Effect of different storage methods on physic-chemical properties of pig slurry
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摘要:目的
针对猪粪水贮存过程中氮素大量损失的问题，比较秋季和冬季条件下敞口和密封贮存对猪粪水贮存过程中理化特性的影响，以便为猪粪水贮存还田提供理论参考。
方法在实验室条件下，比较了秋季和冬季敞口与密封贮存对猪粪水贮存过程中物质转化、氮素损失及无害化的影响，分析了猪粪水pH、电导率(Electrical conductivity，κ)、化学需氧量(Chemical oxygen demand，COD)、种子发芽率及NH4+-N、NO3−-N、总氮(Total nitrogen，TN)和重金属(As、Zn、Cu、Pb和Cd)含量的变化。
结果猪粪水贮存过程中，pH先增加后保持相对稳定，κ、COD及TN、NO3−-N和重金属含量均逐渐降低，NH4+-N含量先增加后降低，种子发芽率逐渐增加；贮存后猪粪水中无机氮占比明显增加(冬季敞口贮存除外)，除Cu和Zn含量未达到《农田灌溉水质标准》(GB 5084—2021)要求外，As、Pb和Cd含量均达到无害化和稳定化要求；贮存造成氮素损失严重，秋季和冬季敞口贮存猪粪水的氮素损失率分别为79.44%和52.60%。与敞口相比，密封贮存降低了猪粪水pH，显著减少了贮存过程中氮素损失，降低了Zn含量，特别是显著减少了NH4+-N损失，秋季和冬季贮存后猪粪水氮素损失率较敞口贮存分别减少36.14和21.30个百分点；贮存后猪粪水κ显著高于敞口贮存，种子发芽率略低，对其他重金属(As、Cu、Pb和Cd)含量无显著影响。
结论尽管敞口贮存简单方便，但氮素损失严重，降低了贮存后猪粪水的肥料价值，故在有条件的地区应鼓励养殖场进行猪粪水密封贮存。
Abstract:ObjectiveAiming at the great loss of nitrogen during swine slurry storage process, effects of open and sealed storage on the physic-chemical properties of swine slurry during the storage process were compared in autumn and winter to provide a theoretical reference for swine slurry storage and return to the field.
MethodThe effects of open and sealed storage on material transformation, nitrogen loss and harmlessness of pig slurry storage were compared in autumn and winter under laboratory condition. The changes of pH value, electrical conductivity (κ), chemical oxygen demand (COD), NH4+-N content, NO3−- N content, total nitrogen (TN) content, seed germination rate and heavy metal (As, Zn, Cu, Pb and Cd) contents were analyzed.
ResultThe pH value first increased and then remained relatively stable, κ, COD, the contents of TN, NO3−-N and heavy metals gradually decreased, NH4+-N content first increased and then decreased gradually, and the seed germination rate gradually increased during the storage of pig slurry. After storage, the proportion of inorganic nitrogen in pig slurry increased significantly (Except for winter open storage). Except Cu and Zn did not meet the requirements of “Water Quality Standard for Farmland Irrigation” (GB 5084—2021), As, Pb and Cd met the requirements of harmlessness and stabilization. However storage also caused serious nitrogen loss, with the nitrogen loss rates of 79.44% and 52.60% respectively in autumn and winter under open storage. Compared with open storage, sealed storage reduced the pH value of pig slurry, significantly reduced the nitrogen loss and Zn content during storage, especially the NH4+-N loss. The nitrogen loss rate of pig slurry after storage in autumn and winter decreased by 36.14 and 21.30 percentage points respectively compared with open storage. However, after storage, the κ of pig slurry was significantly higher than that of open storage, seed germination rate was slightly lower, and there was no significant effect on the contents of other heavy metals (As, Cu, Pb and Cd).
ConclusionAlthough open storage is simple and convenient, but the nitrogen loss is serious, which reduces the fertilizer value of pig slurry after storage. Therefore, farms should be encouraged to store pig slurry in sealed condition.
