Cloning, subcellular localization and functional analysis of GmMADS4 in soybean
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摘要:目的
挖掘大豆Glycine max MADS转录因子家族成员GmMADS4基因信息，分析其结构及功能。
方法通过生物信息学分析，对GmMADS4基因进行基因结构、编码蛋白信息、保守结构域、系统进化树以及互作蛋白预测等分析。利用烟草叶片瞬时转化法分析亚细胞定位，通过RT-qPCR进行组织部位及响应缺素的表达模式分析，利用下胚轴复合植株转化法分析超量表达GmMADS4对转基因毛根生长的影响。
结果GmMADS4基因开放阅读框长732 bp，编码蛋白相对分子质量为28 000；保守结构域含有MADS-box和K-box，属于II型MADS家族成员，与拟南芥的AtAP3相似性较高；GmMADS4在大豆多个部位均有表达，且在花和种子中的表达量较高；缺氮和缺磷处理均显著增加GmMADS4在叶和根部的表达量；GmMADS4主要定位在细胞核，超量表达GmMADS4显著增加转基因毛根的可溶性磷含量。
结论GmMADS4属于大豆II型MADS家族成员，具有核定位功能，可能在大豆种子和花的发育过程中发挥作用，并参与大豆根部缺磷响应及磷稳态调节。
Abstract:ObjectiveTo explore the genetic information of GmMADS4, a member of soybean (Glycine max) MADS transcription factor family, and analyze its structure and function.
MethodThe structure, coding protein information, conserved domain, phylogenetic tree analysis and interaction protein prediction of GmMADS4 were analyzed by bioinformatics analysis. Transient transformation of tobacco leaves was used to analyze subcellular localization, RT-qPCR was used to analyze its expression patterns in different tissues and response to nutrient deficiency, and hypocotyl complex plant transformation method was used to analyze the effects of overexpression of GmMADS4 on transgenic hair root growth.
ResultThe length of open reading frame of GmMADS4 was 732 bp and the relative molecular mass of coding protein was 28 000. The conserved domain of GmMADS4 contained MADS-box and K-box, which was a member of type II MADS family, and had a high similarity with Arabidopsis AtAP3. GmMADS4 was expressed in many parts of soybean, especially in flowers and seeds. The expression of GmMADS4 in leaves and roots significantly increased by nitrogen and phosphorus deficiency induction. GmMADS4 was mainly located in the nucleus, and overexpression of GmMADS4 significantly increased soluble phosphate content in transgenic hair roots.
ConclusionGmMADS4 is a member of soybean type II MADS family, and has nuclear localization function, which may play a role in the development of soybean seeds and flowers, as well as participate in soybean root adaptive responses to phosphorus deficiency and the regulation of phosphate homeostasis.
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Keywords:
- Soybean /
- GmMADS4 /
- Subcellular localization /
