Identification and fungicide sensitivity of pathogen causing anthracnose of pepper
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摘要:目的
明确辣椒炭疽病病原菌Colletotrichum spp.种类，并筛选防治药剂。
方法采集贵州省贵阳市花溪区具有典型炭疽病症状的‘党武’辣椒叶片和果实，分离病原菌；采用单孢分离法、柯赫氏法则、形态学特征结合ITS、GADPH、CHS-1和ACT多基因序列分析，明确病原菌的致病能力及分类地位；采用菌丝生长速率法测定病原菌对6种化学杀菌剂和6种生物杀菌剂的敏感性。
结果病原菌鉴定为斯高维尔炭疽菌Colletotrichum scovillei；室内药剂敏感性测定发现12种杀菌剂对C. scovillei均有一定的抑制作用，75%(w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC的抑制效果最好，EC50分别为0.254、0.731、0.745 mg/L。其次是200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL、3%(w)中生菌素WP、10 g/L申嗪霉素SC、80 g/L宁南霉素AS、200 g/L异硫氰酸烯丙酯EW和10 g/L蛇床子素ME，EC50分别为1.238、1.307、1.711、2.929、3.175和2.191 mg/L。将10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC按照1∶4、2∶3的体积比复配时，联合毒力测定和评价结果显示两者复配对该病菌具有协同增效作用。
结论本研究可为辣椒生产中辣椒炭疽病的田间药剂防治提供参考。
Abstract:ObjectiveTo identify the pathogenic fungi of pepper anthracnose and screen the fungicides with strong inhibitory effects.
MethodThe typical leaves and fruits with anthracnose symptoms were collected from the peppers named ‘Dangwu’ in Huaxi, Guiyang, Guizhou. The pathogen was isolated. Its pathogenicity and classification were determined by monospore isolation, Koch’s postulates, and morphological characteristics combined with multi-locus (ITS, ACT, GAPDH andCHS-1) phylogenetic analysis. The sensitivities of pathogen to six chemical fungicides and six biological fungicides were investigated by the mycelial growth rate method.
ResultThe pathogen causing pepper ‘Dangwu’ anthracnose in Huaxi was identified as Colletotrichum scovillei. The indoor fungicide sensitivity test showed that 12 fungicides all had certain inhibitory effect against C. scovillei. The inhibition effects of 75%(w) trifloxystrobin·tebuconazole WDG, 10%(w) difenoconazole WDG and 250 g/L pyraclostrobin SC were higher with the EC50 of 0.254, 0.731 and 0.745 mg/L, respectively, followed by 200 g/L allylisothiocyanate SL, 3% (w) zhongshengmycin WP, 10 g/L phenazine-1-carboxylic acid SC, 80 g/L ningnanmycin AS, 200 g/L allylisothiocyanate EW and 10 g/L osthol ME with the EC50 of 1.238, 1.307, 1.711, 2.929, 3.175 and 2.191 mg/L, respectively. 10% (w) difenoconazole WDG and 250 g/L pyraclostrobin SC mixed at the volume ratio of 1∶4 or 2∶3 showed an obvious synergistic effect on inhibiting the pathogen based on the joint toxicity test and evaluation results.
ConclusionThis study can provide references for the field prevention and control of pepper anthracnose using pesticides.
