Efficacy of humic acid alkaline liquid fertilizer on banana growth and mechanism
-
摘要:目的
探究腐植酸碱性肥料对香蕉生长的影响及促生机制，为腐植酸碱性肥料的研制与推广应用提供理论依据。
方法采用盆栽试验，研究腐植酸碱性肥料对香蕉生物量、土壤微生物、酶活性、根系活力和土壤氮磷养分含量的影响。
结果与常规复合肥和无腐植酸碱性液体肥料相比，腐植酸碱性肥料有利于促进香蕉生长，明显增加香蕉生物量、根系活力、土壤脲酶活性、酸性磷酸酶活性、土壤矿质氮含量、有效磷含量以及细菌、真菌和放线菌数量。香蕉叶面积增加了50~100 cm2，生物量增加了10%~21%，香蕉根系活力增加了89%~188%，土壤脲酶活性增加了25%~91%，酸性磷酸酶活性增加了2.4~3.5倍。腐植酸碱性液体肥处理的土壤细菌、真菌和放线菌的数量分别是常规肥料的1.6~14.4、1.7~26.7和2.3~3.8倍，分别是无腐植酸碱性肥的3.0~10.6、3.9~56.0和1.2~2.0倍。
结论施用腐植酸碱性液体肥能明显促进香蕉生长，其机制在于：一方面，肥料的碱性改良了土壤酸性环境而有利于土壤微生物多样性；另一方面，肥料的腐植酸增加了土壤的脲酶和酸性磷酸酶活性，改善了土壤的氮、磷营养状况，进而增加土壤肥力。因此，施用腐植酸碱性液体肥料是为香蕉提供养分和提高土壤肥力的有效措施。
Abstract:ObjectiveTo reveal the effect of humic acid alkaline fertilizer on banana growth and its promotion mechanism, and provide a theoretical basis for the development, popularization and application of the humic-acid alkaline fertilizer.
MethodBanana pot experiment was carried out. Banana biomass, soil microorganism, enzyme activity, root activity, soil nitrogen and phosphorus nutrient content were measured to identify the efficacy of humic acid alkaline liquid fertilizer.
ResultCompared with conventional compound fertilizer and non-humic-acid alkaline liquid fertilizer, humic acid alkaline fertilizer could promote banana growth and biomass, increase root activity. The soil urease and acid phosphatase activities, soil mineral nitrogen and available phosphorus content, number of bacteria, fungi and actinomyces increased obviously. Leaf area and biomass increased by 50–100 cm2 and 10%–21%, respectively. The root activity increased by 89%–188%. Soil urease and acid phosphatase activity increased by 25%–91% and 2.4–3.5 times, respectively. The number of soil bacteria, fungi and actinomycetes of humus-acid alkaline liquid fertilizer were 1.6–14.4, 1.7–26.7 and 2.3–3.8 times those of compound fertilizer treatment, respectively. The corresponding data of the humus acid alkaline liquid fertilizer were 3.0–10.6, 3.9–56.0 and 1.2–2.0 times of those of alkaline liquid fertilizer without humus acid, respectively.
ConclusionApplication of humic acid alkaline liquid compound fertilizer could obviously promote banana growth. The mechanism was that the acidic soil environment was improved by the alkaline fertilizer and then the soil microbial diversity increased on the one hand; The humic acid increased soil urease and acid phosphatase activities, the soil nitrogen and phosphorus nutritional status were improved on the other hand to increase soil fertility. Therefore, the synergistic application of humic acid and alkaline liquid fertilizer is a rational measure to supply nutrients to banana and improve soil fertility.
