Effects of astragalus polysaccharide and astragaloside IV on lipopolysaccharides-induced inflammation of bovine mammary epithelial cells
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摘要:目的
考察黄芪提取物黄芪甲苷(Astragalus IV，AS-Ⅳ)及黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)干预对脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells，BMECs)炎症的作用及对炎症细胞中β–酪蛋白表达的影响。
方法使用APS、AS-Ⅳ干预LPS诱导的BMECs，检测细胞炎症因子、氧化因子、凋亡因子、β–酪蛋白的变化。
结果CCK-8筛选发现，1 g/L APS及50、75、100 mg/L AS-Ⅳ为刺激BMECs的最适质量浓度，0.5 mg/L LPS刺激BMECs 24 h后成功建立炎症细胞模型。AS-Ⅳ、APS可显著抑制炎症细胞中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的表达，缓解炎症状态下细胞膜的持续损伤；显著抑制炎症细胞中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的表达，缓解细胞的氧化损伤；显著抑制炎症细胞中IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子的表达，降低细胞的炎症反应；显著抑制炎症细胞中凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡；显著激活BMECs炎症细胞及正常细胞中β–酪蛋白，显著抑制TGF-β和ERK1/2的表达。
结论使用最适浓度的AS-Ⅳ、APS可抑制LPS诱导的BMECs炎症反应，激活炎症细胞中β–酪蛋白的表达。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of astragaloside IV (AS-IV) and astragalus polysaccharides (APS) of astragalus extract on the lipopolysaccharides (LPS)-induced inflammation of bovine mammary epithelial cells (BMECs) and the effect on the expression of β-casein in inflammatory cells.
MethodAPS and AS-IV were used to intervene LPS-induced BMECs to detect the changes of cell inflammatory factors, oxidative factors, apoptosis factors and β-casein.
ResultCCK-8 screening found the concentrations of 1g/L APS and 50, 75, 100 mg/L AS-IV were optimal to stimulate BMECs. After stimulating BMECs with 0.5 mg/L LPS for 24 h, the inflammatory cell model was successfully established. Experiments found that AS-IV and APS could significantly inhibit the expression of lactate dehydrogenase (LDH) in inflammatory cells and alleviate the continuous damage of cell membranes in the inflammatory state; Significantly inhibit the expression of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) in inflammatory cells and alleviate the oxidative damage of cells; Significantly inhibit the expression of IL-6, IL-8, TNF-α inflammatory factors in inflammatory cells, and reduce the inflammatory response of cells; Significantly inhibit the expression of apoptotic proteins in inflammatory cells and inhibit cell apoptosis; Significantly activate β-casein in BMECs inflammatory cells and normal cells, and inhibit the expression of TGF-β and ERK1/2.
ConclusionAS-IV and APS can inhibit the inflammatory response of BMECs induced by LPS and activate the expression of β-casein in inflammatory cells at the optimal concentrations.
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Keywords:
- Astragalus polysaccharide /
- Astragaloside IV /
- Inflammation /
- Bovine /
- Mastitis /
- Epithelial cell /
- β-casein
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当前全球环境经历着巨大变化，气候变暖、氮沉降和降雨带北移等显著改变了植物的分布及生理生态特性[1]。作为全球变化的重要组分，外来生物入侵对生态环境、经济建设及生物多样性造成了严重威胁[2]。全球环境变化增加了资源波动程度及生境片断化，为外来植物的入侵扩散提供了有利条件[3]。入侵植物对环境变化响应强烈，其可通过提高长势和形态可塑性等方式维持入侵优势[4]。升温导致马缨丹Lantana camara降低了对地下生物量的分配，提高了对叶片等光合器官的投资[5]；氮添加显著增加了瘤突苍耳Xanthium strumarium的生物量、叶绿素含量及蒸腾速率[6]；增温和施氮的交互效应提升了入侵植物加拿大一枝黄花Solidago canadensis的叶面积和叶绿素含量，显著增强其叶片获取资源的能力[7]；降雨增加导致的水位波动显著提升了粉绿狐尾藻Myriophyllum aquaticum的形态可塑性，有助于其对本土水生植物的竞争替代[8]。