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辣椒Capsicum annuum是贵州省主要的经济作物之一，2020年，贵州省辣椒种植面积达36万hm2，全国第一，产值达242亿元，约占全国的1/6，全球的1/10[1]。随着贵州省辣椒种植面积不断扩大，辣椒真菌性病害的为害也在逐年加剧。辣椒的真菌性病害多达15种，可造成辣椒生产减产20%~50%，其中，由链格孢属Alternaria sp.真菌引起的黑斑病、镰刀菌属Fusarium sp.真菌引起的根腐病和炭疽菌属Colletotrichum sp.真菌引起的炭疽病为害较严重[2]。李小霞等[3]调查了贵州省遵义、湄潭、清镇、花溪和大方等地辣椒炭疽病的发病情况，结果显示黑色炭疽菌C. nigium、黑点炭疽菌C. capsici和胶孢炭疽菌C. gloeosporioides是引起这些地区辣椒炭疽病的主要病原菌，明确了75%(w)甲基布拖津WP对C. nigium菌丝生长具有较好的抑制效果。王妮等[4]从贵阳市花溪区磊庄村辣椒基地分离得到1株辣椒炭疽病病原菌，鉴定为尖孢炭疽菌C. acutatum，且30%(w)吡唑醚菌酯SC与25%(w)咪鲜胺EC对病原菌菌丝生长的抑制效果最好，此外，大豆炭疽菌C. truncatum、菠菜炭疽菌C. spinaciae、博宁炭疽菌C. boninense、斯高威尔炭疽菌C. scovillei等炭疽菌属真菌也是辣椒炭疽病的致病菌[5-6]。因此，鉴定辣椒炭疽病病原菌种属并有针对性地进行防治药剂筛选，对辣椒炭疽病防控具有重要意义。
利用化学手段防治辣椒炭疽病仍是关键且有效的措施，常用的化学杀菌剂有味鲜胺、甲基硫菌灵、多菌灵和代森锰锌等，但长期单一使用某种化学药物，不仅使病原菌产生抗药性，还加剧土壤中农药残留等问题[7]。不同类型化学农药交替施用或配合施用，可有效解决上述问题[8]。采用对环境友好的生物农药，不仅能改善土壤微生物结构，也能提高植株抗病性[9-10]。本研究对贵州省花溪区辣椒炭疽病菌进行分离鉴定及致病力测定；通过测定12种杀菌剂及其混配药剂对辣椒炭疽病菌的毒力作用，筛选对该病菌具有抑制作用的化学药剂，以期为辣椒炭疽病的防治提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
标本均采自贵州省花溪区辣椒种植基地辣椒炭疽病发病严重地块，选取带有典型病症的病叶或病果，共采集样品11份，其中，病果5份，病叶6份。供试辣椒品种为‘党武’。
培养基为水琼脂培养基(WA)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)[11]。
化学杀菌剂：75%(w)肟菌·戊唑醇WDG购自拜耳作物科学(中国)有限公司北京分公司；10%(w)苯醚甲环唑WDG购自先正达南通作物保护有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯SC购自江苏托球农化股份有限公司；227 g/L二氰蒽醌 SC购自江西禾益化工股份有限公司、500 g/L丙环唑 ME购自山东省青岛格力斯药业有限公司；250 g/L溴菌腈 EC购自江苏托球农化股份有限公司。
植物源杀菌剂：10 g/L蛇床子素ME购自云南南宝生物科技有限责任公司；200 g/L异硫氰酸烯丙酯EW购自江苏腾龙生物药业有限公司；200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL购自北京亚戈农生物药业有限公司。
微生物源杀菌剂：3%(w)中生菌素WP购自深圳诺普信农化股份有限公司；10 g/L申嗪霉素SC购自上海农乐生物制品股份有限公司；80 g/L宁南霉素AS购自德强生物股份有限公司。
1.2 病原菌分离与鉴定
1.2.1 病原菌的分离
病原菌分离采用单孢分离法[12]，并稍加改动。在体视镜下用无菌手术刀将病样上的分生孢子堆切下，置于无菌水中，用移液枪反复吸打将分生孢子堆分散混匀，吸取100 μL孢子悬浮液放入WA平板中均匀涂布，室温下正置培养8~12 h后，在显微镜下用无菌手术刀挑取单个已萌发的分生孢子，转移至PDA平板上，25 ℃、黑暗条件培养7 d后观察菌落形态。
1.2.2 病原菌的致病性
将纯化的菌株接种于PDA平板上，于25 ℃条件下培养7~14 d，待产孢后，将分生孢子冲洗制成孢子悬浮液，用血球计数板计算悬浮液孢子数量，最终将数量调整至1.0 × 10 6/mL。采用刺伤接种法，参考Than 等[13]的方法并稍加改动。健康辣椒果实和叶片用φ为75%乙醇溶液表面消毒30 s，无菌水清洗3次后晾干备用。将表面消毒的果实和叶片置于含有滤纸的保鲜盒(长、宽、高为10 cm×8 cm×5 cm)中。采用无菌接种针刺伤供试植物组织，在刺伤处滴加 10 µL 孢子悬浮液，阴性对照滴加 10 µL 无菌水，每个处理重复3次。接种好的植物材料置于光照培养箱中培养，光照周期为12 h光∶12 h暗，湿度(w)为80%，温度为25 ℃，2 d后观察并记录发病情况。
1.2.3 病原菌的形态观察
利用Leica S8APO 体式显微镜和Olympus BX 53光学显微镜对病原菌进行观察，并拍照记录菌落特征和孢子形态。参照刘方玲[14]的研究方法进行附着胞的观察，将28 ℃条件下培养7 d的病原菌用无菌水洗脱配制孢子悬浮液，在显微镜10×40倍下每视野观察孢子约30~50个，选取无菌载玻片，在其中央滴1滴孢子悬浮液，置于28 ℃条件下保湿培养24~48 h，观察附着孢的形成。
1.2.4 病原菌分子鉴定
根据真菌DNA提取试剂盒 (Biomiga Fungal gDNA Kit) 说明书提取病原菌基因组DNA，分别选择内转录间隔区(Internal transcribed spacers，ITS)、肌动蛋白基因(Actin gene，ACT)、几丁质合成酶(Chitin synthase 1，CHS-1)和3–磷酸甘油醛脱氢酶(3-Ghosphate-glycerol aldehyde dehydrogenase，GAPDH)基因引物(表1)进行PCR扩增，扩增产物采用10 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后将扩增产物送往上海生工生物技术有限公司进行测序。将测序所得序列在GenBank数据库中进行比对，参照Damm等[18]的研究选取相关炭疽菌株基因序列(表2)，用系统发育分析软件MEGA X执行最大简约法(Maximum likelihood，ML)[19]构建系统发育树。本研究所得的序列提交到 NCBI 的 GenBank 数据库，并获取相应的序列号(表2)。
