桑树Morusalba是多年生木本植物，广泛分布于亚洲、非洲、欧洲等地区，具有良好的经济效益^[1]。现代的蚕桑产业不再拘泥于传统的“种桑养蚕”，更多的是朝着蚕桑资源综合利用的方向发展^[2-3]，以蚕桑产业作为扶贫项目的手段已经在我国广西、云南等地广泛实施。随着蚕桑产业的不断发展，桑树的种植面积也不断扩大，但作为蚕桑产业基石的桑树却受到诸多病害的影响，尤其是桑树真菌性病害严重影响了桑叶的质量与产量。

桑树褐斑病与桑轮纹病同属于桑树2种主要的真菌性病害。桑褐斑病主要症状为桑树叶片出现褐色斑点，病原菌为黏隔孢Septogleum mori和褐斑壳丰孢Phloeospora maculans 2种病原真菌^[4-5]。Hong等^[6]研究认为黏隔孢与褐斑壳丰孢属于同种异名。2017年，Videira等^[7]将二者名称统一更正为如今的新褐斑壳丰孢Neophloeospora maculans。桑褐斑病分布广泛，在巴西、土耳其及印度等地均有报道^[8-10]，桑感染褐斑病后桑叶中的主要营养成分含量会显著降低，对家蚕的消化吸收率、虫蛹生命率均有影响^[11]。与褐斑病导致的症状类似，桑轮纹病的主要症状为桑叶出现轮纹型斑块^[12],主要病原菌为膝节霉Gonatophragmium triuniae。该病原菌寄主有桑科桑属和无花果属等共15科22属的木本和草本植物，危害严重^[13]。桑褐斑病与桑轮纹病病原菌具有较强的生命活力，尤其是轮纹病病原菌膝节霉，菌丝的致死温度可达到85 ℃^[14]。不仅如此，褐斑病与轮纹病病原菌均以分生孢子盘遗落在病叶或者土壤中，可长期存活，待适宜条件又可侵染桑树，导致病害的大面积爆发^[4]。目前，对2种病害病症的识别主要是通过肉眼观察法，但桑叶上观测到2种病害症状的时候，病原菌的增殖已达到一定数量，给病害的防控工作带来极大的困扰。因此，如何建立一种快速、准确的桑树褐斑病与轮纹病病原菌的检测技术是桑褐斑病与轮纹病早期防控的关键。

常见的植物病原菌核酸检测方法主要有聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增法^[15]、实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative PCR，qPCR)扩增法^[16]、环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)法等^[17]。目前，对桑树病害的检测多为普通PCR和LAMP检测^[18-19]，不同的检测技术各有优势，但多局限于对单个病原的检测。对于多种病原菌复合侵染的情况，或对于症状相似的病害，目前还鲜有较实用的快速检测方法，且针对于桑轮纹病和桑褐斑病2种危害严重的桑树真菌病害仍需相应的检测技术。多重PCR技术是指在同一个反应体系中加入2对或2对以上的引物，可以同时扩增出2组或2组以上的核酸片段，实现多种病原菌的快速检测^[20]。本研究建立了桑褐斑病与桑轮纹病病原菌的多重PCR检测技术，为桑树真菌性病害的防控提供技术支持。

1.   材料与方法

1.1   样本收集

2019—2021年从广东、广西、云南和陕西主要种桑地区不同品种上采集褐斑病和轮纹病病样共250份，样本详细信息见表1。

表  1  样本材料收集信息

Table  1.  Sample material collection information

感病类型 Type of infected disease	采样地区 Collection site	经纬度 Latitude and longitude	品种 Variety	样本数量 Number of sample
褐斑病 Brown spot disease	广西百色市隆林县 Longlin County, Baise City, Guangxi	105.17°E，24.64°N	桂优12号 Guiyou 12	30
	陕西安康市石泉县 Shiquan County, Ankang City, Shaanxi	108.32°E，32.97°N	强桑1号 Qiangsang 1	30
			大10 Da 10	30
			长果桑 Changguosang	30
	陕西安康市汉阴县 Hanyin County, Ankang City, Shaanxi	108.90°E，32.62°N	强桑1号 Qiangsang 1	10
	云南楚雄彝族自治州永仁县 Yongren County, Chuxiong Yi Autonomous Prefecture, Yunnan	101.38°E，26.06°N	强桑1号 Qiangsang 1	30
			农桑14 Nongsang 14	30
轮纹病 Ring leaf spot disease	广东清远市英德蚕种场 Yingde Silkworm Breeding Farm, Qingyuan City, Guangdong	113.45°E，24.18°N	抗青10号 Kangqing 10	30
	广西百色市隆林县 Longlin County, Baise City, Guangxi	105.57°E，24.64°N	桂优12号 Guiyou 12	30