入侵植物通常还具备强大的次生代谢防御能力，如合成单宁、黄酮、多酚和花青素等化学物质；次生代谢是入侵植物在入侵地中与生物、非生物环境相互作用的结果，对于其提高种间竞争力及生态适应性具有重要作用[9-10]。沈文燕等[11]发现，外界高硫环境导致互花米草Spartina alterniflora 体内花青素含量明显升高；五爪金龙Ipomoea cairica体内总黄酮含量与光照强度及本土植物竞争程度呈显著正相关[12]；研究发现，入侵中国的美洲商陆Phytolacca americana体内皂苷含量和入侵美国的乌桕Sapium sebiferum体内单宁及类黄酮含量均随纬度上升而增加，且乌桕在高纬度地区相对减少了用于防御生物压力的单宁的分泌，增加了用于抵抗无机环境胁迫的类黄酮的分泌[13-14]。Huang 等[15]发现，乌桕入侵地种群用以防御专食性昆虫的单宁含量显著低于原产地种群，且咀嚼式昆虫能够增加入侵地种群的总酚、单宁和黄酮含量。深入探讨入侵植物生理特性与异质生境之间的关系对于阐明生物入侵机制及预测全球变化下的入侵态势具有重要意义。
空心莲子草Alternanthera philoxeroides为苋科莲子草属杂草，原产于南美洲，由于其具有强大的生态可塑性、水陆两栖性及克隆生殖能力，已广泛入侵中国南北方20余省，给经济建设和生态系统稳定性造成了巨大危害[16]。前人研究表明，目前中国境内空心莲子草的分布北界为37°N，气候变暖和氮沉降显著提升了空心莲子草的可塑性及竞争力，其还可与土壤微生物互作以削弱本土群落的生物抗性[17-18]。部分学者还发现陆生环境中空心莲子草的单宁和总酚含量显著高于水陆两栖生境的[19]；光氧化胁迫下，空心莲子草叶绿素、总酚和类黄酮含量均高于本土种刺花莲子草A. pungens[20]；南方菟丝子Cuscuta australis寄生显著增加了空心莲子草的单宁、总酚和皂苷等防御性物质含量[21]。但关于大空间尺度上空心莲子草生理特性对多重环境的响应鲜见报道。本研究拟在大纬度梯度范围内开展野外调查，详细探讨生物及非生物因素对水、陆两境空心莲子草生长和防御等方面生理特性的影响，以期为其入侵防治提供依据。
1. 材料与方法
1.1 野外调查
于2019、2020年的7—8月植物生长旺季，对中国北纬21°~37°范围内的空心莲子草入侵植物群落进行野外调查。沿着每2个纬度梯度，在空心莲子草种群连续入侵面积>100 m2的区域设置样地。共设置8条纬度带，每条纬度带选取4~5个陆生调查样地，并在同纬度带生境条件较为一致的区域设置4~5个水生调查样地。共计设置72个样地(陆生36个，水生36个)，每个样地的面积为10 m×10 m，间隔10 km以上。样地所在研究区涵盖了中国南北方的10省17市，横跨热带、亚热带和暖温带等3大气候区。样地所属的17个城市的年均气温、年均降雨量与纬度共变关系如图1所示。
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图 1 研究区样地所属城市的纬度−气温和纬度−降雨量拟合关系Figure 1. Fitting relationships between the latitude and temperature, precipitation of sampling cities调查时，在各样地中央均匀布设3条10 m长的样带，每条样带上再均匀设置5个面积为0.5 m×0.5 m的样方，按照草本群落调查方法[16]详细记录每个样方中植物的物种名称、高度、盖度和多度。对于少数水库、河流等水位较深的生境，为方便调查，选取靠近岸边的水生型空心莲子草毯状斑块，沿水平方向连续设置3条10 m长的样带进行调查。植物调查结束后，随机选择1条样带使用可伸缩式捕虫网(直径长30 cm，网深度60 cm)横扫10网(来回扫1次算1网)，将捕获的昆虫装进昆虫瓶带回实验室后进行物种鉴定。最后，沿各样地的任意1条对角线均匀设置3个取样点，采集0~20 cm土层土壤样品约250 g，装进自封袋，置于车载冰箱(Mobicool CF-50DC，德国)冷藏保存，及时带回实验室。
1.2 指标测定
每个样地中随机选择5个样方，以手持式植物多酚−叶绿素测量仪(Dualex，法国)随机测定每个样方中5片空心莲子草叶片的氮平衡指数(Nitrogen balance index, NBI)、叶绿素指数(Chlorophyll index, Chla)、类黄酮指数(Flavonoid index, Flav)和花青素指数(Anthocyanin index, Anth)，最后取平均值。
利用手持式GPS定位仪(Garmin eTrex20，美国)测量各样地所在生境的经度、纬度和海拔数据。将土壤样品自然晾干磨碎后，过20目筛，利用全自动化学分析仪(Easychem Plus，意大利)测定土壤中铵态氮和硝态氮含量。对于水生样地，利用YSI便携式水质分析仪(Professional Plus，美国)测量水体中的铵态氮和硝态氮含量。测量前使用标准液对YSI分析仪探头进行校准，然后将连接电缆线的探头置于水面下约10 cm处，待主机显示屏上的数据稳定读数。在中央气象台国家气象中心( http://www.nmc.cn)在线信息库中获取样地所在城市近50年以来的年均气温及年均降雨量等数据。
根据野外采集的昆虫标本统计各样地昆虫丰富度和专食性生防昆虫莲草直胸跳甲数量；根据野外调查的植物指标分别计算植物重要值及各样地的α−物种多样性指数。
1.3 数据计算
植物重要值=(相对高度+相对盖度+相对多度)/3。
Patrick 丰富度指数(R)、Shannon-Wiener 多样性指数(H)、Simpson 多样性指数(λ)和Pielou均匀度指数(E)的计算公式[22]如下：
R =S，
H =−
$\displaystyle \sum {} $ Pi × lnPi，λ = 1−
$\displaystyle \sum {} $ Pi2，E = H/ lnS，
式中，S 为样地内所有植物的物种数，Pi为第i种植物的相对重要值。
1.4 统计分析
使用SPSS 16.0软件(SPSS Inc，美国)对各样地的7项非生物因子(经度、纬度、海拔、铵态氮含量、硝态氮含量、年均气温、年均降雨量)和6项生物因子(昆虫丰富度、莲草直胸跳甲数量、植物群落的Patrick指数、Shannon-Wiener指数、Simpson指数和Pielou指数)分别与空心莲子草的4项生理指标(NBI、Chla、Flav和Anth)进行单因素回归分析，以软件提供的11种曲线方程建立模型，选择回归显著且拟合系数最高者进行讨论。对水、陆两境空心莲子草各自的4项生理指标进行独立样本t检验。
为了探讨多重因子对空心莲子草生理特性的综合效应，在水、陆两境样地中分别建立36×7的非生物因子矩阵、36×6的生物因子矩阵和36×4的植物生理指标矩阵。使用Canoco 4.5软件(Microsoft，美国)对2种生境中空心莲子草4项生理指标沿生物、非生物环境梯度的分布进行典范对应分析(Canonical correspondence analysis，CCA)，并利用基于499次置换的 Monte Carlo检验判断各环境因子与CCA排序轴的显著性。