表 1 本研究所用的引物Table 1. Primers used in this study基因 Gene 引物 Primer 引物序列 (5′→3′) Primer sequence ITS ITS1[15] TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4[15] TCCTCCGCTTATTGATATGC ACT ACT-512F[16] ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC ACT-783R[16] TACGAGTCCTTCTGGCCCAT CHS-1 CHS-79F[16] TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG CHS-354R[16] TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG GAPDH gpd1[17] CAACGGCTTCGGTCGCATTG gpd2[17] GCCAAGCAGTTGGTTGTGC 表 2 多基因序列分析所用菌株信息1)Table 2. Species used for multi-gene phylogeny analysis in this study种名 Species 菌株编号 Strain No. 序列号 GenBank No. ITS GAPDH CHS-1 ACT Colletotrichum acutatum CBS 129921 JQ948380 JQ948711 JQ949041 JQ949701 CBS 129922 JQ948381 JQ948712 JQ949042 JQ949702 C. chrysanthemi IMI 364540 JQ948273 JQ948603 JQ948934 JQ949594 CBS 126518 JQ948271 JQ948601 JQ948932 JQ949592 C. fioriniae CBS 127600 JQ948308 JQ948638 JQ948969 JQ949629 CBS 127599 JQ948309 JQ948639 JQ948970 JQ949630 C. lupini CBS 109225 NR111730 JQ948485 JQ948816 JQ949476 CBS 129944 MH865693 JQ948508 JQ948839 JQ949499 C. nymphaeae CBS 129945 MH865694 JQ948531 JQ948862 JQ949522 CBS 129937 MH865686 JQ948583 JQ948914 JQ949574 C. paxtonii CBS 502.97 JQ948286 JQ948616 JQ948947 JQ949607 IMI 165753 JQ948285 JQ948615 JQ948946 JQ949606 C. scovillei CBS 126529 NR111737 JQ948597 JQ948928 JQ949588 HGUP LJ169 MW741882 MW751812 MW751811 MW751810 C. simmondsii CBS 294.67 JQ948277 JQ948607 JQ948938 JQ949598 CBS 295.67 JQ948278 JQ948608 JQ948939 JQ949599 C. tamarilloi CBS 129814 JQ948184 JQ948514 JQ948845 JQ949505 CBS 129811 JQ948185 JQ948515 JQ948846 JQ949506 1)加粗字体表示本研究分离得到的菌株 1)The bold fonts show the isolated strain of this study 1.3 杀菌剂敏感性测定
1.3.1 单剂毒力测定
采用菌丝生长速率法[11]进行室内药剂筛选。将各供试药剂用无菌水配制成母液，母液浓度为终浓度的10倍，然后以体积比1∶9分别加至冷却至 45 ℃ 的 PDA 培养基中，充分摇匀后制成含药平板，终质量浓度见表3。用打孔器在供试菌株菌落边缘处打取0.5 cm菌饼，用接种针挑取菌饼接种在PDA平板的中央，以无菌水作对照，每个浓度3次重复，25 ℃条件下培养7 d，采用十字交叉法量取菌落直径(D)，计算抑制率。
表 3 供试杀菌剂及有效成分质量浓度Table 3. Fungicides and the contentrations of active ingredients used in this study杀菌剂 Fungicide 有效成分质量浓度/(mg·L−1) Concentration of active ingredient 药剂类型 Type of drug 75% (w)肟菌·戊唑醇 WDG 75% (w) Trifloxystrobin·tebuconazole WDG 0.075 0.150 0.300 0.600 1.200 甲氧基氨基甲酸酯类+三唑类 Methoxycarbamate carbamate+triazol 10% (w)苯醚甲环唑 WDG 10% (w) Difenoconazole WDG 0.15 0.30 0.60 1.20 2.40 三唑类 Triazol 250 g/L吡唑醚菌酯 SC 250 g/L Pyraclostrobin SC 0.15 0.30 0.60 1.20 2.40 甲氧基氨基甲酸酯类 Methoxycarbamate carbamate 227 g/L二氰蒽醌 SC 227 g/L Dithianon SC 37.50 75.00 150.00 300.00 600.00 醌类 