Effect of CRISPR/Cas system on drug resistance and virulence genes of Staphylococcus aureus
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摘要:目的
了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”) Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的分布情况，分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。
方法从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个，利用生物信息学方法，统计CRISPR结构的携带情况，菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况；对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR−)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析，验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计，讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。
结果基因组组装完整的575株金葡菌中，有62株携带CRISPR结构(CRISPR+)，513株不携带CRISPR结构(CRISPR−)；CRISPR+金葡球菌携带耐药基因、毒力基因的数目显著小于CRISPR− 金葡菌。实验室60株金葡菌中，有14株为CRISPR+，46株为CRISPR−；CRISPR+金葡菌携带更少的耐药基因和毒力基因，与公共数据库分析结果一致。对原噬菌体和接合质粒的分析结果显示，CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05)；接合质粒方面，CRISPR−和CRISPR+菌株无显著性差异。
结论CRISPR结构可能限制了金葡菌中耐药基因和毒力基因的水平转移，CRISPR−菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究为进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播提供了参考。
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关键词:
- 金黄色葡萄球菌 /
- CRISPR/Cas系统 /
- 耐药基因 /
- 毒力基因
Abstract:ObjectiveTo understand the distribution of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in Staphylococcus aureus and analyze their effects on the horizontal transfer of antibiotic resistance gene and virulence gene.
MethodTotal 575 complete S. aureus genomes were obtained from public databases, and bioinformatics methods were used to count the CRISPR carriage, multi-locus sequence typing (MLST) types distribution of strains and the distribution of strain drug resistance genes and virulence genes. The significance analysis of the difference in the number of drug resistance genes and virulence genes was carried out between CRISPR structure-positive (CRISPR+) and CRISPR structure-negative (CRISPR−)S. aureus. The data of 60 strains of S. aureus were also analyzed by second-generation sequencing to verify the results of public database analysis. We also counted the carriage of prophages and conjugative plasmids in 60 strains of S. aureus in the laboratory, and discussed the effect of CRISPR structure on the prophages and conjugative plasmids of the strains.
ResultAmong the 575 strains with complete genome assembly, there were 62 strains with CRISPR structure (CRISPR+) and 513 strains without (CRISPR−). The number of drug resistance genes and virulence genes of CRISPR+S. aureus was less than that of CRISPR−S. aureus, and the difference was significant. Among 60 strains of S. aureus in the laboratory, there were 14 strains of CRISPR+ and 46 strains of CRISPR−. CRISPR+S. aureus carried fewer drug resistance genes and virulence genes, which was consistent with the results of the public database analysis. Analysis of prophages and conjugative plasmids showed that CRISPR− strains carried more prophage sequences, which were significantly different from CRISPR+ strains (P<0.05). For conjugative plasmids, CRISPR− and CRISPR+ strains were largely consistent with no significant difference.
ConclusionCRISPR structure may limit the horizontal transfer of drug resistance and virulence genes in S. aureus, and CRISPR− strains are more susceptible to be interfered by phage and removable plasmids. This study provides a reference for further research on transmission of drug resistance and virulence genes inS. aureus.
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Keywords:
- Staphylococcus aureus /
- CRISPR/Cas system /
- Drug resistance gene /
- Virulence gene