2. 结果与分析
2.1 环境与陆生型空心莲子草生理指标的回归分析
独立样本t检验结果表明，水、陆2种生境空心莲子草各自的NBI、Chla、Flav和Anth之间均无显著性差异。陆生型空心莲子草4项生理指标与各因子的回归分析如图2所示，Chla与经度之间具有显著的二项式拟合关系(P=0.049)，其随经度上升而增加。Flav与纬度(P=0.042)和经度(P=0.003)之间均具有显著的生长函数拟合关系，其随纬度、经度的上升而增加；Flav与年均降雨量(P=0.014)、Patrick丰富度指数(P=0.037)之间分别具有显著的线性和对数函数拟合关系，其随年均降雨量、Patrick指数的上升而下降；Flav与昆虫丰富度之间具有显著的二项式拟合关系(P=0.040)，其随昆虫丰富度增加呈现“先上升−后下降”趋势。陆生型空心莲子草的NBI、Anth与所有异质性环境因子之间均无显著性关系。
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图 2 陆生型空心莲子草生理指标与环境因子的回归拟合Figure 2. Regression fittings between physiological indexes of terrestrial Alternanthera philoxeroides and environmental factors2.2 环境与水生型空心莲子草生理指标的回归分析
回归分析结果表明(图3)，水生型空心莲子草的Chla与水体硝态氮之间具有显著的复合函数拟合关系(P=0.037)，其随硝态氮的增加而上升。Flav与纬度、年均降雨量之间分别具有显著的二项式(P=0.039)和反函数(P=0.028)拟合关系，整体而言，水生型空心莲子草的Flav随纬度上升而增加、随年均降雨量增加而下降，这与陆生型空心莲子草Flav变化趋势基本相一致。Anth与纬度、年均温之间分别具有显著的S型曲线函数(P=0.012)和生长函数(P=0.008)拟合关系，其随纬度上升而下降、随年均温上升而增加；Anth与Pielou均匀度指数之间具有显著的三项式拟合关系(P=0.016)，其随Pielou指数的增加呈明显波动趋势。
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图 3 水生型空心莲子草生理指标与环境因子的回归拟合Figure 3. Regression fittings between physiological indexes of aquatic Alternanthera philoxeroides and environmental factors2.3 陆生型空心莲子草生理指标沿着环境梯度的CCA排序
陆生型空心莲子草−非生物因子CCA排序结果如图4a所示，前2个排序轴累计包含了99.9%的生态信息(第1轴92.8%，第2轴7.1%)，第1轴起到决定性作用。由表1和图4a可知，决定第1轴的主导性非生物因子为海拔；除了铵态氮含量之外，其余的非生物因子均对CCA第2轴产生了显著影响。Chla、NBI和Flav均位于排序图中心位置，表明它们在中等梯度环境条件下具有最大值；Anth偏离环境矢量连线距离较远，说明其基本不受非生物因子的影响。
表 1 陆生环境因子与CCA排序轴的相关性分析1)Table 1. Correlation analysis of terrestrial environmental factors and CCA axis环境因子 Environmental factor CCA第1轴 CCA axis 1 CCA第2轴 CCA axis 2 纬度 Latitude −0.161 −0.667** 经度 Longitude 0.148 −0.787** 海拔 Elevation 0.503** 0.516** 铵态氮含量 Ammonium nitrogen content −0.255 −0.047 硝态氮含量 Nitrate nitrogen content −0.041 0.494** 年均气温 Annual mean air temperature 0.087 0.595** 年均降雨量 Annual mean precipitation 0.010 0.745** 莲草直胸跳甲数量 Abundance of Agasicles hygrophila 0.041 −0.037 昆虫丰富度 Insect richness −0.671** 0.396* Patrick丰富度指数 Patrick richness index −0.214 −0.607** Shannon-Wiener多样性指数 Shannon-Wiener diversity index 0.225 −0.405* Simpson多样性指数 Simpson diversity index 0.405* −0.013 Pielou均匀度指数 Pielou evenness index 0.705** 0.107 1) “*”“**”分别表示在0.05，0.01水平显著相关
1) “*” and “**” represent significant correlations at 0.05 and 0.01 levels, respectively![]()
图 4 陆生型空心莲子草生理指标与环境因子的CCA排序环境矢量箭头的方向代表其与排序轴的正负相关性；环境矢量连线越长、与排序轴间的夹角越小，则说明该环境因子的主导性越强；表征各生理指标的圆圈与环境矢量连线的垂直距离越短，表示两者相关性越大Figure 4. CCA ordination of physiological indexes of terrestrial Alternanthera philoxeroides and environmental factorsDirection of environment vector arrow represents its positive or negative correlation with CCA axis; The longer the environment vector and the smaller angle between vector and axis, the stronger the dominance of environment factor; The shorter the vertical distance between the circle and vector, the greater the correlation between certain plant physiological index and environment factor陆生型空心莲子草−生物因子CCA排序结果如图4b所示，前2个排序轴累计包含100%的生态信息(第1轴79.2%，第2轴21.8%)，第1轴起到决定性作用。由表1和图4b可知，第1轴的主导性生物因子依次为Pielou均匀度指数、昆虫丰富度和Simpson多样性指数，第2轴的主导性生物因子为Patrick丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数和昆虫丰富度。Chla和NBI位于中心位置，表明它们在中等水平的植物多样性及昆虫丰富度环境中具有最大值。Flav与昆虫丰富度具有一定正向关系、与Patrick丰富度指数和 Shannon-Wiener多样性指数具有较大负向关系，这与回归分析的结果基本吻合。Anth与Pielou均匀度指数和Simpson多样性指数具有较大负向关系。