Quinones 500 g/L丙环唑 ME 500 g/L Propiconazol ME 16.70 33.40 66.80 133.60 267.20 三唑类 Triazol 250 g/L溴菌腈 EC 250 g/L Bromothalonil EC 14.00 28.00 56.00 112.00 224.00 溴代氰烷烃类 Bromocyanoalkanes 10 g/L蛇床子素 ME 10 g/L Osthole ME 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 植物源 Plant source 10 g/L申嗪霉素 SC 10 g/L Phenazine-1-carboxylic acid SC 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 微生物源 Microorganism source 80 g/L宁南霉素 AS 80 g/L Ningnanmycin AS 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 微生物源 Microorganism source 3% (w)中生菌素 WP 3% (w) Zhongshengmycin WP 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 微生物源 Microorganism source 200 g/L异硫氰酸烯丙酯 EW 200 g/L Allylisothiocyanate EW 0.80 1.60 3.20 6.40 12.80 植物源 Plant source 200 g/L异硫氰酸烯丙酯 SL 200 g/L Allylisothiocyanate SL 0.40 0.80 1.60 3.20 6.40 植物源 Plant source $$ 抑制率=\dfrac{(D_{对照}-D_{处理})}{D_{对照}} \times 100{\text{%}}。 $$ 1.3.2 混剂毒力测定
根据单剂毒力测定结果，选择作用机制不同且抑制效果较好的2种杀菌剂以不同的体积比(4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4)进行复配，每个体积比设置5个浓度梯度，每个梯度设置3次重复，计算EC50，采用黄清臻等[20]的方法计算共毒系数(Co-toxicity coefficient)。
1.4 数据处理
使用Excel和DPS软件进行数据整理和分析。
2. 结果与分析
2.1 致病性测定
通过对采集的典型炭疽病发病叶片和果实进行单孢分离，从11份培养物中共分离得到8株具有致病力的菌株，分离率为72.7%，其中，菌株HGUP LJ169致病力最强。菌株HGUP LJ169致病性测定结果如图1所示，有伤接种的辣椒叶片在3 d后开始表现出病害症状，发病中心呈灰白色至深棕色，病斑边缘呈现黄色，对照叶片无发病症状(图1A、1B)。有伤接种的辣椒果实在5 d后开始表现病害症状，发病中心灰白色至深褐色，病斑凹陷，呈长椭圆形，边缘呈黑色，对照果实无发病症状(图1C、1D)。发病叶片和果实症状与原病害样本症状一致，对接种发病叶片和果实进行病原菌的再分离，经鉴定与原接种菌种相同，符合科赫氏法则，以上结果证明菌株HGUP LJ169为‘党武’辣椒炭疽病的致病菌。
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图 1 菌株HGUP LJ169致病性测定A和C：无菌水对照；B：刺伤法接种叶片发病症状；D：刺伤法接种果实发病症状Figure 1. Pathogenicity test of HGUP LJ169A, C: Sterile water control; B: Symptoms of leaf onset by prick inoculation; D: Symptoms of fruit onset by prick inoculation2.2 形态学鉴定
如图2所示，菌株HGUP LJ169在PDA培养基上于28 ℃条件下培养7 d后菌落直径达8.0~9.0 cm。菌落圆形，边缘整齐，菌丝致密、羊绒状，白色至浅灰色，菌落中心隆起呈灰白色同心轮纹状生长，菌落背面橘黄色至灰黑色，有时在背面有深色斑点(图2A、2B)。分生孢子附着胞棕色，卵圆形或圆形，边缘整齐；大小为：4.1~4.9×6.7~11.4 µm，
$ \bar{x} $ =(4.53±0.49)×(8.73±0.93)，n=30(图2C~2F)；分生孢子单胞、无色、壁光滑，圆柱状，两端钝圆，有油球，大小为：3.1~8.2×4.6~17.2 µm，$ \bar{x} $ =(4.16±0.37)×(12.67±1.47)，n=50(图2G)，根据菌株的形态学特征，初步鉴定菌株为Colletotrichum sp.。![]()
图 2 菌株HGUP LJ169的形态特征A、B：菌落形态；C~F：分生孢子附着胞；G: 分生孢子Figure 2. Morphological characteristics of HGUP LJ169A, B: Colony morphology; C-F: Appressorium; G: Conidia2.3 系统发育树分析
采用ITS、ACT、CHS-1、GAPDH等基因序列构建多基因联合系统发育树，如图3所示，在以C. acutatum CBS 129921和C. acutatum CBS 129922菌株为外群的系统发育树中，菌株HGUP LJ169与C. scovillei CBS 126529 以 100% 的支持率聚集于一支，并与其他种明显区分开。与菌株C. scovillei CBS 126529相比，ITS序列相似性达100%，ACT序列相似性达100%，CHS-1序列相似性达99%，GAPDH序列相似性达100%。因此，结合菌株形态学特征，将菌株HGUP LJ169鉴定为斯高维尔炭疽菌C. scovillei。
