Effect of different storage methods on physic-chemical properties of pig slurry
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摘要:目的
针对猪粪水贮存过程中氮素大量损失的问题，比较秋季和冬季条件下敞口和密封贮存对猪粪水贮存过程中理化特性的影响，以便为猪粪水贮存还田提供理论参考。
方法在实验室条件下，比较了秋季和冬季敞口与密封贮存对猪粪水贮存过程中物质转化、氮素损失及无害化的影响，分析了猪粪水pH、电导率(Electrical conductivity，κ)、化学需氧量(Chemical oxygen demand，COD)、种子发芽率及NH4+-N、NO3−-N、总氮(Total nitrogen，TN)和重金属(As、Zn、Cu、Pb和Cd)含量的变化。
结果猪粪水贮存过程中，pH先增加后保持相对稳定，κ、COD及TN、NO3−-N和重金属含量均逐渐降低，NH4+-N含量先增加后降低，种子发芽率逐渐增加；贮存后猪粪水中无机氮占比明显增加(冬季敞口贮存除外)，除Cu和Zn含量未达到《农田灌溉水质标准》(GB 5084—2021)要求外，As、Pb和Cd含量均达到无害化和稳定化要求；贮存造成氮素损失严重，秋季和冬季敞口贮存猪粪水的氮素损失率分别为79.44%和52.60%。与敞口相比，密封贮存降低了猪粪水pH，显著减少了贮存过程中氮素损失，降低了Zn含量，特别是显著减少了NH4+-N损失，秋季和冬季贮存后猪粪水氮素损失率较敞口贮存分别减少36.14和21.30个百分点；贮存后猪粪水κ显著高于敞口贮存，种子发芽率略低，对其他重金属(As、Cu、Pb和Cd)含量无显著影响。
结论尽管敞口贮存简单方便，但氮素损失严重，降低了贮存后猪粪水的肥料价值，故在有条件的地区应鼓励养殖场进行猪粪水密封贮存。
Abstract:ObjectiveAiming at the great loss of nitrogen during swine slurry storage process, effects of open and sealed storage on the physic-chemical properties of swine slurry during the storage process were compared in autumn and winter to provide a theoretical reference for swine slurry storage and return to the field.
MethodThe effects of open and sealed storage on material transformation, nitrogen loss and harmlessness of pig slurry storage were compared in autumn and winter under laboratory condition. The changes of pH value, electrical conductivity (κ), chemical oxygen demand (COD), NH4+-N content, NO3−- N content, total nitrogen (TN) content, seed germination rate and heavy metal (As, Zn, Cu, Pb and Cd) contents were analyzed.
ResultThe pH value first increased and then remained relatively stable, κ, COD, the contents of TN, NO3−-N and heavy metals gradually decreased, NH4+-N content first increased and then decreased gradually, and the seed germination rate gradually increased during the storage of pig slurry. After storage, the proportion of inorganic nitrogen in pig slurry increased significantly (Except for winter open storage). Except Cu and Zn did not meet the requirements of “Water Quality Standard for Farmland Irrigation” (GB 5084—2021), As, Pb and Cd met the requirements of harmlessness and stabilization. However storage also caused serious nitrogen loss, with the nitrogen loss rates of 79.44% and 52.60% respectively in autumn and winter under open storage. Compared with open storage, sealed storage reduced the pH value of pig slurry, significantly reduced the nitrogen loss and Zn content during storage, especially the NH4+-N loss. The nitrogen loss rate of pig slurry after storage in autumn and winter decreased by 36.14 and 21.30 percentage points respectively compared with open storage. However, after storage, the κ of pig slurry was significantly higher than that of open storage, seed germination rate was slightly lower, and there was no significant effect on the contents of other heavy metals (As, Cu, Pb and Cd).
ConclusionAlthough open storage is simple and convenient, but the nitrogen loss is serious, which reduces the fertilizer value of pig slurry after storage. Therefore, farms should be encouraged to store pig slurry in sealed condition.