- Expression pattern /
- Functional analysis
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杉木Cunninghamia lanceolata在我国已有上千年栽培历史，因其生长迅速、产量高、材质优良等特性[1]，长期以来深受人们的青睐而得以广泛种植。随着人们对杉木需求的日益高端化、高值化和生态化，杉木大径材培育对国家木材安全、生态安全、绿色发展越来越具有战略性意义[2-3]。近年来，许多学者致力于杉木大径材定向培育技术研究，提出了不同立地指数下的适宜保留密度范围[4-5]，针对不同遗传品质苗木及土壤条件提出了相应的抚育、施肥等经营措施[6-7]，运用林分经营模型对不同地区提出了间伐时间、间伐强度等优化管理模式[8]。但涉及杉木大径材材种形成的主要影响因子及其影响规律等方面的研究鲜有报道[9]。粤北、粤西北、粤东北等南岭山区丘陵地带是我国杉木四大中心产区之一，其地理位置优越，受季风环流影响，降水丰富，气候温暖湿润[10]，拥有培育优质高效杉木大径材林分得天独厚的自然条件。本研究基于广东省南岭山区特殊的自然生态条件，将现有杉木大径材林分特征因子数量化或标准化，形成综合反映林分控制因子和生态环境因子的指数评价体系，通过挖掘大径材形成主导影响因子并探究其影响规律，构建南岭山区杉木大径材出材量的预测模型，以期为广东省杉木大径材培育和经营提供理论指导，推动杉木由高密度、中小径材为经营目标向以生态为先导的大径材经营模式转变。
1. 研究区域自然概况
本研究在对粤北、粤西北、粤东北等南岭山区范围内现存具有杉木大径材的林分全面踏查的基础上，选择广东省肇庆市国有新岗林场，韶关市国有韶关林场、国有小坑林场、国有河口林场、国有大瑶山林场，广东省连山林场、广东连山笔架山省级自然保护区等7个地点，共计36块保存完好、长势优良的典型杉木大径材林分。研究区域位于111°57′~113°81′E，24°13′~25°55′N，地处南岭山脉西南至南麓，地貌以山地丘陵为主，土层深厚，土壤为赤红壤和黄壤；属中亚热带季风气候，年平均气温20 ℃左右，年均降雨量1600 mm，相对湿度80%。
2. 研究方法
2.1 标准样地设置与调查
2018—2019年，在上述7个地点的杉木大径材林分中选择不同坡向和坡位，设置400 m2(20 m×20 m)标准样地，4个角点埋设pvc管作为标志，共计设置标准样地36个。对标准样地内的杉木进行每木检尺，测量胸径、树高、冠幅、枝下高、干形等，同时按照梅花形选择5株优势木，测其树高，求优势木平均高。记录标准样地的郁闭度、经纬度、海拔、坡形、坡度、坡向、坡位等，并收集造林时间、造林密度、造林种苗情况以及抚育、施肥等林分经营历史和背景资料。标准样地基本情况见表1。
表 1 标准样地基本情况Table 1. Basic situation of standard plot地点
Site样地数
No. of
plots林龄
Stand
age保留密度/
(株·hm−2)
Reserved density平均胸径/cm
Average
DBH平均树高/m
Average
tree height优势木平均高/m
Average height of
dominant wood立地指数
Site
index国有新岗林场 Xingang State Forest Farm 9 23~28 1075~1626 21.7~23.4 15.0~17.2 17.9~23.8 16~22 国有韶关林场 Shaoguan State Forest Farm 3 20 1375~1405 20.5~21.6 12.5~14.8 16.1~17.2 16 国有小坑林场 Xiaokeng State Forest Farm 9 26~32 1150~1650 21.2~25.2 15.8~18.0 19.4~21.2 18~20 国有河口林场 Hekou State Forest Farm 3 26 1300 23.4~28.4 18.2~21.1 24.0~25.4 22 国有大瑶山林场
Dayaoshan State Forest Farm6 25 1176~1450 21.2~23.5 14.9~16.2 16.8~18.1 16 广东省连山林场
Guangdong Lianshan Forest Farm3 27 1150~1225 24.7~26.7 17.9~18.2 20.4~22.6 18~20 连山笔架山省级自然保护区
Bijiashan Provincial Nature Reserve
in Lianshan3 29 904~975 22.4~24.0 17.3~18.4 19.8~20.5 18 2.2 土样采集与理化性质测定
在标准样地中沿对角线布设取样点3个，每个样点分别在0~10、10~20和20~40 cm土层取样，采用多点取样，同层次混合，取土壤各层次混合样品，带回室内风干，拣去石砾、植物根系和碎屑，过2.000和0.149 mm土壤筛后，储藏于密封的塑料自封袋中，用于土壤化学性质(pH、有机质、全N、全P、全K、水解N、速效P和速效K等)测定[11]。同时，采用“环刀法”取各层次的原状土壤，带回实验室，测定其水分物理性质(土壤容重、自然含水量、最大持水量、最小持水量、田间持水量、总孔隙度、非毛管孔隙度、毛管孔隙度等)[11]。
2.3 林分数据计算
2.3.1 径阶平均胸径(