2.4 水生型空心莲子草生理指标沿着环境梯度的CCA排序
水生型空心莲子草−非生物因子CCA排序结果如图5a所示，前2个排序轴累计包含99.2%的生态信息(第1轴54.8%，第2轴44.4%)，第1轴的作用较大。由表2和图5a可知，决定第1轴的主导性非生物因子为海拔，这与陆生型的CCA排序结果相一致；第2轴的主导性非生物因子为纬度、年均气温和年均降雨量。Flav与纬度具有较大正向关系、与降雨量具有较大负向关系，这与水、陆两境的回归分析结果均高度一致。NBI与海拔具有极强的负向关系。Chla在中等环境梯度下具有最大值，Anth受非生物因子的影响很弱。
表 2 水生环境因子与CCA排序轴的相关性分析1)Table 2. Correlation analysis of aquatic environmental factors and CCA axis环境因子 Environmental factor CCA第1轴 CCA axis 1 CCA第2轴 CCA axis 2 纬度 Latitude −0.071 −0.713** 经度 Longitude −0.296 −0.170 海拔 Elevation −0.363* 0.003 铵态氮含量 Ammonium content −0.102 −0.104 硝态氮含量 Nitrate nitrogen content −0.193 0.223 年均气温 Annual mean air temperature −0.040 0.684** 年均降雨量 Annual mean precipitation 0.095 0.595** 莲草直胸跳甲数量 Abundance of Agasicles hygrophila −0.443** 0.140 昆虫丰富度 Insect richness −0.471** 0.172 Patrick丰富度指数 Patrick richness index 0.298 −0.618** Shannon-Wiener多样性指数 Shannon-Wiener diversity index 0.050 −0.479** Simpson多样性指数 Simpson diversity index −0.334* −0.496** Pielou均匀度指数 Pielou evenness index −0.349* 0.270 1) “*”“**”分别表示在0.05和0.01水平显著相关
1) “*” and “**” represent significant correlations at 0.05 and 0.01 levels, respectively![]()
图 5 水生型空心莲子草生理指标与环境因子的CCA排序Figure 5. CCA ordination of physiological indexes of aquatic Alternanthera philoxeroides and environmental factors水生型空心莲子草−生物因子CCA排序结果如图5b所示，前2轴累计包含96.7%的生态信息(第1轴62.1%，第2轴34.6%)，第1轴起到决定性作用。由表2和图5b可知，决定第1轴的主导性生物因子依次为昆虫丰富度、莲草直胸跳甲数量、Pielou均匀度指数和Simpson多样性指数；第2轴的主导性生物因子为Patrick丰富度指数、Simpson多样性指数和Shannon-Wiener多样性指数。Flav与Pielou均匀度指数呈较大正向关系、与Patrick丰富度指数和Shannon-Wiener多样性指数呈极强负向关系；NBI与Pielou均匀度指数、昆虫丰富度、莲草直胸跳甲数量呈极强负向关系、与Patrick丰富度指数和Shannon-Wiener多样性指数具有较大正向关系。Chla在中等环境梯度下具有最大值，Anth基本不受生物因子的影响。
3. 讨论与结论
次生代谢产物是植物迅速适应异质环境的物质基础，入侵植物自身生长与防御功能之间存在此消彼长的权衡关系，二者均与环境密切相关[23]。类黄酮是一类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，具有很强的抗菌、抗虫和清除自由基等作用，可显著提升植物的抗逆性及自我防御能力[24]。回归分析及CCA均表明，水、陆2种生境空心莲子草的Flav与纬度呈正向关系、与降雨量呈负向关系，这是由于温度、降雨量等均随纬度升高而降低，空心莲子草在高纬度地区受到多种非生物胁迫导致其Flav增加；与本研究类似，前人发现欧洲刺柏Juniperus communis、笃斯越桔Vaccinium uliginosum和乌桕等植物的类黄酮含量也均随纬度升高而增加[14, 25-26]。在低降雨量环境中，干旱胁迫诱导植物利用过剩的光合产物(如：NADPH和磷酸丙糖等)合成类黄酮以减缓生境含水量过低对其生长造成的损伤，而当降雨量逐渐升高时，植物体内类黄酮合成关键酶的活性下降使得其Flav降低[27-28]。
CCA中，水、陆两境空心莲子草的Flav均与Patrick指数和Shannon指数呈负向关系，是由于植物多样性增加为群落中昆虫提供了更广泛的食物来源，或有助于形成生物防治的“非靶标效应”，降低了昆虫对空心莲子草的取食压力[18, 29]，使得空心莲子草体内化学防御物质类黄酮含量降低。水生Flav还与Pielou指数、昆虫丰富度和莲草直胸跳甲数量呈正向关系，是因为群落中植物分布越均匀，则其对外来植物入侵的抗性越大[30]，且水生型空心莲子草茎秆的髓部薄壁细胞较薄，莲草直胸跳甲的化蛹率更高[31]，水生型空心莲子草为应对更大强度的种间竞争和昆虫取食压力而增加其Flav。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起到核心作用。而氮素是叶绿素的重要组成部分，也是限制植物光合作用的大量营养元素。回归分析表明，陆生和水生型空心莲子草的Chla分别与经度、硝态氮含量具有显著正向关系。一方面，中国植物多样性随经度增加明显上升，入侵植物为了应对更强的种间竞争而将更多氮素分配至光合器官，通过合成大量叶绿素以提高其光合效能[32]；另一方面，中国境内降雨量随经度上升呈增加趋势，生境水分含量上升可使植物体内抗旱性物质(如：游离脯氨酸等)含量降低而叶绿素含量增加[33]，且水分对陆生植物生长的限制性作用大于水生植物，使得陆生空心莲子草的Chla随经度上升而显著增加。外源环境中植物可吸收的无机氮主要为硝态氮和铵态氮，其中，硝态氮可显著促进植物生长，特别是增加其地上生物量及叶绿素含量；而较高浓度的铵态氮则会削弱植物对于碱性离子的摄取从而降低阳离子吸附能力，使得线粒体电子传递链与氧化磷酸化解偶联，对植物产生毒害作用[34]。此外，水体连通性使得水域生态系统中氮素营养的循环与扩散速率高于陆生生境[35]，故水生型空心莲子草的Chla随硝态氮含量上升而增加。