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Keywords:
- Storage method /
- Pig slurry /
- Physicochemical characterization /
- Nitrogen loss /
- Open storage /
- Sealed storage
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蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV)和帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus，PALV)均为通过库蠓Culicoides传播的呼肠孤病毒科Reoviridae环状病毒属Orbivirus成员，广泛分布于热带、亚热带与温带地区，牛是3种病毒的重要宿主[1-3]。BTV、EHDV和PALV在全球引起的动物疫病的暴发和流行给牛羊养殖业造成了严重经济损失，导致牛羊进出口贸易受限，影响了国际畜产品正常贸易。据估计，2009年全球畜牧业仅因BTV引发蓝舌病而导致的经济损失就高达30亿美元[4]；近年来EHDV在中东多国特别是在阿尔及利亚、突尼斯、摩洛哥和以色列等国家的牛群中多次引发流行性出血病的暴发，严重影响了当地畜牧业的健康发展[5]；PALV感染妊娠期母牛能引起新生犊牛积水性无脑和小脑发育不全，曾在日本和韩国暴发，给两国的肉牛养殖业造成了严重的经济损失[6]。目前，蓝舌病和流行性出血病已经被世界动物卫生组织(Office international des epizooties，OIE)列为法定报告的跨境动物疫病。
BTV、EHDV和PALV血清型众多，目前世界范围内已发现27种BTV血清型[7]、9种EHDV血清型[8]和10种PALV血清型[9]。2013年在公益性行业(农业)科研专项的资助下，在全国范围内开展了虫媒病毒的流行病学调查，发现我国主要流行12种BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)[10]，5种EHDV血清型(EHDV-1、-5、-6、-7和-10)[11]和3种PALV血清型[Chuzan disease virus (CHUV)、D’Aguilar virus (DAV)与Bunyip Creek virus (BCV)][12]等，表明流行于我国的BTV、EHDV和PALV血清型具有丰富多样性。对3种病毒的血清学调查发现，我国至少12个省区的牛羊群中同时存在BTV、EHDV和PALV抗体阳性，且阳性率由北向南逐渐升高，特别是在南方地区，如云南、广西和广东等地的牛群中，3种病毒的血清抗体阳性率均高于30%；说明BTV、EHDV和PALV在我国已经广泛存在，严重威胁我国畜牧产业的健康发展[13-15]。
快速诊断病原是动物疫病防控的重要一环，BTV、EHDV和PALV不仅具有共同的传播媒介与易感动物，在流行区域上也存在重叠；因此，建立一种能同时诊断这3种病原的检测方法具有重要的应用价值。多重RT-qPCR可在1个反应管中同时检测多种目的基因，克服了普通荧光PCR只能检测单一基因的缺点，具有特异性强、敏感性高和短时间内检测多种病原的优点，被广泛应用于动物传染病的诊断[16]。本研究旨在运用TaqMan探针技术建立一种三重RT-qPCR方法，提高病毒检出率，简化操作流程，降低检测成本，为临床快速鉴别检测BTV、EHDV和PALV提供有效的技术手段。
1. 材料与方法
1.1 毒株、血液和核酸样品
24个BTV血清型(BTV-1~BTV-24)南非参考毒株由OIE南非蓝舌病参考实验室(Onderste-poort Veterinary Institute)提供，6个EHDV血清型(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8)参考毒株由澳大利亚麦克阿瑟·伊丽莎白农业研究所(Elizabeth Macarthur Agricultural Institute，EMAI)提供，中国分离的12种BTV血清型、5种EHDV血清型和3种PALV血清型代表毒株信息见表1。阿卡斑病毒(Akabane virus, AKAV)核酸由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室保存，小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)核酸由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus, BEFV)核酸由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。BTV Seg-10、EHDV Seg-5和PALV Seg-7基因节段重组质粒pLB-BTV-NS3-T7、pLB-EHDV-NS1-T7和pLB-CHUV-VP7-T7由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室前期制备并保存。
1.2 主要试剂与仪器
病毒RNA抽提试剂盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit购自Thermo公司，DNA胶回收试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，T7启动子RNA体外转录试剂盒购自Promega公司，RNA纯化试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、pLB平末端克隆载体购自天根生化科技有限公司，7500实时荧光定量PCR系统购自ABI公司。
1.3 引物和探针的设计与合成
从NCBI检索并下载BTV、EHDV、PALV病毒的全基因组序列，并根据云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室分离的3种病毒的全基因组序列，利用MEGA-X进行序列对比分析，确定并选择BTV NS3、EHDV NS1和PALV VP7基因保守区序列，利用Primer Express 6.0软件设计相应的特异性引物，分别用FAM、VIC和TAMRA荧光基团标记TaqMan探针，使用BHQ1作为淬灭基团(表2)。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成，并用RNase-free 水稀释至20 μmol/L。
表 2 蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR的引物与探针Table 2. Primers and probes used for detecting bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus by triplex RT-qPCR引物/探针
Primer/Probe扩增或标记位置
Amplification or