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Keywords:
- Storage method /
- Pig slurry /
- Physicochemical characterization /
- Nitrogen loss /
- Open storage /
- Sealed storage
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桑树Morusalba是多年生木本植物，广泛分布于亚洲、非洲、欧洲等地区，具有良好的经济效益[1]。现代的蚕桑产业不再拘泥于传统的“种桑养蚕”，更多的是朝着蚕桑资源综合利用的方向发展[2-3]，以蚕桑产业作为扶贫项目的手段已经在我国广西、云南等地广泛实施。随着蚕桑产业的不断发展，桑树的种植面积也不断扩大，但作为蚕桑产业基石的桑树却受到诸多病害的影响，尤其是桑树真菌性病害严重影响了桑叶的质量与产量。
桑树褐斑病与桑轮纹病同属于桑树2种主要的真菌性病害。桑褐斑病主要症状为桑树叶片出现褐色斑点，病原菌为黏隔孢Septogleum mori和褐斑壳丰孢Phloeospora maculans 2种病原真菌[4-5]。Hong等[6]研究认为黏隔孢与褐斑壳丰孢属于同种异名。2017年，Videira等[7]将二者名称统一更正为如今的新褐斑壳丰孢Neophloeospora maculans。桑褐斑病分布广泛，在巴西、土耳其及印度等地均有报道[8-10]，桑感染褐斑病后桑叶中的主要营养成分含量会显著降低，对家蚕的消化吸收率、虫蛹生命率均有影响[11]。与褐斑病导致的症状类似，桑轮纹病的主要症状为桑叶出现轮纹型斑块[12],主要病原菌为膝节霉Gonatophragmium triuniae。该病原菌寄主有桑科桑属和无花果属等共15科22属的木本和草本植物，危害严重[13]。桑褐斑病与桑轮纹病病原菌具有较强的生命活力，尤其是轮纹病病原菌膝节霉，菌丝的致死温度可达到85 ℃[14]。不仅如此，褐斑病与轮纹病病原菌均以分生孢子盘遗落在病叶或者土壤中，可长期存活，待适宜条件又可侵染桑树，导致病害的大面积爆发[4]。目前，对2种病害病症的识别主要是通过肉眼观察法，但桑叶上观测到2种病害症状的时候，病原菌的增殖已达到一定数量，给病害的防控工作带来极大的困扰。因此，如何建立一种快速、准确的桑树褐斑病与轮纹病病原菌的检测技术是桑褐斑病与轮纹病早期防控的关键。
常见的植物病原菌核酸检测方法主要有聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增法[15]、实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative PCR，qPCR)扩增法[16]、环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)法等[17]。目前，对桑树病害的检测多为普通PCR和LAMP检测[18-19]，不同的检测技术各有优势，但多局限于对单个病原的检测。对于多种病原菌复合侵染的情况，或对于症状相似的病害，目前还鲜有较实用的快速检测方法，且针对于桑轮纹病和桑褐斑病2种危害严重的桑树真菌病害仍需相应的检测技术。多重PCR技术是指在同一个反应体系中加入2对或2对以上的引物，可以同时扩增出2组或2组以上的核酸片段，实现多种病原菌的快速检测[20]。本研究建立了桑褐斑病与桑轮纹病病原菌的多重PCR检测技术，为桑树真菌性病害的防控提供技术支持。
1. 材料与方法
1.1 样本收集
2019—2021年从广东、广西、云南和陕西主要种桑地区不同品种上采集褐斑病和轮纹病病样共250份，样本详细信息见表1。
表 1 样本材料收集信息Table 1. Sample material collection information感病类型
Type of infected disease采样地区
Collection site经纬度
Latitude and longitude品种
Variety样本数量
Number of sample褐斑病
Brown spot
disease广西百色市隆林县
Longlin County, Baise City, Guangxi105.17°E，24.64°N 桂优12号 Guiyou 12 30 陕西安康市石泉县
Shiquan County, Ankang City, Shaanxi108.32°E，32.97°N 强桑1号 Qiangsang 1 30 大10 Da 10 30 长果桑 Changguosang 30 陕西安康市汉阴县
Hanyin County, Ankang City, Shaanxi108.90°E，32.62°N 强桑1号 Qiangsang 1 10 云南楚雄彝族自治州永仁县
Yongren County, Chuxiong Yi Autonomous Prefecture, Yunnan101.38°E，26.06°N 强桑1号 Qiangsang 1 30 农桑14 Nongsang 14 30 轮纹病
Ring leaf
spot disease广东清远市英德蚕种场
Yingde Silkworm Breeding Farm, Qingyuan City, Guangdong113.45°E，24.18°N 抗青10号 Kangqing 10 30 广西百色市隆林县
Longlin County, Baise City, Guangxi105.57°E，24.64°N 桂优12号 Guiyou 12 30 1.2 供试真菌与试剂耗材
主要病原菌：新褐斑壳丰孢N. maculans与膝节霉G. triuniae等均分离保藏于亚太地区蚕桑培训中心。