花青素是广泛分布于植物体内的水溶性糖苷衍生物，其在植物抵御外源非生物胁迫(如紫外线辐射)和生物胁迫(如病虫害)中起到重要作用[27]。回归分析中，水生型空心莲子草的Anth与纬度呈负向关系、与年均温呈正向关系。纬度是影响植物次生代谢物的重要地理因素之一，低纬度的空心莲子草具有较高花青素含量，可能是由于低纬度地区的紫外辐射强度更大，花青素含量的提高可有效清除细胞内活性氧，缓解紫外胁迫造成的氧化损伤[36]，且低纬度植食性动物较高纬度地区对植物施加了更大压力[37]。前人研究认为，低温可促进多种蔬菜和花卉的花青素积累，高温则会加速花青素的降解[38]；但入侵种空心莲子草原产于南美洲热带地区，具有较高的嗜热性[16]，故其Anth随年均气温上升而增加，这或使得水生型空心莲子草在低纬度的高温地区比本土植物具有更高的化学防御水平。CCA中，陆生型空心莲子草的Anth与Pielou指数和Simpson指数呈负向关系，可能由于陆生植物多样性的大幅增加显著削弱了空心莲子草的防御能力。
氮平衡指数是重要的胁迫荧光参数，其为叶绿素和类黄酮的比值，反映了植物的长势[39]。CCA中，水生空心莲子草NBI与Pielou指数、昆虫丰富度和莲草直胸跳甲数量呈负向关系、与Patrick指数和Shannon指数呈正向关系，这与其Flav在CCA中的排列呈完全相反的格局，表明水生型空心莲子草的生长和防御之间具有明显的权衡关系。当种间竞争作用加剧或昆虫数量增多时，水生型空心莲子草优先将资源用于合成类黄酮而相应降低其生物量积累。高芳磊等[19]、郭素民等[21]也发现模拟昆虫取食和南方菟丝子寄生会诱导空心莲子草的生长−防御权衡策略。此外，CCA中水生型空心莲子草的NBI还与海拔具有较大负向关系，是由于高海拔的低温和紫外线辐射等逆境条件加剧了入侵植物对其化学防御能力的投资而相应降低了长势[40]。本研究中，Chla的CCA排序与回归分析结果不相一致，可能是由于大空间尺度上生物、非生物因子之间产生了显著的交互作用或共变效应，使得Chla在中等水平的多重环境梯度下具有最大值。此外，相较于水生生境，陆生型空心莲子草的“生长−防御”权衡关系受外源环境的影响程度较弱，表明其入侵力可能具有较高的内稳性。
本研究表明，入侵植物空心莲子草的“生长−防御”生理特性在大空间尺度上受到异质性环境因子的显著影响。经度、水体硝态氮含量影响空心莲子草的生理生长特性；纬度、降雨量、年均气温和植物多样性影响空心莲子草的化学防御特性；而植物多样性、昆虫发生量使得水生型空心莲子草的生长与防御之间具有明显权衡关系。关于陆生型空心莲子草“生长−防御”权衡策略的内稳性机制有待进一步研究验证。
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图 1 不同LPS质量浓度和作用时间下BMECs生物学活性
Figure 1. BMECs bioactivities under different concentrations and action time of LPS
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图 2 不同LPS质量浓度对BMECs炎症因子基因表达的影响
“**”表示处理与对照在P<0.01水平差异显著(t检验)
Figure 2. Effects of different LPS concentrations on the gene expression of inflammatory factor in BMECs
“**” indicates significant difference at P<0.01 level between the treatment and control (t test)
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图 3 不同质量浓度LPS刺激的BMECs细胞形态(a)及细胞核形态(b)变化
Figure 3. Cell morphology (a) and nuclear morphology (b) changes of BMECs stimulated by different concentrations of LPS
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图 4 AS-IV、APS、青霉素、林可霉素对BMECs存活率的影响
“*”和“**”分别表示处理与对照在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 4. Effects of AS-IV, APS, penicillin and lincomycin on the viabilities of BMECs
“*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively between the treatment and control (t test)
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图 5 AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs损伤的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ；“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 5. Effects of AS-IV and APS interference on LPS damaging BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively (t test)
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图 6 AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs中炎症因子基因相对表达量的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ；“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 6. Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating relative expression of inflammatory factor genes in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+ethanol (φ=1%), G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively (t test)
