Seed germination index of the product of kitchen waste biochemical equipment and its influencing factors
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摘要:目的
确定厨余生化机产物腐熟度及Na+、小分子有机酸与种子发芽指数(Seed germination index，GI)的关系，促进厨余生化机产物的资源化利用及推广，同时，开拓固碳于土壤达到碳中和目标的新技术途径。
方法利用萝卜Raphanus sativus种子测定厨余生化机产物的GI，并模拟不同浓度Na+、小分子有机酸溶液，分析其对GI的影响。
结果厨余生化机产物的GI为1.53%，不满足堆肥基本腐熟的标准(GI≥50%)，厨余生化机产物浸提液稀释10倍时，溶液中Na+质量浓度为75.25 mg/L，GI为43.73%。模拟试验结果显示，随着Na+浓度的升高，GI呈下降趋势，当Na+质量浓度为1200 mg/L时，GI为52.86%。随着小分子有机酸浓度的增加，GI呈下降趋势，当乙酸和乳酸质量浓度高于100 mg/L、丙酸和丁酸质量浓度高于50 mg/L时，GI小于50%。丙酸、丁酸对GI的影响强于乙酸、乳酸。
结论厨余生化机产物的GI未达到堆肥基本腐熟的标准，制约其未达标的主要影响因素是厨余垃圾降解产生的小分子有机酸，而非其含盐量。
Abstract:ObjectiveTo determine the relationships between maturity, Na+, small molecular organic acids of product of kitchen waste biochemical equipment and germination index (GI), promote the resource utilization and popularization of the product of kitchen waste biochemical equipment, and at the same time, exploit the new technological way of carbon neutrality through soil carbon sequestration.
MethodThe GI of product of kitchen waste biochemical equipment was determined using radish (Raphanus sativus) seeds, and the effects of Na+ and small molecular organic acid solutions on GI were analyzed by mimic experiments.
ResultThe GI of the kitchen waste biochemical equipment product was 1.53%, which did not reach the standard of basic maturity of compost (GI ≥ 50%). When the extract of kitchen waste biochemical equipment product was diluted for 10 times, the Na+ content in the solution was 75.25 mg/L, and the GI value was 43.73%. With the increase of sodium concentration, the GI value showed a downward trend. When the Na+ concentration was 1 200 mg/L, the GI value was 52.86%. With the increase of the concentration of small molecular organic acids, the GI value showed a downward trend. When the concentrations of acetic acid and lactic acid were higher than 100 mg/L, and while the concentrations of propionic acid and butyric acid were higher than 50 mg/L, the GI value was less than 50%. The inhibiting effect of propionic acid and butyric acid on GI was stronger than that of acetic acid and lactic acid.
ConclusionThe GI of product of kitchen waste biochemical equipment did not reach the maturity standard of composting, and the main restriction factor was the small molecular organic acids produced by the degradation of kitchen waste, rather than its salt content.
