷酸数/nt Nucleotide number of gene interval
    N AACAGG CATGAAAAAAA 431 72~1 367 21
    P AACAGG CATGAAAAAAA 278 1 415~2 251 47
    M AACAGG CATGAAAAAAA 223 2 320~2 991 68
    G AACAGG CATGAAAAAAA 623 3 059~4 930 67
    GNS AACAGG CATGAAAAAAA 603 4 954~6 765 23
    α1、α2 AACAGG CTTGAAAAAAA 88、116 6 830~7 096、7 098~7 448 64
    β AACAGG CATGAAAAAAA 147 7 508~7 951 59
    γ AACAGG CATGAAAAAAA 114 8 031~8 375 79
    L AACAGG CATGAAAAAAA 2 147 8 411~14 854 35
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    分离株JM 2020前导序列与其他7株毒株前导序列的前31 nt高度保守,3′端前导序列和5′端尾随序列具有互补特性,最多可互补9 nt。此外,本毒株同qy2017及泰国株均出现P′基因截断[14]的情况(图7),P′蛋白是P基因多顺反子的产物,正常株P′为49 aa,JM 2020株P′为22 aa。截断的原因可能是基因发生突变,导致翻译提前终止。由此推测,P′蛋白是非功能性蛋白,不参与病毒结构的组成。截断的P′蛋白对病毒复制周期的影响仍有待阐明[15]

    图  7  JM 2020毒株P′基因序列分析
    “.”为与对照组毒株氨基酸相同;“-”为该位置氨基酸缺失
    Figure  7.  Analysis of P′ gene sequence of JM 2020 strain
    “.” is the same amino acid as the control group; “-” is the amino acid deletion at this position

    表3可知,在氨基酸水平,N蛋白氨基酸序列最为保守,与其他毒株的平均相似性为98.9%;其次为L蛋白(平均相似性为97.9%)、G蛋白(平均相似性为96.6%)、M蛋白(平均相似性为95.2%)、GNS蛋白(平均相似性为93.0%)和P蛋白(平均相似性为90.2%)。总体上,JM 2020毒株各基因与泰国株TH/LRI0045/East Asia/2016毒株相比变异最小,JM 2020全基因组和泰国分离株核苷酸序列相似性最高,为99.0%;这表明广东近年流行株JM 2020和泰国分离株很可能具有相同的起源。且有分析显示,BEFV分离株的进化关系与地理位置密切相关[16-17]

    表  3  JM 2020与参考毒株各基因编码区氨基酸序列相似性
    Table  3.  Amino acid sequence similarity of individual gene coding region between JM 2020 and reference strains %
    参考毒株 Reference strain N P M GNS G L
    Bovine/China/Henan1/2012 99.5 97.8 100.0 76.4 98.6 98.2
    qy2017/China/2017 99.5 99.3 88.0 99.5 99.0 99.7
    Australian NC 002526.1 97.9 84.5 96.9 92.7 94.4 96.5
    Australian AF234533.1 97.9 84.5 96.9 92.7 94.4 96.5
    BEFV/Israel /2006 99.1 87.4 98.2 95.2 96.1 97.5
    JT02L/China/2002 99.3 97.8 99.6 99.0 98.4 99.3
    TH/LRI0045/East Asia/2016 99.5 98.6 100.0 99.7 99.2 99.7
    India/2019 99.1 87.1 87.2 94.2 96.3 97.3
    RSA/OBP/BEF2008/South Africa /2008 99.1 78.1 87.2 86.9 93.1 96.5
    BEFV/Ad12/TUR/2012 98.6 87.1 98.2 93.2 96.5 97.3
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    牛流行热在广东省每年都有小范围流行[17],比中国其他地区更常见。根据本研究前期调研显示,2013—2017年,在两广地区每年都检测到BEFV,截至2022年,已检测到包括JM 2020在内共6株BEFV毒株。基于JM 2020全基因组序列的分子特征和G基因的系统发育分析,证明了JM 2020与其他地理区域,尤其是与泰国的BEFV遗传关系较近,这为BEFV在东亚和东南亚之间流通提供了证据。有证据表明,BEFV分离株之间的系统发育关系与地理位置密切相关[16-17]。风和动物活体贸易在BEFV的跨界传播中起重要作用[18]。由于季风环流的作用,夏季风在高温季节给泰国和我国的亚热带地区带来丰沛的降水,形成温暖湿润的气候,有利于泰国虫媒介乘风传入中国广东沿海地区,这为虫媒介的繁殖和传播病毒提供了有利的条件,由于BEFV核苷酸序列数量有限,东亚和东南亚之间的BEFV传播的具体途径仍然未知。中国为泰国农产品最重要的出口市场之一,但截至2022年,泰国牛肉还未获得中国市场准入许可,中泰两国还没有牛肉进出口方面的相关协议;因此,基本可以排除通过活体贸易传播BEFV的可能。

