Resistance to blue ear disease and production performance assessment of CD163 gene-edited Large White pigs
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摘要:目的
运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout，CD163-KO)的克隆猪，验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性，并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别，评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。
方法用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状，记录直肠温度变化，检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片，通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色，观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况；采集猪外周血单核细胞进行诱导分化，观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白−结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后，统计分析CD163-KO与野生型大白猪的生产性能及公猪的繁殖性能。
结果本研究获得的CD163-KO大白猪对蓝耳病NADC30-like毒株具有完全抗性，敲除CD163基因不影响巨噬细胞的生理功能，CD163-KO与野生型大白猪的生长性能和繁殖性能无明显差异。
结论本研究是对CD163-KO猪抵抗蓝耳病的又一佐证和补充，证明CD163基因敲除操作对生产性能没有潜在的负面影响，为抗蓝耳病猪的生物安全提供了支撑。
Abstract:ObjectiveThe purpose of this study was to generate CD163 gene knockout (CD163-KO) Large White pigs by CRISPR/Cas9 gene editing and somatic cell nuclear transfer technologies, investigate the resistance to blue ear disease and the biosafety effect including physiology, productive and reproductive performances of the gene knockout pigs, and assess the main production performances of CD163-KO Large White pigs.
MethodIn this study, the 11 CD163-KO pigs and five age- and body weight-matched wild type Large White pigs were challenged with NADC30-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). The rectal temperature, PRRSV antibody and virus variation were monitored continuously for 14 days. The lung tissues were examined by immunofluorescence of PRRSV antigen. Expression of CD163 protein on the surface of pulmonary alveolar macrophages in wild type and CD163-KO Large White pigs were examined through immunofluorescence staining. We compared the differentiation potential of monocytes into macrophages between CD163-KO and wild type pigs, and observed their uptake capacities to hemoglobin-haptoglobin complex. In addition, we analyzed the growth and reproductive production of the boars between CD163-KO pigs and wild type control to assess their biosafety and breeding value.
ResultCD163-KO pigs were completely resistant to NADC30-like strain without impairing the biological function associated with the modified gene, as well as productive and reproductive performances.