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据联合国估计，2050年世界人口将达到90亿，这将对全球粮食供应提出更高的要求。与此同时，全球可耕地面积已经达到上限，因此，提高单位面积的农作物产量是解决粮食供应的有效策略[1-2]。据统计，植物病虫害造成农作物减产20%~40%，严重威胁着农业生产；世界十大植食性害虫之一的小菜蛾Plutella xylostella每年对全球造成的经济损失高达40~50亿美元[3]。目前主要以化学杀虫剂防治小菜蛾，但长期且不合理地施用化学杀虫剂导致小菜蛾抗性问题日益突出，同时也带来了一系列环境问题[4-6]。因此，迫切需要开发新靶标或已知靶标而抗性尚未形成的新型高效安全杀虫剂[7-9]。天然产物在作物保护领域尤其是害虫防治方面具有诸多优势，如对非靶标生物低毒、易降解等。徐汉虹课题组2019年报道了从鸦胆子Brucea javanica 中分离出的鸦胆因D (Bruceine D)对小菜蛾、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾Spodoptera litura表现出强烈的拒食作用[10]，这激发了课题组对天然产物中广泛存在的杂环骨架进行改造的兴趣。噻唑是一类具有广泛生物活性的五元杂环化合物，存在于多种天然产物中，在医药和农药领域应用广泛[11-12]；包括杀虫剂噻虫胺、噻虫嗪[13]；杀菌剂噻菌灵、噻唑菌胺和噻呋酰胺[14]；杀线虫剂氟噻虫砜[15]等。尽管含噻唑骨架的化合物已有众多商品化农药，但是用于防治鳞翅目Lepidoptera害虫的噻唑类杀虫剂还未成功开发上市。徐汉虹课题组2020年报道了基于二代点击化学合成的一系列含有噻唑骨架的磺酰二胺类化合物，其中，化合物D25对小菜蛾具有优异的杀虫活性(LC50 = 2.42 mg/L)，优于商品化杀虫剂茚虫威[16]；2022年报道了一系列含有噻唑骨架的酰胺和酯类衍生物，其中，化合物7g对多种鳞翅目害虫表现出优异的杀虫活性，如小菜蛾(LC50 = 5.32 mg/L)、甜菜夜蛾(LC50 = 6.75 mg/L)和草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda (LC50 = 7.64 mg/L)，与常用药剂茚虫威表现出相似的杀虫效力[17]。这些工作为进一步开发含有噻唑骨架的新型杀虫剂提供了很好的线索和思路。受课题组前期发现鸦胆因D的杀虫线索及对噻唑骨架化合物的修饰工作启发，进一步挖掘噻唑骨架在防治鳞翅目害虫领域的潜力是一项极具价值的工作。本文设计并合成了一系列芳基噻唑伯酰胺和氰类化合物，测试目标化合物对小菜蛾的杀虫活性并初步分析构效关系(Structure-activity relationship，SAR)，应用密度泛函理论(Density functional theory，DFT)计算分子轨道的能级并进行分析，以期为噻唑骨架在杀虫剂领域的开发与应用提供指导。
1. 材料与方法
1.1 化学试剂及仪器
化学试剂及溶剂购自安耐吉化学和上海毕得医药股份有限公司，如未特殊说明，均未经进一步纯化；柱层析硅胶购自青岛海洋化工有限公司；Z-Ⅲ型循环水式真空泵(郑州长城)；1702-MPS 型万分之一电子天平(德国Srrtorius Gmbh Gottingen公司)；Bruker-600核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；Bruker maxis 4G ESI-Q-TOF质谱仪(德国Bruker Datonics 公司)。
1.2 化合物合成
1.2.1 中间体2a~2i的合成
如图1所示，相应的苯甲酸1a~1i (10 mmol)、1− (3−二甲氨基丙基) −3−乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，12 mmol)、1−羟基苯并三唑(HOBt，12 mmol)溶于乙腈(50 mL)，搅拌5 min，随后加入1.5 mL氨水，常温搅拌2 h。TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加水50 mL，50 mL乙酸乙酯萃取，有机相用50 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到伯酰胺中间体2a~2i，产率86%~95%。
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图 1 目标化合物6a~6i和7a~7i的合成路线Figure 1. The synthetic routes of target compounds of 6a~6i and 7a~7i1.2.2 中间体3a~3i的合成
相应的伯酰胺中间体2a~2i (8 mmol)溶于四氢呋喃(50 mL)，加入劳森试剂(4.8 mmol)，回流搅拌2 h。TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加碳酸氢钠饱和水溶液50 mL，50 mL乙酸乙酯萃取，有机相用50 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到硫酰胺中间体3a~3i，产率73%~79%。
1.2.3 中间体4a~4i的合成
相应的硫酰胺中间体3a~3i (5 mmol)溶于30 mL无水乙醇，加入6 mmol的3−溴丙酮酸乙酯，回流搅拌过夜。TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加水50 mL，50 mL乙酸乙酯萃取，有机相用50 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到苯基噻唑乙酯中间体4a~4i，产率65%~81%。
1.2.4 中间体5a~5i的合成
相应的苯基噻唑乙酯中间体4a~4i (3 mmol)溶于20 mL无水乙醇，缓慢滴加1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，常温搅拌2 h。TLC监测原料消耗完全后，用1 mol/L盐酸溶液调节pH至1.0，50 mL乙酸乙酯萃取，有机相用50 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，无需纯化得到苯基噻唑羧酸中间体5a~5i。
1.2.5 目标化合物6a~6i的合成
相应的苯基噻唑羧酸5a~5i (1 mmol)、EDCI (1.2 mmol)和HOBt(1.2 mmol)溶于50 mL乙腈，搅拌5 min，随后加入100 μL氨水，常温搅拌2 h。TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加水10 mL，10 mL乙酸乙酯萃取，有机相用20 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到苯基噻唑伯酰胺目标产物6a~6i (图1)，产率85%~93%。
1.2.6 目标化合物7a~7i的合成
相应的苯基噻唑伯酰胺化合物6a~6i (0.5 mmol)溶于3 mL无水N,N−二甲基甲酰胺(DMF)，0 ℃条件下缓慢滴加200 μL 氯化亚砜，滴加完成后，缓慢升至室温并搅拌3 h。TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加水10 mL，10 mL乙酸乙酯萃取，有机相用20 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到苯基噻唑氰基目标产物7a~7i (图1)，产率73%~90%。
1.2.7 中间体8的合成
如图2所示，5 mmol的对三氟甲基硫代苯甲酰胺和6 mmol的1,3−二氯丙酮溶于50 mL无水乙醇，然后回流搅拌过夜，TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加水50 mL，50 mL乙酸乙酯萃取，有机相用50 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到中间体8，产率76%。
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图 2 目标化合物13a、13b、14a和14b的合成路线Figure 2. The synthetic routes of the target compounds of 13a, 13b, 14a and 14b1.2.8 中间体9a和9b的合成
3 mmol的中间体8+3.3 mmol的 N−氯代丁二酰亚胺(NCS)或N−溴代丁二酰亚胺(NBS)溶于30 mL乙腈中，回流搅拌5 h。TLC监测原料消耗完全后，减压浓缩除去溶剂，粗产物加30 mL碳酸氢钠饱和溶液，30 mL乙酸乙酯萃取，有机相用30 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到中间体9a和9b，产率分别为86%和91%。
1.2.9 中间体10a和10b的合成
2.5 mmol中间体9a或9b、5.0 mmol五水硫酸铜加入到二甲基亚砜(8 mL)和水(4 mL)的混合溶液中，加热至103 ℃搅拌1 h。TLC监测原料消耗完全后，粗产物加水30 mL，30 mL乙酸乙酯萃取，有机相用30 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到中间体10a和10b，产率分别为79%和82%。
1.2.10 中间体11a和11b的合成
1.5 mmol中间体10a或10b溶于20 mL三氯甲烷，加入4.5 mmol活性二氧化锰，常温搅拌过夜。TLC监测原料消耗完全后，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱层析分离得到中间体11a和11b，产率分别为93%和91%。
1.2.11 中间体12a和12b的合成
1.0 mmol中间体11a或11b、0.5 mL 的30% (w)过氧化氢溶液溶于10 mL的甲醇，缓慢加入50% (w)的KOH溶液3.0 mmol和0.15 mL水，剧烈放热，缓慢升至65 ℃，搅拌1 h。TLC监测原料消耗完全后，粗产物加水30 mL，20 mL乙酸乙酯萃取，有机相用20 mL饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得中间体12a和12b粗产物，产率约95%。
1.2.12 目标化合物13a、13b、14a和14b的合成