其他真菌：致密链格孢Alternaria compacta、黑链格孢A. solani、棒状孢子菌Corynespora cassiicola、博宁炭疽菌Colletotrichum boninese、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、禾谷镰刀菌F. graminearum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense等均分离保藏于亚太地区蚕桑培训中心。
Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、植物总DNA提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，T3 PCR Mix、高纯度低电渗琼脂糖、DL 2000 DNA marker、TS-GelRed核酸凝胶染料、1×TBE速溶颗粒均购于北京擎科生物科技有限公司，电泳仪(Powerpac Basci )采购于伯乐生命医学产品有限公司，PCR仪(A200)采购于杭州朗基科学仪器有限公司，超微分光光度计(NDlife)和全自动数码凝胶成像系统(Tanon-120)采购于广州誉维生物科技仪器有限公司。
1.3 病菌、病样及健康桑树DNA的提取
供试真菌总DNA提取采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒。供试样本总DNA提取采用植物总DNA抽提试剂盒。提取后的DNA用分光光度计测量DNA的浓度，使DNA的D260 nm/D280 nm控制在1.8~2.0，质量浓度为1 ng/μL左右。
1.4 多重PCR引物设计及特异性测定
根据多重PCR的反应原理，采用引物对ITS1/ITS4[21]对新褐斑壳丰孢与膝节霉的核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spacer)进行扩增，拟扩增片段大小为560 bp左右，经比较NCBI数据库中新褐斑壳丰孢与膝节霉的核糖体内转录间隔区序列与2种病原菌的测序结果,使用DNAMAN软件和Primer Premier 5.0软件分别设计特异性引物对HBF6 (5′-GACCTCCAACCCCCTGTG-3′)/HBR6(5′-CGCGACTCTTCAGCGACATA-3′)和LWF2(5′-CCTTTGCACAACCGTATCCC-3′)/LWR2(5′-GACATGCTCCCTGGAGAACC-3′),并通过Primer-BLAST( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)查询引物的具体参数及特异性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以“1.3”中提取的新褐斑壳丰孢与膝节霉DNA为阳性对照，以健康桑叶总DNA 为空白对照，以“1.2”中其他真菌的DNA为阴性对照，进行多重PCR扩增，验证引物的特异性。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。
1.5 多重PCR反应体系优化
多重PCR反应体系为25 µL 扩增体系：T3 PCR Mix 22 µL,引物HBF6/HBR6和LWF2/LWR2各1 μL、DNA模板1 μL。扩增程序：98 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35个循环；72 ℃延伸2 min，于4 ℃保存。取PCR产物在110 V下经过12 g/L 琼脂糖凝胶电泳30 min，用凝胶成像系统拍照观察。
按照T3 PCR Mix试剂盒说明，当引物LWF2/LWR2达到试剂盒使用浓度时（用量1 µL，在25 µL PCR体系中浓度为0.4 mmol/L），电泳结果中已出现明亮条带，因此确定LWF2/LWR2的用量为1 µL。在这基础上，对引物HBF6/HBR6用量进行优化，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL的初始浓度为 10 µmol/L的引物HBF6/HBR6，确定引物最终用量后，将2对引物加入同一体系中，待测病原菌新褐斑壳丰孢与膝节霉的DNA模板各1 μL，进行不同的退火温度(55~65 ℃)(仪器自设)最优条件探究，产物经过12 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据全自动数码凝胶成像系统中条带的亮度选择最优参数。
1.6 多重PCR灵敏度分析
将“1.3”提取的桑褐斑病病原菌新褐斑壳丰孢与桑轮纹病病原菌膝节霉的DNA质量浓度分别梯度稀释为1 000、 100、 10、1、0.1、0.01、0.001 pg/μL，采用“1.5”最佳扩增体系及程序进行扩增，取病原菌新褐斑壳丰孢及膝节霉 DNA模板各1 μL加入同一体系中，根据全自动数码凝胶成像系统中有无目的条带判断该多重PCR的灵敏度。
1.7 多重PCR田间样本检测
对部分收集的田间病样提取总DNA，以健康样本DNA为阴性对照。根据最优的多重PCR反应体系进行PCR扩增，检测45份田间病样DNA是否存在新褐斑壳丰孢与膝节霉。最后根据全自动数码凝胶成像系统中有无目的条带判断其对应的病原菌。
2. 结果与分析
2.1 多重PCR检测的特异性
经过引物筛选，本研究确定了引物组HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2，设计的新褐斑壳丰孢特异引物HBF6/HBR6扩增出的目的片段大小为406 bp(图1A)；膝节霉特异引物LWF2/LWR2扩增出的目的片段大小为248 bp(图1B)，2组引物只对阳性待测菌进行特异性扩增，且条带明亮单一，而空白对照及其他8种阴性对照真菌无法扩增出目的条带，且PCR产物的测序结果与目的基因一致，表明本研究设计的引物HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2具有良好的特异性。