ConclusionThis study is an evidence and supplement of CD163-KO pigs resistance to blue ear disease, and demonstrates that CD163 gene knockout has no potentially negative effects on production performance, which provides evidences for the biosecurity of CD163-KO pigs.
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甜玉米Zea mays L. saccharata Sturt.属于禾本科玉米属，又称水果玉米，是普通玉米胚乳淀粉合成基因发生隐性突变形成的特殊玉米类型[1-2]。甜玉米鲜嫩香甜，营养价值高，维生素、蛋白质、糖和脂肪等含量均显著高于普通玉米[3]。甜玉米富含7种“抗衰剂”——钙、谷胱甘肽、维生素、镁、硒、维生素E和脂肪酸，还具有降低胆固醇、软化血管和防治冠心病的作用，深受消费者喜爱[4]。近年来，我国甜玉米种植面积、单产连年攀升。随着人们消费水平的提高，消费者对甜玉米食用品质、营养品质的要求不断提升，带动了对甜玉米品质的深入研究[5]。
关于谷物、蔬菜及水果在贮藏过程中可溶性固形物、蛋白质和糖分等营养物质变化有诸多研究[6-10]，但关于挥发性风味物质变化的报道较少[9, 11-13]。谷物和豆类在储存过程中会发生明显的生化和营养变化[6,14-16]；谷物的含水量和储存温度会导致pH，游离氨基氮、可溶性固形物、蛋白质和淀粉含量等急剧变化[6-8]；甜椒在储藏期间芳香族挥发物含量显著降低[9]；杏在低温储存一段时间后，无法恢复水果的果香[10]。甜玉米采收后货架期有限，随着贮藏时间延长，食用品质和营养品质逐渐降低。风味是甜玉米食用品质的重要衡量标准。风味主要通过挥发性风味物质体现[17]。为探讨贮藏期间甜玉米挥发性风味物质的变化规律，本研究以3个广东省种植面积较大的甜玉米品种—‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’为研究对象，采用顶空固相萃取方法，通过色谱−质谱联用仪测定3个品种在常温和低温储存时挥发性风味物质的变化规律，采用手持数显糖度计测定可溶性固形物含量变化情况，阐明甜玉米采后在不同贮藏温度、贮藏时间下挥发性风味物质和可溶性固形物含量的差异，以期为甜玉米采后品质性状研究奠定基础。
1. 材料方法
1.1 材料
甜玉米品种‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’于2019年秋季种植于华南农业大学增城试验基地。双行种植，行宽0.67 m，株距0.30 m，每个品种种植约40株，采用常规大田管理技术。单株套袋自交，各品种同一天授粉，授粉后22 d取长势一致的果穗用于后续挥发性物质和品质指标的测定。
1.2 方法
1.2.1 材料贮藏处理
低温储藏温度为4 ℃，湿度60%~70%；常温储藏温度为室温(23~26 ℃)，湿度60%~70%。分别于储藏0、3、5 d后取样，取其中3株玉米果穗中部籽粒4~5行混样作为1次重复，每个样品做3次生物学重复。
1.2.2 可溶性固形物含量测定
取不同储藏温度、不同储藏时间的3个甜玉米品种籽粒分别用研钵研磨，2层洁净纱布过滤收集汁液，利用PAL-1手持数显糖度计分别测定各样品可溶性固形物含量。
1.2.3 挥发性物质测定
每个品种籽粒混样约30 g于250 mL三角瓶内，用锡纸包裹住瓶口后盖塞密闭。在80 ℃水浴锅中顶空固相微萃取吸附40 min(萃取纤维头为50/30 μm CAR/DVB/pDMS)，立即插入色谱气化室，解吸5 min，利用气相色谱−质谱联用仪(GC-MS)(安捷伦7890B-5977A)进行分析。GC条件参照褚能明等[18]的方法，并略做修改。色谱柱：DB5柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样；升温程序：50 ℃保持3 min，15 ℃/min升至110 ℃，然后以3 ℃/min升温至170 ℃，再以25 ℃/min升温至250 ℃，维持3 min；载气：高纯He(体积分数为99.999%)，流速：1.0 mL/min；MS条件：电子电离；电离电压：70 eV；离子源温度：280 ℃；选择性离子扫描，扫描质量范围为35~350 U。
1.3 数据处理
GC-MS检测样品中未知挥发性成分定性分析与NIST08谱库匹配，筛选记录匹配度大于80 (最大值为100)的物质，并剔除相对含量小于5%的物质。定量分析按峰面积归一化法进行，求得各挥发性成分的相对含量。使用simca14.1软件进行偏最小二乘分析(Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)[19]，采用TBtools软件( https://github.com/CJ-Chen/TBtools)进行系统聚类分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)[20]。
2. 结果与分析
2.1 3个甜玉米品种可溶性固形物含量分析