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1.2   供试真菌与试剂耗材

主要病原菌：新褐斑壳丰孢N. maculans与膝节霉G. triuniae等均分离保藏于亚太地区蚕桑培训中心。

其他真菌：致密链格孢Alternaria compacta、黑链格孢A. solani、棒状孢子菌Corynespora cassiicola、博宁炭疽菌Colletotrichum boninese、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、禾谷镰刀菌F. graminearum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense等均分离保藏于亚太地区蚕桑培训中心。

Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、植物总DNA提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，T3 PCR Mix、高纯度低电渗琼脂糖、DL 2000 DNA marker、TS-GelRed核酸凝胶染料、1×TBE速溶颗粒均购于北京擎科生物科技有限公司，电泳仪(Powerpac Basci )采购于伯乐生命医学产品有限公司，PCR仪(A200)采购于杭州朗基科学仪器有限公司，超微分光光度计(NDlife)和全自动数码凝胶成像系统(Tanon-120)采购于广州誉维生物科技仪器有限公司。

1.3   病菌、病样及健康桑树DNA的提取

供试真菌总DNA提取采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒。供试样本总DNA提取采用植物总DNA抽提试剂盒。提取后的DNA用分光光度计测量DNA的浓度，使DNA的D_{260 nm}/D_{280 nm}控制在1.8~2.0，质量浓度为1 ng/μL左右。

1.4   多重PCR引物设计及特异性测定

根据多重PCR的反应原理，采用引物对ITS1/ITS4^[21]对新褐斑壳丰孢与膝节霉的核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spacer)进行扩增，拟扩增片段大小为560 bp左右，经比较NCBI数据库中新褐斑壳丰孢与膝节霉的核糖体内转录间隔区序列与2种病原菌的测序结果,使用DNAMAN软件和Primer Premier 5.0软件分别设计特异性引物对HBF6 (5′-GACCTCCAACCCCCTGTG-3′)/HBR6(5′-CGCGACTCTTCAGCGACATA-3′)和LWF2(5′-CCTTTGCACAACCGTATCCC-3′)/LWR2(5′-GACATGCTCCCTGGAGAACC-3′),并通过Primer-BLAST( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)查询引物的具体参数及特异性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以“1.3”中提取的新褐斑壳丰孢与膝节霉DNA为阳性对照，以健康桑叶总DNA 为空白对照，以“1.2”中其他真菌的DNA为阴性对照，进行多重PCR扩增，验证引物的特异性。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.5   多重PCR反应体系优化

多重PCR反应体系为25 µL 扩增体系：T3 PCR Mix 22 µL,引物HBF6/HBR6和LWF2/LWR2各1 μL、DNA模板1 μL。扩增程序：98 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35个循环；72 ℃延伸2 min，于4 ℃保存。取PCR产物在110 V下经过12 g/L 琼脂糖凝胶电泳30 min，用凝胶成像系统拍照观察。

按照T3 PCR Mix试剂盒说明，当引物LWF2/LWR2达到试剂盒使用浓度时（用量1 µL，在25 µL PCR体系中浓度为0.4 mmol/L），电泳结果中已出现明亮条带，因此确定LWF2/LWR2的用量为1 µL。在这基础上，对引物HBF6/HBR6用量进行优化，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL的初始浓度为 10 µmol/L的引物HBF6/HBR6，确定引物最终用量后，将2对引物加入同一体系中，待测病原菌新褐斑壳丰孢与膝节霉的DNA模板各1 μL，进行不同的退火温度(55~65 ℃)(仪器自设)最优条件探究，产物经过12 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据全自动数码凝胶成像系统中条带的亮度选择最优参数。