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图 7 AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs炎症因子表达量的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+乙醇(φ为1%)，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ；“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 7. Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating the expression of inflammatory factors in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+ethanol (φ=1%), G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively(t test)
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图 8 AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs凋亡因子mRNA相对表达量的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/LAPS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ；“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 8. Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating relative expression of apoptosis factor mRNA in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol , G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively(t tset)
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图 9 AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs凋亡蛋白表达的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ
Figure 9. Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating expression of apoptotic protein in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol, G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ
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图 10 AS-IV、APS干预LPS对BMECs凋亡蛋白表达量的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ；“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 10. Effect of AS-IV and APS intervention on LPS affecting expression of apoptotic protein in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol , G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively(t test)
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图 11 AS-IV和APS对BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、CSN2 相对表达量的影响
“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 11. Effects of AS-IV and APS on relative expression level of TGF-β, ERK1/2 and CSN2 in BMECs
“*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively(t test)
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图 12 AS-IV和APS对BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β–酪蛋白表达的影响
Figure 12. Effects of AS-IV and APS on expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein proteins in BMECs
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图 13 AS-IV和APS对BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β–酪蛋白表达的影响
“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t检验)
Figure 13. Effects of AS-IV and APS on expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs
“*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively(t test)
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图 14 4种药物干预对LPS刺激BMECs 中TGF-β、ERK1/2、β−酪蛋白表达量的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ
Figure 14. Effect of four drugs intervention on LPS stimulating the protein expression of TGF-β, ERK1/2 andβ-casein in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol, G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ
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图 15 4种药物干预对LPS刺激BMECs中TGF-β、ERK1/2、β–酪蛋白表达量的影响