利用PAL-1手持数显糖度计分别测定3个甜玉米品种‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’在不同储藏温度和不同储藏时间下的可溶性固形物含量。常温和低温储藏的3个甜玉米品种在不同储藏时间下的可溶性固形物含量均呈现下降趋势，但在不同储藏条件下不同甜玉米品种可溶性固形物含量下降趋势略有差异(图1)。常温和低温储藏0 d的‘奥弗兰’可溶性固形物含量显著高于储藏5 d的‘奥弗兰’；常温和低温储藏0 d的‘王朝’可溶性固形物含量显著高于储藏5 d的‘王朝’，而且常温储藏0天的‘王朝’可溶性固形物含量显著高于储藏3 d的‘王朝’；低温储藏0和3 d的‘广良甜27’可溶性固形物含量均显著高于储藏5 d的‘广良甜27’，常温储藏0、3、5 d的‘广良甜27’可溶性固形物含量间均差异显著。
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图 1 常温和低温不同储藏时间3个甜玉米品种的可溶性固形物含量各图中相同品种柱子上方的不同小写字母表示不同储藏天数间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Soluble solid contents of three sweet corns at different storage time under normal temperature and low temperature storageDifferent lowercase letters on the columns of the same cultivar indicate significant differences among different storage periods (P<0.05, Duncan’s method)2.2 3个甜玉米品种挥发性风味物质测定
利用GC-MS分别测定3个甜玉米品种‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’在不同储藏温度和不同储藏时间下的挥发性风味物质的相对含量(图2，表1)。3个甜玉米品种在常温和低温下分别检测到58和59种挥发性风味物质，其中‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’在常温储存条件下分别检测到33、31、31种；在低温储存条件下分别检测到34、33、27种(表1)。储藏0 d的3个甜玉米品种在34.431~34.439 min处均存在高丰度的峰(十六酸乙酯)(图2)。储藏0 d时‘奥弗兰’相对含量最高的物质为壬醛(具油脂气味和甜橙气息)，但在常温和低温储藏3和5 d时，均未检测到壬醛(表1)。储藏0 d时，‘王朝’相对含量最高的物质也为壬醛，常温储藏3 d时，未检测到壬醛，储藏5 d时，壬醛的相对含量高于0 d；低温储藏3 d时，未检测到壬醛，储藏5 d时，壬醛的相对含量低于0 d (表1)。储藏0 d时，‘广良甜27’相对含量最高的物质为十六酸乙酯(具蜡香、果爵和奶油香气)，常温储藏3 d时，未检测到，储藏5 d时，十六酸乙酯的相对含量低于0 d；低温储藏3 d时，十六酸乙酯的相对含量低于0 d，储藏5 d时，十六酸乙酯的相对含量低于0 d高于3 d (表1)。由表1可知，储藏0 d时相对含量大于10%的物质，随着储藏温度的不同和储藏时间的延长，相对含量呈现不同的变化；储藏3和5 d时均检测到一些储藏0 d时未检测到的挥发性物质，且部分物质的相对含量高于10%，这些因素可能是甜玉米在储藏期间风味变差的原因。
表 1 不同储藏条件下3个甜玉米品种挥发性风味成分的相对含量1)Table 1. Relative contents of volatile flavor components in three sweet corns under different storage conditions% 品种
Cultivar挥发性成分
Volatile substance0 d 常温
Normal temperature低温
Low temperature3 d 5 d 3 d 5 d 奥弗兰 八甲基环四硅氧烷 10.73 — — — — 氯甲酸正辛酯 6.16 — — — — 壬醛 18.19 — — — — 正十二烷 0.98 6.04 8.53 3.69 2.62 3,8−二甲基癸烷 1.51 3.36 — — — 萘 5.48 — — — — 正癸醛 2.21 — — 3.69 2.29 9−甲基十九烷 1.38 — 12.35 1.48 1.97 (+)−环苜蓿烯 8.13 13.02 27.93 18.95 21.47 [1S,2R,6R,7R,8S,(+)]−1,3−二甲基−8−(1−甲基乙基)
三环[4.4.0.0(2,7)]癸−3−烯3.93 5.16 — 10.25 — 十四烷 1.60 4.01 7.40 2.02 1.96 聚二甲基硅氧烷 5.22 3.37 — — — (−)−α−荜澄茄油烯 1.07 — — 1.80 3.02 香叶基丙酮 3.89 — — 1.21 — 1,2,4a,5,6,8a−六氢−1−异丙基−4,7−二甲基萘 1.43 — — 3.68 4.13 2,4−二叔丁基酚 1.46 — — 2.03 1.65 (1S,8aR)−1−异丙基−4,7−二甲基−1,2,3,5,6,8a−六氢萘 2.33 — — 5.59 5.52 正十六烷 3.99 — 3.91 3.33 — 正十七烷 1.96 — 4.95 4.07 — 姥鲛烷 1.12 — — — — 十四酸乙酯 1.45 — — — — 十六酸乙酯 12.91 28.62 15.77 9.22 22.40 油酸乙酯 2.89 4.54 — — 5.09 4−甲基十一烷 — — — 1.63 — 3−甲基十一烷 — 9.71 — 7.80 4.85 (−)−α−蒎烯 — — — 1.30 — 8−甲基−十七烷 — — — 1.67 — 3−甲基十五烷 — 3.80 — 2.46 2.03 正十八烷 — — — 4.39 — 正十九烷 — 2.99 — 6.76 — 正二十一烷 — — — 1.01 — 正二十烷 — — — 1.97 1.14 邻二甲苯 — — — — 5.62 二异丁基对苯二甲酸酯 — — — — 1.19 2−甲基十一烷 — 2.79 — — — 2−溴十二烷 — 4.76 — — — 癸基环戊烷 — 4.39 — — — 2,6−二叔丁基−4−甲基苯酚 — 3.45 — — — 3−甲基十三烷 — — 7.56 — — 8−己基十五烷 — — 7.46 — — 2,2′,5,5′−四甲基联苯基 — — 4.14 — — 续表 1 Continued table 1 % 品种
