石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联

    黄健玲, 杨子敏, 王雨欣, 李鑫帅, 刘翠瑜, 陈锦鹏, 秦启伟, 杨敏

    黄健玲, 杨子敏, 王雨欣, 等. 石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(3): 391-401. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202203022
    引用本文: 黄健玲, 杨子敏, 王雨欣, 等. 石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(3): 391-401. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202203022
    HUANG Jianling, YANG Zimin, WANG Yuxin, et al. Association between PPAR-δ gene SNPs, haplotypes and resistances to SGIV and RGNNV in the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 391-401. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202203022
    Citation: HUANG Jianling, YANG Zimin, WANG Yuxin, et al. Association between PPAR-δ gene SNPs, haplotypes and resistances to SGIV and RGNNV in the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 391-401. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202203022

    石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联

    基金项目: 国家自然科学基金(U20A20102,311021006);广东省自然科学基金(2019A1515011747);南方海洋科学与工程广东实验室珠海实验室创新群项目(311021006);中国农业科学研究体系(CARS-47-G16)
    详细信息
      作者简介:

      黄健玲,硕士研究生,主要从事水产动物病害与分子生物学研究,E-mail:1065974326@qq.com

      通讯作者:

      秦启伟,教授,博士,主要从事海洋鱼类病毒学、免疫学和水产病害防控等研究,E-mail: qinqw@scau.edu.cn

      杨 敏,副教授,博士,主要从事水产动物抗病性状功能基因分析、种质资源调查和抗病遗传育种等研究,E-mail: yangmin2016@scau.edu.cn

    • 中图分类号: S965.334

    Association between PPAR-δ gene SNPs, haplotypes and resistances to SGIV and RGNNV in the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides

    • 摘要:
      目的 

      获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。

      方法 

      基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)抗性的关联分析。

      结果 

      在SGIV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到9个SNP位点,均位于内含子中;多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)的范围为0.177~0.375,其中,SNP-S1(g.940T>A)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP位点属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析结果显示,SNP-S7(g.4595T>A)基因型频率在SGIV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-S7的TT和AA这2种纯合子基因型与SGIV抗感性状相关,而AT杂合子基因型与SGIV易感性相关。在RGNNV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到8个SNP位点,其中,SNP-N1位于外显子中,属于同义突变,其余SNP均位于内含子中;PIC的范围为0.106~0.317,其中,SNP-N1(g.324G>A)和SNP- N2(g.883A>G)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析表明,SNP-N5(g.2510C>T)基因型频率在RGNNV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-N5的CT基因型与RGNNV抗感性状相关, CC基因型与RGNNV易感性状相关。

      结论 

      本研究在PPAR-δ的基因组DNA序列中分别筛选到与SGIV和RGNNV抗性相关的SNP标记各1个,可以为石斑鱼抗病育种提供技术支持和理论依据。

      Abstract:
      Objective 

      To obtain the disease-resistant molecular markers in grouper (Epinephelus spp.), and serve for the selective breeding program of disease-resistant grouper strains, so as to solve the problem of frequent occurrence of grouper disease.

      Method 

      Single nucleotide polymorphisms (SNPs) were screened based on PPAR-δ genomic DNA sequence, and association analysis of resistance to Singapore grouper iridovirus (SGIV) and red-spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV) was performed on these SNPs.

      Result 

      A total of nine SNPs were detected in the susceptible and resistant groups against SGIV infection, all of which were located in the introns, with the polymorphism information contents (PICs) ranging from 0.177−0.375. Among the SNPs, SNP-S1(g.940T>A) showed low degree polymorphism (PIC<0.25), while the rest SNPs showed moderate degree polymorphism(0.25≤PIC<0.50). The association analysis showed that the genotype frequencies of SNP-S7 (g.4595T>A) were significantly different between SGIV susceptible and resistant groups (P<0.05), the TT and AA homozygous genotypes of SNP-S7 were correlated with SGIV resistance traits, while the AT heterozygous genotypes were correlated with SGIV susceptibility traits. In addition, a total of eight SNPs were detected in the susceptible and resistant groups agasinst RGNNV infection, among which SNP-N1 was located in the exon, with a synonymous mutation, and the rest SNPs were located in the introns, with the PICs ranging from 0.106−0.317. Among the SNPs, SNP-N1 (g.324G>A) and SNP-N2 (g.883A>G) showed low degree polymorphism (PIC<0.25), while the rest SNPs showed moderate degree polymorphism (0.25≤PIC<0.50). The association analysis showed that SNP-N5 (g.2510C>T) genotype frequencies were significantly different between RGNNV susceptible and resistant groups (P<0.05), the CT genotype of SNP-N5 was correlated with RGNNV resistance traits and the CC genotype was correlated with RGNNV susceptibility traits.