目标化合物13a和13b的合成方法与6a~6i的合成方法相同(图2)，产率分别为76%和82%；目标化合物14a和14b的合成方法与7a~7i的合成方法相同(图2)，产率分别为75%和73%。
1.3 供试虫源及杀虫活性测定
小菜蛾由绿色农药全国重点实验室(华南农业大学)饲养提供。采用浸渍法[18]测试目标化合物对小菜蛾的杀虫活性。将目标化合物溶于DMSO，配置成10 000 mg/L的母液，用含0.1% (w)的吐温80脱氯水稀释成所需浓度的药液。用叶碟器将新鲜菜心叶片制成大小一致的叶碟，浸入药液10 s，取出叶片自然晾干后放入装有10~12头小菜蛾3龄幼虫的培养皿中(提前饥饿处理3 h)，每个处理重复3次。设置2个对照，0.1% (w)吐温80的脱氯水作为空白对照，茚虫威原药作为药剂对照。置于26 ℃、85%相对湿度、光照16 h (黑暗8 h)的环境中培养，48 h后检查处理结果并计算死亡率。筛选出的具有良好杀虫活性的候选化合物，设置浓度梯度并测试对小菜蛾幼虫的致死率，计算化合物的致死中浓度(LC50)。采用 SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析，Duncan’s法进行多重比较。LC50 采用Finney’s Probit分析法[19]计算，校正死亡率的计算公式如下：
$$ \mathrm{死}\mathrm{亡}\mathrm{率}=\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\dfrac{\mathrm{死}\mathrm{虫}\mathrm{数}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}}{\mathrm{供}\mathrm{试}\mathrm{虫}\mathrm{数}}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\times \mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}100\mathrm{{\text{%}}} \text{，} $$ (1) $$ \mathrm{校}\mathrm{正}\mathrm{死}\mathrm{亡}\mathrm{率}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}=\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\dfrac{\mathrm{处}\mathrm{理}\mathrm{组}\mathrm{死}\mathrm{亡}\mathrm{率}\mathrm{}\mathrm{}-\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}\mathrm{死}\mathrm{亡}\mathrm{率}}{100\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}-\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}\mathrm{死}\mathrm{亡}\mathrm{率}}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\times \mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}100\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{{\text{%}}}\mathrm{。} $$ (2) 1.4 DFT计算
DFT 计算可为发现和优化新型农用化学品提供宝贵的信息[20-21]。根据前沿分子轨道理论，最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)的能级是影响目标化合物杀虫活性的最重要因素之一[22]。此外，HOMO和LUMO分别通过提供和接受电子来影响电子跃迁，HOMO−LUMO 间隙(ΔE)越小，农用化合物的杀虫和杀菌活性越高。采用DFT−B3LYP结合Gaussian 09程序包中的6−311G’标准基集，按照文献[23]所报道的程序对所选化合物的分子结构、能级和振动谐波频率进行理论计算。
2. 结果与分析
2.1 目标化合物的鉴定结果
目标化合物经1H NMR、13C NMR和ESI-MS确证(图3)，表征数据如下：
2–(4–(叔丁基)苯基)噻唑–4–甲酰胺(6a)：黄色固体，产率87%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.11 (s, 1H), 7.89– 7.86 (m, 2H), 7.50–7.46 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 5.91 (s, 1H), 1.36 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 168.40, 163.10, 154.23, 150.09, 130.13, 126.44 (2C), 126.03 (2C), 123.61, 34.95, 31.16 (3C)。ESI-MS m/z: C14H17N2OS ([M+H]+)，计算值261.10，测量值261.12。
2–(4–氯苯基)噻唑–4–甲酰胺(6b)：黄色固体，产率90%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.31 (s, 1H), 8.09–8.02 (m, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.62–7.57 (m, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.08, 162.60, 151.59, 135.72, 131.83, 129.74 (2C), 128.60 (2C), 125.18。ESI-MS m/z: C10H8ClN2OS ([M+H]+)，计算值239.00，测量值239.00。
2–(4–氟苯基)噻唑–4–甲酰胺(6c)：白色固体，产率93%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.97–7.87 (m, 2H), 7.29 (s, 1H), 7.18–7.10 (m, 2H), 6.12 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 167.11, 165.03, 163.18 (d, J = 52.8 Hz), 150.22, 129.13 (d, J = 3.4 Hz), 128.65, 128.59, 124.00, 116.31, 116.16。ESI-MS m/z: C10H8FN2OS ([M+H]+)，计算值223.03，测量值223.02。
2–[4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲酰胺(6d)：黄色固体，产率88%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.23 (s, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.29 (s, 1H), 6.07 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 166.43, 162.74, 150.65, 135.81, 132.31 (q, J = 32.8 Hz), 126.89 (2C), 126.13 (q, J = 3.8 Hz, 2C), 124.98, 123.73 (q, J = 272.4 Hz)。ESI-MS m/z: C11H8F3N2OS ([M+H]+)，计算值273.02，测量值273.00。
2–(2–(三氟甲基)苯基)噻唑–4–甲酰胺(6e)：黄色固体，产率92%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.28 (s, 1H), 7.85 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.68–7.65 (m, 2H), 7.65–7.61 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 5.95 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 164.45, 162.81, 149.87, 132.15, 131.88, 131.60, 130.22, 128.89 (q, J = 31.5 Hz), 127.14 (q, J = 5.6 Hz), 125.89, 123.49 (q, J = 273.8 Hz)。ESI-MS m/z: C11H8F3N2OS ([M+H]+)，计算值273.02，测量值273.00。