label location扩增或标记长度/bp
Amplification or
label length引物或探针序列(5′→3′)
Primer or probe sequenceBTV-NS3-F Seg-10 189~207 TGGAYAAAGCGATGTCAAA BTV-NS3-R Seg-10 266~285 ACATCATCACGAAACGCTTC BTV-NS3-Probe Seg-10 243~264 FAM-ARGCTGCATTCGCATCGTACGC-BHQ1 EHDV-NS1-F Seg-5 12~32 TCTTCGTCGACTGCCATCGAG EHDV-NS1-R Seg-5 66~94 AACATTTTGACATGATTKGCRTARTAACT EHDV-NS1-Probe Seg-5 34~63 TAMRA-TGGAGCGCTTTTTGAGAAAATACAACATGA-BHQ1 PALV-VP7-F Seg-7 275~295 CATCAATGGCAACAATCGGTG PALV-VP7-R Seg-7 346~369 ATTCAGCATACCTGTAATTCGTAC PALV-VP7-Probe Seg-7 314~341 VIC-TTCCATATACAACGTCGGCAATGACAAG-BHQ1 1.4 标准品的制备
提取pLB-BTV-NS3-T7、pLB-EHDV-NS1-T7和pLB-CHUV-VP7-T7基因序列重组质粒，使用XbaⅠ内切酶进行质粒的酶切线性化。取1 μg纯化后的DNA作为模板，使用T7体外转录试剂盒进行BTV Seg-10 (822 bp)、EHDV Seg-5 (533 bp)和PALV Seg-7 (950 bp) ssRNA的体外转录，反应体系为：DNA模板5 μL、RiboMAXTM Express T7 2× Buffer 10 μL、T7 Express Enzyme Mix 2 μL，加入RNase-free 水补齐至20 μL；37 ℃反应30 min。使用RNA纯化试剂盒纯化转录产物，Nanodrop ND-2000测定核酸浓度后，根据相对分子质量计算纯化后ssRNA的拷贝数。
1.5 三重RT-qPCR反应条件的优化
以体外转录的BTV Seg-10、EHDV Seg-5和PALV Seg-7的ssRNA为模板，采用方阵法分别对三重RT-qPCR方法的引物浓度(0.1~0.5 μmol·L−1)、探针浓度(0.1~0.8 μmol·L−1)、退火温度(50~60 ℃)和模板体积(2~8 μL)进行筛选，确定最佳反应条件。
1.6 特异性试验
以制备好的BTV Seg-10、EHDV Seg-5和PALV Seg-7的ssRNA模板作为阳性对照，与AKAV、PPRV、FMDV和BEFV核酸一同进行三重RT-qPCR检测，设立阴性牛羊血液总RNA及DEPC水分别作为阴性和空白对照，重复3次。
1.7 敏感性试验和标准曲线的绘制
分别将3种病毒的体外转录ssRNA以10倍梯度稀释获得拷贝数为1×1010~1×10−1 µL−1的12个梯度，分别以阴性牛羊血液总RNA及DEPC水作为阴性和空白对照。所有样品及对照均设2个复孔，同时进行单重和三重RT-qPCR检测，并以RNA浓度的对数值为横坐标、三重RT-qPCR结果Ct值为纵坐标绘制标准曲线。
1.8 重复性试验
以BTV、EHDV和PALV体外转录的ssRNA的3个稀释度(拷贝数分别为1×103、1×105和1×107 μL−1)为模板，每个稀释度各取10份样本分别在不同的时间重复检测3次，同时设立阴性牛羊血液总RNA及DEPC水分别作为阴性和空白对照，并通过计算Ct值的标准差和变异系数，验证三重RT-qPCR的批内和批间重复性。
1.9 混合病毒核酸样品的检测试验
将BTV、EHDV和PALV 3种病毒高、中、低浓度(拷贝数分别为1×106、1×104和1×102 µL−1)的ssRNA分别按体积比1∶1混合，同时进行单重和三重RT-qPCR检测，并设立阴性牛羊血液总RNA及DEPC水分别作为阴性和空白对照。在3种病毒核酸混合的情况下分析高浓度的核酸模板是否会影响三重RT-qPCR对低浓度核酸模板的检测结果。
1.10 毒株与临床血液样本的检测
提取2012—2016年在我国分离的BTV、EHDV和PALV不同血清型毒株及已分离毒株对应的阳性血液样本核酸，与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株的核酸同时进行单重和三重RT-qPCR检测。比较试验结果，分析和评价该方法的临床实用性。
表 1 中国分离的不同蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒血清型代表毒株信息Table 1. Representative strains of different serotypes of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus isolated in China血清型 Serotype 毒株 Strain 分离年份 Isolation year 分离地点 Isolation place 来源动物 Animal source BTV-1 V147 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 绵羊 Sheep BTV-2 V146 2013 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-3 V025 2013 云南德宏 Dehong, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-4 V030 2013 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-5 V084 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-7 V089 2014 广东汕头 Shantou, Guangdong 黄牛 Cattle BTV-9 V008 2013 云南德宏 Dehong, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-12 V007 2012 广西南宁 Nanning, Guangxi 黄牛 Cattle BTV-15 V061 2014 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-16 V109 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 绵羊 Sheep BTV-21 V057 2013 江苏须臾 Xuyu, Jiangsu 黄牛 Cattle BTV-24 V015 2013 云南德宏 Dehong, Yunnan 黄牛 Cattle EHDV-1 V128 2013 广东汕头 Shantou, Guangdong 奶牛 Cow EHDV-5 V127 2015 广西融水 Rongshui, Guangxi 水牛 Buffalo EHDV-6 V274 2014 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle EHDV-7 V296 2013 云南师宗 Shizong, Yunnan 水牛 Buffalo EHDV-10 V280 2017 云南师宗 Shizong, Yunnan 黄牛 Cattle CHUV V144 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 黄牛 Cattle DAV V157 2015 云南红河 Honghe, Yunnan 水牛 Buffalo BCV V252 2016 广东汕头 Shantou, Guangdong 奶牛 Cow 2. 结果与分析