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烟粉虱Bemisia tabaci Gennadius是一个正在快速进化的复合种，其生物型B与Q是重要入侵害虫[1-2]。B型烟粉虱于20世纪90年代传入我国，几年时间内就扩散至全国除青藏高原以外的地方，严重威胁农作物生产，它通过口针直接刺吸植物汁液，分泌大量的蜜露引发煤污病，更为严重的是它还能传播双生病毒引起植物黄化曲叶等植物病害[3-4]。虫生真菌的利用是防治烟粉虱的重要手段，在前期研究中，已发现烟粉虱在田间自然条件下可感染玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea，分离筛选了生物活性较高的玫烟色棒束孢菌株；并且发现该菌在致病烟粉虱的同时，可减轻番茄黄化曲叶病毒病(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)的传播[5-7]。玫烟色棒束孢是一种重要的虫生真菌，地理分布广泛，能够寄生同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目等多种昆虫，对烟粉虱、小菜蛾Plutella xylostella Linnaeus、柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama、红火蚁Solenopsis invicta Buren，以及朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus Boisduval等重要害虫具有生物应用潜力[8-12]。20世纪90年代以来，对玫烟色棒束孢的鉴定分离、培养性状、代谢产物、遗传变异、致病性及应用等方面的研究显著增加[13-14]。
本研究拟通过对广东、福建和青海省的玫烟色棒束孢进行ITS序列比对，研究不同地区的玫烟色棒束孢间的亲缘关系，同时测定菌株对B型烟粉虱的致病力，分析玫烟色棒束孢菌的地理遗传性，及对烟粉虱致病性的影响，为利用玫烟色棒束孢防治烟粉虱提供新材料与科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
16株玫烟色棒束孢菌株为华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室从广东省、福建省和青海省不同地区采集土壤经分离鉴定的菌株(表1)。取斜面菌种接种至PDA培养基平板上培养2~3周，收集分生孢子，并用w为0.02%的吐温–80溶液悬浮，用血球计数板法调整孢子悬浮液浓度为107 mL–1，备用。
表 1 来自不同地区的16株玫烟色束孢菌株Table 1. Sixteen Isaria fumosorosea strains isolated from different regions菌株名称 来源地 菌株名称 来源地 IfFJ01 福建南平市建阳区 IfGD12 广东梅县 IfFJ02 福建连城县 IfGD14 广东恩平市 IfFJ04 福建福安市 IfGD15 广东惠东县 IfFJ05 福建沙县 IfGD17 广东博罗县 IfFJ06 福建武夷山市 IfGD18 广东龙门县 IfFJ17 福建永安市 IfGD20 广东龙门县 IfGD02 广东饶平县 IfGD21 广东中山市三乡镇 IfGD07 广东徐闻县 IfTS01 青海门源县 烟粉虱为华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室保存的B型烟粉虱品系，在盆栽棉花Gossypium spp.品种鲁傲7886苗上饲养，选择2龄若虫供生物测定。
1.2 方法
1.2.1 玫烟色棒束孢菌株的同源性分析
根据供试菌株的ITS序列(引物ITS1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′；ITS4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′)，在Genbank中搜索已经报道的玫烟色棒束孢ITS序列(KX057373.1、KX057375.1)，用MegAlign软件中的Clustal W和Phylogenetic tree对ITS序列进行相似性分析和系统树的构建。
1.2.2 玫烟色棒束孢对烟粉虱的致病性测定
采用离体叶片浸渍法测定玫烟色棒束孢对烟粉虱的生物活性。剪切带有B型烟粉虱2龄若虫的棉花叶片(每片叶50头以上)，在配好的107 mL–1的玫烟色棒束孢分生孢子悬浮液中浸泡20 s后晾干，设w为0.02%的吐温–80溶液为空白对照，在叶柄处包裹含有植物营养液(氮、磷、钾质量比为1∶2∶1)的棉花叶片，置于直径为9 cm的培养皿中，在光周期为14 h光∶10 h暗、温度(25±1) ℃、相对湿度(70±10)%的光照培养箱中培养。从第2天开始，每48 h在解剖镜下检查若虫生长存活情况，若虫虫体干瘪、颜色变枯黄者即视为死亡，继续保湿培养观察虫体是否长出玫烟色棒束孢，验证是否为病死虫，统计病死率，每个处理重复3次。
1.3 数据处理
根据Abbott公式计算校正后的累积病死率[15]。数据处理采用SPSS软件，差异显著性分析用Duncan’s法；半致死时间(LT50)用SPSS软件中的Probit analysis进行分析。
2. 结果与分析
2.1 各地区玫烟色棒束孢的ITS序列相似性分析