1.6   多重PCR灵敏度分析

将“1.3”提取的桑褐斑病病原菌新褐斑壳丰孢与桑轮纹病病原菌膝节霉的DNA质量浓度分别梯度稀释为1 000、 100、 10、1、0.1、0.01、0.001 pg/μL，采用“1.5”最佳扩增体系及程序进行扩增，取病原菌新褐斑壳丰孢及膝节霉 DNA模板各1 μL加入同一体系中，根据全自动数码凝胶成像系统中有无目的条带判断该多重PCR的灵敏度。

1.7   多重PCR田间样本检测

对部分收集的田间病样提取总DNA，以健康样本DNA为阴性对照。根据最优的多重PCR反应体系进行PCR扩增，检测45份田间病样DNA是否存在新褐斑壳丰孢与膝节霉。最后根据全自动数码凝胶成像系统中有无目的条带判断其对应的病原菌。

2.   结果与分析

2.1   多重PCR检测的特异性

经过引物筛选，本研究确定了引物组HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2，设计的新褐斑壳丰孢特异引物HBF6/HBR6扩增出的目的片段大小为406 bp(图1A)；膝节霉特异引物LWF2/LWR2扩增出的目的片段大小为248 bp(图1B)，2组引物只对阳性待测菌进行特异性扩增，且条带明亮单一，而空白对照及其他8种阴性对照真菌无法扩增出目的条带，且PCR产物的测序结果与目的基因一致，表明本研究设计的引物HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2具有良好的特异性。

图  1  HBF6/HBR6 (A) 和LWF2/LWR2 (B)引物特异性检测结果

M：DL 2000 marker；1：新褐斑壳丰孢；2：膝节霉；3：致密链格孢；4： 黑链格孢；5：棒状孢子菌；6：博宁炭疽菌；7： 木贼镰刀菌；8：禾谷镰刀菌；9：胶孢炭疽菌；10：暹罗炭疽菌;11：健康桑树

Figure  1.  The specificity detection results using primer sets HBF6/HBR6 (A) and LWF2/LWR2 (B)

M: DL 2000 marker; 1: Neophloeospora maculans; 2: Gonatophragmium triuniae; 3: Alternaria compacta; 4: A. solani; 5: Corynespora cassiicola; 6: Colletotrichum boninese; 7: Fusarium equiseti; 8: F. graminearum; 9: Colletotrichum gloeosporioides; 10: Colletotrichum siamense; 11: Healthy muberry

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2.2   多重PCR扩增体系的优化与建立

多重PCR扩增体系优化结果显示，引物组HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2在25 µL的反应体系中用量分别为0.6 µL(0.24 mmol/L)和1.0 µL(0.40 mmol/L)时，多重PCR的检测结果最好，条带最亮(图2)。其次，根据引物退火温度的筛选结果(图3)，2组混合引物的最佳退火温度为59 ℃。因此，确定最优的多重PCR反应体系为：T3 PCR Mix 21.7 μL、10 μmol/L 引物HBF6/HBR6各0.6 μL、LWF2/LWR2各1.0 μL、DNA模板1 μL；最佳的扩增程序的退火温度为59 ℃。利用最优条件对2种病原菌DNA进行扩增，当只存在新褐斑壳丰孢N. maculans时，仅检测到1条大小为406 bp的条带；当只存在膝节霉G. triuniae时，仅检测到1条大小为248 bp的条带；当存在2种病原菌的时候可以同时检测到上述2种条带(图4)。表明本研究经优化的多重PCR检测方法可靠。

图  2  HBF6/HBR6 引物用量筛选结果

M：DL 2000 marker; 1~2、3~4、5~6、7~8、9~10的HBF6/HBR6引物用量分别为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 µL; 1~10中LWF2/LWR2引物用量均为1.0 µL

Figure  2.  HBF6/HBR6 primer dosage test results

M: DL 2000 marker; The amounts of HBF6/HBR6 primer added in 1−2，3−4，5−6，7−8，9−10 were 1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 µL; The amounts of LWF2/LWR2 primer in 1−10 were all 1.0 µL