2.1 标准品的制备
以构建好的3种重组质粒为模板进行体外转录，获得BTV Seg-10 (822 bp)、EHDV Seg-5 (533 bp)和PALV Seg-7 (950 bp)的ssRNA，经纯化后测定质量浓度分别为656.5、408.6和785.7 ng·μL−1，计算获得拷贝数分别为1.41×1012、1.36×1012和1.46×1012 μL−1。将获得的ssRNA样品作为三重RT-qPCR灵敏性评价的标准品。
2.2 三重RT-qPCR方法的建立与优化
通过引物和探针浓度的不同配比试验及反应条件的优化试验，最终确定反应体系。总反应体积为20 μL，其中2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，Ex Taq HS (5 U·μL−1) 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，BTV上、下游引物各0.2 μL及探针0.4 μL，EHDV的上、下游引物各0.3 μL及探针0.6 μL，PALV上、下游引物各0.2 μL及探针0.4 μL，变性模板RNA 4 μL，双蒸水补充至20 μL。反应条件：42 ℃ 5 min；92 ℃ 10 s；92 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。
2.3 特异性试验
将3种病毒体外转录ssRNA作为阳性对照，同时对AKAV、PPRV、FMDV和BEFV的核酸及阴性对照进行三重RT-qPCR检测。结果(图1)显示，本研究建立的三重RT-qPCR具有高度特异性，仅与对应的BTV、EHDV和PALV核酸产生扩增曲线，其他病原(AKAV、PPRV、FMDV、BEFV)和阴性对照均无扩增曲线，判定为阴性。
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图 1 三重RT-qPCR特异性试验BTV：蓝舌病病毒；EHDV：流行性出血病病毒；PALV：帕利亚姆血清群病毒Figure 1. Specificity test of triplex RT-qPCRBTV: Bluetongue virus; EHDV: Epizootic hemorrhagic disease virus; PALV: Palyam serogroup virus2.4 敏感性试验和标准曲线的绘制
以拷贝数为1×1010~1×10−1 µL−1的12个梯度ssRNA作为模板，根据已优化的条件同时进行三重和单重RT-qPCR反应。结果显示，所有阴性对照及空白对照均无阳性扩增(图2a、2b、2c)；在核酸拷贝数为1×1010~1×101 µL−1的范围内，标准曲线均具有良好的线性，相关系数(R)均在0.998以上，引物扩增效率(E)为91.99%~103.42%(图2d、2e、2f)。各浓度体外转录ssRNA单重与三重RT-qPCR检测的Ct均值(表3)表明本研究建立的三重 RT-qPCR最低可检测到拷贝数为1×101 µL−1的BTV、EHDV和PALV核酸，与单重检测结果一致。
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图 2 蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒体外转录ssRNA对三重RT-qPCR灵敏性评价曲线上数字0~10分别代表ssRNA拷贝数为1×100~1×1010 μL−1Figure 2. Sensitivity evaluation of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus in vitro transcribed ssRNA to triplex RT-qPCRThe numbers from 0 to 10 on the curves indicate ssRNA copy numbers of 1×100−1×1010 μL−1 respectively表 3 单重和三重RT-qPCR方法Ct值比较1)Table 3. Ct value comparison between monoplex and triplex RT-qPCR核酸拷贝数/μL−1
Nucleic acid copy number蓝舌病病毒
Bluetongue virus流行性出血病病毒
Epizootic hemorrhagic disease virus帕利亚姆血清群病毒
Palyam serogroup virus单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex 1×1010 8.57 9.00 9.05 9.15 6.47 6.80 1×109 11.63 12.17 12.23 12.26 9.22 9.20 1×108 15.43 15.72 15.71 15.76 13.75 13.45 1×107 18.83 19.11 19.35 19.04 16.83 17.05 1×106 22.30 22.34 22.59 22.48 20.92 21.01 1×105 25.40 25.75 26.15 26.12 24.59 24.55 1×104 28.50 28.87 29.47 29.59 28.09 28.13 1×103 31.75 32.10 32.65 33.17 31.03 30.96 1×102 34.38 35.04 35.51 36.03 34.28 34.61 1×101 37.78 38.11 38.28 38.64 37.48 37.66 1×100 — — — — — — 1×10−1 — — — — — — 1) “—”表示未检测出
1) “—”indicates not detectable2.5 混合病毒核酸样品的检测
将BTV、EHDV和PALV 3种病毒的ssRNA分别按高、中、低3个浓度等体积混合，同时进行单重和三重RT-qPCR检测。结果(表4)显示，一种病毒核酸模板浓度较高(拷贝数为106 μL−1)而另一种病毒核酸模板浓度较低(拷贝数为102 μL−1)时，三重RT-qPCR依然可以同时检测到3种病毒，并且与单重RT-qPCR结果无明显差异。