将供试玫烟色棒束孢菌株的ITS序列与参考菌株构建系统发育树(图1)，结果发现除了来自福建的IfFJ17菌株与参考菌株(KX057375.1、KX057373.1) 的ITS序列相似性为97.7%外，其余15个菌株与参考菌株(KX057375.1、KX057373.1)ITS序列的相似性均高于98.0%。但是，结果显示供试菌株没有明显的地域性遗传分化倾向，比如，来自青海的IfTS01菌株与参考菌株KX057375.1的ITS序列几乎相同，也与福建菌株IfFJ02、IfFJ06及广东菌株IfGD17的ITS序列高度相似。
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图 1 基于ITS基因序列构建的玫烟色棒束孢系统发育树福建菌株(IfFJ01、IfFJ02、IfFJ04、IfFJ05、IfFJ06、IfFJ17)，广东菌株(IfGD02、IfGD07、IfGD12、IfGD14、IfGD15、IfGD17、IfGD18、IfGD20、IfGD21)，青海菌株(IfTS01)Figure 1. Phylogenetic tree of Isaria fumosorosea based on ITS gene sequences2.2 玫烟色棒束孢对烟粉虱的致病性
供试的16株玫烟色棒束孢对2龄烟粉虱均有致病作用，但不同菌株对烟粉虱2龄若虫的致病力不同(表2)。
表 2 B型烟粉虱2龄若虫被玫烟色棒束孢菌株侵染后的病死率1)Table 2. Fatality rates of the second instar nymphs of B-biotype Bemisia tabaci after infected with Isaria fumosorosea strains菌株名称 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天 IfFJ01 0 9.23±1.63e 30.84±1.98bcd 48.84±2.91de 70.60±0.87de IfFJ02 0 9.04±2.96e 24.11±6.39e 47.57±3.20de 53.65±4.49f IfFJ04 0 9.03±1.07de 30.83±2.01de 41.23±2.49e 47.63±3.24f IfFJ05 0 12.68±2.22de 36.30±2.32cde 56.20±1.99cb 71.59±1.41e IfFJ06 0 13.31±1.10cde 50.75±1.54a 70.51±2.48a 80.97±1.88ab IfFJ17 0 9.20±0.57e 30.58±2.26de 44.58±2.31e 53.80±1.70f IfGD02 0 10.96±1.59de 41.96±2.11abc 71.03±1.46a 85.45±0.54a IfGD07 0 9.22±0.77e 36.48±1.21bcd 71.14±3.04a 77.04±1.06bcd IfGD12 0 9.06±0.66e 37.21±1.13bcd 64.79±3.05ab 79.85±3.35abc IfGD14 0 19.87±2.03b 50.12±1.89a 66.68±0.38a 73.51±1.67cde IfGD15 0 15.34±3.28bcd 45.14±1.05ab 68.28±2.37a 79.28±1.58abc IfGD17 0 14.51±0.54bcde 45.96±3.17ab 65.09±3.12ab 79.17±1.75abc IfGD18 0 12.86±0.87cde 41.39±3.47abc 58.36±2.96bc 72.03±2.35de IfGD20 0 12.25±1.17cde 30.51±2.84de 41.54±2.29e 53.55±2.74f IfGD21 0 17.66±0.69bc 37.23±0.46bcd 58.91±1.17bc 71.40±0.68de IfTS01 0 25.36±3.60a 52.46±2.64a 69.53±1.63a 82.28±1.59ab 1)表中数据为校正病死率的平均值±标准误；同列数据后凡是具有一个相同小写字母者，表示差异不显著 (P > 0.05，Duncan’s 法) 由表2可知，以玫烟色棒束孢107 mL–1分生孢子悬浮液处理后，烟粉虱的病死率随时间延长而增多，处理后第2天，未发现烟粉虱死亡现象；处理后第4天，烟粉虱病死9%~26%；处理后第6天与第8天，病死率分别达到24%~53%与41%~72%。至处理后第10天，不同菌株对烟粉虱致病力差异增大，病死率达到80%以上的菌株有来自福建的菌株IfFJ06、广东的菌株IfGD02与青海菌株IfTS01；病死率低于60%的菌株有福建的IfFJ02、IfFJ04、IfFJ17与广东的IfGD20；而其他菌株处理的烟粉虱具有70%~80%的病死率。不同菌株的致死中时间LT50也存在差异，其中IfTS01菌株的LT50最短，小于6 d，IfFJ04的LT50最长，大于10 d (表3)。试验结果显示，广东、福建与青海菌株对烟粉虱都有致病力，且致病力强弱与菌株地理来源没有明显关系，青海虽然不是B型烟粉虱的分布地，但其菌株IfTS01仍然对烟粉虱有效，可见，供试菌株对B型烟粉虱的致病力未表现出明显的地理分化现象。