Cultivar挥发性成分
Volatile substance0 d 常温
Normal temperature低温
Low temperature3 d 5 d 3 d 5 d 王朝 十一烷 1.23 — — — — 壬醛 23.78 — 45.81 — 13.58 正十九烷 1.89 2.10 — 5.90 — 3,8−二甲基癸烷 1.86 2.73 — 4.00 — 3−甲基十一烷 10.58 10.11 — — — 正十二烷 4.96 5.34 4.21 2.02 3.92 9−甲基十九烷 2.56 3.77 5.98 1.78 5.11 (+)−环苜蓿烯 3.59 1.75 — — 1.70 [1S,2R,6R,7R,8S,(+)]−1,3−二甲基−8−(1−甲基乙基)
三环[4.4.0.0(2,7)]癸−3−烯2.24 — — — — 十四烷 2.77 3.41 5.43 2.13 2.99 6−β−纳曲醇盐酸盐 3.23 — — — — (1S,8aR)−1−异丙基−4,7−二甲基−1,2,3,5,6,8a−六氢萘 2.80 — — — — 3−甲基十五烷 1.24 3.25 4.36 3.05 3.50 正十六烷 4.68 1.97 2.98 6.37 1.58 正十七烷 2.51 2.23 2.68 8.94 2.03 棕榈酸甲酯 1.22 — — — — 2−[(4−甲氧基苯基)氨基]−4,6−二甲基吡啶−3−甲酰胺 1.21 1.38 — 1.92 — 十六酸乙酯 19.92 13.97 10.14 2.48 31.09 (9Z)−十八碳−9,17−二烯醛 6.04 — — — — 正二十烷 1.68 — 2.81 3.92 1.92 环十四烷 — 2.98 — — 2.62 正十八烷 — 4.95 — 9.13 — 正二十六烷 — 3.57 — — — 正二十一烷 — 1.73 2.54 — 3.01 八甲基环四硅氧烷 — 24.24 — — — 3,7−二甲基癸烷 — 2.58 — — — 4−甲基十一烷 — 1.93 — — — 2−甲基十一烷 — 4.69 — — — 2,4−二叔丁基酚 — 1.35 — — — 正癸醛 — — 9.25 5.76 5.60 2−溴十二烷 — — 3.81 — — 2,6−二叔丁基−4−甲基苯酚 — — — 34.18 — 2,4,6−三叔丁基苯酚 — — — 4.88 — 四十四烷 — — — 3.56 — 壬烯 — — — — 2.25 2−硝基苯辛醚 — — — — 1.89 油酸乙酯 — — — — 11.55 正二十四烷 — — — — 2.33 三癸基环氧乙烷 — — — — 1.57 十八烯 — — — — 1.78 续表 1 Continued table 1 % 品种
Cultivar挥发性成分
Volatile substance0 d 常温
Normal temperature低温
Low temperature3 d 5 d 3 d 5 d 广良甜27 环庚烷 1.98 — — — — 2,6,10,15−四甲基十七烷 2.66 — — — — 3,8−二甲基癸烷 2.86 — 6.37 — 2.53 3−甲基十一烷 5.50 14.58 15.63 — 5.81 安息香酸乙酯 11.91 — — — 5.53 正十二烷 5.91 11.26 10.16 — 6.01 3−甲基十三烷 5.37 7.99 — — — 十四烷 3.77 5.23 3.34 — 3.34 香叶基丙酮 4.48 — — — — 2,4−二叔丁基酚 4.29 — — — 3.03 3−甲基十五烷 4.15 3.88 3.39 — 3.16 9−十六碳烯酸乙酯 2.45 — — — — 十六酸乙酯 27.76 — 3.80 19.07 25.62 油酸乙酯 16.91 — — — 17.17 2−庚酮 — 8.91 — — — 十三烷 — 3.26 — — — 正十九烷 — 5.25 — — 4.16 正十六烷 — 5.71 1.03 — 1.38 4−甲基十一烷 — 4.20 4.56 — — 2−甲基十一烷 — 10.15 10.46 — 5.42 2−甲基癸烷 — 6.52 2.31 — — 5,6−二甲基癸烷 — 2.53 — — — 甲基丁香酚 — 5.26 4.65 — — 环十四烷 — 5.27 — — 3.54 六甲基环三硅氧烷 — — 10.65 — — 3,7−二甲基癸烷 — — 5.94 — — 植烷 — — 1.87 — — 9−甲基十九烷 — — 1.81 — — 2−甲基十九烷 — — 7.04 — — 10−甲基十九烷 — — 4.51 — — 2,6−二叔丁基−4−甲基苯酚 — — 2.48 — — 1,3−二甲苯 — — — 16.17 — 邻苯二甲酸二异丁酯 — — — 33.19 — 邻苯二甲酸二丁酯 — — — 19.22 — 亚油酸乙酯 — — — 12.35 — 2−溴十二烷 — — — — 4.52 8−甲基十七烷 — — — — 2.22 正十七烷 — — — — 2.54 十四酸乙酯 — — — — 1.95 正十八烷 — — — — 2.09 1)“—”表示未检测出