$ {\bar D}_{i} $ )和树高($ {\bar H}_{i} $ )以2 cm为1个径阶，将所测量的杉木8~42 cm胸径划分为18个径阶，计算各径阶平均胸径：
$$ {\bar D}_{i}=\sqrt{\frac{1}{N_i}\sum {{d}_{i}}^{2}}, $$ (1) 式中，di为第i径阶中实测胸径值，Ni为第i径阶总株数。
运用Excel软件对胸径和树高进行拟合，径阶平均树高最佳回归方程为：
$${\bar H_i} = 2.884\;8\bar D_i^{0.561\;0},\;\left( {R = 0.56} \right)\text{。}$$ (2) 2.3.2 单株材积(Vs)与径阶材积(Vi)
广东省杉木单株材积公式为：
$${V_{\rm{s}}} = 0.000\;058\;770\;42 \times {d^{1.969\;983\;1}} \times {h^{0.896\;461\;57}},$$ (3) 式中，d为单株胸径，h为单株树高。
径阶材积公式为：
$$\begin{split}{V_i} =& 0.000\;058\;770\;42 \times {\bar D_i}^{1.969\;983\;1} \times\\& {\bar H_i}^{0.896\;461\;57} \times {N_i}\text{。}\end{split}$$ (4) 2.3.3 林分蓄积量(V)
林分蓄积量为标准样地中各径阶活立木蓄积量之和，公式为：
$$V = \sum {V_i}\text{。}$$ (5) 2.3.4 大径材蓄积量(Vl)
参照《木材标准实用手册》[12]，根据过渡径阶大径材材种株数比例(Ai/%)，统计各标准样地大径材蓄积量之和，公式为：
$$\begin{split}{V_{\rm{l}}} = &\sum 0.000\;058\;770\;42 \times {\bar D_i}^{1.969\;983\;1} \times\\& {\bar H_i}^{0.896\;461\;57} \times {N_i} \times {A_i}\text{。}\end{split}$$ (6) 2.3.5 大径材出材量(Ol)
大径材出材量(规格材原条)公式[13]采用：
$$\begin{split}{O_{\rm{l}}} =& \sum 3.602\;437\;58 \times {10^{ - 5}} \times\\& {\bar D_i}^{1.947\;520\;76} \times {\bar H_i}^{1.007\;937\;69} \times {N_i} \times {A_i}\text{。}\end{split}$$ (7) 2.3.6 大径材株数比例(ND≥26)
统计各标准样地大径材(胸径D≥26 cm)株数占样地总株数的百分比。
2.3.7 大径材出材率(Yl)
统计大径材出材量占林分蓄积量的百分比，公式为：
$${Y_{\rm{l}}} = {O_{\rm{l}}}/V \times 100{\text{%}} \text{。}$$ (8) 2.4 评价指数
2.4.1 立地指数(SI)
根据标准样地内优势木平均高和林分年龄，查广东省杉木立地指数表[14]，确定各标准样地的立地指数。
2.4.2 土壤综合肥力指数(I)
采用隶属函数法对土壤8个物理性质和8个化学性质测定指标值进行标准化处理，其中，容重采用降型函数公式(9)，其他指标采用升型函数公式(10)：
$$ Q\left({X}_{i}\right)=\frac{{X}_{i\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-{X}_{ij}}{{X}_{i\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-{X}_{i\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}},$$ (9) $$ Q\left({X}_{i}\right)=\frac{{X}_{ij}-{X}_{i\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{{X}_{i\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-{X}_{i\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}, $$ (10) 式中，Q
$ \left({X}_{i}\right) $ 为各因子的隶属度值，$ {X}_{ij} $ 为第i项第j个指标的测定值，$ {X}_{i\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}} $ 和$ {X}_{i\;\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}} $ 分别为第$ i $ 项指标中的最大值和最小值。对隶属度值进行主成分分析，得到各指标的公因子方差，再计算各指标的权重，公式如下：
$${\omega _i} = {C_i}\Bigg/\sum\limits_{i = 1}^n {{C_i}} ,$$ (11) 式中，