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图 3 基于ITS、ACT、CHS-1、GAPDH基因序列的菌株系统发育树标尺表示遗传距离，分支上的数字表示支持率(%)Figure 3. Phylogenetic tree of bacterial strains based on ITS, GADPH, CHS-1 and ACT gene sequencesThe scale bar shows the genetic distance，and the number on the node shows the Bootstrap support rate (%)2.4 12种杀菌剂的敏感性测定
由表4可见，12种杀菌剂对辣椒炭疽病菌C. scovillei均表现出一定的抑制效果，但对菌丝生长的抑制效果不同，毒力差异较大。所选用的6种化学药剂中，75%(w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC抑菌效果最好，其EC50分别为0.254、0.731和0.745 mg/L；所选用的6种生物农药中，200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL和3%(w)中生菌素WP抑菌效果较好，其EC50分别为1.238 和1.307 mg/L。
表 4 12种杀菌剂对Colletotrichum scovillei的抑制效果Table 4. Inhibitory effects of twelve fungicides against Colletotrichum scovillei杀菌剂 Fungicide 毒力回归方程1)Regression equation of toxicity EC50/ (mg·L−1) EC50 95%置信限/ (mg·L−1) 95% confidence limit of EC50 相关系数 (R) Correlation coefficient 75% (w)肟菌·戊唑醇WDG 75% (w) Trifloxystrobin·tebuconazole WDG y=5.5671+0.9525x 0.254 0.222~0.291 0.9924 10% (w)苯醚甲环唑WDG 10% (w) Difenoconazole WDG y=5.9588+0.8439x 0.731 0.623~0.843 0.9884 250 g/L吡唑醚菌酯SC 250 g/L Pyraclostrobin SC y=5.6501+0.5764x 0.745 0.658~0.843 0.9959 227 g/L二氰蒽醌SC 227 g/L Dithianon SC y=4.2691+0.9029x 64.490 40.020~103.921 0.9408 500 g/L丙环唑ME 500 g/L Propiconazol ME y=4.3835+0.9116x 47.453 40.574~55.499 0.9912 250 g/L溴菌腈EC 250 g/L Bromothalonil EC y=4.8736+0.4457x 19.218 17.062~21.648 0.9948 10 g/L蛇床子素ME 10 g/L Osthole ME y=3.5437+1.0864x 2.191 1.195~4.0156 0.9656 10 g/L申嗪霉素SC 10 g/L Phenazine-1-carboxylic acid SC y=3.5916+1.1421x 1.711 1.418~2.063 0.9956 80 g/L宁南霉素AS 80 g/L Ningnanmycin AS y=3.1609+1.2538x 2.929 1.659~5.171 0.9715 3% (w)中生菌素WP 3%(w) Zhongshengmycin WP y=3.6943+1.1698x 1.307 0.675~2.531 0.9586 20 g/L异硫氰酸烯丙酯 EW 200 g/L Allylisothiocyanate EW y=3.8994+1.9167x 3.175 3.499~4.022 0.9981 200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL 200 g/L Allylisothiocyanate SL y=4.8799+1.2955x 1.238 1.027~1.493 0.9906 1) x为药剂剂量取对数，y为死亡率转换成概率 1) x: Log value of the agent dose, y: Probability converted form mortality 2.5 混配药剂共毒系数计算
由表5可见，将250g/L吡唑醚菌酯SC和10%(w)苯醚甲环唑WDG按照体积比为4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4配比进行混配并测定其共毒系数及联合毒力，结果表明，配比组合为4∶1、3∶2、1∶1、2∶3和1∶4时，EC50均较小，且明显小于2种单剂的EC50。5种配比组合的共毒系数分别为635.953、420.795、125.992、108.012、95.836，说明以这5种配比组合进行混配均对该辣椒炭疽病菌具有较好的抑制作用。配比为4∶1、3∶2和1∶1时其共毒系数大于120，表现出明显的增效作用；配比为2∶3和1∶4时其共毒系数大于80，小于120，表现出相加作用。综合以上，5种药剂配比中，250 g/L吡唑醚菌酯SC和10%(w)苯醚甲环唑WDG 体积比为4∶1时为最佳配比。