    进化分析表明,JM 2020毒株与2017年在广东清远地区检测到的毒株qy2017核苷酸序列相似性为98.9%,与2017年以前广东地区检测到的BEFV序列相似性较低。但本毒株与2013—2017年的泰国流行株(TH/LRI0045/East Asia/2015等)G基因以及全基因组的核苷酸和氨基酸序列相似性均最高,G蛋白氨基酸序列相似性更是高达99.2%,这表明近几年所流行毒株应与泰国株密切相关,且2株毒株和泰国株处于同一分支,很可能具有相同起源。JM 2020与疫苗株JB76H、JT02L等国内毒株核苷酸序列相似性为95.1%~98.0%,存在一定进化距离。qy2017与泰国株的氨基酸序列相似性最高,为99.4%,表明该毒株很可能是从泰国传入,而JM 2020可能是1株新的突变株。这一研究对广东地区BEFV的流行及进化情况有了一定了解,丰富中国流行BEFV基因库的同时,为病毒的变异性研究和新型快速诊断技术的研发提供了新的BEFV种源,为开发有效、保护力更强的新疫苗[19]提供了依据。

    本研究成功扩增且测定了广东近年来流行毒株JM 2020全基因组,绘制了系统进化树,发现JM 2020与泰国株进化关系最近,核苷酸序列相似性最高,与澳大利亚毒株最远;与JB76H G基因核苷酸序列有一定差异。全基因组结构分析为在基因结构方面对BEFV进行分子研究提供了有用信息,了解BEFV的基因进化关系及基因组特征有助于广东省牛流行热流行病学的研究。

  • 图  1   PCR扩增G基因

    Figure  1.   PCR amplification of G gene

    M: DS5000 DNA marker

    图  2   全基因组(G基因及10个片段)PCR扩增结果

    Figure  2.   Results of whole genome (G gene and 10 fragments) amplification by PCR

    图  3   JM 2020 G基因进化树

    “●”为JM 2020毒株;“○”为本研究检测到的毒株

    Figure  3.   Phylogenetic tree of JM 2020 G gene

    “●” is the JM 2020 strain; “○” is the strain detected in this study

    图  4   JM 2020毒株G基因核苷酸相似性分析(部分)

    Figure  4.   Nucleotide similarity analysis of G gene of JM 2020 strain (part)

    图  5   JM 2020毒株G蛋白抗原位点分析

    “.”为与对照组毒株氨基酸相同;“-”为该位置氨基酸缺失

    Figure  5.   Antigenic sites of G protein of JM 2020 strain

    “.” is the same amino acid as the control group; “-” is the amino acid deletion at this position

    图  6   JM 2020毒株全基因组进化树

    “●”为JM 2020毒株

    Figure  6.   Phylogenetic tree of whole genome of JM 2020 strain

    “●” is the JM 2020 strain

    图  7   JM 2020毒株P′基因序列分析

    “.”为与对照组毒株氨基酸相同;“-”为该位置氨基酸缺失

    Figure  7.   Analysis of P′ gene sequence of JM 2020 strain

    “.” is the same amino acid as the control group; “-” is the amino acid deletion at this position

    表  1   扩增G基因以及JM 2020全基因组序列引物

    Table  1   Primers employed for the amplication of G gene and whole genome of JM 2020 strain