      Conclusion 

      In this study, we successfully screened one SNP marker related to SGIV resistance and one SNP marker related to RGNNV resistance from PPAR-δ genomic DNA sequence. This finding can offer a technical support and a theoretical basis for resistance breeding of grouper.

    • 植物内生真菌(Endophytic fungus)是指那些生活史的部分阶段或全部生活于健康植物组织或器官内部,且在长期的协同进化过程中与宿主植物形成互惠共生关系的一类真菌[1-2]。内生真菌与宿主植物形成的这种互惠共生关系为研究者从植物内生真菌次生代谢产物中寻找新型的天然活性先导物提供了新的方向[3]。近年来,内生真菌次生代谢产物的研究越来越受到人们的重视,尤其是从短叶红豆杉Taxus brevifolia韧皮部分离到产紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae后,掀起了人们对内生真菌次生代谢产物研究的热潮[4-5]。内生真菌作为一种新型的天然活性物质资源宝库,能够产生多种结构新颖的次生代谢产物,其具有抗菌、杀虫、抗氧化、抗肿瘤以及促进植物生长和提高植物抗病性等多种生物活性,从植物内生真菌中寻找具有开发潜能的生物活性物质引起了人们极大的兴趣[6-9]

      目前对于桉树内生真菌及其次生代谢产物的研究多集中在内生真菌的生理学和生态学作用方面。谢安强等[10-12]研究发现桉树内生真菌能够显著提高桉树的抗逆能力,如促进植株对磷的吸收能力,提高桉树的抗寒能力,促进植株的光合作用效能等。Kharwar等[13]从柠檬桉Eucalyptus citriodora中分离得到的曲霉属Aspergillussp.和毛壳菌属Chaetomiumsp.内生真菌表现出较强的抗真菌和抗细菌活性。格希格图等[14]从不同桉树根部分离到的内生真菌对桉树青枯病菌Ralstonia solanacearum有不同程度的拮抗作用,其中以大叶桉Eucalyptus robusta内生真菌的抗菌活性最为明显。Mohali等[15]从桉树和金合欢Acacia farnesiana中分离到2株新的内生真菌Fusicoccum sp.,但并未对其次生代谢产物的生物活性进行研究。华南农业大学林学与风景园林学院森林保护教研室的前期研究表明,窿缘桉Eucalyptus exserta果实内生真菌Eef-10表现出较好的抗桉树青枯病菌活性[16],本文在前期研究的基础上,以内生真菌Eef-10为研究对象,通过形态学和分子生物学相结合的方法确定其分类地位,同时分离和鉴定内生真菌Eef-10中的活性成分,并测定其抗细菌和抗肿瘤细胞活性,以期为内生真菌资源的开发和利用提供理论依据。

      内生真菌Eef-10分离自健康的窿缘桉果实,目前保藏于华南农业大学林学与风景园林学院植物和微生物健康实验室。

      供试细菌包括大肠埃希菌Escherichia coli(G-)、根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens(G-)、黄瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans(G-)、桉树青枯病菌Ralstonia solanacearum(G-)和番茄疮痂病菌Xanthomonas vesicatoria(G-),以上菌株均保藏于华南农业大学林学与风景园林学院植物和微生物健康实验室。

      供试细胞株系为肝癌细胞(Hep-G2)和宫颈癌细胞(HeLa),供试肿瘤细胞由中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所提供。

      核磁共振波谱仪(Bruker Avance-600,美国Bruker公司),半制备型液相色谱仪(泵:UC-3281,紫外检测器:UC-3292S,上海Welch公司),分析型液相色谱仪(LC-10F,天津博纳艾杰尔科技有限公司),三用紫外仪(ZQ-1,上海安亭科学仪器厂),超净工作台(SW-CJ-2G,苏州净化设备有限公司),生化培养箱(LRH-250,上海一恒科技有限公司)。

      Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞士GE Heaithcare公司),GF254薄层层析硅胶和正相柱层析硅胶(青岛化工有限公司),硫酸链霉素(w=98%,上海麦克林生化科技有限公司),噻唑蓝(MTT)生物显色剂(w=98%,美国Amresco公司),喜树碱(w≥99%,上海麦克林生化科技有限公司),真菌基因组DNA抽提试剂盒 [生工生物工程(上海)股份有限公司],甲醇、二甲基亚砜、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和石油醚(分析纯,天津富宇精细化工厂),甲醇(色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司),氘代氯仿、氘代丙酮(巴斯夫化学有限公司)。