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图  3  多重PCR退火温度筛选结果

Figure  3.  Screening results of multiplex PCR annealing temperature

M：DL 2000 marker;1~8: 55.0, 55.5, 56.7, 59.0 , 61.0, 63.3, 64.5, 65.0 ℃

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图  4  多重PCR体系对2种病原菌的扩增效果

M：DL 2000 marker；1~2：新褐斑壳丰孢； 3~4： 膝节霉； 5~6：新褐斑壳丰孢+膝节霉；7：ddH₂O

Figure  4.  Amplification results of two pathogenic fungus by multiplex PCR system

M:DL 2000 marker; 1−2:Neophloeospora maculans; 3−4: Gonatophragmium triuniae; 5−6: N. maculans and G. triuniae; 7: ddH₂O

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2.3   多重PCR检测的灵敏度

经过“2.2”优化后多重PCR体系检测不同质量浓度的新褐斑壳丰孢与膝节霉混合DNA，结果表明新褐斑壳丰孢与膝节霉DNA最低检测限分别达0.1和1.0 pg/μL(图5)。说明本研究建立的多重PCR体系灵敏度较高，可用于桑轮纹病与褐斑病早期菌量较少时的检测。

图  5  多重PCR体系对2种病原菌的灵敏度检测结果

M：DL 2000 marker；样品中含有等量新褐斑壳丰孢和膝节霉DNA，且1~7中每种病原菌的质量浓度分别为1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001 pg/μL

Figure  5.  Sensitivity detection results of two pathogenic fungus by multiple PCR system

M: DL 2000 marker; Each sample has equal amounts of Neophloeospora maculans DNA and Gonatophragmium triuniae DNA , and the contents of each pathogenic fungus in 1−7 are 1 000，100，10，1，0.1，0.01 and 0.001 pg/μL, respectively

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2.4   桑褐斑病及桑轮纹病田间样品的检测结果

采用“2.2”优化的反应体系及程序对所收集的250份田间病样随机抽取45份加以检测，结果(图6、图7)显示，在广东省英德蚕种场与广西隆林县的桑轮纹病病样中均检测到膝节霉，未检测到新褐斑壳丰孢，表明该桑轮纹病样本主要病原菌为膝节霉，未出现2种病原菌复合侵染的情况；而在广西隆林县收集的桑褐斑病病样中，不仅检测到新褐斑壳丰孢，也有部分检测到膝节霉，表明在广西隆林县收集的桑褐斑病病样中有轮纹病病原菌的存在，而在其他地区收集的多份桑褐斑病病样中，唯有陕西石泉县的1份样本和陕西汉阴县的1份样本中检测到2种病原菌，其余的均只检测到新褐斑壳丰孢1种病原菌；部分病样未检测到新褐斑壳丰孢与膝节霉，出现了空白条带，推测可能在取样或DNA的提取过程中未提取到病原菌的DNA，其次，部分桑树真菌病害的特征与桑褐斑病非常相似，导致出现了桑树病害的误判。综上，本研究建立的多重PCR检测方法特异性好、灵敏度高，能应用于桑树褐斑病与桑树轮纹病病原菌的检测。

图  6  桑树桑轮纹病病原菌的多重PCR检测结果

M：DL 2000 marker；1：膝节霉；2：新褐斑壳丰孢；3：膝节霉+新褐斑壳丰孢；4~7：广东省英德桑轮纹病病样；8~11：广西隆林县桑轮纹病病样

Figure  6.  Multiplex PCR detection results of mulberry ring leaf spot disease pathogen

M: DL 2000 marker; 1: Gonatophragmium triuniae; 2: Neophloeospora maculans; 3: G. triuniae and N. maculans; 4−7: Sample with mulberry ring leaf spot disease from Yingde City, Guangdong Province; 8−11: Sample with mulberry ring leaf spot disease from Longlin County, Guangxi

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图  7  桑树褐斑病病原菌的多重PCR检测结果

M：DL 2000 marker；1：新褐斑壳丰孢；2：膝节霉；3：膝节霉+新褐斑壳丰孢；4~7：广西隆林县桑褐斑病病样；8~12：陕西省石泉县‘强桑1号’褐斑病病样；13~17：陕西省石泉县‘大10’褐斑病病样；18~22：陕西省石泉县‘长果桑’褐斑病病样；23~31：陕西省汉阴县‘强桑1号’褐斑病病样；32~35：云南省永仁县‘强桑1号’褐斑病病样；36~39：云南省永仁县‘农桑14’褐斑病病样；40：健康桑树