-
Keywords:
- Humic-acid alkaline fertilizer /
- Banana /
- Root vigor /
- Soil urease /
- Acid phosphatase /
- Soil microbial population
-
敌草隆(Diuron)，化学名称为3−(3,4−二氯苯基)−1,1−二甲基脲，是一种低毒、高效的取代脲类除草剂，广泛应用于棉花、甘蔗[1]、葡萄[2]等作物的苗前除草。该药还在新疆作为棉花脱叶剂(复配制剂噻苯·敌草隆)广泛应用于棉田机械化作业中[3]。然而，敌草隆对哺乳动物和鸟类有轻微毒性，对水生无脊椎动物中等毒性，在土壤和地下水中具有持久性[4]。在施药后70 d，径流水和土壤中仍可以检测到低浓度的敌草隆[5]。因此，研究敌草隆的降解对农业可持续发展具有重要意义。
随着社会经济发展，农药对环境的影响受到人们日益关注，Khongthon 等[6]在微米反应器中通过电化学高级氧化工艺降解敌草隆，降解率约为90%；Vanraes 等[7]优化了介质阻挡放电(Dieletric barrier discharge, DBD)等离子体反应器与活性炭纺织材料吸附相结合的装置，可以最大限度地减少敌草隆在水中的氧化副产物的生成。在农业可持续发展进程中，微生物降解农药作为一种生态友好型技术具有很好的应用前景[8]，生物修复环境中残留的敌草隆是目前最佳途径之一。据报道，目前分离得到的降解敌草隆的菌株主要为白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium[9]、Ganoderma lucidum[10]、Trametes versicolor[11]、)，费氏埃希菌Escherichia fergusonii[12]及嗜根寡养单胞菌Stenotrophomonas rhizophila[13]。本文从长期施用敌草隆的棉田土壤中筛选分离出降解效果好的敌草隆降解菌株，并进行形态学观察、生理生化及分子生物学鉴定，探索菌株的降解特性及优化降解条件，提高菌株降解效率，以期为该菌剂的制备提供理论基础，对敌草隆污染土壤修复提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 仪器
超净工作台；高速冷冻离心机；生化培养箱；高压灭菌锅；PCR仪；紫外分光光度计；高效液相色谱仪(Waters e2695 Separations Module)；旋转蒸发仪；恒温水浴锅；摇床；超纯水器；精确电子分析天平；烘箱；震荡仪。
1.1.2 土壤采集及制备
2018年9月在新疆生产建设兵团第八师147团和149团采集连续施用敌草隆药剂10年以上的棉田，取土深度10~20 cm，各采集1 kg。将采集的土样去除大粒石块并过2 mm筛，风干后贴标存于密封袋，置于4 ℃冰箱保存。
1.1.3 药剂及培养基
药剂：敌草隆原药、敌草隆标准品(质量分数98.8%)购于Dr.Ehrenstorfer公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；甲醇(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)购于天津市富余精细化工有限公司；无水硫酸钠(分析纯)购于天津市盛奥化学试剂有限公司。
液体培养基：无机盐培养基( MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO4 0.5 g，(NH4)2SO4 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0~7.2)，牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0~7.2)，富集培养基(在无机盐培养基中添加所需含量的敌草隆)，LB培养基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1000 mL)；固体培养基均在以上液体培养基中加入18 g/L琼脂粉末，高氏一号培养基(可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g)。
1.2 试验方法
1.2.1 敌草隆降解菌株的筛选
在含100 mg/L敌草隆的90 mL富集培养液中加入10 g供试土样，在30 ℃、180 r/min下培养7 d后，取体积分数为10%的混合液体，接种到含500 mg/L敌草隆的富集培养液中继续培养7 d后，再按照10%(φ)的接菌量将上述富集培养液接种到含1000 mg/L敌草隆的富集培养液中，如此持续不断转接至1500、1800、2000 mg/L时，进行平板涂布，观察菌落形成情况(2000 mg/L时未形成菌落)。
随机从1800 mg/L富集培养液的平板中挑取36组形态不同且清晰的菌落通过划线处理的方法接种于含100 mg/L敌草隆的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于30 ℃恒温培养箱培养。待平板长出单个菌落，直至培养基中敌草隆质量浓度为2000 mg/L(进行压力筛选)，取7株生长良好的菌株编号并放入4 ℃的冰箱内进行保存。
从以上7株菌落中挑取单菌落接入LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min下制成菌液。在含100 mg/L敌草隆的无机盐降解培养基中加入10%体积的菌液，置于摇床上，分别摇培3、6、9、12、15 d后，HPLC法检测降解液中敌草隆的含量，计算降解率(重复3次，设置无菌对照)。
1.2.2 敌草隆的HPLC检测
取降解液2 mL于管内，12000 r/min离心处理8 min，取上层液体1 mL与二氯甲烷4 mL，充分震荡后分层，取下层有机相至无水硫酸钠柱中，将过柱后的液体移至圆底烧瓶，减压浓缩至接近干燥，加入甲醇定容至2 mL，再通过有机相微孔过滤器过滤后装入样瓶，待液相色谱检测。
色谱条件：色谱柱5.0 μm×4.6 mm×250 mm、流动相V(甲醇)∶V(水)=60∶40、流速1.0 mL/min、柱温 35 ℃、测定波长254 nm、进样量20 μL。
1.2.3 敌草隆降解菌株的鉴定