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图 1 HBF6/HBR6 (A) 和LWF2/LWR2 (B)引物特异性检测结果M：DL 2000 marker；1：新褐斑壳丰孢；2：膝节霉；3：致密链格孢；4： 黑链格孢；5：棒状孢子菌；6：博宁炭疽菌；7： 木贼镰刀菌；8：禾谷镰刀菌；9：胶孢炭疽菌；10：暹罗炭疽菌;11：健康桑树Figure 1. The specificity detection results using primer sets HBF6/HBR6 (A) and LWF2/LWR2 (B)M: DL 2000 marker; 1: Neophloeospora maculans; 2: Gonatophragmium triuniae; 3: Alternaria compacta; 4: A. solani; 5: Corynespora cassiicola; 6: Colletotrichum boninese; 7: Fusarium equiseti; 8: F. graminearum; 9: Colletotrichum gloeosporioides; 10: Colletotrichum siamense; 11: Healthy muberry2.2 多重PCR扩增体系的优化与建立
多重PCR扩增体系优化结果显示，引物组HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2在25 µL的反应体系中用量分别为0.6 µL(0.24 mmol/L)和1.0 µL(0.40 mmol/L)时，多重PCR的检测结果最好，条带最亮(图2)。其次，根据引物退火温度的筛选结果(图3)，2组混合引物的最佳退火温度为59 ℃。因此，确定最优的多重PCR反应体系为：T3 PCR Mix 21.7 μL、10 μmol/L 引物HBF6/HBR6各0.6 μL、LWF2/LWR2各1.0 μL、DNA模板1 μL；最佳的扩增程序的退火温度为59 ℃。利用最优条件对2种病原菌DNA进行扩增，当只存在新褐斑壳丰孢N. maculans时，仅检测到1条大小为406 bp的条带；当只存在膝节霉G. triuniae时，仅检测到1条大小为248 bp的条带；当存在2种病原菌的时候可以同时检测到上述2种条带(图4)。表明本研究经优化的多重PCR检测方法可靠。
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图 2 HBF6/HBR6 引物用量筛选结果M：DL 2000 marker; 1~2、3~4、5~6、7~8、9~10的HBF6/HBR6引物用量分别为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 µL; 1~10中LWF2/LWR2引物用量均为1.0 µLFigure 2. HBF6/HBR6 primer dosage test resultsM: DL 2000 marker; The amounts of HBF6/HBR6 primer added in 1−2，3−4，5−6，7−8，9−10 were 1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 µL; The amounts of LWF2/LWR2 primer in 1−10 were all 1.0 µL![]()
图 3 多重PCR退火温度筛选结果Figure 3. Screening results of multiplex PCR annealing temperatureM：DL 2000 marker;1~8: 55.0, 55.5, 56.7, 59.0 , 61.0, 63.3, 64.5, 65.0 ℃![]()
图 4 多重PCR体系对2种病原菌的扩增效果M：DL 2000 marker；1~2：新褐斑壳丰孢； 3~4： 膝节霉； 5~6：新褐斑壳丰孢+膝节霉；7：ddH2OFigure 4. Amplification results of two pathogenic fungus by multiplex PCR systemM:DL 2000 marker; 1−2:Neophloeospora maculans; 3−4: Gonatophragmium triuniae; 5−6: N. maculans and G. triuniae; 7: ddH2O2.3 多重PCR检测的灵敏度
经过“2.2”优化后多重PCR体系检测不同质量浓度的新褐斑壳丰孢与膝节霉混合DNA，结果表明新褐斑壳丰孢与膝节霉DNA最低检测限分别达0.1和1.0 pg/μL(图5)。说明本研究建立的多重PCR体系灵敏度较高，可用于桑轮纹病与褐斑病早期菌量较少时的检测。
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图 5 多重PCR体系对2种病原菌的灵敏度检测结果M：DL 2000 marker；样品中含有等量新褐斑壳丰孢和膝节霉DNA，且1~7中每种病原菌的质量浓度分别为1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001 pg/μLFigure 5. Sensitivity detection results of two pathogenic fungus by multiple PCR systemM: DL 2000 marker; Each sample has equal amounts of Neophloeospora maculans DNA and Gonatophragmium triuniae DNA , and the contents of each pathogenic fungus in 1−7 are 1 000，100，10，1，0.1，0.01 and 0.001 pg/μL, respectively2.4 桑褐斑病及桑轮纹病田间样品的检测结果