$ {\omega }_{i} $ 为第$ i $ 项指标的权重，$ {C}_{i} $ 为第$ i $ 项指标的公因子方差，n为土壤理化性质测定指标的个数。应用模糊集加权综合法，计算土壤综合肥力指数(I)[15]，公式如下：
$$ I=\sum\limits_{i=1}^{n}\left[{\omega _i} \cdot Q\left({X}_{i}\right)\right], $$ (12) 式中，
${\omega _i}$ 为各单项指标权重。本研究先分别计算各标准样地3个层次土壤混合样的土壤综合肥力指数，再以3个层次平均土壤综合肥力指数作为该样地的土壤综合肥力指数(I)。2.4.3 微地形指数(M)
为了使一些相关性较大、性质相近的定性因素能进行数量统计分析，对坡向、坡位、坡度、坡形等指征林地微地形要素的指标进行数量化分级，分级标准参考《杉木大径材培育技术规程：LY/T 2809—2017》[16]，并按其对杉木生长的影响程度提出“林地微地形指标数量化表”(表2)，进行数据标准转化处理及计算各指标权重，根据数量化理论Ⅲ[17]计算数量化加权值并作为微地形指数(M)。
表 2 林地微地形指标数量化表Table 2. Quantization table of forest land micro-topography index指标分级
Grade of index坡向
Slope aspect坡位
Slope position坡度/(°)
Slope degree坡形
Slope shape1 南 South 山顶 Hilltop ＞35 凸 Convex 2 东南、西南 Southeast, Southwest 上坡 Upslope 26~35 直 Straight 3 东、西 East, West 中坡 Middle slope 16~35 凹 Concave 4 北、东北、西北 North, Northeast, Northwest 下坡 Downslope 10~16 2.4.4 地理指数(G)
根据GPS定位，将海拔和纬度数据进行几何平均数转化[14]，得到地理指数(G)。
2.5 数据分析
采用Microsoft excel 对所有数据进行统计及分析，用SAS V8.1进行显著性检验，用SPSS 19.0进行数据标准化转换及主成分分析等。
3. 结果与分析
3.1 立地指数(SI)对杉木大径材生长的影响
36个标准样地的SI范围为16~22，SI为16、18、20和22的标准样地分别占总样地数的38.9%、36.1%、13.9%和11.1%。不同SI与大径材蓄积量(Vl)、大径材出材量(Ol)、大径材株数比例(ND≥26)和大径材出材率(Yl)等指标进行相关性分析，结果(图1)显示，随着SI的增加，大径材成材各相关指标均呈增加的趋势，相关性均达到极显著水平(P<0.01)，相关系数为0.37~0.44。根据SI与Vl的二次项回归方程(y = 1.51x2 − 17.20 x + 111.16)，当SI为16、18、20和22时，Vl的理论值分别为223.12、291.56、372.10和464.74 m3·hm−2，相邻立地指数的Vl增幅为30%左右；根据立地指数与Ol的指数方程(y = 18.97e0.13x)，当SI为16、18、20和22时，Ol的理论值分别为163.67、214.27、280.52和367.25 m3·hm−2，相邻立地指数的Ol增幅均为31.0%，与Vl增幅基本一致；根据SI与ND≥26的二次项回归方程(y = −0.20 x2 + 12.53x − 120.74)，当立地指数为16、18、20和22时， ND≥26的理论值分别为20.1%、39.4%、49.1%和57.3%，SI为18的林地生产大径材株数比SI为16的提高近100.0%，SI为20、22的比18、20的增加幅度逐渐减缓；根据立地指数与Yl的二次项回归方程(y = −0.38 x2 + 17.57x−145.64)，当SI为16、18、20和22时，Yl的理论值分别为38.6%、48.0%、54.4%和57.7%。
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图 1 不同立地指数(SI)下的杉木大径材生长相关指标分析Figure 1. Analysis of growth indexes for large-diameter wood of Cunninghamia lanceolataunder different site index (SI)3.2 土壤综合肥力指数(I)对杉木大径材生长的影响
36个标准样地的土壤综合肥力指数(I)为0.11~0.57，数值越大，土壤综合肥力越高。不同土壤综合肥力指数与大径材蓄积量(Vl)、大径材出材量(Ol)、大径材株数比例(ND≥26)和大径材出材率(Yl)等指标进行相关性分析，结果(图2)显示，随着土壤综合肥力指数的增加，大径材成材各相关指标均呈增加的趋势，其中，I与Vl、Ol、ND≥26等指标的相关性达显著水平(P<0.05)，相关系数为0.24~0.39；I与Yl相关性未达显著水平(P>0.05)。