表 3 玫烟色棒束孢菌株对B型烟粉虱2龄若虫的半致死时间Table 3. LT50 of Isaria fumosorosea strains to the second instar nymphs of B-biotype Bemisia tabaci菌株名称 LT50/d LT5095%置信区间/d 菌株名称 LT50/d LT5095%置信区间/d IfFJ01 7.25 6.56~8.11 IfGD12 6.50 5.94~7.11 IfFJ02 8.21 7.30~9.61 IfGD14 6.00 5.44~6.60 IfFJ04 >10 >10 IfGD15 6.04 5.44~6.66 IfFJ05 6.94 6.28~7.22 IfGD17 6.35 5.77~6.98 IfFJ06 6.13 5.61~6.67 IfGD18 6.71 6.05~7.47 IfFJ17 8.19 7.28~9.59 IfGD20 8.14 7.25~9.48 IfGD02 6.22 5.68~6.77 IfGD20 6.72 6.08~7.48 IfGD07 6.57 6.01~7.17 IfTS01 5.74 5.13~6.36 3. 讨论与结论
有研究认为玫烟色棒束孢是一个复合种，存在显著的遗传分化现象[1]。本研究发现来自福建的IfFJ17菌株与参考菌株的ITS序列相似性最低，只有97.7%，而其他15个菌株的序列相似性都高于98.0%，说明我国的玫烟色棒束孢菌可能存在较大的种内分化倾向。然而，本研究中来自广东、福建菌株的ITS序列并未表现出地理特征，青海菌株与广东、福建菌株的ITS序列也没有明显的地理分界，说明玫烟色棒束孢在上述地区并没有明显的遗传地理分化倾向，可能原因是这些地区的基因交流较多，遗传性趋于相同。
不同菌株对B型烟粉虱的致病力是有显著差异的，福建菌株IfFJ06、广东菌株IfGD02及青海菌株IfTS01引起烟粉虱的病死率高于80%，而福建的IfFJ02、IfFJ04、IfFJ17与广东的IfGD20菌株引起烟粉虱的病死率低于60%，其他菌株则具有70%~80%的烟粉虱病死率。可见，玫烟色棒束孢对烟粉虱的致病性似乎与其产地关系不大，各地均可发现致病力较强的菌株。来源于福建的低致病力菌株较多而广东的较少，这一方面可能与供试B型烟粉虱是广东品系有关，广东品系烟粉虱与广东玫烟色棒束孢菌株间可能存在协同进化关系。另一方面也可能与供试菌株的数量不足有关。然而，青海菌株IfTS01产自无B型烟粉虱分布的地区，它仍然具有较高的烟粉虱致病力。因此，上述猜想还需要进一步研究证明。
综上所述，本研究认为来自我国广东、福建与青海等地区的玫烟色棒束孢菌具有遗传多样性，但没有遗传地理分化特征，其对B型烟粉虱的致病力具有显著差异，但致病力与菌株的产地没有明显关系。本研究初步筛选的IfFJ06、IfGD02与IfTS01菌株对烟粉虱具有较高致病力，有进一步研究价值。
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图 1 不同浓度钠离子的种子发芽指数
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 1. Seed germination index(GI)of different concentrations of sodium ions
Different lowercase letters on the columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
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图 2 4种小分子有机酸不同浓度下的种子发芽指数
各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 2. The seed germination index of four kinds of small molecular organic acids under different concentrations
In each figure, different lowercase letters on the columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
表 1 厨余生化机产物浸提液的种子发芽指数(GI)
Table 1 Seed germination index (GI) of extract of kitchen waste biochemical machine product
浸提液稀释倍数 Dilution times of extract ρ(Na+)/(mg·L−1) 电导率1)/(µS·cm−1) Electrical conductivity GI1)/% 0 752.44 5 800.00±200.00a 1.53±0.04d 5 150.49 1 300.00±50.00b 30.43±2.69c 10 75.25 697.67±68.07c 43.73±2.88b 50 15.05 161.33±17.21d 76.95±4.75a 1)表中数据为平均值±标准误，n=3；同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法) 1) The data in the table were mean ± standard error, n=3; Different lowercase letters after the data in the same column indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s method) 
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