将降解率最高的菌株接种至LB平板上，30 ℃条件下培养，进行形态观察、生理生化试验(生理生化鉴定参照BIOLOG GEN III、API 20 E、API 20 NE等说明书，其中BIOLOG GEN III鉴定板用于革兰阴性和阳性好氧菌的鉴定，API 20E是肠杆菌科和其他G−杆菌的标准鉴定系统，API 20NE是鉴定不属肠杆菌科、革兰阴性非苛养杆菌的标准鉴定系统)。
选择新鲜菌体作为PCR扩增模板进行分子鉴定，采用细菌16S rRNA序列通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增菌株目标片段。PCR反应体系(100 μL)：正、反向引物(10 μmol/L)各2 μL；Taq(5 U/μL)0.8 μL；10×PCR Buffer(Mg2＋Plus)10 μL；dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)8 μL；模板DNA 2.5 ng；ddH2O补足到100 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 5 min。
使用引物nrdA-F (5′-ACTGATTCCCGACCTGTTC-3′)和nrdA-R(5′-TTCGATTTGACGTACAAGTTCTGG-3′)扩增菌株目标片段。nrdA PCR反应体系(100 μL)：正、反向引物(50 μmol/L)各2 μL；Taq(2.5 U/μL)0.8 μL；10×PCR Buffer (Mg2＋Plus)10 μL；dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)8 μL；模板DNA 10 ng；ddH2O补足到100 μL。nrdA PCR反应条件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，33个循环；72 ℃ 10 min。
产物进行测序后，将结果在GenBank数据库中通过BLAST进行比对，采用临位连接法构建系统进化树。
1.2.4 不同培养条件对菌株降解率的影响
探索降解菌在不同敌草隆初始质量浓度、接菌量、蔗糖含量、pH、温度及最优条件下对敌草隆的降解效果，评估降解能力，其中敌草隆初始质量浓度为25、50、100、200和500 mg/ L；接菌量为1%、3%、5%、10%和15%(φ)；蔗糖质量分数为0.0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%；pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0；温度为20、25、30、35和40 ℃。
1.3 数据统计与分析
试验结果均采用SPSS 22.0与Excel统计软件进行数据方差分析，运用Duncan’s法进行各处理间的多重比较分析，本试验所显示的结果均为3次重复测定的平均值。
2. 结果与分析
2.1 HPLC检测敌草隆的标准曲线
用敌草隆标准品分别配置20、50、100、200、500、1000 mg/L的敌草隆样品，进行HPLC检测，以峰面积为纵坐标，添加水平为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析，获得的标准曲线为：y=4.13×104x+1.81×105(R2=0.99)(图1)，相对保留时间为5.658 min(图2)。
2.2 HPLC检测方法的准确性和精密度
敌草隆在空白培养基中的添加质量浓度分别为25、50、100 mg/L，进行HPLC检测，每个质量浓度重复5次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。测定的样品中敌草隆的回收率为94.72%~96.99%，RSD为1.29%~1.86%(表1)，符合对敌草隆的残留检测要求，可用于培养基中敌草隆残留检测。
表 1 敌草隆在培养基中的回收率Table 1. The recovery rate of diuron in mediumρ添加/(mg·L−1)
Added concentration回收率/% Recovery rate 相对标准偏差/%
Relative standard deviation (RSD)1 2 3 4 5 平均 Average 25 92.82 96.37 91.23 98.58 94.62 94.72 1.29 50 96.92 90.78 100.02 91.69 92.29 94.34 1.77 100 91.47 102.76 98.22 95.18 97.32 96.99 1.86 2.3 敌草隆降解菌的降解速率测定
经平板初筛，逐步提高培养基中敌草隆的含量进行压力筛选，筛选出7株菌株并对其命名为SL-6、SL-7、SL-8、SL-9、SL-10、SL-11和SL-12，涂板保存。初筛获得的7株菌株，在含100 mg/L敌草隆、接菌量10%(φ)的培养基中，30℃、180 r/min的条件下进行培养。
菌株SL-6、7、9对敌草隆的降解效果明显高于其余4株。且在第15天，降解率均高达90%以上(图3)，因此选取该3株菌株开展后续试验。
![]()
图 3 初筛菌株对敌草隆的降解率Figure 3. Degradation rate of diuron by preliminary screening strains在敌草隆质量浓度为100 mg/L的培养基中，以10%的接菌量(φ)分别接种初筛获得3个菌株后，敌草隆的消解动态符合消解动力学方程。如表2所示，菌株SL-6、7、9对培养基中的敌草隆消解方程分别为ρt = 74.482e−0.213t、ρt = 59.264e−0.166t、ρt = 58.165e−0.182t，其中ρt为t时刻敌草隆的质量浓度；半衰期分别为3.2、4.2、3.8 d。
表 2 敌草隆的消解动力学方程和相关参数Table 2. Digestion kinetic equation and related parameters of diuron菌株
Strain消解方程
Degradation equation速率常数
Rate constant (K)决定系数
Coefficient of determination (R2)t半衰/d
Half-lifeSL-6 ρt = 74.482e−0.213t 0.213 0.9636 3.2 SL-7 ρt = 59.264e−0.166t 0.166 0.9782 4.2 SL-9 ρt = 58.165e−0.182t 0.182 0.9691 3.8 2.4 降解菌株的鉴定