表 4 混合病毒核酸样品单重和三重RT-qPCR检测结果Table 4. Results of mixed virus nucleic acid samples detected by monoplex and triplex RT-qPCR样品
Sample病毒1)
Virus核酸拷贝数/ μL−1
Nucleic acid copy numberCt 单重 Monoplex 三重 Triplex 1 BTV 1×106 23.20 23.24 EHDV 1×104 30.45 30.57 PALV 1×102 35.33 35.66 2 BTV 1×104 29.48 29.85 EHDV 1×102 37.01 37.08 PALV 1×106 21.82 21.91 3 BTV 1×102 35.43 36.09 EHDV 1×106 23.49 23.38 PALV 1×104 29.07 29.11 1) BTV：蓝舌病病毒；EHDV：流行性出血病病毒；PALV：帕利亚姆血清群病毒
1) BTV: Bluetongue virus; EHDV: Epizootic hemorrhagic disease virus; PALV: Palyam serogroup virus2.6 重复性试验
以高、中、低3个稀释度的BTV、EHDV和PALV的ssRNA作为模板，分3个批次进行检测，每批次每个稀释度各10份样本，通过计算批内、批间变异系数评价多重体系的稳定性。结果(表5)显示，BTV、EHDV和PALV病毒核酸高中低3个浓度所对应的批内和批间Ct值的标准差均在0.5以内，变异系数均在2%以下，可见三重体系对于3种病毒核酸的检测均具有良好的稳定性。
表 5 三重RT-qPCR重复性试验中Ct值与变异系数Table 5. Means and coefficients of variation in repeatability tests of triplex RT-qPCR病毒
Virus核酸拷贝数/μL−1
Nucleic acid copy numberCt1) 变异系数/% Coefficient of variation 批内 Intra-assay 批间 Inter-assay 批内 Intra-assay 批间 Inter-assay BTV 1×107 18.61±0.19 18.89±0.29 1.05 1.54 1×105 25.39±0.26 25.32±0.40 1.03 1.58 1×103 31.37±0.43 32.54±0.46 1.37 1.40 EHDV 1×107 19.32±0.25 19.12±0.30 1.30 1.59 1×105 26.28±0.32 26.66±0.48 1.22 1.82 1×103 32.62±0.35 33.17±0.40 1.08 1.19 PALV 1×107 16.85±0.20 17.15±0.24 1.16 1.38 1×105 24.58±0.27 24.43±0.40 1.10 1.64 1×103 30.91±0.32 30.55±0.50 1.03 1.44 1)表中数据为平均值±标准差
1)The data are mean ± standard deviation2.7 毒株与临床血液样本的检测
对2012—2016年在我国分离的BTV、EHDV和PALV不同血清型毒株及分离出病毒的阳性血液样本和BTV、EHDV参考毒株核酸同时进行单重和三重RT-qPCR检测。结果(表6和表7)显示，本研究建立的三重RT-qPCR方法对参考毒株和在我国分离培养的毒株核酸检测Ct值为14.67~27.62，对血液样本检测Ct值为27.69~35.24；单重RT-qPCR检测病毒毒株Ct值为15.08~26.04，对血液样品检测Ct值为28.03~34.67。对2种方法的检测结果进行单因素方差分析，P>0.05，无显著差异。本研究建立的三重RT-qPCR方法可准确检测出国内外BTV、EHDV和PALV不同血清型毒株及临床血液样本中对应的不同血清型病毒核酸，具有较好的群特异性，与单重检测结果无明显差异。
表 6 单重和三重RT-qPCR检测中国分离的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒毒株及对应阳性血液样本的验证试验Table 6. Demonstration tests of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease and Palyam serogroup virus strains isolated in China and corresponding blood samples by monoplex and triplex RT-qPCR血清型
Serotype毒株
StrainCt(病毒样品 Virus sample) Ct(血液样品 Blood sample) 单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex BTV-1 V147 16.21 16.79 32.01 32.63 BTV-2 V146 22.12 22.60 30.89 30.67 BTV-3 V025 19.03 18.87 30.02 29.82 BTV-4 V030 23.13 23.45 31.52 31.76 BTV-5 V084 20.57 21.67 31.87 32.21 BTV-7 V089 25.23 25.12 31.13 30.53 BTV-9 V008 17.55 17.63 30.21 29.98 BTV-12 V007 21.06 20.15 28.03 27.69 BTV-15 V061 18.73 18.67 32.89 33.13 BTV-16 V109 20.12 19.32 33.34 34.27 BTV-21 V057 24.32 25.07 32.08 31.45 BTV-24 V015 17.55 17.34 34.67 35.24 EHDV-1 V128 18.67 18.69 30.34 29.68 EHDV-5 V127 20.23 20.12 29.76 30.20 EHDV-6 V274 22.95 23.32 34.32 34.46 EHDV-7 V296 15.15 14.67 33.58 32.14 EHDV-10 V280 16.07 16.12 30.31 29.07 CHUV V144 21.22 20.69 31.68 30.57 DAV V157 16.32 15.32 30.57 31.75 BCV V252 23.46 24.54 31.76 32.62 表 7 单重和三重RT-qPCR检测蓝舌病病毒和流行性出血病病毒参考毒株的验证试验Table 7. Demonstration test of reference strains of bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus by monoplex and triplex RT-qPCR血清型
SerotypeCt 血清型