      采用形态学和分子生物学相结合的方法对内生真菌Eef-10进行鉴定。

      用灭菌牙签挑取PDA培养基上菌落边缘生长旺盛的菌丝,接种于新的PDA培养基中,置于生化培养箱中培养7~10 d,然后用生物显微镜观察菌丝、有性孢子和产孢结构等特征,参照Sekhar等[17]对内生真菌Eef-10进行形态学鉴定。

      参照单体江等[18]的方法对内生真菌Eef-10进行分子生物学鉴定。将纯化后的内生真菌Eef-10(在PDA培养基上生长5 d)接种到PDB培养基中,28 ℃、150 r/min条件下振荡培养5 d,分液漏斗过滤后收集菌丝,用液氮进行充分研磨至粉末状,采用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取其总DNA,使用真菌的通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增其ITS序列。PCR反应体系(50 μL):去离子水21 μL,2×Taq PCR MasterMix(含染料)25 μL,ITS4(10 μmol/L)1 μL,ITS5(10 μmol/L)1 μL,模板DNA(10 ng/ μL)2 μL;PCR扩增程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min 20 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序成功的ITS序列提交至GenBank数据库,获得登录号。通过在NCBI网站上进行BLAST,下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列,使用MAFTT version 7处理后,用MEGA6软件采用最大似然法构建系统发育树。

      采用大米固体培养基对内生真菌Eef-10进行大规模发酵。首先从4 ℃冻存管中挑取少许Eef-10菌丝接种到PDA平板上活化培养5~7 d,再将其菌丝接种在500 mL装有200 mL PDB培养基的三角瓶中,置于28 ℃、150 r/min条件下振荡培养3~5 d。将获得的液体种子接入已灭菌的大米培养基中,共发酵6 kg,28 ℃条件下暗培养60 d,以确保菌丝将大米培养基营养消耗完毕。而后将发酵好的固体发酵物用甲醇冷浸提取3次,每次7 d,减压浓缩后水混悬,依次用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取,分别得到石油醚层和乙酸乙酯层粗提物。

      乙酸乙酯层提取物(51.40 g)经减压硅胶柱层析,先用石油醚洗脱,再用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,通过薄层层析合并成A~D 4个部分。其中B部分(25.19 g)再经减压硅胶柱层析,采用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,通过薄层层析合并成11个馏分,分别编号为B1~B11。B4馏分(2.9 g)经Sephadex LH-20柱层析(三氯甲烷︰甲醇体积比为1︰1),通过薄层层析检测后合并为7个组分,分别编号为B4-1~B4-7。B4-7(30 mg)经semi-HPLC(甲醇︰水体积比为 65︰35,流速5 mL/min,λ = 210 nm,进样体积为0.1 mL)制备,得到化合物Ⅰ(4.5 mg)和化合物Ⅱ(5.5 mg)。B6馏分(9.5 g),经Sephadex LH-20(三氯甲烷︰甲醇体积比为1︰1)柱层析,通过薄层层析检测后合并成6个组分,编号为B6-1~B6-6。其中B6-3(95 mg)经semi-HPLC(甲醇︰水体积比为50︰50,流速5 mL/min,λ = 210 nm,进样体积为0.1 mL)制备,得到化合物Ⅲ(30 mg)。

      单体化合物的结构主要通过1H NMR、13C NMR等波谱学数据进行鉴定,并与文献比对后确定。

      抗细菌活性的测定参照刘志强等[19]的方法,精密称取单体化合物Ⅰ~Ⅲ各2.0 mg分别溶于0.3 mL丙酮中,再加入0.7 mL蒸馏水,配成质量浓度为2 000 μg/mL的母液,然后用φ为30%的丙酮溶液依次稀释成质量浓度为2 000.000、1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg/mL的样品溶液。阳性对照为硫酸链霉素,采用相同的方法配成质量浓度为500.000 00、250.000 00、125.000 00、62.500 00、31.250 00、15.625 00、7.812 50、3.906 25 μg/mL的溶液,备用。在无菌的96微孔板中加入106 CFU/mL的供试菌液90 μL,然后加入不同浓度的测试样品溶液10 μL。同时设空白对照(H2O)和溶剂对照(φ为30%的丙酮溶液),每处理6个重复。用封口膜将96微孔板四周封口,于28 ℃、黑暗条件下振荡(15 r/min)培养24 h,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),继续培养4 h后,以3 000 r/min 离心20 min,去上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL,振荡(15 r/min)30 min,为了测定半抑制浓度(IC50),多孔板离心后,每孔取100 μL,于510 nm 下测定吸光度(D510 nm)。按下面公式计算待测样品对供试细菌的抑制率:

      $${\text{抑制率}} = \frac{{{\text{溶剂对照孔}}{D_{510\;{\rm{nm}}}} - {\text{药液孔}}{D_{510\;{\rm{nm}}}}}}{{{\text{溶剂对照孔}}{D_{510\;{\rm{nm}}}}}} \times 100\% {\text{。}}$$