1) “—” indicates not detectable![]()
图 2 3个甜玉米品种储藏0 d时挥发性物质的GC-MS总离子图Figure 2. GC-MS total ion current chromatograms of volatile substances in three sweet corns while storing for 0 d常温储藏条件下主要检测到9类挥发性物质，包括烷烃类、酯类、烯烃类、醛类、酮类、芳香烃类、酚类、盐类和酰胺类；低温储藏条件下主要检测到10类挥发性物质，包括烷烃类、酯类、烯烃类、醛类、酮类、芳香烃类、酚类、盐类、酰胺类和醚类(表2)。
表 2 常温和低温储藏条件下3个甜玉米品种挥发性风味成分的相对含量1）Table 2. Relative contents of volatile substances in three sweet corns under normal and low temperature storage% 香气类别
Aroma class奥弗兰 Aofulan 王朝 Wangchao 广良甜27 Guangliangtian 27 常温
Normal
temperature低温
Low
temperature常温
Normal
temperature低温
Low
temperature常温
Normal
temperature低温
Low
temperature烷烃类 Alkanes 41.95 28.90 50.78 39.11 69.03 26.30 酯类 Esters 24.12 20.44 15.08 22.08 20.94 64.37 烯烃类 Olefins 19.75 27.19 2.53 3.85 — — 醛类 Aldehydes 8.09 8.79 28.29 18.25 — — 酮类 Ketones — 1.70 — — 4.47 1.49 芳香烃类 Arenes 4.46 11.26 0.93 0.93 — 5.39 酚类 Phenols 1.64 1.72 0.45 13.02 5.56 2.44 盐类 Salts — — 1.08 1.08 — — 酰胺类 Amides — — 0.86 1.04 — — 醚类 Ethers — — — 0.63 — — 1)“—”表示未检测出
1) “—” indicates not detectable甜玉米中挥发性物质的相对含量以烷烃类和酯类最高，为主要挥发性物质，但不同品种和不同储藏温度之间存在差异。常温储藏时‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’的烷烃类物质相对含量最高；低温储藏时3个品种相对含量最高的物质却不同，‘奥弗兰’和‘王朝’烷烃类物质含量较高，而‘广良甜27’酯类物质含量较高。常温储藏时‘奥弗兰’和’广良甜27’的主要挥发性物质为烷烃类和酯类，而‘王朝’的主要挥发性物质为烷烃类和醛类；低温储藏时‘王朝’和‘广良甜27’的主要挥发性物质为烷烃类和酯类，而‘奥弗兰’的主要挥发性物质为烷烃类和烯烃类。
2.3 3个甜玉米品种挥发性风味物质差异
本研究建立了不同甜玉米品种在常温和低温储藏时挥发性物质相对含量的PLS-DA模型(图3)，更加直观地体现不同甜玉米品种在不同储藏条件下挥发性物质特点。常温和低温储藏条件下PLS-DA模型的得分图显示，常温储藏时3个甜玉米品种的不同储藏时间聚类性略差(图3a)，低温储藏时‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’的不同储藏时间分别聚类在一起(图3b)。常温和低温储藏时PC1均可以区分3个甜玉米品种的不同储藏时间。
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图 3 低温和常温储藏时3个甜玉米品种的偏最小二乘分析图a，b中，圆点旁边的数字代表储藏天数；图c中，1：(+)−环苜蓿烯，2：正二十烷，3：壬醛，4：(−)−α−蒎烯，5：3−甲基十五烷，6：3−甲基十三烷，7：正十七烷，8：4−甲基十一烷，9：正十二烷；图d中，1：α−衣兰油烯，2：(+)−环苜蓿烯，3：(−)−α−荜澄茄油烯，4：正二十烷，5：9−甲基十九烷，6：δ−杜松烯，7：2,4−二叔丁基酚，8：正癸醛，9：正十六烷，10：衣兰烯Figure 3. Partial least squares discriminant analysis of three sweet corns under normal and low temperature storageIn figure a and b, the number next to the dot indicates storage period; In figure c, 1: (+)-Cycloclofalene, 2: Eicosane, 3: Nonanal, 4: (-)-α-Pinene, 5: 3-Methylpentadecane, 6: 3-Methyltridecane, 7: n-Heptadecane, 8: 4-Methylundecane, 9: Dodecane; In figure d, 1: α-Muurolene, 2: (+)-Cycloclofalene, 3: (-)-α-Cubebene, 4: Eicosane, 5: 9-Methylnonadecane, 6: δ-Cadinene, 7: 2,4-Ditert-butyl phenol, 8: Decanal, 9: n-Hexadecane, 10: Ylangene通过变量重要性投影(Variable importance projection，VIP)分析每一个变量对PLS-DA模型的总体贡献度，以VIP=1为阈值。