SerotypeCt 单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex BTV-1 17.09 16.72 BTV-16 19.66 20.07 BTV-2 20.62 21.45 BTV-17 15.08 14.86 BTV-3 21.09 22.63 BTV-18 18.60 17.32 BTV-4 18.32 17.82 BTV-19 22.23 21.12 BTV-5 20.44 19.31 BTV-20 21.15 20.67 BTV-6 21.16 20.08 BTV-21 26.04 27.62 BTV-7 22.67 23.43 BTV-22 22.62 23.51 BTV-8 15.96 15.67 BTV-23 25.34 26.02 BTV-9 22.26 21.30 BTV-24 20.26 19.09 BTV-10 20.68 21.67 EHDV-1 19.68 18.93 BTV-11 21.75 22.52 EHDV-2 21.79 22.22 BTV-12 21.63 20.03 EHDV-5 18.60 17.45 BTV-13 22.78 23.12 EHDV-6 19.73 18.96 BTV-14 24.06 23.56 EHDV-7 20.62 19.65 BTV-15 23.12 22.67 EHDV-8 19.63 20.05 3. 讨论与结论
作为虫媒病毒的BTV、EHDV和PALV血清型多样，传播途径相同，流行地域重叠，并且在动物感染早期存在部分相似的临床症状。国外研究曾报道3种病毒交叉感染的情况[17]。2013—2016年在公益性行业(农业)科研专项的资助下，云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室在我国多个虫媒病毒监控点的不同哨兵牛上同时分离出了BTV、EHDV和PALV，对这3种病原的早期诊断是一项重大挑战，往往仅能检测出其中1种病毒核酸阳性忽略另外2种病毒，增加病毒检测的漏检率，不利于动物疫病的防控。基于此，本试验在原有RT-qPCR对虫媒病毒的检测基础上，建立了针对BTV、EHDV和PALV的三重RT-qPCR检测方法。
多重RT-qPCR方法易受引物、试剂和反应条件等诸多因素影响[18]。因此本研究首先根据BTV NS3、EHDV NS1和PALV VP7基因的高度保守性和较好群特异性等特点[19-21]，选择作为引物和探针设计的靶基因，同时适当引入简并碱基，并进行BLAST序列对比分析确保引物和探针的保守性和特异性。随后对反应体系的退火温度，模板体积、引物和探针浓度进行了一系列优化，确定了最优反应条件，将复合扩增中引物间、模板间和引物与模板间可能存的竞争抑制和相互干扰降到最低，从而实现从单种病毒检测到同时进行3种病毒的检测，节省样品用量、试验资源和操作时间。
本研究利用BTV、EHDV和PALV的体外转录ssRNA对三重RT-qPCR灵敏度进行测试并绘制标准曲线，结果显示，三重反应对病毒体外转录ssRNA拷贝数最低检测限在10 μL−1级别，与单重反应相比，灵敏度无明显差异。龚雪蕊等[22]建立的寨卡病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒三重RT-PCR检测方法的最低拷贝数检出限为10 μL−1，Nunes等[23]报道的用于南美洲汉坦4种流行病毒的RT-qPCR检测方法的拷贝数灵敏度为10 μL−1，二者均与本研究相近。本研究构建的标准曲线的相关系数均大于等于0.998，扩增效率基本相同且均大于90%，符合RT-qPCR扩增效率在90%~110%的合理范围。
前期调查发现，BTV、EHDV和PALV在临床上出现混合感染时，3种病毒在动物血液中的载量会存在较大差异；因此，本试验将3种病毒不同浓度的核酸模板进行混合，分析高浓度核酸模板是否对低浓度核酸模板存在干扰。结果显示，一种病毒核酸模板浓度较高而另一种病毒模板浓度较低时，所建立的三重RT-qPCR方法依然可以同时检测到3种病毒，并且与单重法的结果无明显差异，表明高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显。重复性试验中，对3种病毒高、中、低3个浓度的模板ssRNA进行检测，变异系数均小于2%，表明本研究建立的三重RT-qPCR检测方法具有较好的稳定性和重复性，有良好的检测效果。
2017年刘佳佳等[24]建立了BTV和EHDV双重RT-qPCR检测方法，但仅进行了1种BTV和EHDV血清型的特异性验证。本研究以单重RT-qPCR检测方法作为参照，使用建立的三重RT-qPCR同时对不同BTV和EHDV血清型参考毒株和我国主要流行的不同BTV、EHDV和PALV血清型毒株及其阳性血液样品进行检测。结果显示，本研究建立的三重RT-qPCR方法具有较好的群特异性，可以检测出不同血清型的参考毒株和在我国主要流行的毒株及其血液样品中对应病毒的核酸，与单重法的检检测结果无明显差异。
综上所述，本研究将在我国已经存在、主要流行于南方热带亚热带地区的3种虫媒病毒作为一个组合，首次建立了一套三重RT-qPCR检测方法，填补了同时检测BTV、EHDV和PALV 3种病毒核酸方法的空缺。该方法可应用于疫区或出入境动物带毒状况监测，对早期临床疫病鉴定和防疫指导具有参考价值。此外，多重RT-qPCR检测方法试验步骤简化、样本用量少、试验成本低，可为疫情防控争取宝贵时间。
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图 2 试验过程中猪粪水电导率(κ)的变化
Figure 2. Change of electrical conductivity (κ) of pig slurry during the experiment
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图 3 试验过程中猪粪水化学需氧量(COD)的变化
Figure 3. Change of chemical oxygen demand (COD) of pig slurry during the experiment
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图 4 试验过程中猪粪水NH4+-N含量的变化
Figure 4. Change of ammonium N content of pig slurry during the experiment
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图 5 试验过程中NO3−-N含量的变化
Figure 5. Change of nitrate N content of pig slurry during the experiment
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图 6 试验过程中总氮(TN)含量的变化
Figure 6. Change of total nitrogen (TN) content of pig slurry during the experiment
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图 7 猪粪水贮存过程对种子发芽率的影响