2–[3–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲酰胺(6f)：黄色固体，产率90%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.77–7.70 (m, 1H), 7.61 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.01 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 166.45, 162.69, 150.58, 133.49, 131.74 (q, J = 32.9 Hz), 129.79, 129.70, 127.11 (q, J = 3.6 Hz), 124.69, 123.68 (q, J = 272.6 Hz), 123.35 (q, J = 3.9 Hz)。ESI-MS m/z: C11H8F3N2OS ([M+H]+)，计算值273.02，测量值273.00。
2–[2–氯–4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲酰胺(6g)：黄色固体，产率85%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.72 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 162.50, 161.10, 150.67, 134.76, 132.45, 132.03, 131.56 (q, J = 32.7 Hz), 128.22 (q, J = 3.4, 3.0 Hz), 127.33, 124.87, 123.56 (q, J = 272.8 Hz)。ESI-MS m/z: C11H7ClF3N2OS ([M+H]+)，计算值306.98，测量值306.99。
2–(3,5–二甲基苯基)噻唑–4–甲酰胺(6h)：白色固体，产率87%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.12 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.10 (s, 1H), 2.38 (s, 6H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 168.74, 163.23, 150.04, 138.79, 132.64, 132.42 (2C), 124.45 (2C), 123.78, 21.23 (2C)。ESI-MS m/z: C12H13N2OS ([M+H]+)，计算值233.07，测量值233.10。
2–(2,6–二氟苯基)噻唑–4–甲酰胺(6i)：白色固体，产率87%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.53 (s, 1H), 7.73–7.61 (m, 3H), 7.33 (t, J = 8.6 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 162.40, 159.90 (dd, J = 252.9, 5.6 Hz, 2C), 154.60 (t, J = 2.6 Hz), 151.28, 133.25 (t, J = 10.8 Hz), 127.11, 112.99 (dd, J = 21.3, 4.1 Hz, 2C), 110.99 (t, J = 16.8 Hz)。ESI-MS m/z: C10H7F2N2OS ([M+H]+)，计算值241.02，测量值241.01。
2–[4–(叔丁基)苯基]噻唑–4–甲腈(7a)：白色固体，产率73%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.93 (s, 1H), 7.90–7.85 (m, 2H), 7.55–7.41 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 169.97, 155.10, 129.40, 129.21, 127.49, 126.75 (2C), 126.21 (2C), 114.16, 35.04, 31.12 (3C)。ESI-MS m/z: C14H15N2S ([M+H]+)，计算值243.09，测量值243.10。
2–(4–氯苯基)噻唑–4–甲腈(7b)：白色固体，产率82%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.99 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 168.52, 137.59, 130.32, 130.03, 129.55 (2C), 128.12 (2C), 127.72, 113.89。ESI-MS m/z: C10H6ClN2S ([M+H]+)，计算值220.99，测量值220.99。
2–(4–氟苯基)噻唑–4–甲腈 (7c)：白色固体，产率85%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.98–7.93 (m, 3H), 7.17 (t, J = 8.6 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 168.63, 165.44, 163.76, 129.77, 129.06, 129.00, 127.93 (d, J = 91.0 Hz), 116.55, 116.40, 113.95. ESI-MS m/z: C10H6FN2S ([M+H]+)，计算值205.02，测量值205.05。
2–[4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲腈(7d)：白色固体，产率86%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.10–8.05 (m, 3H), 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 167.97, 134.86, 133.00 (q, J = 33.0 Hz), 130.64, 128.10, 127.24 (2C), 126.31 (q, J = 3.7 Hz, 2C), 123.59 (q, J = 272.4 Hz), 113.72。ESI-MS m/z: C11H6F3N2S ([M+H]+)，计算值255.01，测量值255.02。
2–[2–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲腈(7e)：油状，产率86%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.16 (s, 1H), 7.82 (dd, J = 7.1, 2.1 Hz, 1H), 7.69–7.61 (m, 3H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 166.18, 132.34, 132.12, 132.04, 130.80, 130.51, 129.05 (q, J = 31.4 Hz), 127.06, 126.96 (q, J = 5.3 Hz), 123.35 (q, J = 273.9 Hz), 113.77。ESI-MS m/z: C11H6F3N2S ([M+H]+)，计算值255.01，测量值255.02。
2–[3–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲腈(7f)：白色固体，产率76%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.24 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 7.8 Hz, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 168.02, 132.57, 131.95 (q, J = 33.2 Hz), 130.36, 130.05, 129.93, 128.02, 127.87 (q, J = 3.3 Hz), 123.73 (q, J = 3.5 Hz), 123.52 (q, J = 272.7 Hz), 113.70。 ESI-MS m/z: C11H6F3N2S ([M+H]+)，计算值255.01，测量值255.02。
2–[2–氯–4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲腈(7g)：黄色固体，产率89%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.49 (dd, J = 8.3, 1.0 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.81 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.74–7.60 (m, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 163.47, 133.40 (q, J = 34.5 Hz), 133.20, 132.51, 131.80, 131.67, 127.92 (q, J = 3.9 Hz), 127.04, 124.25 (q, J = 3.3 Hz), 122.82 (q, J = 273.0 Hz), 113.74。ESI-MS m/z: C11H5ClF3N2S ([M+H]+)，计算值288.97，测量值288.94。