表 5 苯醚甲环唑WDG和吡唑醚菌酯SC对Colletotrichum scovillei的联合毒力作用Table 5. Co-toxicity of the mixed difenoconazole WDG and pyraclostrobin SC to Colletotrichum scovilleiV(吡唑醚菌酯):V(苯醚甲环锉) V(Difenoconazole): V(Pyraclostrobin) 毒力回归方程1)Regression equation of toxicity 相关系数 (R) Correlation coefficient EC50/ (mg·L−1) EC50 95%置信限/ (mg·L−1) 95% confidence limit of EC50 共毒系数 Co-toxicity coefficient 效果 Effect 4∶1 y=5.1605+0.8151x 0.9969 0.117 0.099~0.137 635.953 增效 Synergy 3∶2 y=5.6904+0.9141x 0.9964 0.176 0.154~0.201 420.795 增效 Synergy 1∶1 y=5.3989+1.7171x 0.9707 0.586 0.440~0.780 125.992 增效 Synergy 2∶3 y=5.2299+1.3827x 0.9892 0.682 0.566~0.822 108.012 相加 Additive effect 1∶4 y=5.1727+1.5551x 0.9895 0.774 0.624~0.962 95.836 相加 Additive effect 1) x为药剂剂量取对数，y为死亡率转换成概率 1) x: Log value of the agent dose, y: Probability converted form mortality 3. 结论与讨论
本研究中通过病原菌分离和致病力测定，依据病原菌形态学，结合ITS、GADPH、CHS-1和ACT基因序列构建系统发育树对比分析，将菌株HGUP LJ169鉴定为C. scovillei。由C. scovillei引起的辣椒炭疽病在安徽、甘肃、美国南卡罗来纳州、日本岛根县、韩国、巴西等地均有发现，而在贵州鲜见报道[21-25]。C. scovillei侵染后发病速度快、传染性强，具有很强的寄主组织专化性，能够危害芒果、苹果等，对果实产量和品质造成一定的影响[26-27]。结合本研究，表明贵州省花溪区辣椒炭疽病可由C. scovillei引起，明确病原菌的分类地位有利于为后续研究其病害的防治提供依据。
本研究以菌株HGUP LJ169为靶标病原菌，采用菌丝生长速率法测定了C. scovillei对生产中常用的12种杀菌剂的敏感性。结果表明，所选用的6种化学杀菌剂对C. scovillei均表现出一定的抑制效果，其中75% (w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC抑菌效果最好；同时在测定单一化学杀菌剂室内抑制效果的基础上，选用了2种作用机制不同的化学杀菌剂，10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC在不同体积配比下对C. scovillei的室内抑制作用，2种药剂的复配抑制效果较好，其中最佳配比体积比为4∶1，可用于下一步的辣椒炭疽病田间药剂筛选。所选用的6种生物杀菌剂(3种微生物源杀菌剂和3种植物源杀菌剂)均具有一定的防治潜力，200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL和3%(w)中生菌素WP抑菌效果较好；6种生物杀菌剂的抑菌效果均优于溴代氰烷烃类杀菌剂(250 g/L溴菌腈EC)、三唑类杀菌剂(500 g/L丙环唑ME)和醌类杀菌剂(227 g/L二氰蒽醌SC)。研究结果表明C. scovillei对溴菌腈、丙环唑和二氰蒽醌的敏感性较低，其原因可能是生产中长期使用这3种药剂，导致C. scovillei产生了一定抗性。长期或同时使用同种类型杀菌剂可能会导致病原菌产生抗药性，炭疽菌对甲氧基氨基甲酸酯类杀菌剂和三唑类杀菌剂的自发突变频率较高，且存在一定的抗性分化[28-30]。若长时间单一使用某种杀菌剂，可能会导致病原菌产生抗药性，不同类型杀菌剂交替或配合使用，可延缓抗药性的产生，延长药剂的使用寿命。本研究可为生产中常用防治辣椒炭疽病药剂的替代药剂或轮换药剂的使用提供参考。
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图 1 菌株HGUP LJ169致病性测定
A和C：无菌水对照；B：刺伤法接种叶片发病症状；D：刺伤法接种果实发病症状
Figure 1. Pathogenicity test of HGUP LJ169
A, C: Sterile water control; B: Symptoms of leaf onset by prick inoculation; D: Symptoms of fruit onset by prick inoculation
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图 2 菌株HGUP LJ169的形态特征
A、B：菌落形态；C~F：分生孢子附着胞；G: 分生孢子
Figure 2. Morphological characteristics of HGUP LJ169
A, B: Colony morphology; C-F: Appressorium; G: Conidia
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图 3 基于ITS、ACT、CHS-1、GAPDH基因序列的菌株系统发育树
标尺表示遗传距离，分支上的数字表示支持率(%)
Figure 3. Phylogenetic tree of bacterial strains based on ITS, GADPH, CHS-1 and ACT gene sequences
The scale bar shows the genetic distance，and the number on the node shows the Bootstrap support rate (%)
表 1 本研究所用的引物
Table 1 Primers used in this study