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图 2 不同土壤综合肥力指数(I)下的杉木大径材生长相关指标分析Figure 2. Analysis of growth indexes for large-diameter wood of Cunninghamia lanceolataunder different soil integrated fertility indexes (I)对标准样地土壤8个物理性质和8个化学性质测定指标值进行主成分分析，结果(图3)显示，土壤孔隙度和土壤持水量等土壤物理性质占较大权重，是土壤综合肥力的关键指标，其次是土壤N和有机质含量。可见，土壤物理结构、土壤N和有机质含量是杉木大径材形成的重要土壤指标。
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图 3 土壤理化性质指标权重雷达图Figure 3. Weighted radar chart of indexes for soil physical and chemical properties3.3 微地形指数(M)对杉木大径材生长的影响
将坡向、坡位、坡度、坡形等指征林地微地形要素的指标数量化、综合化，以微地形指数(M)作为综合指标考察林地微地形对杉木大径材生长的影响。36个标准样地的M为−1.14~1.25，不同微地形指数与大径材蓄积量(Vl)、大径材出材量(Ol)、大径材株数比例(ND≥26)和大径材出材率(Yl)等指标进行相关性分析，结果(图4)显示，随着微地形指数的增加，大径材成材各相关指标均呈增加的趋势，相关性均达到极显著水平(P<0.01)，相关系数为0.22~0.33。根据林地微地形指标数量化表(表2)，微地形指数最大的东北坡向、下坡位、坡度低于35°的凹坡有利于南岭山区杉木大径材的生长与形成。
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图 4 不同微地形指数(M)下的杉木大径材生长相关指标分析Figure 4. Analysis of growth indexes for large-diameter wood of Cunninghamia lanceolataunder different micro-topography indexes (M)3.4 地理指数(G)对杉木大径材生长的影响
树木的生长也受海拔和纬度的影响[18]，因此本研究将纬度和海拔转换为地理指数，以研究其对杉木大径材生长的影响。从图5可知，地理指数(G)与大径材成材各指标相关性均不显著(P>0.05)，随地理指数的增加，整体呈现先下降再上升的U型曲线趋势。南岭山区地貌特征以海拔200~1000 m的低山丘陵为主[10]，纬度范围为N 24°~26°，本研究选择的36个杉木大径材标准样地的海拔均在200~1000 m范围内，基本囊括了南岭山区所有海拔梯度级，具有代表性，可见，海拔和纬度对南岭山区杉木大径材形成的影响不明显。
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图 5 不同地理指数(G)下的杉木大径材生长相关指标分析Figure 5. Analysis of growth indexes for large-diameter wood of Cunninghamia lanceolata under different geographical index (G)3.5 林龄(A)对杉木大径材生长的影响
36个标准样地林龄为20~32年，参照南方杉木用材林龄组划分标准[19]，杉木近熟林(20~25年)占41.7%，杉木成熟林(26~32年)占58.3%。从图6可知，林龄(A)与大径材成材各指标相关性均不显著(P>0.05)，随林龄的增大整体呈现先上升再下降的倒U型曲线趋势。由于本研究对象为南岭山区具有杉木大径材的林分，所有标准样地的杉木林龄均在近熟至成熟期10年左右的区间内，因此林龄效应及对大径材生长的影响趋势体现不充分，而图6显示，杉木大径材等指标后期出现下降的趋势，主要是标准样地中30~32年生的林分立地指数多为16或18，且土壤综合肥力指数、微地形指数值相对较低，其大径材成材各指标均低于立地指数为18以上且林龄较小的林分。可见，南岭山区杉木大径材普遍在近熟林至成熟林时期(23~30年)就已形成，不具杉木大径材生产潜力的林分即使生长期更长，也难以形成大径材。
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图 6 不同林龄(A)下的杉木大径材生长相关指标分析Figure 6. Analysis of growth indexes for large-diameter wood of Cunninghamia lanceolataunder different stand age (A)3.6 保留密度(D)对杉木大径材生长的影响
南岭山区杉木造林密度普遍为2 m×2 m(2500株·hm−2)，本研究调查的36个标准样地林分保留密度(D)为900~1700株·hm−2，保留密度与大径材蓄积量(Vl)、大径材出材量(Ol)、大径材株数比例(ND≥26)和大径材出材率(Yl)等指标进行相关性分析，结果(图7)显示，Vl和Ol均随保留密度的增加呈先缓慢上升后缓慢下降的平缓二次项曲线趋势，相关性达显著水平(P<0.05)；ND≥26和Yl随保留密度的增加先平缓下降然后下降幅度逐渐增大，但相关性不显著。保留密度为1100~1300株·hm−2时，大径材成材各指标均处于较大值区间。