2–(3,5–二甲基苯基)噻唑–4–甲腈(7h)：白色固体，产率84%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.94 (s, 1H), 7.56 (s, 2H), 7.13 (s, 1H), 2.38 (s, 6H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 170.39, 139.05, 133.17 (2C), 131.70, 129.60, 127.39, 124.72 (2C), 114.11, 21.20 (2C)。ESI-MS m/z: C12H11N2S ([M+H]+)，计算值215.06，测量值215.06。
2–(2,6–二氟苯基)噻唑–4–甲腈(7i)：白色固体，产率88%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.19 (s, 1H), 7.47 (tt, J = 8.4, 6.2 Hz, 1H), 7.13–7.05 (m, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 161.05 (d, J = 5.6 Hz), 159.35 (d, J = 5.2 Hz), 157.22 (t, J=4.0 Hz), 132.42 (d, J = 10.7 Hz), 132.32 , 131.47 (t, J = 3.8 Hz), 127.40, 113.80, 112.49 (d, J=3.9 Hz)。112.35 (d, J = 3.9 Hz)。ESI-MS m/z: C10H5F2N2S ([M+H]+)，计算值223.01，测量值223.00。
5–氯–2–[4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲酰胺(13a)：黄色固体，产率76%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.18 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.06 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.79 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 161.88, 161.44, 144.54, 135.70, 131.24 (q, J=32.0 Hz), 130.72, 127.46 (2C), 126.61 (q, J = 3.8 Hz, 2C), 124.29 (q, J = 272.4 Hz)。ESI-MS m/z: C11H7ClF3N2OS ([M+H]+)，计算值306.98，测量值306.99。
5–溴–2–[4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲酰胺(13b)：黄色固体，产率82%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.21 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.08 (s, 1H), 7.88 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.77 (s, 1H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 164.64, 162.28, 146.66, 135.74, 131.19 (q, J=31.9 Hz), 127.55 (2C), 126.66 (q, J = 3.8 Hz, 2C), 124.32 (q, J = 272.4 Hz), 113.97。ESI-MS m/z: C11H7BrF3N2OS ([M+H]+)，计算值350.93，测量值350.90。
5–氯–2–[4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲腈(14a)：黄色固体，产率75%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.98 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 165.21, 138.54, 134.57, 133.35 (q, J = 33.0 Hz), 126.94, 126.85 (2C), 126.41 (q, J = 3.8 Hz, 2C), 123.49 (q, J = 272.4 Hz), 111.68。ESI-MS m/z: C11H5ClF3N2S ([M+H]+), ESI-MS m/z: C11H5ClF3N2S ([M+H]+)，计算值288.97，测量值288.96。
5–溴–2–[4–(三氟甲基)苯基]噻唑–4–甲腈(14b)：黄色固体，产率73%；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 168.08, 134.53, 133.34 (q, J = 33.3 Hz), 130.20, 126.92 (2C), 126.43 (q, J = 3.7 Hz, 2C), 123.50 (q, J = 272.6 Hz), 121.50, 112.48。ESI-MS m/z: C11H5BrF3N2S ([M+H]+)，计算值332.92，测量值332.94。
2.2 目标化合物的杀虫活性
根据徐汉虹课题组之前的报道，噻唑衍生物可能对鳞翅目害虫具有杀虫活性[16-17]。因此，为了从合成的一系列苯基噻唑伯酰胺和氰基衍生物中筛选出对鳞翅目害虫具有杀虫活性的潜在杀虫化合物，评估了目标化合物6a~6i、7a~7i、13a、13b、14a和14b在100 mg/L质量浓度下对小菜蛾的杀虫活性，并以商品化杀虫剂茚虫威作为阳性对照。结果(表1)表明，在合成的22个目标化合物中有6个化合物(6d、7d、13a、13b、14a和14b)对小菜蛾表现出很好的杀虫活性(校正死亡率 > 50%)，尤其是化合物6d和7d，100 mg/L质量浓度处理小菜蛾后48 h校正死亡率达到了100%。
表 1 目标化合物处理小菜蛾3龄幼虫48 h后的死亡率1)Table 1. The mortality rate of the 3rd-instar larvae of Plutella xylostella treated by target compound after 48 hours化合物
Compound校正死亡率/%
Corrected
mortality rate化合物
Compound校正死亡率/%
Corrected
mortality rate6a 6.67 ± 3.33ab 7a 0.00 ± 0.00a 6b 35.56 ± 2.22d 7b 9.44 ± 0.56b 6c 13.33 ± 3.33b 7c 0.00 ± 0.00a 6d 100.00 ± 0.00g 7d 100.00 ± 0.00g 6e 0.00 ± 0.00a 7e 0.00 ± 0.00a 6f 27.27 ± 0.00c 7f 28.33 ± 1.67cd 6g 13.33 ± 6.67b 7g 0.00 ± 0.00a 6h 0.00 ± 0.00a 7h 0.00 ± 0.00a 6i 0.00 ± 0.00a 7i 0.00 ± 0.00a 13a 62.78 ± 3.64f 14a 51.52 ± 1.52e 13b 69.44 ± 6.26f 14b 53.33 ± 4.24e 茚虫威
Indoxacarb100.00 ± 0.00g 1) 表中数据为平均值±标准误；同列数据后的不同字母表示差异显著(P < 0.05，Duncan’s法)
1) The data in the table was mean ± standard error, the different lowercase letters in the same column indicated significant difference (P<0.05, Duncan’s method)表1中可以看出，苯环及吡唑环的不同取代基对杀虫活性具有显著的影响。表现在：1)苯基噻唑伯酰胺化合物不同苯环取代基对杀虫活性的影响不同。苯环对位存在吸电子基团的化合物杀虫活性优于对位存在供电子基团的，如：4–CF3 (6d) > 4–t–Bu (6a)；苯环对位不同吸电子基团的化合物杀虫活性差异显著，如：4–CF3 (6d) > 4–Cl (6b) > 4–F (6c)；当苯环只存在–CF3时，对位、邻位和间位的杀虫活性依次降低，如：4–CF3 (6d) > 2–CF3 (6e) > 3CF3 (6f)；当苯环对位为–CF3且邻位被–Cl取代时，杀虫活性急剧下降，这可能是因为增加苯环取代基会减弱小分子与受体蛋白活性位点的亲和力，如：4–CF3 (6d) > 2–Cl–4–CF3 (6g)；当苯环上存在2个相同取代基时，无论是吸电子基团还是供电子基团，在100 mg/L时杀虫活性均消失。2)设计合成了5–Cl–噻唑化合物13a和5–Br–噻唑伯酰胺化合物13b，探究不同噻唑环取代基对杀虫活性的影响。结果表明，噻唑5位未被取代的化合物杀虫活性优于被取代的，且5–Br–噻唑的杀虫活性与5–Cl–噻唑的杀虫活性相当(6d > 13b， 6d > 13a)。3)苯基噻唑氰基化合物不同取代基对杀虫活性的影响不同。除了苯环4–F (6c)及2–Cl–4–CF3 (6g) 在100 mg/L质量浓度时杀虫活性消失外，该系列的构效关系与苯环不同取代基伯酰胺的趋势大致相同。4)伯酰胺衍生物的杀虫活性优于氰基衍生物的杀虫活性或相当。由构效关系可以得出，苯环单取代且为4–CF3时，苯甲噻唑伯酰胺和氰基化合物能保持最优的杀虫活性，这为以后的结构优化进而提升杀虫活性提供了有用的线索。