      所得数据采用 Microsoft excel 软件进行分析,供试样品浓度取对数(X),抑制率换算成概率值(Y),求得抑制活性回归方程(Y = aX+b)和半抑制浓度(IC50)。

      抗肿瘤细胞活性的测定参照Ouyang等[20]的方法,阳性对照为喜树碱。将对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板(Nest)中,待6~8 h后细胞贴壁。用含有5%(w)FBS(Gibco)的DMEM(Hyclone)细胞培养基将化合物以2倍梯度稀释,共制备8个梯度(质量浓度分别为80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 μg/mL)备用。小心吸弃各孔内原生长培养基后,将制备好的各浓度化合物分别加入对应孔中,每孔200 μL,每个化合物每个浓度设置4组重复孔。对照孔加入相应浓度的DMSO。在37 ℃,φ(CO2)为5%条件下,化合物与细胞继续共培养48 h。每孔加入CCK8试剂15 μL,在37 ℃、φ(CO2)为5%条件下继续培养4 h后,采用多功能微孔板检测仪在450 nm下检测各孔的吸光度(D450 nm),记录并保存数据。采用GraphPad Prism 5拟合各化合物在各细胞株的生长抑制曲线并计算其IC50值。

      内生真菌Eef-10的菌落和显微形态如图1所示。在PDA培养基上,菌落呈规则圆形(图1a),气生菌丝发达,绒毛状,初始时菌落白色,后期菌落颜色逐渐变灰,且随时间延长而逐渐加深,培养7 d后可布满整个培养皿(d = 7.5 cm)。在显微镜下观察发现,菌丝有隔(图1b),内含多个油滴,菌丝后期颜色较深且粗细不均,隔间距缩短;子囊果近球形(图1d),有孔口;附属丝较长,呈菌丝状,有隔,周生于子囊果且大部分集中生长于子囊果顶部;子囊孢子灰褐色(图1c),单孢,卵圆形,光滑,长×宽平均为7.0 μm×5.5 μm,有顶生萌发孔;与毛壳菌属Chaetomium的特征相一致[17, 21]

      图  1  内生真菌Eef-10的菌落(a)、菌丝(b)、子囊孢子(c)和子囊果(d)
      Figure  1.  Colony (a), mycelium (b), ascospore (c) and ascoma (d) of endophytic fungus Eef-10

      进一步通过真菌通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,获得大小为592 bp的目的序列,将该目的序列提交至GenBank,获得登录号MK120863。在GenBank数据库中进行同源性比对,采用最大似然法通过MEGA 6构建系统发育树(图2)。从图2可以看出,内生真菌Eef-10与Chaetomium sp.(登录号:KU504294.1)聚在同一支上,其最大相似度为99.82%,结合形态学特征最终将内生真菌Eef-10确定为子囊菌门Ascomycota核菌纲Pyrenomycetes粪壳目Sordariales毛壳菌科Chaetomiaceae毛壳菌属Chaetomium sp.真菌。

      图  2  依据内生真菌Eef-10的rDNA-ITS 序列构建的系统发育树
      Figure  2.  Phylogenetic tree of endophytic fungus Eef-10 based on rDNA-ITS sequence

      通过1H NMR、13C NMR等波谱学数据以及与文献比对,确定了3种化合物的结构(图3)。

      图  3  化合物Ⅰ~Ⅲ的结构
      Figure  3.  The structures of compounds Ⅰ-Ⅲ

      化合物Ⅰ,淡黄色固体,1H NMR谱在δH6.20 (1H, s)处有1个苯基质子信号,在δH2.09 (3H, s)和2.46 (3H, s)处有2个苯甲基质子信号,在δH3.91 (3H, s)处有1个甲氧基质子信号,δH 12.06 (1H, s)和 5.14 (1H, s)表明其结构中含有2个羟基信号,而且13C NMR谱中的2个芳香族碳信号δC163.37和158.20进一步支持了苯环在C-2和C-4处的氧化;通过1H NMR谱的相关信息及13C NMR谱δC163.37,158.20,140.39,110.75,108.70,105.46可以推导其结构中含有1个五取代苯环;13C NMR谱在δ 172.83处表明其结构中含有1个羰基。化合物Ⅰ的1H NMR (600 MHz,CDCl3)δH:12.06 (1H,s,2-OH),6.20 (1H,s,H-5),5.14 (1H,s,5-OH),3.91 (3H,s,H-1'),2.45 (3H,s,H-6),2.10 (3H,s,H-3);13C NMR (151 MHz,CDCl3) δC:172.83 (C-7),163.37 (C-2),158.20 (C-4),140.39 (C-6),110.75 (C-5),108.70 (C-3),105.46 (C-1),52.08 (C-1'),24.36 (C-6),7.89 (C-3)。上述数据与文献[22]数据一致,故将化合物Ⅰ鉴定为2, 4−二羟基−3, 6−二甲基苯甲酸甲酯(Methyl 2, 4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate,即Atraric acid)(图3a)。