各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 7. Effect of storage process of pig slurry on seed germination rate
In each figure, different lowercase letters on the bars of the same time indicate significant differences among different treatments(P<0.05, Duncan’s method)
表 1 贮存前后猪粪水中氮素形态占比变化1)
Table 1 Changes of nitrogen form percentage in pig slurry obtained before and after storage
季节
Season处理
Treatment贮存前占比/%
Percentage before storage贮存后占比/%
Percentage after storage氮素损失率/%
Nitrogen
loss rateNH4+-N NO3−-N NH4+-N +
NO3−-NNH4+-N NO3−-N NH4+-N +
NO3−-N秋季
Autumn敞口
Open43.64±1.50 10.62±0.57 54.26±1.29b 63.63±2.21 30.03±1.25 93.66±1.99a 79.44±2.19a 密封
Sealed41.23±1.88 10.57±0.29 51.80±1.56b 75.98±2.91 4.81±0.28 80.79±2.10c 43.30±2.66c 冬季
Winter敞口
Open42.70±2.05 30.05±1.34 72.75±1.82a 38.34±0.91 26.38±0.84 64.72±0.89d 52.60±2.91b 密封
Sealed38.78±2.05 29.17±0.66 67.95±1.16a 76.65±0.95 10.59±0.44 87.24±0.85b 31.30±1.48d 1) 表中数据为平均值±标准误，n=3；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Data in table are means ±SE, n=3; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method )
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表 2 猪粪水贮存过程中重金属含量变化1)
Table 2 Changes of heavy metal contents during the storage process of pig slurry
ρ/(mg·L−1) 季节
Season处理
TreatmentAs Zn 0 d 60 d 120 d 180 d GB 5084—
20210 d 60 d 120 d 180 d GB 5084—
2021秋季
Autumn敞口
Open0.05±0.00a 0.03±0.00ab 0.04±0.00a 0.04±0.00a ≤0.05 12.58±0.81c 6.68±0.25c 5.53±0.12c 3.28±0.16c ≤2.00 密封
Sealed0.03±0.00b 0.04±0.00a 0.04±0.00a — 14.28±0.66b 4.58±0.08d 2.58±0.03d 2.53±0.11d 冬季
Winter敞口
Open0.03±0.00c 0.02±0.00c 0.02±0.00c 0.01±0.00c 52.93±4.47a 48.53±3.37a 16.83±1.01a 10.93±0.62a 密封
Sealed0.03±0.00c 0.03±0.00b 0.03±0.00b 0.02±0.00b 48.63±2.90a 23.73±1.66b 8.93±0.34b 6.03±0.23b
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季节
Season处理
TreatmentCu Pb Cd 0 d 120 d 180 d GB 5084—
20210 d 120 d GB 5084—
20210 d 120 d GB 5084—
2021秋季
Autumn敞口
Open2.76±0.19bc 2.01±0.02a 0.56±0.02c ≤0.50 0.11±0.01a — ≤0.20 0.05±0.00 — ≤0.01 密封
Sealed2.42±0.21c 1.93±0.13ab 0.63±0.01b 0.11±0.03a — 0.04±0.00 — 冬季
Winter敞口
Open3.03±0.07b 1.68±0.11b 1.04±0.11a 0.08±0.00b — — — 密封
Sealed3.61±0.16a 0.58±0.01c 0.39±0.01d 0.10±0.01 a 0.02±0.00 — — 1)表中数据为平均值±标准误，n=3；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)；“—”表示未检测到
1) Data in table are means ±SE, n=3; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method); “—” indicates not detected
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[1] 国家统计局. 中国统计年鉴: 2021[M]. 北京: 中国统计出版社, 2021. [2] 徐鹏翔, 沈玉君, 丁京涛, 等. 规模化养猪场粪污全量收集及贮存工艺设计[J]. 农业工程学报, 2020, 36(9): 255-262. [3] 国务院办公厅. 国务院办公厅关于加快推进畜禽养殖废弃物资源化利用的意见: 国办发〔2017〕48号[A/OL]. (2017-05-12)[2021-08-13]. https://huanbao.bjx.com.cn/news/20170613/830752.shtml. [4] 农业部. 农业部关于印发《畜禽粪污资源化利用行动方案(2017—2020年)》的通知[A/OL]. (2017-07-07)[2021-08-13]. http://www.moa.gov.cn/nybgb/2017/dbq/201801/t20180103_6134011.htm. [5] 全国畜牧总站, 中国饲料工业协会, 国家畜禽养殖废弃物资源化利用科技创新联盟. 畜禽养殖废弃物资源化利用主推技术模式[N]. 农民日报, 2017-12-6(6). [6] 孔凡克, 鞠鑫鑫, 杨守军, 等. 种养结合技术在畜禽粪水处理与资源化利用中的应用[J]. 猪业科学, 2017, 34(8): 106-107. doi: 10.3969/j.issn.1673-5358.2017.08.035 [7] 张朋月, 丁京涛, 孟海波, 等. 牛粪水酸化贮存过程中氮形态转化的特性研究[J]. 农业工程学报, 2020, 36(8): 212-218. [8] 马艳茹, 孟海波, 沈玉君, 等. 粪水酸化储存还田应用效果[J]. 农业工程学报, 2020, 36(15): 245-251. doi: 10.11975/j.issn.1002-6819.2020.15.030 [9] MANSYUR M, CHOI H L. Changes of physico–chemical properties of pig slurry during storage[J]. Media Peternakan, 2011, 34(3): 179-183. doi: 10.5398/medpet.2011.34.3.179