为了进一步评价化合物6d和7d对小菜蛾的杀虫活性，测试了二者的LC50，结果(表2)表明，伯酰胺化合物6d的杀虫活性优于氰基化合物7d的杀虫活性，其LC50分别为23.94和30.37 mg/L，但弱于对照药剂茚虫威(LC50 = 4.22 mg/L)。
表 2 化合物6d和7d处理小菜蛾3龄幼虫48 h后的杀虫活性Table 2. Insecticidal activities of compounds 6d and 7d against the 3rd-instar larvae of Plutella xylostella at 48 hours after treatment化合物
CompoundLC50/
(mg·L−1)95%置信区间/
(mg·L−1)
95% confidence
interval斜率±标准误
Slop ± SEχ2 6d 23.94 19.94~28.75 3.67 ± 0.47 3.102 7d 30.37 25.18~36.90 3.41 ± 0.44 4.017 茚虫威
Indoxacarb4.22 3.08~5.53 1.92 ± 0.30 1.650 2.3 DFT计算结果
在Gaussian 09软件包中使用DFT−B3LYP/6-311G’标准基集对化合物6d、7d、13a、13b、14a和14b的前沿分子轨道进行计算，并将结果进行比较(图4)。从图4可以得出结论：化合物6d和7d的ΔE比13a、13b、14a和14b的ΔE小，这与表1中的杀虫活性相吻合；化合物6d、7d、13a、13b、14a和14b 的HOMO电子主要位于苯环、噻唑环及其取代基上(分别是伯酰胺和氰基)。在LOMO中，6d和7d的电子主要分散在苯环和噻唑环区域；对比杀虫活性最好的化合物6d和7d，7d的ΔE(0.193 82 eV)比6d(0.193 39 eV)高，这与二者的杀虫活性一致。此外，前沿分子轨道通常位于其原子易于与受体结合的主要取代基团上。DFT计算结果表明，伯酰胺化合物6d的羰基能够接受更多的电子，而氰基化合物7d的氰基无法接受电子，可能造成了6d具有更小的ΔE。总之，当6d和7d与受体结合时，4–三氟甲基苯基噻唑既传递电子又接受电子，与受体蛋白结合，从而增强生物活性。
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图 4 化合物6d、7d、13a、13b、14a和14b的前沿分子轨道红色部分代表正分子轨道，绿色部分代表负分子轨道Figure 4. Frontier molecular orbitals of the compounds of 6d, 7d, 13a, 13b, 14a and 14bThe red part represented positive molecular orbital and the green part represented negative molecular orbital3. 讨论与结论
噻唑在农用化学品中占有重要的地位，尤其是杀虫剂领域，如防治线虫和蚜虫的有机磷类杀虫剂噻唑膦，防治鞘翅目和双翅目害虫的新烟碱类杀虫剂噻虫嗪和噻虫胺。Huang等[24]设计合成了一系列含有噻唑环的1H–吡唑–5–羧酸衍生物，在12.5 mg/L质量浓度下对甜菜蚜Aphis fabae 的致死率达到了87.5%；梁凯等[25]基于吡螨胺的结构, 将噻唑环通过酰胺键与吡唑环相连，合成了一系列在500 mg/L质量浓度下具有杀螨活性的含噻唑环结构的新型吡唑酰胺类化合物； Soliman等[26]合成了一系列磺酰胺噻唑衍生物，对棉叶虫Helicoverpa armigera的LC50达到了49.04 mg/L。徐汉虹课题组也致力于开发含有噻唑环的杀虫化合物[15-16]，对防治多种鳞翅目害虫高效。尽管含有噻唑环的化合物具有广谱的杀虫活性，但是噻唑环在杀虫剂领域的应用前景还远不止于此。目前，鲜见有防治鳞翅目害虫的噻唑类杀虫剂成功开发上市，因此，对噻唑环这类五元杂环进行多样化衍生并拓宽其在杀虫剂领域的应用范围将是极具价值的工作。
本文设计并合成了22个含有伯酰胺和氰基的苯基噻唑衍生物，评价了目标化合物对小菜蛾的杀虫活性。6个化合物(6d、7d、13a、13b、14a和14b)对小菜蛾表现出很好的杀虫活性(校正死亡率 > 50%)，尤其是化合物6d和7d，对小菜蛾的LC50达到了23.94和30.37 mg/L。苯环单取代4–CF3且5–位噻唑无取代时表现出最优的杀虫活性，这为后续的结构优化提供了参考。4–CF3苯基噻唑既能传递电子又能接受电子，从分子轨道层面解释了该骨架具有杀虫活性及差异的原因。可见，苯基噻唑类化合物对鳞翅目害虫具有杀虫活性，其中，化合物6d可作为先导化合物进一步开发，研究结果为含有噻唑骨架杀虫剂的分子设计与优化提供了有价值的线索。
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图 1 公共数据库基因组CRISPR+和CRISPR−金葡菌MLST型别系统发育树(A)和ST型别交叉情况(B)
Figure 1. Phylogenetic tree (A) and ST type crossover (B) of CRISPR+ and CRISPR−Staphylococcus aureus MLST types in public database genome
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图 2 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+与CRISPR−菌株整体携带耐药基因数目平均值比较
“*”和“**”分别表示在P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验)
Figure 2. Comparison of the average number of drug resistance genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database (A) and the laboratory(B) genomes
“*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test)
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图 3 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+和CRISPR−菌株整体携带毒力基因数目平均值比较
“*”和“**”分别表示在 P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验)
Figure 3. Comparison of the average number of virulence genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome (A) and the laboratory genome (B)
“*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test)
表 1 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1)
Table 1 Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome
耐药基因 Drug resistance gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion ant(4')-Ⅰb 2 3 72 14 0.014 ant(9)-Ⅰa 9 15 126 25 0.078 aac(6')-le-aph(2")-Ⅰa 5 8 82 16 0.100 aph(3')-Ⅲa — — 102 20 0.000 aad(6) 1 2 58 11 0.013 ant(6)-Ⅰa 2 3 3 1 0.164 mecA 33 53 285 56 0.727 mecR1 4 6 99 19 0.013 mecⅠ 2 3 74 14 0.009 blaZ 37 60 292 57 0.679 mecC 3 5 4 1 0.032 cfr(A) — — 2 0 1.000 erm(A) 10 16 135 26 0.081 erm(B) 1 2 12 2 1.000 erm(C) 4 6 29 6 0.772 erm(T) 1 2 — — 0.206 Isa(E) 2 3 4 1 0.259 Isa(B) — — 1 0 1.000 msr(A) — — 60 12 0.009 msr(F) — — 1 0 1.000 optr(A) — — 1 0 1.000 vga(A)LC 3 5 3 1 0.014 vga(E) 3 5 4 1 0.032 vga(A)v 1 2 — — 0.206 tet(38) 56 90 491 96 0.063 tet(K) 16 26 50 10 0.000 tet(L) 3 5 6 1 0.063 tet(M) 19 31 71 14 0.001 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 