A：阴性对照，B：LPS，C：LPS+1 g/L APS，D：LPS+50 mg/L林可霉素，E：LPS+50 mg/L青霉素，F：LPS+1%(φ)乙醇，G：LPS+50 mg/L AS-Ⅳ，H：LPS+75 mg/L AS-Ⅳ，I：LPS+100 mg/L AS-Ⅳ；“*”和“**”分别表示在P＜0.05、P＜0.01水平差异显著(t 检验)
Figure 15. Effect of four drugs intervention on LPS stimulating expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs
A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol , G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P＜0.05 and P＜0.01 levels respectively(t test)
表 1 细胞炎症因子基因表达变化 RT-qPCR引物
Table 1 RT-qPCR primers for expression changes of inflammatory genes
基因名称
Gene name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)产物长度/bp
Product lengthIL-1β F：ATGAAGAGCTGCATCCAACACCTG 110 R：ACCGACACCACCTGCCTGAAG TNF-α F：CTGGCGGAGGAGGTGCTCTC 85 R：GGAGGAAGGAGAAGAGGCTGAGG IL-6 F：CACTGACCTGCTGGAGAAGATGC 115 R：CCGAATAGCTCTCAGGCTGAACTG IL-8 F：AGTGGGCCACACTGTGAAAA 113 R：CCCACAGTACATACATGAGGCA β-Actin F：CGTCCGTGACATCAAGGAGAAGC 143 R：GGAACCGCTCATTGCCGATGG 
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表 2 细胞凋亡相关基因表达变化RT-qPCR引物
Table 2 RT-qPCR primers for expression changes of apoptosis related genes
基因名称
Gene name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)产物长度/bp
Product lengthCaspase 3 F：GAACCAACGGACCCGTCAAT 163 R：GCCATGTCATCCTCAGCACC Caspase 8 F：GCTTCATCTGCTGCATCCTCACC 198 R：AGTCGGTCTCAACGGCTACACC Caspase 9 F：GACGCTGGTTCTGGAGGATTCAC 132 R：GCGGCAGAAGTTCACGTTGTTG β-Actin F：CGTCCGTGACATCAAGGAGAAGC 143 R：GGAACCGCTCATTGCCGATGG
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表 3 TGF-β、ERK1/2、CSN2表达变化RT-qPCR引物
Table 3 RT-qPCR primers for TGF-β, ERK1/2 and CSN2expression changes
基因名称
Gene name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)产物长度/bp
Product lengthTGF-β F：CTGTGCTGAATGGCTCTTG 153 R：CATCATCGCTGTCCACACCT ERK1/2 F：GACGCAACACCTCAGCA 162 R：GCCAAGCCAAAGTCACAG CSN2 F：TGGGCAAAGGGGTGGATT 139 R：ACCTGGTGAGATTGTGGAAAGC β-Actin F：CGTCCGTGACATCAAGGAGAAGC 143 R：GGAACCGCTCATTGCCGATGG
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[1] LI D, FU Y, ZHANG W, et al. Salidroside attenuates inflammatory responses by suppressing nuclear factor-κB and mitogen activated protein kinases activation in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice[J]. Inflammation Research, 2013, 62(1): 9-15. doi: 10.1007/s00011-012-0545-4
[2] 赖金伦, 刘玉辉, 陈颖钰, 等. 中药防治奶牛乳腺炎的临床应用及作用机制研究进展[J]. 中国兽医学报, 2017, 37(2): 381-385. [3] 蒋微, 蒋式骊, 刘平. 黄芪甲苷的药理作用研究进展[J]. 中华中医药学刊, 2019, 37(9): 2121-2124. [4] 姜辉, 顾胜龙, 张玉婷, 等. 黄芪化学成分和药理作用研究进展[J]. 安徽中医药大学学报, 2020, 39(5): 93-96. doi: 10.3969/j.issn.2095-7246.2020.05.022 [5] 王凤鸽. 黄芪甲苷对氨诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡的缓解作用及其机制研究[D]. 长春: 吉林大学, 2019. [6] 曾涵芳, 张林, 陈孟姣, 等. 黄芪多糖对H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响[J]. 南京农业大学学报, 2019, 42(5): 903-910. doi: 10.7685/jnau.201809040 [7] 张小强, 宣小龙. 黄芪多糖提高干奶期奶牛乳腺免疫力试验[J]. 中国草食动物, 2010, 30(4): 55-57. [8] 宣小龙. 黄芪多糖提高干奶期奶牛乳腺免疫力试验[J]. 草业与畜牧, 2011(2): 4-6. [9] 连慧香. 发酵黄芪粉对奶牛产奶量及乳成分的影响研究[J]. 粮食与饲料工业, 2015(1): 46-48. [10] JIA F, MA W W, ZHANG X J, et al. Matrine and baicalin inhibit apoptosis induced by Panton-Valentine leukocidin of Staphylococcus aureus in bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of Dairy Science, 2020, 103(3): 2731-2742. doi: 10.3168/jds.2019-17619