采用“2.2”优化的反应体系及程序对所收集的250份田间病样随机抽取45份加以检测，结果(图6、图7)显示，在广东省英德蚕种场与广西隆林县的桑轮纹病病样中均检测到膝节霉，未检测到新褐斑壳丰孢，表明该桑轮纹病样本主要病原菌为膝节霉，未出现2种病原菌复合侵染的情况；而在广西隆林县收集的桑褐斑病病样中，不仅检测到新褐斑壳丰孢，也有部分检测到膝节霉，表明在广西隆林县收集的桑褐斑病病样中有轮纹病病原菌的存在，而在其他地区收集的多份桑褐斑病病样中，唯有陕西石泉县的1份样本和陕西汉阴县的1份样本中检测到2种病原菌，其余的均只检测到新褐斑壳丰孢1种病原菌；部分病样未检测到新褐斑壳丰孢与膝节霉，出现了空白条带，推测可能在取样或DNA的提取过程中未提取到病原菌的DNA，其次，部分桑树真菌病害的特征与桑褐斑病非常相似，导致出现了桑树病害的误判。综上，本研究建立的多重PCR检测方法特异性好、灵敏度高，能应用于桑树褐斑病与桑树轮纹病病原菌的检测。
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图 6 桑树桑轮纹病病原菌的多重PCR检测结果M：DL 2000 marker；1：膝节霉；2：新褐斑壳丰孢；3：膝节霉+新褐斑壳丰孢；4~7：广东省英德桑轮纹病病样；8~11：广西隆林县桑轮纹病病样Figure 6. Multiplex PCR detection results of mulberry ring leaf spot disease pathogenM: DL 2000 marker; 1: Gonatophragmium triuniae; 2: Neophloeospora maculans; 3: G. triuniae and N. maculans; 4−7: Sample with mulberry ring leaf spot disease from Yingde City, Guangdong Province; 8−11: Sample with mulberry ring leaf spot disease from Longlin County, Guangxi![]()
图 7 桑树褐斑病病原菌的多重PCR检测结果M：DL 2000 marker；1：新褐斑壳丰孢；2：膝节霉；3：膝节霉+新褐斑壳丰孢；4~7：广西隆林县桑褐斑病病样；8~12：陕西省石泉县‘强桑1号’褐斑病病样；13~17：陕西省石泉县‘大10’褐斑病病样；18~22：陕西省石泉县‘长果桑’褐斑病病样；23~31：陕西省汉阴县‘强桑1号’褐斑病病样；32~35：云南省永仁县‘强桑1号’褐斑病病样；36~39：云南省永仁县‘农桑14’褐斑病病样；40：健康桑树Figure 7. Multiplex PCR detection results of mulberry brown spot disease pathogenM: DL 2000 marker; 1: Gonatophtagmium triuniae; 2: Neophloeospora maculans; 3: G. triuniae and N. maculans; 4−7: Sample with mulberry brown spot disease from Longlin County, Guangxi; 8−12: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Qiangsang 1’, Shiquan County, Shaanxi Province; 13−17: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Da 10’, Shiquan County, Shaanxi Province; 18−22: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Changguosang’, Shiquan County, Shaanxi Province; 23−31: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Qiangsang 1’, Hanyin County, Shaanxi Province; 32−35: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Qiangsang 1’, Yongren County, Yunnan Province; 36−39: Sample with mulberry brown spot disease from ‘Nongsang 14’, Yongren County, Yunnan Province; 40: Healthy mulberry3. 讨论与结论
桑树轮纹病与桑树褐斑病危害严重，目前鲜见相关病原菌的检测方法，而开发适用于桑树褐斑病与轮纹病病原菌的检测技术，是防控这2种病害的关键。桑树病原菌的检测方法分为传统鉴定法及分子生物学鉴定法，传统的鉴定方法以形态学观察为主，因为观察者的主观臆断易有较大的误差，只能大体判断病原菌的类群。随着分子生物学的发展，多种核酸检测技术得到开发与应用。但多重PCR因具有提高检测通量的优点，而被广泛运用于临床上病原菌和转基因作物的检测。如Egea等[22]基于多重PCR检测技术设计的反应可用于呼吸道感染的急性细菌性脑膜炎病原菌的诊断；邢珍娟等[23]应用多重荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分。不仅如此，多重PCR检测技术也被运用于植物病原检测，杨怡华等[24]建立的巢式多重PCR可以快速检测麦冬2种常见的真菌性病原炭疽菌Colletotrichum liriopes和互隔交链孢菌Alternaria alternata；李明骏等[25]建立了5种玉米病毒的多重PCR检测体系，极大地提高了玉米病毒的检测效率。本研究建立了桑轮纹病与桑褐斑病2种病原菌的多重PCR检测方法，可以通过一步法对2种常见的桑树病原菌进行快速检测，具有良好的可操作性。