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表 2 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1)
Table 2 Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome
耐药基因 Drug resistance gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion lnu(A) 2 14 5 11 0.660 lnu(B) — — 9 20 0.100 lsa(E) — — 9 20 0.100 erm(A) 1 7 1 2 0.955 erm(B) 4 29 20 43 0.368 erm(C) 6 43 28 61 0.234 erm(T) 1 7 4 9 1.000 fexA 2 14 35 76 0.000 fexB 1 7 1 2 0.955 aac(6')-aph(2'') — — 16 35 0.013 aph(2'')-Ia 4 29 18 39 0.542 aadD 2 14 32 70 0.000 ant(6)-Ia 3 21 25 54 0.004 ant(9)-Ia 1 7 1 2 0.955 tet(K) 3 21 14 30 0.737 tet(L) 3 21 25 54 0.004 tet(M) 1 7 7 15 0.667 tet(S) 2 14 14 30 0.314 tet(T) — — 1 2 1.000 blaZ 8 57 17 37 0.180 str — — 3 7 0.779 cfr 2 14 23 50 0.028 mecA1 2 14 17 37 0.189 sal(A) 2 14 17 37 0.189 optrA 2 14 17 37 0.189 mecA 3 21 25 54 0.004 msr(A) — — 1 2 1.000 dfrG 1 7 15 33 0.086 qacG 2 14 — — 0.079 fosD 1 7 13 28 0.154 fosB5 — — 2 4 1.000 fosB4 1 7 0 0 0.525 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected
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表 3 公共数据库与实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因数目比较
Table 3 Comparison of the number of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database and the laboratory genomes
基因组 Genome 耐药基因数目 Number of drug resistance gene 占比/% Proportion CRISPR+ CRISPR− 公共数据库 Public database ≥5 95 100 ≥10 58 77 ≥15 11 38 ≥20 0 6 实验室 Laboratory ≥5 36 76 ≥10 29 74 ≥15 7 50 ≥20 0 17
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表 4 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较1)
Table 4 Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome
毒力基因 Virulence gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion aur 61 98 503 98 0.855 splA 18 29 368 72 0.000 splB 21 34 381 74 0.000 splE 19 31 66 13 0.000 sak 4 6 — — 0.000 scn 4 6 — — 0.000 sea 4 6 103 20 0.009 seb 1 2 44 9 0.074 sec 10 16 58 11 0.267 sed — — 28 5 0.061 seg 15 24 221 43 0.004 seh — — 23 4 0.159 sei 15 24 227 44 0.003 sej — — 39 8 0.015 sek 4 6 137 27 0.000 sel 10 16 54 11 0.185 sem 15 24 229 45 0.002 sen 14 23 225 44 0.001 seo 15 24 229 45 0.002 sep 2 3 62 12 0.033 seq 5 8 131 26 0.002 ser — — 38 7 0.025 seu 15 24 115 22 0.752 tst 4 6 67 13 0.135 hlgA 60 97 507 99 0.192 hlgB 62 100 512 100 0.728 hlgC 62 100 512 100 0.728 lukD 24 39 386 75 0.000 lukE 25 40 378 74 0.000 lukF 7 11 124 24 0.022 lukS — — 28 5 0.061 lukF-PV 7 11 124 24 0.022 lukS-PV — — 28 5 0.061 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected
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表 5 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较
Table 5 Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome
毒力基因 Virulence gene CRISPR+1) CRISPR− P 数量 Quantity 占比% Proportion 数量 Quantity 占比% Proportion aur 10 71 22 48 0.121 splA 1 7 12 26 0.264 splB 2 14 10 22 0.713 splE 2 14 9 20 1.000 sak 6 43 9 20 0.078 scn 7 50 14 30 0.179 hlgA 10 71 22 48 0.121 hlgB 10 71 22 48 0.121 hlgC 10 71 22 48 0.121 lukD 1 7 12 26 0.264 lukE 1 7 12 26 0.264 sea — — 1 2 1.000 seg — — 9 20 0.100 seh — — 2 4 1.000 sei — — 10 22 0.098 sem — — 10 22 0.098 sen — — 10 22 0.098 seo — — 10 22 0.098 seu — — 10 22 0.098 edinA — — 1 2 1.000 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected
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表 6 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因数目比较
Table 6 Comparison of the number of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome
基因组 Genome 毒力基因数目 Number of virulence gene 占比/% Proportion CRISPR+ CRISPR− 公共数据库 Public database ≥5 68 96 ≥10 35 73 ≥15 6 15 ≥20 3 0 实验室 Laboratory ≥5 50 48 ≥10 7 41 ≥15 0 13 ≥20 0 7
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[1] CHEN L, TANG Z Y, CUI S Y, et al. Biofilm production ability, virulence and antimicrobial resistance genes in Staphylococcus aureus from various veterinary hospitals[J]. Pathogens, 2020, 9(4): 264. doi: 10.3390/pathogens9040264.