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图 7 不同保留密度(D)下的杉木大径材生长相关指标分析Figure 7. Analysis of growth indexes for large-diameter wood of Cunninghamia lanceolataunder different reserved density (D)3.7 杉木大径材出材量预测
根据36个标准样地调查统计数据，选取林分特征因子：立地指数(SI)，林龄(A)、保留密度(D)，以Schumacher收获模型[3, 20]为基础，构建杉木大径材出材量(Ol)预测模型。该模型基本形式为：
$$\ln \left( {{O_{\rm{l}}}} \right) = {\beta _0} + {\beta _1}{\rm{SI}} + {\beta _2}{A^{ - 1}} + {\beta _3}\ln D + {\beta _4}{\rm{S}}{{\rm{I}}^{ - 1}},$$ 通过SPSS软件求解参数β0~β4，获得模型如下：
$$\begin{split}\;&\\ {O_{\rm{l}}}{\rm{ = }}&{{\rm{e}}^{{\rm{5}}{\rm{.781 + 0}}{\rm{.004SI + 5}}{\rm{.004}}{A^{{\rm{ - 1}}}}{\rm{ + 0}}{\rm{.261}}\ln D{\rm{ - 45}}{\rm{.151S}}{{\rm{I}}^{{\rm{ - 1}}}}}},\\& \qquad\qquad \left( {R = 0.62,P < 0.01} \right)\text{。}\end{split}$$ 选取不同立地指数、不同林龄、不同保留密度样地的实测数据，将模型的大径材预测产量与实际产量进行比较(表3)，平均预测精度90%，因此，可利用该模型初步预测评估南岭山区20~30年生杉木林分的大径材出材量。
表 3 杉木大径材出材量实际值与预测值Table 3. The actual value and predicted value of large-diameter wood output of Cunninghamia lanceolata立地指数
Site index林龄/年
Stand age保留密度/(株·hm−2)
Reserved density大径材出材量/(m3·hm−2) Output of large-diameter wood 实际值 Actual value 预测值 Predicted value 16 25 1176.0 187.7254 158.2417 16 28 1075.5 139.8997 151.3147 18 25 1176.0 206.9185 216.5177 18 28 1626.0 258.4599 230.6247 20 23 1176.0 294.6004 283.1329 20 23 1300.5 330.7747 290.6677 22 26 1350.0 316.8053 351.4470 4. 讨论与结论
杉木是广东省南岭山区传统优势造林树种，但现有林分以中幼林为主，且经营模式单一、集约化程度低，与周边省份相比，杉木林分生产力与自然资源优势潜力尚未充分发挥[21]。本研究对广东省南岭山区范围内仅存为数不多、保存完好的杉木大径材林分进行调查，以空间代替时间，基于现有样本数据挖掘大径材形成的主导生态环境因子和林分控制因子并探究其影响规律，以期为广东省杉木大径材培育和经营提供理论指导。
立地指数是指林分中在基准年龄时自由生长的优势木平均高度值，可考察林地生产某一类型林木的生产潜力，常作为指导人工林培育最直观的指标[16]。惠刚盈等[9]认为在材种形成过程中，无论有何种保留密度，只要立地指数过低，在目的材种的培育期限内，就无法产生需要的材种。立地指数越高，林木生长速度越快，林分内活立木间的竞争也越大，成熟时期林分内保留木的株数也相对越低，大径材出材率也相对越高[22-23]。现有研究普遍以立地指数16、18作为培育不同杉木目标材种的划分标准[4, 6, 9, 24-25]。在南岭山区，杉木大径材成材各相关指标也是随立地指数的增加均呈显著增加的趋势(P<0.01)，在立地指数16~22范围内，相邻立地指数的大径材蓄积量和大径材出材量增幅为30%左右，立地指数18的林地生产大径材株数比立地指数16的提高近100%，大径材出材率超过40%。可见，立地指数是南岭山区杉木大径材材种形成的重要限制因子，立地指数18及以上适宜培育杉木大径材。
土壤肥力是土壤的本质属性，对林木的长势和品质有直接影响[26-27]。土壤肥力评价能够揭示土壤利用与功能有关的土壤内在属性之间的异同，科学地确定森林土壤肥力指标并进行评价，对立地生产力和多目标森林经营的研究也具有重要价值[28]。本研究采用土壤综合肥力指数作为土壤整体响应特征考察不同土壤对杉木大径材生长的影响。研究发现，大径材成材各相关指标随土壤综合肥力指数的增加均呈增加的趋势，与大径材蓄积量、大径材出材量、大径材株数比例等指标的相关性达显著水平(P<0.05)。据主成分分析结果，土壤综合肥力指数的权重贡献率较大的是土壤物理性质、土壤N含量和有机质含量。土壤物理性质密切影响根系的生长、最大扎根深度和水分的有效吸收[28]，是与南岭山区杉木大径材的形成紧密相关的土壤指标，在进行杉木大径材经营时，应首先选择土壤孔隙度和持水量较高的立地。土壤有机质在提供林木生长所需要养分的同时，能有效改良土壤结构，使土壤变得疏松，促进土壤形成水稳性团聚体，增加土壤持水和保肥能力，有利于根系的生长、土壤微生物和土壤动物活动[29-30]；土壤全氮和水解氮绝大部分是以有机态的形式积累和贮存在土壤有机质中，与土壤有机质相关性更密切，相关系数分别为9.07和0.87[31]，因此，土壤有机质是与杉木大径材成材密切相关的又一重要土壤指标。