分别提取3株敌草隆降解菌株的DNA，并将其作为模板，利用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增，分别得到1500 bp左右的片段，将PCR产物进行回收连接转化，然后进行测序。将菌株SL-6、7、9的16S rDNA基因序列在GeneBank中进行BLAST比对，结果发现，菌株SL-6、7、9与变形菌门Proteobacteria的Achromobacter xylosoxidans菌株的16S rDNA序列相似度均高达99.94%以上，由此首先确定菌株SL-6、7、9均为无色杆菌属Achromobacter，因此选取该3株菌种降解率最高(94.6%)的SL-6进行后续试验及进一步鉴定，并将菌株SL-6鉴定至种。
2.5 菌株SL-6的鉴定
2.5.1 菌株SL-6形态学鉴定
菌株SL-6的LB培养基菌落形态为白色，其单菌落形态呈白色且表面隆起，外表光滑湿润，边缘光滑平整不透明，有黏性；菌株SL-6的革兰氏染色呈阴性(图4)。
![]()
图 4 菌株SL-6的常规形态学特征A:SL-6 LB培养基菌落形态；B:SL-6 LB培养基单菌落形态；C:SL-6革兰氏染色图Figure 4. Conventional morphological characteristics of strain SL-6A: SL-6 colony morphology on LB medium; B: SL-6 single colony morphology on LB medium; C: SL-6 gram staining2.5.2 菌株SL-6的生理生化特征
菌株SL−6细胞形态呈杆状；经BIOLOG GEN III鉴定反应呈阳性的包括氧化酶、接触酶、对羟基苯乙酸、糊精、丙酮酸甲酯、柠檬酸、1％乳酸钠、林可霉素、萘啶酸、夫西地酸、十四烷硫酸钠、亚碲酸钾、葡糖醛酰胺、丙酸、乙酸、糖质酸、醋竹桃霉素、万古霉素、氨曲南、利福霉素、二甲胺四环素、四唑紫、四唑蓝、丁酸钠、α−D−葡萄糖、D−果糖、L−丙氨酸、L−乳酸、L−天冬氨酸、L−谷氨酸、α−酮戊二酸、D−苹果酸、L−鼠李糖、L−焦谷氨酸、L−苹果酸、L−丝氨酸、D−半乳糖醛酸、γ−氨基丁酸、α−羟丁酸、D−葡糖酸、β−羟基−D,L−丁酸、D−葡萄糖醛酸、α−丁酮酸、D−果糖−6−磷酸，反应呈弱阳性的包括溴代丁二酸、盐酸胍、氯化锂、黏酸、甲酸、溴酸钠、D−岩藻糖、L−组氨酸、D−天冬氨酸，反应呈阴性的包括明胶、龙胆二糖、蔗糖、松二糖、水苏糖、肌苷、果胶、吐温−40、肌醇、甘油、乙酰乙酸、奎宁酸、D−甘露糖、甘氨酸−L−脯氨酸、D−麦芽糖、D−乳酸甲酯、D−海藻糖、D−半乳糖、L−精氨酸、D−纤维二糖、3−甲基−D−葡萄糖、L−岩藻糖、D−丝氨酸、D−棉子糖、D−山梨醇、α−D−乳糖、D−甘露醇、D−蜜二糖、D−阿糖醇、L−半乳糖酸内酯、D−水杨苷、N−乙酰−D−葡糖胺、N−乙酰−β−D−甘露糖胺、N−乙酰−D−半乳糖胺、N−乙酰神经氨酸；API 20E鉴定反应呈阳性的包括精氨酸双水解酶、柠檬酸、丙酮酸盐，反应呈阴性的包括赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硫代硫酸钠、脲酶、色氨酸脱氨酶、色氨酸、明胶；API 20NE鉴定反应呈阳性的包括硝酸钾，反应呈阴性的包括色氨酸、葡萄糖、精氨酸、脲素、七叶灵、明胶、β−半乳糖苷酶。以上生理生化特征所包含的资料库无法将其鉴定至种，故后续通过16S rDNA与nrdA基因序列进行分析鉴定。
2.5.3 菌株SL-6与相关菌种的16S rDNA序列系统发育进化树
采用临位连接法显示菌株SL-6与相关菌种的16S rDNA系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，菌株SL-6与木糖氧化无色杆菌A. xylosoxidans的相似性最高，为100%。(图5)。
![]()
图 5 基于16S rDNA序列的菌株SL-6与相关菌种的系统发育进化树Figure 5. Phylogenetic tree of strain SL-6 and related strain species based on 16S rDNA sequence2.5.4 菌株SL-6与相关菌种的nrdA基因序列系统发育进化树
采用临位连接法显示菌株SL-6与相关菌种的nrdA基因序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值。菌株SL-6与木糖氧化无色杆菌A. xylosoxidans的nrdA基因序列相似性高达99.996%(图6)。
![]()
图 6 基于nrdA基因序列的菌株SL-6与相关菌种的系统发育进化树Figure 6. Phylogenetic tree of strain SL -6 and related strain species based on nrdA gene sequence2.6 SL-6菌株不同培养条件对敌草隆降解率的影响
2.6.1 敌草隆质量浓度对敌草隆降解率的影响
降解率随着敌草隆初始质量浓度的增加呈逐渐增加后减少的趋势(图7A)。当培养液中敌草隆质量浓度为200 mg/L时，降解效果最佳，第3天的降解率高达82.2%；当质量浓度为25 mg/L时，第3天的降解率为39.4%，仅为200 mg/L质量浓度的47.9%。
![]()
图 7 不同培养条件对菌株SL-6降解敌草隆的影响A：敌草隆初始质量浓度；B：接菌量；C：蔗糖含量；D：pH；E：温度；F：最优条件；图中数据为平均值和标准误(n=3)；各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)Figure 7. Effect of various cultural conditions on diuron degradation by strain SL-6A: Initial concentration of diuron; B: Inoculation amount; C:Sucrose content; D: pH; E: Temperature; F: Optimal conditions；Data in the figure are means and standard errors (n=3); In each graph, different lowercase letters on bars indicate significant differences(P < 0.05, Duncan’s method)2.6.2 菌株不同接菌量对敌草隆降解率的影响