    扩增片段 Amplified fragment 名称 Name 序列(5′→3′) Sequence 位置/bp Location 产物大小/bp Size of product
    G BEFV G F ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACC 3 059~3 082 1 872
    BEFV G R TTAATGATCAAAGAACCTATCATCACCGATTGGTTTAC 4 893~4 930
    1 BEFV1F ACGAGAAAAAACAAAAAAAC 1~20 820
    BEFV1R GATACAAAAATCCAATCAAG 801~820
    2 BEFV2F ACAAGGATGCCGCAGGAC 730~747 2 120
    BEFV2R TTCCCTCTTCTTTTGCTC 2 832~2 849
    3 BEFV3F ATTCATCCTAGAGATCAGG 2 737~2 752 1 455
    BEFV3R ACCATTCCCCCTCTTGTTG 4 173~4 191
    4 BEFV4F CTCTGTTTGTCCTTACCAG 4 112~4 127 2 066
    BEFV4R AATGACAGTATCTTCATCAG 6 158~6 177
    5 BEFV5F TAGCCAGGCAAGCATCCTG 6 002~6 019 2 196
    BEFV5R TGGATTACTCTCTTGATCAAACATGC 8 170~8 197
    6 BEFV6F AGTGAGATAGATATATGTGATATTCC 7 898~7 823 864
    BEFV6R TGCAAATATATGATGAGAATCTTC 8 738~8 761
    7 BEFV7F ATGAAGAGGAGTCCATGGAC 8 520~8 539 1 275
    BEFV7R TGGGCCAAGTATTATGACTG 9 775~9 794
    8 BEFV8F ATTTGGACATAAGTGGACGGTG 9 099~9 120 1 904
    BEFV8R TCCATTAATTGCATCATGGGGTC 10 980~11 002
    9 BEFV9F CAGACAATCAGCATGTG 10 643~10 659 2 181
    BEFV9R TACAGTTCCTTGAAGTGC 12 806~12 823
    10 BEFV10F AAACTTGACTCATCGCAG 12 758~12 775 2 185
    BEFV10R ACGAAGAAAAACAAATAAAATAC 14 920~14 942
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    表  2   JM 2020单个基因编码区之间的起始信号和终止信号

    Table  2   Initiation signal and termination signal between individual gene coding region of JM 2020 strain

    基因 Gene 起始信号序列 Initiation signal sequence 终止信号序列 Termination signal sequence 编码氨基酸数/aa Number of coded amino acids ORF位置/bp ORF position 基因间隔核苷酸数/nt Nucleotide number of gene interval
    N AACAGG CATGAAAAAAA 431 72~1 367 21
    P AACAGG CATGAAAAAAA 278 1 415~2 251 47
    M AACAGG CATGAAAAAAA 223 2 320~2 991 68
    G AACAGG CATGAAAAAAA 623 3 059~4 930 67
    GNS AACAGG CATGAAAAAAA 603 4 954~6 765 23
    α1、α2 AACAGG CTTGAAAAAAA 88、116 6 830~7 096、7 098~7 448 64
    β AACAGG CATGAAAAAAA 147 7 508~7 951 59
    γ AACAGG CATGAAAAAAA 114 8 031~8 375 79
    L AACAGG CATGAAAAAAA 2 147 8 411~14 854 35
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    表  3   JM 2020与参考毒株各基因编码区氨基酸序列相似性

    Table  3   Amino acid sequence similarity of individual gene coding region between JM 2020 and reference strains %

    参考毒株 Reference strain N P M GNS G L
    Bovine/China/Henan1/2012 99.5 97.8 100.0 76.4 98.6 98.2
    qy2017/China/2017 99.5 99.3 88.0 99.5 99.0 99.7
    Australian NC 002526.1 97.9 84.5 96.9 92.7 94.4 96.5
    Australian AF234533.1 97.9 84.5 96.9 92.7 94.4 96.5
    BEFV/Israel /2006 99.1 87.4 98.2 95.2 96.1 97.5
    JT02L/China/2002 99.3 97.8 99.6 99.0 98.4 99.3
    TH/LRI0045/East Asia/2016 99.5 98.6 100.0 99.7 99.2 99.7
    India/2019 99.1 87.1 87.2 94.2 96.3 97.3
    RSA/OBP/BEF2008/South Africa /2008 99.1 78.1 87.2 86.9 93.1 96.5
    BEFV/Ad12/TUR/2012 98.6 87.1 98.2 93.2 96.5 97.3
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  • [1]

    WALKER P J. Bovine ephemeral fever in Australia and the world[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2005, 292: 57-80.