[11] 李莹莹. TGFβ1对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞增殖的影响及其信号机制的初步研究[D]. 长春: 吉林大学, 2014. [12] 卢金霞. 苦参碱干预金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞粘附作用的研究[D]. 银川: 宁夏大学, 2017. [13] 霍楠. PURB在氨基酸调节BMECs乳合成中的作用和分子机理[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2018. [14] 解颖颖, 胡学权, 崔京春, 等. 脂多糖诱导哺乳期SD大鼠乳腺炎模型的建立[J]. 动物医学进展, 2017, 38(2): 46-50. doi: 10.3969/j.issn.1007-5038.2017.02.010 [15] GAO X J, GUO M Y, ZHANG Z C, et al. Bergenin plays an anti-inflammatory role via the modulation of MAPK and NF-κB signaling pathways in a mouse model of LPS-induced mastitis[J]. Inflammation, 2015, 38(3): 1142-1150. doi: 10.1007/s10753-014-0079-8
[16] SONG X J, ZHANG W, WANG T C, et al. Geniposide plays an anti-inflammatory role via regulating TLR4 and downstream signaling pathways in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice[J]. Inflammation, 2014, 37(5): 1588-1598. doi: 10.1007/s10753-014-9885-2
[17] 齐宏亮, 李婧, 张涌, 等. 乳房炎奶牛组织和血液病理学研究进展[J]. 动物医学进展, 2014, 35(8): 99-102. doi: 10.3969/j.issn.1007-5038.2014.08.022 [18] 胡晓宇. 奶牛瘤胃菌群紊乱与乳腺炎的关联性及机制研究[D]. 长春: 吉林大学, 2020. [19] KOBAYASHI K, OYAMA S, UEJYO T, et al. Underlying mechanisms involved in the decrease of milk secretion during Escherichia coli endotoxin induced mastitis in lactating mice[J]. Veterinary Research, 2013, 44: 119. doi: 10.1186/1297-9716-44-119.
[20] SKELLY D T, HENNESSY E, DANSEREAU M A, et al. A systematic analysis of the peripheral and CNS effects of systemic LPS, IL-1Β, TNF-α and IL-6 challenges in C57BL/6 mice[J]. PLos One, 2013, 8(7): e69123. doi: 10.1371/journal.pone.0069123
[21] 林杰. 植物精油对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2016. [22] 田青, SPITZER A J, 赵凤启. 脂多糖对大鼠乳腺上皮细胞酪蛋白基因表达的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(7): 3365-3373. [23] IONKOVA I, SHKONDROV A, KRASTEVA I, et al. Recent progress in phytochemistry, pharmacology and biotechnology of Astragalus saponins[J]. Phytochemistry Reviews, 2014, 13(2): 343-374. doi: 10.1007/s11101-014-9347-3
[24] GONG A, DUAN R, WANG H, et al. Evaluation of the pharmaceutical properties and value of Astragali Radix[J]. Medicines, 2018, 5(2). doi: 10.3390/medicines5020046.
[25] WU F, CHEN X. A review of pharmacological study on Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2004, 27(3): 232-234.
[26] FU J, WANG Z, HUANG L, et al. Review of the botanical characteristics, phytochemistry, and pharmacology of Astragalus membranaceus (Huangqi)[J]. Phytotherapy Research, 2014, 28(9): 1275-1283. doi: 10.1002/ptr.5188
[27] 葛增广, 佟慧丽, 秦君, 等. 不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β−酪蛋白表达的影响[J]. 东北农业大学学报, 2009, 40(1): 66-71. doi: 10.3969/j.issn.1005-9369.2009.01.015 [28] 李楠, 高学军, 关力. 中药王不留行对奶牛乳腺细胞增殖及泌乳的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(6): 45-48. -
期刊类型引用(2)
1. 孙思昂，邓梓妍，熊佳瑶，李少斌，杜何为，杜小龙. 空心莲子草生物及生态防治研究进展. 南方农业. 2022(09): 164-167 . 
百度学术
2. 杨凤梅，郑舒含，关晓银，邝乃诵，郭雁君. 空心莲子草的生物学特性及利用价值研究进展. 现代农业科技. 2022(22): 99-103+107 . 百度学术
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