随着接菌量增大，敌草隆的降解率也随之增高，当接菌量(φ)为15%时，降解率为63.5%，但接菌量在5%~15%之间，降解率的提高并不显著(图7B)。
2.6.3 外加碳源含量对敌草隆降解率的影响
向培养液中分别加入质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的蔗糖作为外加碳源(图7C)，3 d后敌草隆的降解率并未有较大变化。与不添加碳源相比，添加0.5%~2.0%的蔗糖碳源，降解率在40.6%~53.2%之间，均低于不添加碳源的57.4%降解率。
2.6.4 培养液pH对敌草隆降解率的影响
分析培养液pH对菌株SL-6降解率影响，结果表明，pH 8时降解率最高，为59.6%(图7D)。
2.6.5 培养温度对敌草隆降解率的影响
分析不同培养温度对菌株SL-6降解率的影响，结果表明，20~40 ℃时的降解率呈现逐渐升高后降低的趋势，温度为30℃时，降解效果最佳，第3天的降解率高达57.2%；当温度为20 ℃时，第3天的降解率为18.2%，仅为30℃的31.8%(图7E)。
2.6.6 最优培养条件下菌株降解率
最优敌草隆初始质量浓度为200 mg/L、接菌量为15%(φ)、pH为8、培养温度为30℃，该条件下，分别于1、2、3、4、5 d后，运用液相色谱法检测培养液中敌草隆的剩余浓度，并计算降解率。菌株SL-6在最优培养条件下，随着时间的增加，敌草隆的降解率亦随之增高，第5天的降解率为93.1%；第1天的降解率为43.1%，仅为第5天的46.3%(图7F)。
3. 讨论与结论
在连续施用敌草隆10年以上的棉田中分离得到降解菌，通过形态学观察、生理生化测试、16S rDNA及nrdA基因序列相似性分析，鉴定菌株SL-6为木糖氧化无色杆菌A. xylosoxidans。本研究结果表明：菌株SL-6在敌草隆初始质量浓度为200 mg/L时，降解率为82.2%；接菌量为15%(φ)时，降解率为63.5%；pH为8时，降解率为59.6%；温度为30 ℃时，降解率为57.2%；与不添加蔗糖相比，添加蔗糖后降解率均低于57.4%。于上述最优培养条件下，在第5天，菌株SL-6对200 mg/L的敌草隆降解率达93.1%。
本研究分离得到1株高效降解敌草隆的菌株，为木糖氧化无色杆菌，是一种毒力较弱的革兰阴性杆菌。该菌能够引起轻微的菌血症、心包炎、导管相关的血流感染、肺炎等[14]，相较而言，该菌株治理环境污染时表现出极大潜力，在合理规范的操作下，引起人体不适微乎其微，有研究表明，该菌株可通过碳酸盐矿化作用固定土壤中的复合重金属(Cu、Pb、Cd)[15]以及固结土壤中的有效态Cd，从而减少水稻对Cd的吸收[16]。
国内外已有可降解敌草隆的部分真菌和细菌，以及对降解条件进行优化的报道。孙纪全等[17]报道了1株细菌菌株Y57，鉴定为鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.,该菌株在敌草隆初始质量浓度为20 mg/L，30℃及5%(φ)接菌量时，其降解率达到80%以上，与该研究相比，本研究所得降解条件中敌草隆初始质量浓度更高，接菌量更大，培养温度相同，但降解率相对较高。封国君等[18]报道了1株真菌菌株D12，鉴定为镰刀菌属Fusarium，该菌株在敌草隆初始质量浓度为50 mg/L，35 ℃及pH 6.0时，经过7 d培养，降解率为57.42%，半衰期为7.30 d，与该研究相比，本研究所得降解条件为碱性环境，培养温度更低，敌草隆初始质量浓度更高，同时降解率相对更高。杨孟然[19]报道了敌草隆降解菌株D47(Arthrobacter globiformis)，处理4 d后该菌株对0.5~20.0 mg/L的敌草隆降解率均为100.0%，与该研究相比，本研究所得降解条件中敌草隆初始质量浓度更高，但处理时间与降解率相对较低。以上学者报道的降解菌株在降解过程中敌草隆初始质量浓度较低，而本研究中菌株SL-6可在敌草隆初始质量浓度较高的环境中对其进行降解，无需外加碳源，适于敌草隆残留极端的环境条件，同时菌株SL-6降解敌草隆的最适温度在30 ℃，该温度下无需供给额外能量，此外，菌株SL-6只有一定的耐弱碱性，而新疆棉田土壤呈一定的弱碱性，为该菌株的生产应用提供条件。菌株SL-6的降解能力与pH及温度等因素密切相关，还发现在接菌量较低的情况下，其对敌草隆的降解能力大大减弱。经过系列分析推测，该菌株降解敌草隆时，产生的酶的活性不是特别高，后期应进一步优化。
迄今为止，对于敌草隆降解菌的研究大部分集中于降解特性，关于降解机制的相关研究较少。敌草隆的主要代谢产物为3,4−二氯苯胺(DCA)、3−(3,4−二氯苯基)脲(DCPU )、3−(3,4−二氯苯基)−1−甲基脲(DCPMU )[20]。变色栓菌[21] Trametes versicolor培养7 d后，除降解敌草隆(降解率为83%)外，主要代谢产物DCA(降解率为100%)迅速降解，在降解过程中，根据鉴定的转化产物，3−(3,4−二氯苯基)−1−羟甲基−1−甲基脲(DCPHMU)代谢为N′端去烷基化合物DCPMU和DCPU，DCPHMU的发现揭示了羟基化对N′端去甲基化的相关作用，有助于更好地研究敌草隆降解机制的反应机理。
-
![]()
图 1 腐植酸碱性液体肥(AF)对香蕉根系活力的影响
Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)
Figure 1. Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on root vigor of banana
Comp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; Different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)
![]()
图 2 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤脲酶和酸性磷酸酶活性的影响
Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；各图中，柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)