坡向、坡位、坡度、坡形等是形成林地微地形的主要因素，南岭山区杉木大径材成材各相关指标随着微地形指数的增加，均呈显著增加的趋势(P<0.01)。不同坡向、坡位、坡度、坡形等微地形要素会形成不同的山区小气候，东北坡向等阴坡接受太阳直接辐射较少，主要以地面散射为主，日温差较小、林分相对湿度高[32]；坡位和坡度对水土流失和集聚都有影响，坡形则与风速和蒸腾强度有关[32]，都直接影响到土层的厚度和含水量，故微地形指数最大的东北坡向、下坡位、坡度低于35°凹坡的土层较深厚，排水良好，所形成的小气候最有利于净光合产物长期积累。杉木是亚热带树种，温暖湿润、多雾静风的气候环境以及深厚、排水良好的土壤条件有利于杉木生长，而水湿条件对杉木径向生长的影响非常大，因此杉木大径材的形成对小气候的要求十分严格。南岭山区属于杉木产区分区中产力水平最高的中带东区[16]，气候温暖而不炎热，太阳辐射和水湿条件等微地形因素对杉木大径材形成是比温度更重要的限制因子。
林分密度是通过影响林分直径结构进而影响林分材种结构的[33-34]，保持合理的林分密度也是杉木大径材培育的关键。林分密度与林分直径呈负相关关系已达成共识[35]，关于如何对林分密度进行合理的调控，从而获得较高大径材出材量和出材率，并平衡单位面积整体木材产量，已有很多学者对此展开了广泛的研究。佟金权[24]、刘春燕等[36]认为保留密度为1200~1300 株·hm−2时，林分整体胸径最大，较为适合杉木大径材的培育；惠刚盈等[9]、涂育合等[4]根据不同立地指数提出了不同的保留密度范围，认为立地指数16~18、保留密度1050~1350株·hm−2时适宜培育中大径材，立地指数越大保留密度应越低。本研究发现，大径材蓄积量和大径材出材量均随保留密度的增加呈先缓慢上升后缓慢下降的平缓二次项曲线趋势，相关性达显著水平(P<0.01)；大径材株数比例和大径材出材率随保留密度的增加，先平缓下降，然后下降幅度逐渐增大，但相关性不显著。南岭山区18以上立地指数，保留密度在1100~1300株·hm−2范围内时，大径材成材各指标均达到较大值区间。
本研究以Schumacher收获模型为基础，构建杉木大径材出材量(Ol)预测模型：Ol=
${{\rm{e}}^{{\rm{5}}{\rm{.781 + 0}}{\rm{.004SI + 5}}{\rm{.004}}{A^{{\rm{ - 1}}}}{\rm{ + 0}}{\rm{.261}}\ln D{\rm{ - 45}}{\rm{.151S}}{{\rm{I}}^{{\rm{ - 1}}}}}}$ (R=0.62，P<0.01)，可利用该模型初步预测评估南岭山区20~30年生杉木林分的大径材收获量，据此指导南岭山区杉木大径材培育和经营。 -
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图 1 GmMADS4基因结构及保守结构域预测
Figure 1. Gene structure and conserved domain prediction of GmMADS4
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图 2 GmMADS4蛋白二级结构预测
大写字母表示GmMADS4蛋白氨基酸序列；小写字母代表不同的二级结构，h代表α螺旋，c代表无规则卷曲，e代表延伸链，t代表β转角
Figure 2. Secondary structure prediction of GmMADS4
Capital letters indicate amino acid sequence of GmMADS4 protein; Lowercase letters represent different secondary structures, where h stands for α helix, c for random coil, e for extended strand, and t for β turn
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图 4 GmMADS4互作蛋白预测
不同颜色的圆球表示不同的蛋白，其中红色为GmMADS4；直线相连的2个蛋白预测存在相互作用
Figure 4. Interaction protein prediction of GmMADS4
Different colored spheres indicate different proteins, red is GmMADS4; Two proteins connected in a straight line are predicted to have an interaction
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图 5 GmMADS4基因克隆及酶切检测
A：GmMADS4基因PCR扩增，B：GmMADS4-pTF101s重组质粒酶切检测；M代表DNA marker，P代表PCR产物，泳道1为重组质粒酶切前，泳道2为重组质粒酶切后