[10] 姜晨润, 孙靖博, 李华, 等. 规模化养猪场粪便贮存方式及土壤承载力[J]. 农业工程, 2019, 9(1): 35-37. [11] 丁京涛, 张朋月, 赵立欣, 等. 养殖粪水长期贮存过程理化特性变化规律[J]. 农业工程学报, 2020, 36(14): 220-225. [12] 朱海生, 董红敏, 栾冬梅, 等. 贮存高度和锯末覆盖厚度对猪粪NH3和温室气体排放量及其增温潜势的影响[J]. 农业环境科学学报, 2019, 38(4): 937-943. [13] XUE S K, CHEN S, HERMANSON R E. Wheat straw cover for reducing ammonia and hydrogen sulfide emissions from dairy manure storage[J]. Transactions of the ASAE, 1999, 42(4): 1095-1102. doi: 10.13031/2013.13257
[14] VANDERZAAG A C, GORDON R J, GLASS V M, et al. Floating covers to reduce gas emissions from liquid manure storages: A review[J]. Applied Engineering in Agriculture, 2008, 24(5): 657-671. doi: 10.13031/2013.25273
[15] PAIN B F, MISSELBROOK T H, REES Y J. Effects of nitrification inhibitor and acid addition to cattle slurry on nitrogen losses and herbage yields[J]. Grass and Forage Science, 1994, 49(2): 209-215. doi: 10.1111/j.1365-2494.1994.tb01994.x
[16] SIMS J T, LUKA-MCCAFFERTY N J. On-farm evaluation of aluminum sulfate (alum) as a poultry litter amendment: Effect on litter properties[J]. Journal of Environmental Quality, 2002, 31(6): 2066-2073. doi: 10.2134/jeq2002.2066
[17] SØRENSEN P, ERIKSEN J. Effects of slurry acidification with sulphuric acid combined with aeration on the turnover and plant availability of nitrogen[J]. Agriculture Ecosystems & Environment, 2009, 131(3/4): 240-246.
[18] PEREIRA J L S, FIGUEIREDO V, PINTO A F M A P, et al. Effects of biochar and clinoptilolite on composition and gaseous emissions during the storage of separated liquid fraction of pig slurry[J/OL]. Applied Sciences, 2020, 10(16): 5652. [2021-09-20]. https://doi.org/10.3390/app10165652
[19] 刘美玲. 生物炭与菌剂对猪粪氨气、甲烷和氧化亚氮排放的影响[D]. 保定: 河北农业大学, 2020. [20] 靳红梅, 付广青, 常志州, 等. 猪、牛粪厌氧发酵中氮素形态转化及其在沼液和沼渣中的分布[J]. 农业工程学报, 2012, 28(21): 208-214. [21] 生态环境部. 国家市场监督管理总局. 农田灌溉水质标准: GB 5084—2021[S]. 北京: 生态环境部, 2021. [22] POPOVIC O, JENSEN L S. Storage temperature affects distribution of carbon, VFA, ammonia, phosphorus, copper and zinc in raw pig slurry and its separated liquid fraction[J]. Water Research, 2012, 46(12): 3849-3858. doi: 10.1016/j.watres.2012.04.020
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期刊类型引用(7)
1. 杨冬，黄亚萍. 收割机脱粒装置模块化设计——基于经验预测和德尔菲法. 农机化研究. 2024(07): 106-110 . 
百度学术
2. 旷娜，苗雪雪，邹丹，梁玉刚，唐启源，方宝华. 同等控温下头季稻和再生季稻稻米品质差异分析. 中国稻米. 2024(02): 43-46 . 百度学术
3. 吴泽栋，刘浩蓬，张国忠，周勇，宿衍强，刘冉. 振动挤压式荸荠收获机的设计与试验. 华中农业大学学报. 2024(02): 205-214 . 百度学术
4. 王芳，张伟，申珂，刘中峰. 基于改进鱼群算法的履带式收割机路径跟踪. 山西农业大学学报(自然科学版). 2024(04): 109-117 . 百度学术
5. 任学志，蔡孟媛. 脱粒分离装置的研究现状及发展趋势. 农机使用与维修. 2023(02): 35-37 . 百度学术
6. 杨德生，黄见良，彭少兵. 机收再生稻高产优质栽培技术研究进展. 中国稻米. 2023(05): 1-8 . 百度学术
7. 刘婉茹，周勇，徐红梅，付建伟，张妮，谢干，张国忠. 水稻鼓形纵轴流脱粒滚筒杆齿优化与试验. 农业工程学报. 2023(15): 34-45 . 百度学术
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