Figure 2. Effects of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on soil urease and acid phosphatase
Comp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; In each figure, different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)
![]()
图 3 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤矿质态氮含量的影响
Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；各图中，柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)
Figure 3. Effect of humic cacid alkaline liquid fertilizer (AF) on mineral nitrogen content in soil
Comp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; In each figure, different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)
![]()
图 4 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤有效磷含量的影响
Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)
Figure 4. Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on available phosphorus content in soil
Comp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; Different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)
表 1 腐植酸碱性液体肥(AF)对香蕉株高、茎粗、叶面积和叶片SPAD值的影响1)
Table 1 Effect of humic acid alkline liquid fertilizer (AF) on plant height, stem diameter, leaf area and SPAD value of banana
肥料类型
Fertilizer typeρ(腐植酸)/(g·L−1)
Humic acid content株高/cm
Plant height茎粗/cm
Stem diameter叶面积/cm2
Leaf area叶片SPAD值
SPAD value of leafComp 0 27.75±1.44bc 27.22±0.60b 571.10±8.91ab 52.52±0.73c AF0 0 26.52±0.77c 28.44±0.43ab 536.12±29.23b 56.14±1.63bc AF1 10 29.8±0.51ab 28.33±0.40ab 621.23±12.29a 61.02±1.17a AF2 30 31.63±1.06a 28.82±0.67ab 635.89±37.53a 59.87±1.13ab AF3 50 31.26±1.17a 30.18±0.77a 625.96±30.94a 57.20±1.79ab 1) Comp：常规复合肥；表中数据为平均值±标准误，n=6；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，DMRT法)
1) Comp: Conventional compound fertilizer; Data are means ± SE, n=6; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, DMRT method)
下载: 导出CSV
表 2 腐植酸碱性液体肥(AF)对香蕉单株鲜生物量的影响1)
Table 2 Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on fresh biomass per plant of banana
g 肥料类型
Fertilizer typeρ(腐植酸)/(g·L−1)
Humic acid content根
Root
茎
Stem
叶
Leaf
地上部
AbovegroundComp 0 21.83±0.44b 104.17±2.21d 71.54±2.46d 175.71±4.03d AF0 0 22.71±0.42b 111.80±3.36c 80.49±3.23c 192.28±4.39c AF1 10 24.08±0.36a 122.97±3.21b 95.41±3.33b 218.38±4.66b AF2 30 24.05±0.52a 120.89±2.58b 91.25±3.00b 212.13±3.14b AF3 50 25.13±0.40a 131.29±2.18a 101.46±1.30a 232.74±3.70a 1) Comp：常规复合肥；表中数据为平均值±标准误，n=6；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，DMRT法)
1) Comp: Conventional compound fertilizer; Data are means ± SE, n=6; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, DMRT method)
下载: 导出CSV
表 3 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤微生物数量的影响1)
Table 3 Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on microbial population quantity in soil
肥料类型
Fertilizer typeρ(腐植酸)/(g·L−1)
Humic acid content细菌/(×105 cfu·g−1)