图3c、3d中，有数字代号的圆圈代表VIP>1的挥发性物质，没有数字代号的圆圈代表VIP<1的挥发性物质。常温条件下VIP>1的挥发性物质分别是(+)−环苜蓿烯、正二十烷、壬醛等，低温条件下VIP>1的挥发性物质分别是α−衣兰油烯、(+)−环苜蓿烯、(−)−α−荜澄茄油烯等(表3)。常温储藏时‘奥弗兰’的关键挥发性物质为(+)−环苜蓿烯、(−)−α−蒎烯，‘王朝’的为壬醛、正二十烷、正十七烷，‘广良甜27’的为正十二烷、3−甲基十三烷、3−甲基十五烷、4−甲基十一烷（图3c）；低温储藏时，‘奥弗兰’的关键挥发性物质为(+)−环苜蓿烯、衣兰烯、δ−杜松烯、(−)−α−荜澄茄油烯、α−衣兰油烯，‘王朝’的为9−甲基十九烷、正二十烷、正十六烷、正癸醛，‘广良甜27’的为2,4−二叔丁基酚（图3d）。不同储藏条件不同品种均有其特异的关键挥发性物质，且‘奥弗兰’和‘王朝’在不同储藏条件下存在共有的特异关键挥发性物质，‘奥弗兰’为(+)−环苜蓿烯，‘王朝’为正二十烷。关键挥发性物质可能是造成不同甜玉米品种特异食用风味的原因之一。
表 3 常温和低温储藏时偏最小二乘分析模型中VIP>1的挥发性物质Table 3. Volatile substance of VIP>1 in partial least squares discriminant analysis model under normal temperature and low temperature storage序号
Number常温 Normal temperature 低温 Low temperature 挥发性成分 Volatile substance VIP 挥发性成分 Volatile substance VIP 1 (+)−环苜蓿烯 (+)-Cycloclofalene 1.66 α−衣兰油烯 α-Muurolene 1.43 2 正二十烷 Eicosane 1.45 (+)−环苜蓿烯 (+)-Cycloclofalene 1.43 3 壬醛 Nonanal 1.38 (−)−α−荜澄茄油烯 (-)-α-Cubebene 1.42 4 (−)−α−蒎烯 (-)-α-Pinene 1.23 正二十烷 Eicosane 1.41 5 3−甲基十五烷 3-Methylpentadecane 1.14 9−甲基十九烷 9-Methylnonadecane 1.37 6 3−甲基十三烷 3-Methyltridecane 1.14 δ−杜松烯 δ-Cadinene 1.35 7 正十七烷 n-Heptadecane 1.10 2,4−二叔丁基酚 2,4-Ditert-butyl phenol 1.15 8 4−甲基十一烷 4-Methylundecane 1.06 正癸醛 Decanal 1.14 9 正十二烷 Dodecane 1.04 正十六烷 n-Hexadecane 1.14 10 衣兰烯 Ylangene 1.00 2.4 关键挥发性风味物质的筛选及聚类分析
当VIP>1时，其相应的变量为影响模型的关键变量，VIP越大，其相应变量总体贡献越大，在不同品种间差异越显著[21]。本研究中，如图3所示，低温储藏时3个甜玉米品种的不同储藏时间分别聚类在一起，即‘广良甜27’的不同储藏时间聚类在一起，‘王朝’的不同储藏时间聚类在一起，‘奥弗兰’的不同储藏时间聚类在一起，说明10种关键挥发性物质可以区分3个甜玉米品种。常温储藏时3个甜玉米品种聚类性略差，‘奥弗兰’和‘王朝’的不同储藏时间未聚类到一起，这可能是常温储藏时甜玉米挥发性物质含量下降过快所致。
此外，关键挥发性物质的相对含量在不同品种间差异显著(图4)，常温储藏时不同品种间相对含量最高的关键挥发性物质均不同，‘奥弗兰’为(+)−环苜蓿烯)，‘王朝’为壬醛，‘广良甜27’为正十二烷；低温储藏时不同品种间相对含量最高的关键挥发性物质也不同，‘奥弗兰’为(+)−环苜蓿烯，‘王朝’为正十六烷，‘广良甜27’为2,4−二叔丁基酚。在不同储藏条件下，3个甜玉米品种中仅有‘奥弗兰’相对含量最高的关键挥发性物质相同；在相同储藏条件下，3个甜玉米品种间相对含量最高的关键挥发性物质均不同。随着储藏时间的延长，常温储藏时不同品种相对含量最高的关键挥发性物质含量迅速增加，但低温储藏时仅有‘奥弗兰’迅速增加，‘王朝’和‘广良甜27’均变化不明显。因此，在储藏期间相对含量迅速变化的关键挥发性物质可能是引起甜玉米挥发性物质差异的原因之一，同时储藏条件可能也会影响挥发性物质的变化。
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图 4 常温和低温储藏时3个甜玉米品种关键差异挥发性物质的聚类分析A0、A3、A5：‘奥弗兰’储藏0、3、5 d；W0、W3、W5：‘王朝’储存0、3、5 d；G0、G3、G5：‘广良甜27’储藏0、3、5 dFigure 4. Cluster analysis of key aromatic volatile substances in three sweet corns under normal temperature and low temperature storageA0, A3, A5: Storing ‘Aofulan’ for 0, 3, 5 d; W0, W3, W5: Storing ‘Wangchao’ for 0, 3, 5 d; G0, G3, G5: Storing ‘Guangliangtian 27’ for 0, 3, 5 d3. 讨论与结论