      化合物Ⅱ,白色固体,化合物Ⅱ的1H NMR谱和13C NMR谱与化合物Ⅰ数据非常接近,基本骨架一致,1H NMR谱中δH1.40 (t,J = 7.1 Hz,3H),4.38 (q,J = 7.1 Hz,2H)信号,表明其结构中含有1个R—CH2—CH3信号。化合物Ⅱ的1H NMR (600 MHz,CDCl3)δH:12.14 (1H,s,2-OH),6.19 (1H,s,H-5),5.18 (1H,s,5-OH),4.38 (2H,q,J= 7.1 Hz,H-1′),2.46 (3H,s,H-6),2.09 (3H,s,H-3),1.40 (3H,t,J= 7.1 Hz,H-2′);13C NMR (151 MHz,CDCl3) δC:172.17 (C-7),163.18(C-2),158.01 (C-4),140.18 (C-6),110.53 (C-5),108.55 (C-3),105.28(C-1),61.22(C-1′),24.23(C-6),14.26(C-2′),7.67(C-3)。上述数据与文献[23]数据一致,最终化合物Ⅱ鉴定为2, 4−二羟基−3, 6−二甲基苯甲酸乙酯(Ethyl 2, 4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate)(图3b)。

      化合物Ⅲ,无色油状液体,化合物Ⅲ的1H NMR (600 MHz,Acetone-d6) δH:5.71(1H, s,H-3),4.32 (2H,t,J = 6.2 Hz,H-6),2.42 (2H,t,J = 6.2 Hz,H-5),2.01(3H,s,H-7);13C NMR (151 MHz,Acetone-d6)δC:164.55 (C-2),159.51 (C-4),116.95 (C-3),66.64 (C-6),29.75 (C-5),22.87(C-7)。上述数据与参考文献[24]数据基本一致,所以化合物Ⅲ鉴定为4−甲苯−5, 6−二氢−2H−吡喃−2−酮(4-methyl-5, 6-dihydro-2H-pyran-2-one)(图3c)。

      内生真菌Eef-10次生代谢产物对5种供试细菌的抑制活性如表1所示。其中化合物Ⅲ在供试浓度下对5种供试细菌的IC50均大于200 μg/mL;化合物Ⅱ对所有供试细菌的抑制活性均强于化合物Ⅰ,其中对桉树青枯病菌的抑制活性最强,其IC50为35.87 μg/mL,与阳性对照硫酸链霉素非常接近,其次是对黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌的抑制活性,其IC50分别为38.91和 40.80 μg/mL,对大肠埃希菌和根癌土壤杆菌的抑制活性较弱;化合物Ⅰ对黄瓜角斑病菌的抑制活性最强,其IC50为67.25 μg/mL,其次是对番茄疮痂病菌的抑制活性,其IC50为93.59 μg/mL,而对其他供试细菌的IC50均大于100 μg/mL。

      表  1  内生真菌Eef-10次生代谢产物的抗细菌活性
      Table  1.  Antibacterial activities of the secondary metabolites isolated from endophytic fungus Eef-10
      供试样品
      Tested sample
      IC50/(μg·mL−1)
      大肠埃希菌
      Escherichia
      coli
      根癌土壤杆菌
      Agrobacterium
      tumefaciens
      黄瓜角斑病菌
      Pseudomonas
      lachrymans
      桉树青枯病菌
      Ralstonia
      solanacearum
      番茄疮痂病菌
      Xanthomonas
      vesicatoria
      化合物Ⅰ Compound Ⅰ 130.55 ± 3.57 105.39 ± 4.52 67.25 ± 1.23 113.11 ± 3.58 93.59 ± 0.43
      化合物Ⅱ Compound Ⅱ 48.52 ± 0.33 55.50 ± 1.61 38.91 ± 0.54 35.87 ± 0.18 40.80 ± 0.70
      化合物Ⅲ Compound Ⅲ > 200 > 200 > 200 > 200 > 200
      硫酸链霉素 Streptomycin sulfate 18.51 ± 0.46 5.10 ± 0.03 30.54 ± 0.89 33.07 ± 2.46 13.81 ± 1.62
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      抗肿瘤细胞活性的测定结果如表2所示,通过GraphPad Prism 5拟合各化合物在各细胞株的生长抑制曲线计算其IC50,除化合物Ⅱ之外,其他化合物对2种肿瘤细胞的IC50均大于50 μg/mL;化合物Ⅱ对HeLa细胞的IC50大于50 μg/mL,但对Hep-G2的IC50仅为1.50 μg/mL,明显强于阳性对照喜树碱的3.6 μg/mL,表明化合物Ⅱ对Hep-G2肿瘤细胞具有较好的生长抑制作用。