Bacteria真菌/(×104 cfu·g−1)
Fungi放线菌/(×103 cfu·g−1)
ActinomycesComp 0 1.28±0.12c 6.34±0.43cd 1.76±0.44de AF0 0 1.74±0.38c 2.82±0.30d 3.32±0.42d AF1 10 2.01±0.36c 11.08±0.65c 4.51±1.09b AF2 30 5.20±0.55b 16.36±1.55b 4.03±0.40bc AF3 50 18.44±0.50a 169.08±0.80a 6.67±0.39a 1) Comp：常规复合肥；表中数据为平均值±标准误，n=6；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，DMRT法)
1) Comp: Conventional compound fertilizer; Data are means ± SE, n=6; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, DMRT method)
下载: 导出CSV
-
[1] CANELLAS L P, PICCOLO A, DOBBSS L B, et al. Chemical composition and bioactivity properties of size-fractions separated from a vermicompost humic acid[J]. Chemosphere, 2010, 78(4): 457-466. doi: 10.1016/j.chemosphere.2009.10.018
[2] 张水勤, 袁亮, 林治安, 等. 腐植酸促进植物生长的机理研究进展[J]. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(4): 1065-1076. doi: 10.11674/zwyf.16255 [3] HAO T, ZHU Q, ZENG M, et al. Impacts of nitrogen fertilizer type and application rate on soil acidification rate under a wheat-maize double cropping system[J/OL]. Journal of Environmental Management, 2020, 270, 110888. [2021-11-15]. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2020.110888.
[4] CHENG M, WANG A, TANG C. Ammonium-based fertilizers enhance Cd accumulation in Carpobrotus rossii grown in two soils differing in pH[J]. Chemosphere, 2017, 188: 689-696. doi: 10.1016/j.chemosphere.2017.09.032
[5] ZHOU X Y, XU M G, ZHOU S W, et al. Soil acidification characteristics in Southern China's croplands under long-term fertilization[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2015, 21(6): 1615-1621.
[6] CUI Z, ZHANG H, CHEN X, et al. Pursuing sustainable productivity with millions of smallholder farmers[J]. Nature, 2018, 555(7696): 363-366. doi: 10.1038/nature25785
[7] 曾宪成, 李双. 让腐植酸在优化土肥关系中发挥重要作用[J]. 腐植酸, 2014(6): 1-7. doi: 10.3969/j.issn.1671-9212.2014.06.001 [8] 朱兆良, 金继运. 保障我国粮食安全的肥料问题[J]. 植物营养与肥料学报, 2013, 19(2): 259-273. doi: 10.11674/zwyf.2013.0201 [9] 李进, 樊小林, 蔺中. 碱性肥料对土壤微生物多样性及香蕉枯萎病发生的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(1): 212-219. doi: 10.11674/zwyf.17100 [10] 桂莎, 刘芳, 张立丹, 等. 复合菌剂防控香蕉枯萎病的效果及其微生物学机制[J]. 土壤学报, 2020, 57(4): 995-1007. [11] LI J, DUAN T T, LIN Z, Et al. Study on carbon source screening technology for prevention and control of banana fusarium wilt[J]. American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 2020, 16(1): 87-95. doi: 10.3844/ajbbsp.2020.87.95
[12] 李华平, 李云锋, 聂燕芳. 香蕉枯萎病的发生及防控研究现状[J]. 华南农业大学学报, 2019, 40(5): 128-136. doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.201905062 [13] DITA M, BARQUERO M, HECK D, et al. Fusarium wilt of banana: Current knowledge on epidemiology and research needs toward sustainable disease management[J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 1468. doi: 10.3389/fpls.2018.01468.