[2] SHOPSIN B, KREISWIRTH B N. Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Emerging Infectious Diseases, 2001, 7(2): 323-326. doi: 10.3201/eid0702.010236
[3] KRISHNA S, MILLER L S. Host-pathogen interactions between the skin and Staphylococcus aureus[J]. Current Opinion Microbiology, 2012, 15(1): 28-35. doi: 10.1016/j.mib.2011.11.003
[4] 毛婷婷. 金黄色葡萄球菌CRISPR结构及耐药毒力分子特征[D]. 郑州: 郑州大学, 2019. [5] LINDSAY J A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2014, 304(2): 103-109. doi: 10.1016/j.ijmm.2013.11.010
[6] ANITHA P, ANBARASU A, RAMAIAH S. Gene network analysis reveals the association of important functional partners involved in anti-biotic resistance: A report on an important pathogenic bacterium Staphylococcus aureus[J]. Gene, 2016, 575(2): 253-263. doi: 10.1016/j.gene.2015.08.068
[7] 左祥, 查艳景, 王征. 金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药基因研究[J]. 中国病原生物学杂志, 2017, 12(6): 566-569. [8] ITO T, OKUMA K, MA X X, et al. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: Genomic island SCC[J]. Drug Resistance Updates, 2003, 6(1): 41-52. doi: 10.1016/S1368-7646(03)00003-7
[9] ITO T, KATAYAMA Y, HIRAMATSU K. Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1999, 43(6): 1449-1458. doi: 10.1128/AAC.43.6.1449
[10] KATAYAMA Y, ITO T, HIRAMATSU K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44(6): 1549-1555. doi: 10.1128/AAC.44.6.1549-1555.2000
[11] LIU J, CHEN D, PETERS B M. Staphylococcal chromosomal cassettes mec (SCCmec): A mobile genetic element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Microbial Pathogenesis, 2016, 101: 56-67. doi: 10.1016/j.micpath.2016.10.028
[12] SZCZEPANIK A, KOZIOL-MONTEWKA M, Al-DOORI Z, et al. Spread of a single multiresistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone carrying a variant of staphylococcal cassette chromosome mec type III isolated in a university hospital[J]. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 2007, 26(1): 29-35.
[13] BARRANGOU R, FREMAUX C, DEVEAU H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712. doi: 10.1126/science.1138140
[14] SOREK R, KUNIN V, HUGENHOLTZ P. CRISPR: A widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(3): 181-186. doi: 10.1038/nrmicro1793
[15] MARRAFFINI L A, SONTHEIMER E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J]. Science, 2008, 322(5909): 1843-1845. doi: 10.1126/science.1165771
[16] 张蒙蒙, 毕春霞, 王梦圆, 等. 葡萄球菌CRISPR-Cas系统的基因结构及其与耐药基因的关系[J]. 中国病原生物学杂志, 2019, 14(5): 553-559. [17] ISHINO Y, SHINAGAWA H, MAKINO K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J]. Journal of Bacteriology, 1987, 169(12): 5429-5433. doi: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987
[18] LUO K, SHAO F, KAMARA K N, et al. Molecular characteristics of antimicrobial resistance and virulence determinants of Staphylococcus aureus isolates derived from clinical infection and food[J]. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2018, 32(7): e22456. doi: 10.1002/jcla.22456
[19] GOPHNA U, KRISTENSEN D M, WOLF Y I, et al. No evidence of inhibition of horizontal gene transfer by CRISPR-Cas on evolutionary timescales[J]. ISME Journal, 2015, 9(9): 2021-2027. doi: 10.1038/ismej.2015.20
[20] BOLOTIN A, QUINQUIS B, SOROKIN A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology-SGM, 2005, 151(8): 2551-2561. doi: 10.1099/mic.0.28048-0
[21] PALMER K L, GILMORE M S. Multidrug-resistant enterococci lack CRISPR-cas[J]. mBio, 2010, 1(4): e00227-10.
[22] BURSTEIN D, SUN C L, BROWN C T, et al. Major bacterial lineages are essentially devoid of CRISPR-Cas viral defence systems[J]. Nature Communications, 2016, 7: 10613. doi: 10.1038/ncomms10613.
[23] JIANG W, MANIV I, ARAIN F, et al. Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: Bacteria and beneficial plasmids[J]. PLoS Genetics, 2013, 9(9): e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844
[24] TOUCHON M, CHARPENTIER S, POGNARD D, et al. Antibiotic resistance plasmids spread among natural isolates of Escherichia coli in spite of CRISPR elements[J]. Microbiology, 2012, 158(Pt 12): 2997-3004.
[25] 洪丽娟, 张冰, 段广才, 等. CRISPR/Cas系统与志贺菌毒力和耐药的关系及插入序列IS600对cse2表达水平的影响[J]. 微生物学报, 2016, 56(12): 1912-1923. [26] WATSON B N J, STAALS R H J, FINERAN P C. CRISPR-Cas-mediated phage resistance enhances horizontal gene transfer by transduction[J]. mBio, 2018, 9(1): e02406-17.
[27] WIEDENHEFT B, BONDY-DENOMY J. CRISPR control of virulence in Pseudomonas aeruginosa[J]. Cell Research, 2017, 27(2): 163-164. doi: 10.1038/cr.2017.6
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期刊类型引用(3)
1. 付鸿博，李杰，杨永超. 石榴CCD基因家族的鉴定与分析. 分子植物育种. 2025(08): 2511-2518 . 
百度学术
2. 杜艳霞，王艺光，肖政，董彬，方遒，钟诗蔚，杨丽媛，赵宏波. 桂花OfNCED3调控转基因烟草叶片类胡萝卜素和叶绿素的合成. 园艺学报. 2023(06): 1284-1294 . 百度学术
3. 蔡肖，王海涛，李兴河，甄军波，刘琳琳，刘迪，迟吉娜，张建宏. 亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析. 核农学报. 2022(09): 1713-1722 . 百度学术
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