      表  2  内生真菌Eef-10次生代谢产物的抗肿瘤细胞活性
      Table  2.  Antitumor activities of the secondary metabolites isolated from endophytic fungus Eef-10
      供试细胞Tested cell IC50/(μg·mL−1)
      化合物Ⅰ
      Compound Ⅰ
      化合物Ⅱ
      Compound Ⅱ
      化合物Ⅲ
      Compound Ⅲ
      喜树碱
      Camptothecin
      Hep-G2 > 50 1.50 > 50 3.6
      HeLa > 50 > 50 > 50 6.3
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      本研究以分离和鉴定抗细菌和抗肿瘤的活性化合物为导向,从窿缘桉内生真菌Chaetomium sp. Eef-10中共分离出3个化合物,包括2个苯酚类和1个戊烯酸内酯类化合物。前人的研究表明,化合物Ⅰ(Atraric acid)是一种天然的雄激素受体拮抗剂,主要应用于前列腺癌的治疗[25-26],该化合物曾在地衣植物Parmotrema cooperi[27]Lecidella carpathica[28]Pseudevernia furfuracea[22]以及地钱植物Frullania brasiliensis[29]、非洲臀果木Pygeum africanum[23]和紫葳科植物Newbouldia laevis[30]中被发现和报道,而有关化合物Ⅱ的研究却很少,一般是作为Atraric acid衍生物的形式被报道,但化合物Ⅱ对雄激素受体的拮抗作用甚至略高于Atraric acid,亦可作为抗前列腺癌优先级的候选药物[31]。本研究中活性测定的结果显示,化合物Ⅱ表现出较好的抗细菌活性,其中对桉树青枯病菌的抑制活性最强,IC50为35.87 μg/mL,与阳性对照结果相当,且化合物Ⅱ对Hep-G2肿瘤细胞也具有较好的抑制作用,研究结果为寻找抗桉树青枯病菌天然微生物源活性药物提供了新的思路。

      致谢:感谢华南农业大学农学院谢辉和徐春玲老师在内生真菌形态学鉴定方面提供的帮助!

    • 图  1   石斑鱼PPAR-δ基因结构及SNP位点

      Figure  1.   DNA structure of PPAR-δ gene and its SNP loci of grouper

      图  2   石斑鱼SGIV和RGNNV感染组中筛选出PPAR-δ基因SNP标记的连锁不平衡分析

      图片顶部的白色长方形代表PPAR-δ基因组DNA序列,黑色细线对应标签代表各SNP位点;图片下半部分的正方形色块内的数值为连锁不平衡参数r2;正方形色块的颜色代表两两SNP位点间的连锁不平衡参数D的范围,白色表示D=0,红色和粉色表示0 < D < 1,蓝色表示D=1;黑框代表该区域内相邻的SNP位点处于连锁不平衡状态,形成单倍型块,用Block标记,括号内的数值表示单倍型块碱基的长度

      Figure  2.   Linkage disequilibrium analysis of PPAR-δ SNP markers screened from SGIV and RGNNV infected groupers

      The white rectangle at the top of image represents the PPAR-δ genome DNA sequence, and the black thin lines and corresponding tags represent the SNP sites; In the bottom half of the picture, the value in the square color block is the linkage unbalance parameter r2; The color of the square color block represents the range of linkage unbalance parameter D between two SNP sites, white represents D=0, red and pink represent 0 < D < 1, and blue represents D=1; The black box indicates that the adjacent SNP sites in this region are in the linkage unbalanced state and form a haplotype block, which is marked by Block, and the value in brackets indicates the length of haplotype block base

      表  1   PPAR-δ基因组DNA序列扩增引物

      Table  1   Primers for PPAR-δ genomic DNA sequence amplification

      引物名称 Primer 引物序列(5′→3′) Primer sequence θ/℃ 产物长度/bp Product length
      PPAR-δ-1-F CAGGGCTTTTTCCGACGAAC 59 1325
      PPAR-δ-1-R GGTTGACTCATCACTCGCCT 59
      PPAR-δ-2-F GACCTCCTGTGGCCCTTAAC 60 1398
      PPAR-δ-2-R CTGGGAGCGGCTTAAAGGAA 60
      PPAR-δ-3-F AAGCCGCTCCCAGTAGAAAC 60 1168
      PPAR-δ-3-R TTCCTAGCAATGGCAGCGTT 60
      PPAR-δ-4-F CAAACGCTGCCATTGCTAGG 60 1324
      PPAR-δ-4-R ACGTTCATTAGCCCAGGACG 60
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      表  2   9个SNP在石斑鱼SGIV抗感组和易感组中的遗传多态性信息