    [2] 刘和斯. 牛流行热的临床特点、症状及防治措施[J]. 畜禽业, 2021, 32(10): 139.
    [3]

    LEE F. Bovine ephemeral fever in Asia: Recent status and research gaps[J]. Viruses, 2019, 11(5): 412. doi: 10.3390/v11050412.

    [4]

    JIA K, JIA R R, WANG X B, et al. Genetic characterization of bovine ephemeral fever virus in southern China, 2013−2017[J]. Virus Genes, 2020, 56(3): 390-395. doi: 10.1007/s11262-020-01740-w

    [5]

    LIN G Z, QIU C Q. Phylogenetic relationships of the partial G gene sequence of bovine ephemeral fever virus isolated from Mainland China, Taiwan, Japan, Australia, Turkey and Israel[J]. Journal of Animal and Veterinary Advances, 2012, 11(17): 3217-3222. doi: 10.3923/javaa.2012.3217.3222

    [6]

    STOKES J E, DARPEL K E, GUBBINS S, et al. Investigation of bovine ephemeral fever virus transmission by putative dipteran vectors under experimental conditions[J]. Parasites & Vectors, 2020, 13(1): 597. doi: 10.1186/s13071-020-04485-5.

    [7] 李成, 谷守林, 姜绍德, 等. 应用电镜技术对牛流行热病毒形态学的研究[J]. 电子显微学报, 1993(1): 35.
    [8] 江船. 牛流行热病毒感染宿主细胞差异表达miRNA的筛选及其鉴定[D]. 济南: 山东大学, 2018.
    [9]

    LIU D, LI K, ZHANG L, et al. Seroprevalence investigation of bovine ephemeral fever in yaks in Tibetan Plateau of China from 2012 to 2015[J]. Tropical Animal Health and Production, 2017, 49(1): 227-230. doi: 10.1007/s11250-016-1172-9

    [10]

    LI Z, ZHENG F, GAO S, et al. Large-scale serological survey of bovine ephemeral fever in China[J]. Veterinary Microbiology, 2015, 176(1/2): 155-160.

    [11] 汪祥斌, 贾坤, 贾荣荣, 等. 牛流行热病毒TaqMan实时定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(3): 491-495.
    [12]

    WANG F I, HSU A M, HUANG K J. Bovine ephemeral fever in Taiwan[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2001, 13(6): 462-467. doi: 10.1177/104063870101300602

    [13]

    TRINIDAD L, BLASDELL K R, JOUBERT D A, et al. Evolution of bovine ephemeral fever virus in the Australian episystem[J]. Journal of Virology, 2014, 88(3): 1525-1535. doi: 10.1128/JVI.02797-13

    [14]

    CHAISIRIRAT T, SANGTHONG P, ARUNVIPAS P, et al. Molecular characterization of bovine ephemeral fever virus in Thailand between 2013 and 2017[J]. Veterinary Microbiology, 2018, 227: 1-7. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.10.013

    [15] 童树喜. 牛流行热的流行病学调查及防治[J]. 中国畜牧业, 2021(5): 72-73. doi: 10.3969/j.issn.2095-2473.2021.05.035
    [16]

    WALKER P J, KLEMENT E. Epidemiology and control of bovine ephemeral fever[J]. Veterinary Research, 2015, 46: 124. doi: 10.1186/s13567-015-0262-4.

    [17]

    ZHENG F, QIU C. Phylogenetic relationships of the glycoprotein gene of bovine ephemeral fever virus isolated from mainland China, Taiwan, Japan, Turkey, Israel and Australia[J]. Virology Journal, 2012, 9: 268. doi: 10.1186/1743-422X-9-268.

    [18]

    AZIZ-BOARON O, KLAUSNER Z, HASOKSUZ M, et al. Circulation of bovine ephemeral fever in the Middle East: Strong evidence for transmission by winds and animal transport[J]. Veterinary Microbiology, 2012, 158(3/4): 300-307.

    [19] 杨金雨, 李赞, 王丹. 重新认识牛流行热及其疫苗[J]. 中国奶牛, 2018(5): 47-49.
图(7)  /  表(3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-04-16
  • 网络出版日期:  2023-05-17
  • 刊出日期:  2023-05-09

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