本研究分别以膝节霉与新褐斑壳丰孢的ITS序列为靶基因进行了特异性引物设计与筛选，最终确定了HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2引物组合作为桑褐斑病与轮纹病的最终检测引物。通过对2种病原真菌及其他从桑叶上分离真菌的多重PCR检测结果表明，本研究建立的多重PCR检测技术，同时检测2种病原菌新褐斑壳丰孢和膝节霉的DNA检出限分别达0.1和1.0 pg/μL，且非目标菌株以及空白对照都没有检测到特异性扩增，表明本研究建立的桑褐斑病与桑轮纹病多重PCR检测技术具有良好的灵敏度与特异性。本研究优化了其他相关的反应参数与条件，建立了桑轮纹病与桑褐斑病的多重PCR检测技术，可以对2种病原菌进行快速、准确、有效的检测。
本研究建立的多重PCR检测方法整个流程可在4 h内完成，极大地节约了时间和经费开支，并且具有特异性强和灵敏度高的优点，可应用于桑轮纹病与桑褐斑病的准确鉴定。本研究建立的多重 PCR 体系在田间样本实际检测中，检出率达到91.4%，有较高的准确率与可操作性。其次，本研究在对部分症状类似于桑褐斑病与桑轮纹病的病样进行检测时，并未检测到膝节霉与新褐斑壳丰孢，推测部分叶斑状病样的病症虽与褐斑病相似，但是为不同的病原菌侵染所致，已有部分报道验证这一推测，如关于炭疽病的报道[26]。因此，在对桑树褐斑病与轮纹病的检测过程中，需结合其他病原菌的核酸特性，对所检测病害加以分析。总之，本研究建立的膝节霉与新褐斑壳丰孢的检测方法，既可用于桑轮纹病与褐斑病的快速确诊，也可以用于桑园中2种病害早期的病原筛查，具有较强的实用性，为桑树真菌性病害的防控建立了基础。
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图 2 试验过程中猪粪水电导率(κ)的变化
Figure 2. Change of electrical conductivity (κ) of pig slurry during the experiment
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图 3 试验过程中猪粪水化学需氧量(COD)的变化
Figure 3. Change of chemical oxygen demand (COD) of pig slurry during the experiment
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图 4 试验过程中猪粪水NH4+-N含量的变化
Figure 4. Change of ammonium N content of pig slurry during the experiment
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图 5 试验过程中NO3−-N含量的变化
Figure 5. Change of nitrate N content of pig slurry during the experiment
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图 6 试验过程中总氮(TN)含量的变化
Figure 6. Change of total nitrogen (TN) content of pig slurry during the experiment
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图 7 猪粪水贮存过程对种子发芽率的影响
各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 7. Effect of storage process of pig slurry on seed germination rate
In each figure, different lowercase letters on the bars of the same time indicate significant differences among different treatments(P<0.05, Duncan’s method)
表 1 贮存前后猪粪水中氮素形态占比变化1)
Table 1 Changes of nitrogen form percentage in pig slurry obtained before and after storage
季节
Season处理
Treatment贮存前占比/%
Percentage before storage贮存后占比/%
Percentage after storage氮素损失率/%
Nitrogen
loss rateNH4+-N NO3−-N NH4+-N +
NO3−-NNH4+-N NO3−-N NH4+-N +
NO3−-N秋季
Autumn敞口
Open43.64±1.50 10.62±0.57 54.26±1.29b 63.63±2.21 30.03±1.25 93.66±1.99a 79.44±2.19a 密封
Sealed41.23±1.88 10.57±0.29 51.80±1.56b 75.98±2.91 4.81±0.28 80.79±2.10c 43.30±2.66c 冬季