      Table  2   Genetic polymorphisms of nine SNPs in SGIV resistant and susceptible grouper groups

      组别 Group SNP 观测杂合度 Observed heterozygosity (Ho) 期望杂合度 Expected heterozygosity (He) 多态信息含量 Polymorphism information content (PIC) 有效等位基因数 Number of effective alleles (Ne) Hardy–Weinberg平衡 Hardy-Weinberg equilibrium (H-W) P1)
      抗感组 Resistant group SNP-S1 0.160 0.149 0.136 1.173 0.328 0.567
      SNP-S2 0.460 0.398 0.317 1.651 1.244 0.265
      SNP-S3 0.400 0.407 0.322 1.676 0.016 0.898
      SNP-S4 0.660 0.489 0.367 1.937 6.279 0.012*
      SNP-S5 0.640 0.492 0.369 1.950 4.612 0.032*
      SNP-S6 0.640 0.492 0.369 1.950 4.612 0.032*
      SNP-S7 0.240 0.424 0.332 1.724 9.699 0.002*
      SNP-S8 0.300 0.495 0.370 1.962 7.932 0.005*
      SNP-S9 0.280 0.492 0.369 1.950 9.676 0.002*
      易感组 Susceptible group SNP-S1 0.220 0.198 0.177 1.244 0.688 0.407
      SNP-S2 0.460 0.481 0.363 1.908 0.094 0.759
      SNP-S3 0.280 0.347 0.284 1.523 1.923 0.166
      SNP-S4 0.500 0.500 0.372 1.980 0.000 1.000
      SNP-S5 0.500 0.500 0.372 1.980 0.000 1.000
      SNP-S6 0.520 0.502 0.373 1.987 0.007 0.796
      SNP-S7 0.520 0.453 0.348 1.814 1.109 0.292
      SNP-S8 0.360 0.492 0.369 1.950 3.681 0.055
      SNP-S9 0.360 0.504 0.375 1.997 4.220 0.040*
       1)“*”表示该位点理论基因型频率和观测基因型频率之间的差异显著(P<0.05,χ2检验)  1)“*” indicates significant difference between the theoretical genotype frequency and the observed genotype frequency of the site (P<0.05,χ2 test)
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      表  3   8个SNP在石斑鱼RGNNV抗感组和易感组中的遗传多态性信息

      Table  3   Genetic polymorphisms of eight SNPs in RGNNV resistant and susceptible grouper groups

      组别 Group SNP 观测杂合度 Observed heterozygosity (Ho) 期望杂合度 Expected heterozygosity (He) 多态信息含量 polymorphism information content (PIC) 有效等位基因数 Number of effective alleles (Ne) Hardy–Weinberg平衡 Hardy-Weinberg Equilibrium (H-W) P1)
      抗感组 Resistant group SNP-N1 0.180 0.164 0.150 1.200 0.431 0.512
      SNP-N2 0.160 0.147 0.136 1.170 0.328 0.567
      SNP-N3 0.640 0.435 0.341 1.770 10.700 0.001*
      SNP-N4 0.540 0.466 0.358 1.870 1.100 0.294
      SNP-N5 0.620 0.442 0.344 1.800 7.720 0.005*
      SNP-N6 0.680 0.448 0.349 1.810 12.800 0.000*
      SNP-N7 0.660 0.442 0.344 1.790 11.700 0.001*
      SNP-N8 0.600 0.420 0.332 1.720 8.830 0.003*
      易感组 Susceptible group SNP-N1 0.160 0.149 0.136 1.170 0.328 0.567
      SNP-N2 0.120 0.114 0.106 1.130 0.168 0.682
      SNP-N3 0.480 0.369 0.298 1.570 4.750 0.029*
      SNP-N4 0.380 0.379 0.304 1.600 0.001 0.982
      SNP-N5 0.380 0.358 0.291 1.550 0.200 0.655
      SNP-N6 0.440 0.389 0.311 1.630 0.900 0.343
      SNP-N7 0.420 0.398 0.317 1.650 0.155 0.694
      SNP-N8 0.420 0.335 0.277 1.500 3.340 0.068
       1)“*”表示该位点理论基因型频率和观测基因型频率之间的差异显著(P<0.05,χ2检验)  1)“*” indicates significant difference between the theoretical genotype frequency and the observed genotype frequency of the site (P<0.05,χ2 test)
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      表  4   石斑鱼PPAR-δ基因在2种病毒抗感组和易感组的SNP统计分析