Figure 5. Cloning and enzyme digestion of GmMADS4
A: PCR amplification of GmMADS4 gene, B: Digestion verification of GmMADS4-pTF101s recombinant plasmid; M represents DNA marker, P represents PCR product, lane 1 is the recombinant plasmid before digestion, lane 2 is the recombinant plasmid after digestion
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图 6 GmMADS4在大豆不同部位的表达分析
Figure 6. Expression pattern analysis of GmMADS4 in different soybean organs
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图 7 GmMADS4在大豆根和叶中响应缺素的表达模式分析
“*”表示缺素处理与对照相比差异显著(P < 0.05，t检验)
Figure 7. Expression pattern analysis of GmMADS4 in response to element deficiency in soybean roots and leaves
“*” indicates significant difference between element deficiency treatment and control (P < 0.05, t test)
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图 9 超量表达GmMADS4转基因复合植株的生长表型
Figure 9. Growth phenotypes of overexpressing GmMADS4 transgenic composite plants
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图 10 超量表达GmMADS4对大豆复合植株生物量和可溶性磷含量的影响
“*”表示对照和超量表达处理差异显著(P < 0.05，t检验)
Figure 10. Effects of overexpressing GmMADS4 on biomass and soluble phosphorus content of soybean composite plants
“*” indicates significant difference between control and overexpression treatment (P < 0.05, t test)
表 1 本研究所用到的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′)1)Primer sequence 注释 Annotation OE-GmMADS4-F C GAGCTCATGGGTCGTGGCAAGAT 超量表达 Overexpression OE-GmMADS4-R GC TCTAGATCAAGCAAGGCGAAGGTC GFP-GmMADS4-F GG GGTACCGATGGGTCGTGGCAAGAT 融合绿色荧光蛋白 Fused with GFP GFP-GmMADS4-R CG GGATCCCGAGCAAGGCGAAGGTCATG RT-GmMADS4-F GAGACAGATCAGGCATAGGA RT-qPCR RT-GmMADS4-R CCTACAGGTATCAGTCCGAG RT-GmEF-1α-F TGCAAAGGAGGCTGCTAACT RT-qPCR RT-GmEF-1α-R CAGCATCACCGTTCTTCAAA 1) 下划线为酶切位点 1) The restriction sites are underlined 
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目录
1. 研究区域自然概况
2. 研究方法
2.1 标准样地设置与调查
2.2 土样采集与理化性质测定
2.3 林分数据计算
2.3.1 径阶平均胸径(
$ {\bar D}_{i} $ )和树高($ {\bar H}_{i} $ )2.3.2 单株材积(Vs)与径阶材积(Vi)
2.3.3 林分蓄积量(V)
2.3.4 大径材蓄积量(Vl)
2.3.5 大径材出材量(Ol)
2.3.6 大径材株数比例(ND≥26)
2.3.7 大径材出材率(Yl)
2.4 评价指数
2.4.1 立地指数(SI)
2.4.2 土壤综合肥力指数(I)
2.4.3 微地形指数(M)
2.4.4 地理指数(G)
2.5 数据分析
3. 结果与分析
3.1 立地指数(SI)对杉木大径材生长的影响
3.2 土壤综合肥力指数(I)对杉木大径材生长的影响
3.3 微地形指数(M)对杉木大径材生长的影响
3.4 地理指数(G)对杉木大径材生长的影响
3.5 林龄(A)对杉木大径材生长的影响
3.6 保留密度(D)对杉木大径材生长的影响
3.7 杉木大径材出材量预测
4. 讨论与结论