Winter敞口
Open42.70±2.05 30.05±1.34 72.75±1.82a 38.34±0.91 26.38±0.84 64.72±0.89d 52.60±2.91b 密封
Sealed38.78±2.05 29.17±0.66 67.95±1.16a 76.65±0.95 10.59±0.44 87.24±0.85b 31.30±1.48d 1) 表中数据为平均值±标准误，n=3；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Data in table are means ±SE, n=3; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method )
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表 2 猪粪水贮存过程中重金属含量变化1)
Table 2 Changes of heavy metal contents during the storage process of pig slurry
ρ/(mg·L−1) 季节
Season处理
TreatmentAs Zn 0 d 60 d 120 d 180 d GB 5084—
20210 d 60 d 120 d 180 d GB 5084—
2021秋季
Autumn敞口
Open0.05±0.00a 0.03±0.00ab 0.04±0.00a 0.04±0.00a ≤0.05 12.58±0.81c 6.68±0.25c 5.53±0.12c 3.28±0.16c ≤2.00 密封
Sealed0.03±0.00b 0.04±0.00a 0.04±0.00a — 14.28±0.66b 4.58±0.08d 2.58±0.03d 2.53±0.11d 冬季
Winter敞口
Open0.03±0.00c 0.02±0.00c 0.02±0.00c 0.01±0.00c 52.93±4.47a 48.53±3.37a 16.83±1.01a 10.93±0.62a 密封
Sealed0.03±0.00c 0.03±0.00b 0.03±0.00b 0.02±0.00b 48.63±2.90a 23.73±1.66b 8.93±0.34b 6.03±0.23b
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季节
Season处理
TreatmentCu Pb Cd 0 d 120 d 180 d GB 5084—
20210 d 120 d GB 5084—
20210 d 120 d GB 5084—
2021秋季
Autumn敞口
Open2.76±0.19bc 2.01±0.02a 0.56±0.02c ≤0.50 0.11±0.01a — ≤0.20 0.05±0.00 — ≤0.01 密封
Sealed2.42±0.21c 1.93±0.13ab 0.63±0.01b 0.11±0.03a — 0.04±0.00 — 冬季
Winter敞口
Open3.03±0.07b 1.68±0.11b 1.04±0.11a 0.08±0.00b — — — 密封
Sealed3.61±0.16a 0.58±0.01c 0.39±0.01d 0.10±0.01 a 0.02±0.00 — — 1)表中数据为平均值±标准误，n=3；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)；“—”表示未检测到
1) Data in table are means ±SE, n=3; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method); “—” indicates not detected
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[1] 国家统计局. 中国统计年鉴: 2021[M]. 北京: 中国统计出版社, 2021. [2] 徐鹏翔, 沈玉君, 丁京涛, 等. 规模化养猪场粪污全量收集及贮存工艺设计[J]. 农业工程学报, 2020, 36(9): 255-262. [3] 国务院办公厅. 国务院办公厅关于加快推进畜禽养殖废弃物资源化利用的意见: 国办发〔2017〕48号[A/OL]. (2017-05-12)[2021-08-13]. https://huanbao.bjx.com.cn/news/20170613/830752.shtml. [4] 农业部. 农业部关于印发《畜禽粪污资源化利用行动方案(2017—2020年)》的通知[A/OL]. (2017-07-07)[2021-08-13]. http://www.moa.gov.cn/nybgb/2017/dbq/201801/t20180103_6134011.htm. [5] 全国畜牧总站, 中国饲料工业协会, 国家畜禽养殖废弃物资源化利用科技创新联盟. 畜禽养殖废弃物资源化利用主推技术模式[N]. 农民日报, 2017-12-6(6). [6] 孔凡克, 鞠鑫鑫, 杨守军, 等. 种养结合技术在畜禽粪水处理与资源化利用中的应用[J]. 猪业科学, 2017, 34(8): 106-107. doi: 10.3969/j.issn.1673-5358.2017.08.035 [7] 张朋月, 丁京涛, 孟海波, 等. 牛粪水酸化贮存过程中氮形态转化的特性研究[J]. 农业工程学报, 2020, 36(8): 212-218. [8] 马艳茹, 孟海波, 沈玉君, 等. 粪水酸化储存还田应用效果[J]. 农业工程学报, 2020, 36(15): 245-251. doi: 10.11975/j.issn.1002-6819.2020.15.030 [9] MANSYUR M, CHOI H L. Changes of physico–chemical properties of pig slurry during storage[J]. Media Peternakan, 2011, 34(3): 179-183. doi: 10.5398/medpet.2011.34.3.179