基因 Gene 引物 Primer 引物序列 (5′→3′) Primer sequence ITS ITS1[15] TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4[15] TCCTCCGCTTATTGATATGC ACT ACT-512F[16] ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC ACT-783R[16] TACGAGTCCTTCTGGCCCAT CHS-1 CHS-79F[16] TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG CHS-354R[16] TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG GAPDH gpd1[17] CAACGGCTTCGGTCGCATTG gpd2[17] GCCAAGCAGTTGGTTGTGC 
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表 2 多基因序列分析所用菌株信息1)
Table 2 Species used for multi-gene phylogeny analysis in this study
种名 Species 菌株编号 Strain No. 序列号 GenBank No. ITS GAPDH CHS-1 ACT Colletotrichum acutatum CBS 129921 JQ948380 JQ948711 JQ949041 JQ949701 CBS 129922 JQ948381 JQ948712 JQ949042 JQ949702 C. chrysanthemi IMI 364540 JQ948273 JQ948603 JQ948934 JQ949594 CBS 126518 JQ948271 JQ948601 JQ948932 JQ949592 C. fioriniae CBS 127600 JQ948308 JQ948638 JQ948969 JQ949629 CBS 127599 JQ948309 JQ948639 JQ948970 JQ949630 C. lupini CBS 109225 NR111730 JQ948485 JQ948816 JQ949476 CBS 129944 MH865693 JQ948508 JQ948839 JQ949499 C. nymphaeae CBS 129945 MH865694 JQ948531 JQ948862 JQ949522 CBS 129937 MH865686 JQ948583 JQ948914 JQ949574 C. paxtonii CBS 502.97 JQ948286 JQ948616 JQ948947 JQ949607 IMI 165753 JQ948285 JQ948615 JQ948946 JQ949606 C. scovillei CBS 126529 NR111737 JQ948597 JQ948928 JQ949588 HGUP LJ169 MW741882 MW751812 MW751811 MW751810 C. simmondsii CBS 294.67 JQ948277 JQ948607 JQ948938 JQ949598 CBS 295.67 JQ948278 JQ948608 JQ948939 JQ949599 C. tamarilloi CBS 129814 JQ948184 JQ948514 JQ948845 JQ949505 CBS 129811 JQ948185 JQ948515 JQ948846 JQ949506 1)加粗字体表示本研究分离得到的菌株 1)The bold fonts show the isolated strain of this study
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表 3 供试杀菌剂及有效成分质量浓度
Table 3 Fungicides and the contentrations of active ingredients used in this study
杀菌剂 Fungicide 有效成分质量浓度/(mg·L−1) Concentration of active ingredient 药剂类型 Type of drug 75% (w)肟菌·戊唑醇 WDG 75% (w) Trifloxystrobin·tebuconazole WDG 0.075 0.150 0.300 0.600 1.200 甲氧基氨基甲酸酯类+三唑类 Methoxycarbamate carbamate+triazol 10% (w)苯醚甲环唑 WDG 10% (w) Difenoconazole WDG 0.15 0.30 0.60 1.20 2.40 三唑类 Triazol 250 g/L吡唑醚菌酯 SC 250 g/L Pyraclostrobin SC 0.15 0.30 0.60 1.20 2.40 甲氧基氨基甲酸酯类 Methoxycarbamate carbamate 227 g/L二氰蒽醌 SC 227 g/L Dithianon SC 37.50 75.00 150.00 300.00 600.00 醌类 Quinones 500 g/L丙环唑 ME 500 g/L Propiconazol ME 16.70 33.40 66.80 133.60 267.20 三唑类 Triazol 250 g/L溴菌腈 EC 250 g/L Bromothalonil EC 14.00 28.00 56.00 112.00 224.00 溴代氰烷烃类 Bromocyanoalkanes 10 g/L蛇床子素 ME 10 g/L Osthole ME 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 植物源 Plant source 10 g/L申嗪霉素 SC 10 g/L Phenazine-1-carboxylic acid SC 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 微生物源 Microorganism source 80 g/L宁南霉素 AS 80 g/L Ningnanmycin AS 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 微生物源 Microorganism source 3% (w)中生菌素 WP 3% (w) Zhongshengmycin WP 0.98 3.91 15.63 62.50 250.00 微生物源 Microorganism source 200 g/L异硫氰酸烯丙酯 EW 200 g/L Allylisothiocyanate EW 0.80 1.60 3.20 6.40 12.80 植物源 Plant source 200 g/L异硫氰酸烯丙酯 SL 200 g/L Allylisothiocyanate SL 0.40 0.80 1.60 3.20 6.40 植物源 Plant source