Figure  7.  Multiplex PCR detection results of mulberry brown spot disease pathogen

M: DL 2000 marker; 1: Gonatophtagmium triuniae; 2: Neophloeospora maculans; 3: G. triuniae and N. maculans; 4−7: Sample with mulberry brown spot disease from Longlin County, Guangxi; 8−12: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Qiangsang 1’, Shiquan County, Shaanxi Province; 13−17: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Da 10’, Shiquan County, Shaanxi Province; 18−22: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Changguosang’, Shiquan County, Shaanxi Province; 23−31: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Qiangsang 1’, Hanyin County, Shaanxi Province; 32−35: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Qiangsang 1’, Yongren County, Yunnan Province; 36−39: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Nongsang 14’, Yongren County, Yunnan Province; 40: Healthy mulberry

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3.   讨论与结论

桑树轮纹病与桑树褐斑病危害严重，目前鲜见相关病原菌的检测方法，而开发适用于桑树褐斑病与轮纹病病原菌的检测技术，是防控这2种病害的关键。桑树病原菌的检测方法分为传统鉴定法及分子生物学鉴定法，传统的鉴定方法以形态学观察为主，因为观察者的主观臆断易有较大的误差，只能大体判断病原菌的类群。随着分子生物学的发展，多种核酸检测技术得到开发与应用。但多重PCR因具有提高检测通量的优点，而被广泛运用于临床上病原菌和转基因作物的检测。如Egea等^[22]基于多重PCR检测技术设计的反应可用于呼吸道感染的急性细菌性脑膜炎病原菌的诊断；邢珍娟等^[23]应用多重荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分。不仅如此，多重PCR检测技术也被运用于植物病原检测，杨怡华等^[24]建立的巢式多重PCR可以快速检测麦冬2种常见的真菌性病原炭疽菌Colletotrichum liriopes和互隔交链孢菌Alternaria alternata；李明骏等^[25]建立了5种玉米病毒的多重PCR检测体系，极大地提高了玉米病毒的检测效率。本研究建立了桑轮纹病与桑褐斑病2种病原菌的多重PCR检测方法，可以通过一步法对2种常见的桑树病原菌进行快速检测，具有良好的可操作性。

本研究分别以膝节霉与新褐斑壳丰孢的ITS序列为靶基因进行了特异性引物设计与筛选，最终确定了HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2引物组合作为桑褐斑病与轮纹病的最终检测引物。通过对2种病原真菌及其他从桑叶上分离真菌的多重PCR检测结果表明，本研究建立的多重PCR检测技术，同时检测2种病原菌新褐斑壳丰孢和膝节霉的DNA检出限分别达0.1和1.0 pg/μL，且非目标菌株以及空白对照都没有检测到特异性扩增，表明本研究建立的桑褐斑病与桑轮纹病多重PCR检测技术具有良好的灵敏度与特异性。本研究优化了其他相关的反应参数与条件，建立了桑轮纹病与桑褐斑病的多重PCR检测技术，可以对2种病原菌进行快速、准确、有效的检测。

本研究建立的多重PCR检测方法整个流程可在4 h内完成，极大地节约了时间和经费开支，并且具有特异性强和灵敏度高的优点，可应用于桑轮纹病与桑褐斑病的准确鉴定。本研究建立的多重 PCR 体系在田间样本实际检测中，检出率达到91.4%，有较高的准确率与可操作性。其次，本研究在对部分症状类似于桑褐斑病与桑轮纹病的病样进行检测时，并未检测到膝节霉与新褐斑壳丰孢，推测部分叶斑状病样的病症虽与褐斑病相似，但是为不同的病原菌侵染所致，已有部分报道验证这一推测，如关于炭疽病的报道^[26]。因此，在对桑树褐斑病与轮纹病的检测过程中，需结合其他病原菌的核酸特性，对所检测病害加以分析。总之，本研究建立的膝节霉与新褐斑壳丰孢的检测方法，既可用于桑轮纹病与褐斑病的快速确诊，也可以用于桑园中2种病害早期的病原筛查，具有较强的实用性，为桑树真菌性病害的防控建立了基础。