可溶性固形物含量是评价果蔬类食品风味的重要指标之一[17]，是甜玉米食用品质的重要组成部分。可溶性固形物含量越低，其风味品质越差[22-23]。本研究结果显示，不同甜玉米品种在不同贮藏条件下的可溶性固形物含量均存在明显差异，低温和常温贮藏0和5 d的‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’，可溶性固形物的含量均差异显著，说明不同甜玉米品种储藏至5 d时，可溶性固形物含量均已显著降低；低温和常温贮藏0和3 d的‘奥弗兰’，可溶性固形物含量均差异不显著，说明‘奥弗兰’储藏至3 d时，储藏温度对可溶性固形物含量影响不显著；‘王朝’和‘广良甜27’低温储藏0和3 d的可溶性固形物含量均差异不显著，但常温储藏却差异显著，说明‘王朝’和‘广良甜27’储藏至3 d时，储藏温度和时间是引起甜玉米可溶性固形物含量下降的重要原因。与常温储藏相比，低温储藏可能延缓了可溶性固形物含量的下降，因此，储藏温度和储藏时间可能在保持甜玉米风味品质中发挥重要作用。另外，在相同储藏温度和时间下，不同甜玉米品种的可溶性固形物含量也存在差异，这可能是由品种间的特异性引起的。
挥发性风味成分是评价甜玉米食用品质的重要评价指标，目前玉米中已鉴定出醇类、芳香烃、醛类、烷烃、烯烃等多种挥发性成分，且在不同储藏温度下存在差异[24]。在本研究中，烷烃类和酯类物质是构成甜玉米挥发性风味物质的主要成分，不同品种间存在一定的差异性，常温储藏条件下‘广良甜27’中的烷烃类和酯类物质占比接近90%，而‘奥弗兰’‘王朝’中的烷烃类和酯类物质占比接近70%；低温储藏时‘广良甜27’中的烷烃类和酯类物质占比90.67%，‘王朝’占比61.19%，而‘奥弗兰’低于50%。‘王朝’在常温储藏时醛类物质含量超过28%，‘奥弗兰’中含量很低，‘广良甜27’未检测到；而‘奥弗兰’在低温储藏下烯烃类物质含量超过27%，‘王朝’中含量很低，‘广良甜27’未检测到。因此，不同品种有共有的8种挥发性成分(3,8−二甲基癸烷、3−甲基十一烷、正十二烷、十四烷、3−甲基十五烷、十六酸乙酯、正十九烷和正十六烷)，又有其独特的挥发性成分，这种独特的挥发性成分可能是造成不同甜玉米品种间风味物质差异的原因。PLS-DA是一种用于判别分析的多变量统计分析方法[19]。本试验通过PLS-DA模型鉴定的关键差异挥发性成分，在不同品种间也具有明显的差异。该结果与前人在其他植物上的研究一致，不同品种间有相似的挥发性物质[13, 25]，也存在着差异挥发性物质，且相对含量也具有一定差异[10, 21, 24, 26-29]。对3个甜玉米品种关键差异挥发性成分的聚类分析发现，低温储藏时‘奥弗兰’、‘王朝’和‘广良甜27’的不同储藏时间分别聚类在一起，常温储藏时聚类性略差，‘奥弗兰’和‘王朝’的不同储藏时间未聚类到一起，这可能是常温储藏时甜玉米挥发性物质含量下降过快所致。
影响果蔬挥发性风味物质释放的因素很多，贮藏温度或预处理均会对挥发性化合物产生显著影响[10]。有关甜玉米储藏期间挥发性物质变化的研究还处于初级阶段，但在其他蔬果中已有大量报道，例如，与在常温下储存的水果相比，低温储存的西红柿主要挥发性化合物含量显著降低，有助于风味的糖和酸却不受低温存储的影响[30]。但是与前人不同的是，在本研究中甜玉米可溶性固形物(糖、酸等)含量受低温储藏影响，这可能是物种差异所致。
本研究揭示了不同甜玉米品种在不同储藏温度和不同储藏时间下可溶性固形物含量和挥发性物质的差异，但引起不同品种间可溶性固形物含量和挥发性物质差异的其他原因有待进一步深入研究。因此，仍需在此基础上，从分子机制方面入手，解析关键挥发性成分的生物合成途径，寻找关键调控候选基因，为甜玉米育种奠定基础。
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图 1 猪CD163基因示意图和CD163-gRNA序列
Figure 1. Genetic map of pig CD163 gene and sequence of CD163-gRNA
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图 2 野生型和CD163-KO大白猪取样组织中CD163蛋白表达
Figure 2. CD163 protein expression in sampling tissues of wild type and CD163-KO Large White pigs
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图 3 野生型和CD163-KO大白猪肺泡巨噬细胞表面CD163免疫荧光检测
Figure 3. Immunofluorescence detection of CD163 on the surface of pulmonary alveolar macrophages in wild type and CD163-KO Large White pigs
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图 4 野生型和CD163-KO大白猪攻毒后直肠温度、血清中PRRSV含量和抗体水平
Figure 4. Rectal pemperature, PRRSV load and antibody level in serum of wild type and CD163-KO Large White pigs post infection