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表 4 12种杀菌剂对Colletotrichum scovillei的抑制效果
Table 4 Inhibitory effects of twelve fungicides against Colletotrichum scovillei
杀菌剂 Fungicide 毒力回归方程1)Regression equation of toxicity EC50/ (mg·L−1) EC50 95%置信限/ (mg·L−1) 95% confidence limit of EC50 相关系数 (R) Correlation coefficient 75% (w)肟菌·戊唑醇WDG 75% (w) Trifloxystrobin·tebuconazole WDG y=5.5671+0.9525x 0.254 0.222~0.291 0.9924 10% (w)苯醚甲环唑WDG 10% (w) Difenoconazole WDG y=5.9588+0.8439x 0.731 0.623~0.843 0.9884 250 g/L吡唑醚菌酯SC 250 g/L Pyraclostrobin SC y=5.6501+0.5764x 0.745 0.658~0.843 0.9959 227 g/L二氰蒽醌SC 227 g/L Dithianon SC y=4.2691+0.9029x 64.490 40.020~103.921 0.9408 500 g/L丙环唑ME 500 g/L Propiconazol ME y=4.3835+0.9116x 47.453 40.574~55.499 0.9912 250 g/L溴菌腈EC 250 g/L Bromothalonil EC y=4.8736+0.4457x 19.218 17.062~21.648 0.9948 10 g/L蛇床子素ME 10 g/L Osthole ME y=3.5437+1.0864x 2.191 1.195~4.0156 0.9656 10 g/L申嗪霉素SC 10 g/L Phenazine-1-carboxylic acid SC y=3.5916+1.1421x 1.711 1.418~2.063 0.9956 80 g/L宁南霉素AS 80 g/L Ningnanmycin AS y=3.1609+1.2538x 2.929 1.659~5.171 0.9715 3% (w)中生菌素WP 3%(w) Zhongshengmycin WP y=3.6943+1.1698x 1.307 0.675~2.531 0.9586 20 g/L异硫氰酸烯丙酯 EW 200 g/L Allylisothiocyanate EW y=3.8994+1.9167x 3.175 3.499~4.022 0.9981 200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL 200 g/L Allylisothiocyanate SL y=4.8799+1.2955x 1.238 1.027~1.493 0.9906 1) x为药剂剂量取对数，y为死亡率转换成概率 1) x: Log value of the agent dose, y: Probability converted form mortality
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表 5 苯醚甲环唑WDG和吡唑醚菌酯SC对Colletotrichum scovillei的联合毒力作用
Table 5 Co-toxicity of the mixed difenoconazole WDG and pyraclostrobin SC to Colletotrichum scovillei
V(吡唑醚菌酯):V(苯醚甲环锉) V(Difenoconazole): V(Pyraclostrobin) 毒力回归方程1)Regression equation of toxicity 相关系数 (R) Correlation coefficient EC50/ (mg·L−1) EC50 95%置信限/ (mg·L−1) 95% confidence limit of EC50 共毒系数 Co-toxicity coefficient 效果 Effect 4∶1 y=5.1605+0.8151x 0.9969 0.117 0.099~0.137 635.953 增效 Synergy 3∶2 y=5.6904+0.9141x 0.9964 0.176 0.154~0.201 420.795 增效 Synergy 1∶1 y=5.3989+1.7171x 0.9707 0.586 0.440~0.780 125.992 增效 Synergy 2∶3 y=5.2299+1.3827x 0.9892 0.682 0.566~0.822 108.012 相加 Additive effect 1∶4 y=5.1727+1.5551x 0.9895 0.774 0.624~0.962 95.836 相加 Additive effect 1) x为药剂剂量取对数，y为死亡率转换成概率 1) x: Log value of the agent dose, y: Probability converted form mortality
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