      Table  4   PPAR-δ gene SNPs analysis in resistant and susceptible grouper groups infected by two viruses

      SNP (SGIV) 基因型1) Genotype 基因型频率/% Genotype frequency χ2 SNP (RGNNV) 基因型1) Genotype 基因型频率/% Genotype frequency χ2
      抗感组 Resistant group 易感组 Susceptible group 抗感组 Resistant group 易感组 Susceptible group
      SNP-S1 TT(81) 84 78 0.585 SNP-N1 GA(17) 18.8 16.3 0.099
      AT(19) 16 22 GG(80) 81.3 83.7
      SNP-S2 CC(44) 50 38 4.418 SNP-N2 AA(83) 83.3 87.8 0.384
      GC(46) 46 46 GA(14) 16.7 612.2
      GG(10) 4 16 SNP-N3 AT(54) 62.5 49.0 1.796
      SNP-S3 AC(34) 40 28 1.680 TT(43) 37.5 51.0
      AA(58) 52 64 SNP-N4 AA(45) 37.5 55.1 2.520
      CC(8) 8 8 GA(44) 52.1 38.8
      SNP-S4 CC(28) 26 3 3.818 GG(8) 10.4 6.1
      CT(58) 66 50 SNP-N5 CC(46) 37.5 57.1 4.260*
      TT(14) 8 2 CT(48) 60.4 38.8
      SNP-S5 AA(28) 26 30 2.669 TT(3) 2.1 4.1
      AT(57) 64 50 SNP-N6 CC(2) 0 4.1 3.820
      TT(15) 10 20 GC(54) 66.7 44.9
      SNP-S6 GA(58) 64 52 2.324 GG(41) 33.3 51.0
      GG(27) 26 28 SNP-N7 AA(3) 0 6.1 3.410
      AA(15) 10 20 GA(52) 64.6 42.9
      SNP-S7 TT(50) 60 40 8.491* GG(42) 35.4 51.0
      AT(38) 24 52 SNP-N8 CT(49) 58.3 42.9 2.320
      AA(12) 16 8 TT(48) 41.7 57.1
      SNP-S8 TT(26) 28 24 0.451
      AT(33) 15 18
      AA(41) 42 40
      SNP-S9 TT(39) 44 34 1.176
      AT(32) 28 36
      AA(29) 28 30
       1)括号中的数字为基因型数量;2)使用多组样品的χ2检验统计,“*”表示该SNP位点不同基因型在抗感组和易感组的分布差异显著,即该位点不同基因型与抗感/易感性状相关联(P<0.05)  1) Numbers in the brackets are numbers of the genotypes; 2) χ2 test statistics of samples from multiple groups are used, “*” indicates the distribution of different genotypes of the SNP locus is significantly different between the resistant group and the susceptible group, that is, different genotypes of this locus are associated with the resistant/susceptible traits (P<0.05)
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      表  5   石斑鱼PPAR-δ基因SNP连锁单倍型与2种病毒抗性的关联分析

      Table  5   Association analysis between PPAR-δ SNPs linked haplotype and resistance of two viruses

      病毒 Virus 单倍块 Haploblock 单倍型 Haplotype 分布频率/% Distribution frequency 抗感组频率/% Frequency in resistant group 易感组频率/% Frequency in susceptible group χ2 P1)
      SGIV 单倍块1 Block 1 TTT 42.50 43.00 42.00 0.020 0.890
      AAA 32.00 30.00 34.00 0.370 0.540
      TAA 13.00 15.00 14.00 0.040 0.840
      TAT 12.50 12.00 10.00 0.200 0.650
      单倍块2 Block 2 CAG 56.00 58.00 54.00 0.330 0.570
      TTA 43.00 41.00 45.00 0.000 0.990
      CAA 1.00 1.00 1.00 0.000 1.000
      RGNNV 单倍块1 Block 1 TACGGT 23.20 20.00 27.40 2.950 0.086
      AGTCAC 12.70 13.30 11.90 0.177 0.674
      TGCGGT 12.70 13.80 11.30 0.528 0.468
      TACCAT 12.50 12.40 12.50 0 0.987
      AGTCAT 13.50 14.20 12.50 0.245 0.621
      AACGGT 12.00 12.00 11.90 0.001 0.977
      TGTCAT 13.50 14.20 12.50 0.245 0.621
       1) P>0.05表示该位点的单倍型分布频率在抗感组和易感组之间差异不显著(χ2检验)  1) P>0.05 indicates the distribution frequency of haplotype of the site is not significantly different between the resistant group and the susceptible group (χ2 test)
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    出版历程
    • 收稿日期:  2022-03-10
    • 网络出版日期:  2023-05-17
    • 刊出日期:  2023-05-09

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