[14] SENECHKIN I V, VAN OVERBEEK L S, VAN BRUGGEN A H C. Greater Fusarium wilt suppression after complex than after simple organic amendments as affected by soil pH, total carbon and ammonia-oxidizing bacteria[J]. Applied Soil Ecology, 2014, 73: 148-155. doi: 10.1016/j.apsoil.2013.09.003
[15] 《腐植酸》编辑部. 含腐植酸水溶肥料产品登记增长快[J]. 腐植酸, 2017(4): 102. [16] 樊小林, 李进. 碱性肥料调节香蕉园土壤酸度及防控香蕉枯萎病的效果[J]. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(4): 938-946. doi: 10.11674/zwyf.2014.0416 [17] 石朋飞, 玄先路, 侯翠红, 等. 腐植酸类肥料的研究现状及展望[J]. 河南化工, 2015, 32(7): 7-11. doi: 10.3969/j.issn.1003-3467.2015.07.003 [18] 张祥, 梁济, 李接励, 等. 腐植酸肥料对小麦氮素吸收利用的影响[J]. 化肥工业, 2019, 46(3): 61-66. doi: 10.3969/j.issn.1006-7779.2019.03.016 [19] 姜佰文, 谢晓伟, 王春宏, 等. 应用腐植酸减肥对玉米产量及氮效率的影响[J]. 东北农业大学学报, 2018, 49(3): 21-29. doi: 10.3969/j.issn.1005-9369.2018.03.003 [20] 赫臣, 郑桂萍, 赵海成, 等. 增施腐植酸及减量施肥对盐碱地水稻穗部性状与产量的影响[J]. 作物杂志, 2018(3): 129-134. [21] 张亮亮, 樊小林, 张立丹, 等. 碱性肥料对稻田土壤和稻米镉含量的影响[J]. 应用生态学报, 2016, 27(3): 891-896. [22] 郭春铭, 刘卫军, 樊小林. 碱性长效缓释氮肥对蕉园土壤pH和香蕉氮肥利用效率的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(1): 128-136. doi: 10.11674/zwyf.16094 [23] 李进, 张立丹, 刘芳, 等. 碱性肥料对香蕉枯萎病发生及土壤微生物群落的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2016, 22(2): 429-436. doi: 10.11674/zwyf.14460 [24] 中华人民共和国农业部. 含腐植酸水溶肥料: NY 1106—2010[S]. 北京: 中国农业出版社, 2011. [25] 中华人民共和国农业部. 水溶肥料总氮、磷、钾含量的测定: NY/T 1977—2010[S] . 北京: 中国农业出版社, 2011. [26] 中华人民共和国农业部. 水溶肥料腐植植酸含量的测定: NY/T 1971—2010[S] . 北京: 中国农业出版社, 2011. [27] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 3版. 北京: 中国农业出版社, 2000. [28] 高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006. [29] 关松荫. 土壤酶与土壤肥力[J]. 土壤通报, 1980, 11(6): 41-44. [30] 徐广平, 滕秋梅, 沈育伊, 等. 香蕉茎叶生物炭对香蕉枯萎病防控效果及土壤性状的影响[J]. 生态环境学报, 2020, 29(12): 2373-2384. [31] TKACZYK P, MOCEK-PŁÓCINIAK A, SKOWROŃSKA M, et al. The mineral fertilizer-dependent chemical parameters of soil acidification under field conditions[J/OL]. Sustainability, 2020, 12(17): 7165. [2021-11-15]. https://doi.org/10.3390/su12177165.
[32] ZHU H, CHEN C, XU C, et al. Effects of soil acidification and liming on the phytoavailability of cadmium in paddy soils of central subtropical China[J]. Environmental Pollution, 2016, 219: 99-106. doi: 10.1016/j.envpol.2016.10.043
[33] HAYNES R J. What effect does liming have on silicon availability in agricultural soils?[J]. Geoderma, 2019, 337: 375-383. doi: 10.1016/j.geoderma.2018.09.026
[34] 曹巧滢, 江家泉, 王学江, 等. 新型碱性肥料治酸改土降镉的效果和机理[J/OL]. 土壤学报(2021-07-09) [2021-11-05]. https://kns.cnki.net/kcms/detail/32.1119.p.20210709.1345.006.html. -
期刊类型引用(1)
1. 林金钩. 2种复合除草剂降解菌剂的制备与性状分析. 环境工程. 2022(08): 178-184 . 
百度学术
其他类型引用(2)
计量
- 文章访问数: 199
- HTML全文浏览量: 4
- PDF下载量: 520
- 被引次数: 3