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图 5 野生型和CD163-KO大白猪攻毒后第14天肺脏PRRSV免疫荧光结果
Figure 5. Immunofluorescence result of PRRSV in lung of wild type and CD163-KO Large White pigs at 14 d post infection
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图 6 野生型和CD163-KO大白猪巨噬细胞对血红蛋白−结合珠蛋白复合物的摄取能力
Figure 6. Uptake capacity of macrophages from wild type and CD163-KO Large White pigs to hemoglobin-haptoglobin complex
表 1 阳性单克隆细胞及CD163-KO大白猪测序结果
Table 1 Sequencing results of positive monoclonal cells and CD163-KO Large White pigs
类型 Type 靶位点序列(5′→3′) Sequence of target site 插入/缺失 Insertion/ Deletion 数量 Number 野生型大白猪 Wild type Large White pig GGTCGTGTTGAAGTACAACATGG 阳性单克隆细胞 Positive monoclonal cell GGTCGTGTTGAAGTACAAACATGG +A 3 CD163-KO大白猪 CD163-KO Large White pig GGTCGTGTTGAAGTACAAACATGG +A 18 
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表 2 野生型(n=10)和CD16-KO (n=5)大白猪生产性能比较1)
Table 2 Comparison of the productive performance of wild type and CD163-KO Large White pigs
项目 Item 野生型 Wild type CD163-KO P 出生体质量/kg Birth body weight 2.04±0.13 1.80±0.15 0.277 115 kg体长/cm Body length of 115 kg 119.8±1.2 119.2±1.0 0.746 115 kg体高/cm Body height of 115 kg 68.6±0.6 68.4±0.8 0.841 115 kg背膘厚/mm Backfat thickness of 115 kg 12.069±0.401 11.702±0.495 0.592 115 kg眼肌面积/cm2Eye muscle area of 115 kg 35.670±1.202 36.320±1.090 0.736 30 ~115 kg平均日增体质量/kg Average daily gain of body weight during 30−115 kg 1.075±0.047 1.008±0.068 0.428 30~115 kg饲料转化率 Feed/gain ratio during 30−115 kg 2.326±0.085 2.548±0.154 0.191 1)表中数据为平均值±标准误，P>0.05表示两组间差异不显著 (t检验) 1) Data are expressed as the mean ± standard error, P > 0.05 means there is no significant difference between two sets ( t test)
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表 3 野生型(n=20)与CD163-KO (n=10)大白猪精液质量比较1)
Table 3 Comparison of the quality of the semen from wild type and CD163-KO Large White pigs
项目 Item 野生型 Wild type CD163-KO P 精子总数/亿 Number of sperms 680.643 ± 84.535 685.726 ± 99.930 0.971 1∶1稀释后精子活力 Sperm motility after 1∶1 dilution 0.675 ± 0.013 0.700 ± 0.000 0.219 1∶1稀释后精子密度/(亿·mL−1) Sperm density after 1∶1 dilution 1.685 ± 0.195 1.578 ± 0.239 0.747 精子畸形率/% Abnormal rate of sperm 11.092 ± 1.358 10.000 ± 0.964 0.606 1)表中数据为平均值±标准误，P>0.05表示两组间没有显著差异(t检验) 1) Data are expressed as the mean ± standard error, P > 0.05 means there is no significant difference between two sets ( ttest)
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