[10] 姜晨润, 孙靖博, 李华, 等. 规模化养猪场粪便贮存方式及土壤承载力[J]. 农业工程, 2019, 9(1): 35-37. [11] 丁京涛, 张朋月, 赵立欣, 等. 养殖粪水长期贮存过程理化特性变化规律[J]. 农业工程学报, 2020, 36(14): 220-225. [12] 朱海生, 董红敏, 栾冬梅, 等. 贮存高度和锯末覆盖厚度对猪粪NH3和温室气体排放量及其增温潜势的影响[J]. 农业环境科学学报, 2019, 38(4): 937-943. [13] XUE S K, CHEN S, HERMANSON R E. Wheat straw cover for reducing ammonia and hydrogen sulfide emissions from dairy manure storage[J]. Transactions of the ASAE, 1999, 42(4): 1095-1102. doi: 10.13031/2013.13257
[14] VANDERZAAG A C, GORDON R J, GLASS V M, et al. Floating covers to reduce gas emissions from liquid manure storages: A review[J]. Applied Engineering in Agriculture, 2008, 24(5): 657-671. doi: 10.13031/2013.25273
[15] PAIN B F, MISSELBROOK T H, REES Y J. Effects of nitrification inhibitor and acid addition to cattle slurry on nitrogen losses and herbage yields[J]. Grass and Forage Science, 1994, 49(2): 209-215. doi: 10.1111/j.1365-2494.1994.tb01994.x
[16] SIMS J T, LUKA-MCCAFFERTY N J. On-farm evaluation of aluminum sulfate (alum) as a poultry litter amendment: Effect on litter properties[J]. Journal of Environmental Quality, 2002, 31(6): 2066-2073. doi: 10.2134/jeq2002.2066
[17] SØRENSEN P, ERIKSEN J. Effects of slurry acidification with sulphuric acid combined with aeration on the turnover and plant availability of nitrogen[J]. Agriculture Ecosystems & Environment, 2009, 131(3/4): 240-246.
[18] PEREIRA J L S, FIGUEIREDO V, PINTO A F M A P, et al. Effects of biochar and clinoptilolite on composition and gaseous emissions during the storage of separated liquid fraction of pig slurry[J/OL]. Applied Sciences, 2020, 10(16): 5652. [2021-09-20]. https://doi.org/10.3390/app10165652
[19] 刘美玲. 生物炭与菌剂对猪粪氨气、甲烷和氧化亚氮排放的影响[D]. 保定: 河北农业大学, 2020. [20] 靳红梅, 付广青, 常志州, 等. 猪、牛粪厌氧发酵中氮素形态转化及其在沼液和沼渣中的分布[J]. 农业工程学报, 2012, 28(21): 208-214. [21] 生态环境部. 国家市场监督管理总局. 农田灌溉水质标准: GB 5084—2021[S]. 北京: 生态环境部, 2021. [22] POPOVIC O, JENSEN L S. Storage temperature affects distribution of carbon, VFA, ammonia, phosphorus, copper and zinc in raw pig slurry and its separated liquid fraction[J]. Water Research, 2012, 46(12): 3849-3858. doi: 10.1016/j.watres.2012.04.020
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1. 张兴楠，罗龙辉，黄裕鑫，刘吉平. 桑褐斑病病原菌的分离鉴定及高通量测序分析. 蚕业科学. 2024(01): 9-16 . 
百度学术
2. 胡昌雄，杨伟克，刘增虎，李涛，李琼艳，范永慧，董占鹏. 桑蓟马种群动态及异色瓢虫对其的捕食功能反应. 蚕业科学. 2023(03): 225-233 . 百度学术
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