• 《中国科学引文数据库(CSCD)》来源期刊
  • 中国科技期刊引证报告(核心版)期刊
  • 《中文核心期刊要目总览》核心期刊
  • RCCSE中国核心学术期刊

黄芪多糖及黄芪甲苷干预对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的作用

樊嘉琦, 贾芳, 李宇思, 周学章

樊嘉琦, 贾芳, 李宇思, 等. 黄芪多糖及黄芪甲苷干预对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的作用[J]. 华南农业大学学报, 2022, 43(4): 16-28. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202106034
引用本文: 樊嘉琦, 贾芳, 李宇思, 等. 黄芪多糖及黄芪甲苷干预对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的作用[J]. 华南农业大学学报, 2022, 43(4): 16-28. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202106034
FAN Jiaqi, JIA Fang, LI Yusi, et al. Effects of astragalus polysaccharide and astragaloside IV on lipopolysaccharides-induced inflammation of bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of South China Agricultural University, 2022, 43(4): 16-28. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202106034
Citation: FAN Jiaqi, JIA Fang, LI Yusi, et al. Effects of astragalus polysaccharide and astragaloside IV on lipopolysaccharides-induced inflammation of bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of South China Agricultural University, 2022, 43(4): 16-28. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202106034

黄芪多糖及黄芪甲苷干预对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的作用

基金项目: 宁夏自然科学基金(2020AAC03111);大学生创新创业训练计划(Q2020107490063)
详细信息
    作者简介:

    樊嘉琦,博士研究生,主要从事动物病原生物学研究,E-mail: 2090883224@qq.com

    通讯作者:

    周学章,教授,博士,主要从事动物病原生物学研究,E-mail: zhouxuezhang@nxu.edu.cn

  • 中图分类号: S823

Effects of astragalus polysaccharide and astragaloside IV on lipopolysaccharides-induced inflammation of bovine mammary epithelial cells

  • 摘要:
    目的 

    考察黄芪提取物黄芪甲苷(Astragalus IV,AS-Ⅳ)及黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)干预对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)炎症的作用及对炎症细胞中β–酪蛋白表达的影响。

    方法 

    使用APS、AS-Ⅳ干预LPS诱导的BMECs,检测细胞炎症因子、氧化因子、凋亡因子、β–酪蛋白的变化。

    结果 

    CCK-8筛选发现,1 g/L APS及50、75、100 mg/L AS-Ⅳ为刺激BMECs的最适质量浓度,0.5 mg/L LPS刺激BMECs 24 h后成功建立炎症细胞模型。AS-Ⅳ、APS可显著抑制炎症细胞中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的表达,缓解炎症状态下细胞膜的持续损伤;显著抑制炎症细胞中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的表达,缓解细胞的氧化损伤;显著抑制炎症细胞中IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子的表达,降低细胞的炎症反应;显著抑制炎症细胞中凋亡蛋白的表达,抑制细胞凋亡;显著激活BMECs炎症细胞及正常细胞中β–酪蛋白,显著抑制TGF-β和ERK1/2的表达。

    结论 

    使用最适浓度的AS-Ⅳ、APS可抑制LPS诱导的BMECs炎症反应,激活炎症细胞中β–酪蛋白的表达。

    Abstract:
    Objective 

    To investigate the effects of astragaloside IV (AS-IV) and astragalus polysaccharides (APS) of astragalus extract on the lipopolysaccharides (LPS)-induced inflammation of bovine mammary epithelial cells (BMECs) and the effect on the expression of β-casein in inflammatory cells.

    Method 

    APS and AS-IV were used to intervene LPS-induced BMECs to detect the changes of cell inflammatory factors, oxidative factors, apoptosis factors and β-casein.

    Result 

    CCK-8 screening found the concentrations of 1g/L APS and 50, 75, 100 mg/L AS-IV were optimal to stimulate BMECs. After stimulating BMECs with 0.5 mg/L LPS for 24 h, the inflammatory cell model was successfully established. Experiments found that AS-IV and APS could significantly inhibit the expression of lactate dehydrogenase (LDH) in inflammatory cells and alleviate the continuous damage of cell membranes in the inflammatory state; Significantly inhibit the expression of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) in inflammatory cells and alleviate the oxidative damage of cells; Significantly inhibit the expression of IL-6, IL-8, TNF-α inflammatory factors in inflammatory cells, and reduce the inflammatory response of cells; Significantly inhibit the expression of apoptotic proteins in inflammatory cells and inhibit cell apoptosis; Significantly activate β-casein in BMECs inflammatory cells and normal cells, and inhibit the expression of TGF-β and ERK1/2.

    Conclusion 

    AS-IV and APS can inhibit the inflammatory response of BMECs induced by LPS and activate the expression of β-casein in inflammatory cells at the optimal concentrations.

  • 中药大黄来源于蓼科植物大黄的根茎,最早记载于《神农百草经》,有药中“将军”之美称,被列为中药“四大金刚”之一,已经有2000多年的中医临床用药史[1]。中药大黄主要由大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素等游离蒽醌,番泻苷A/B等二蒽酮苷类结合型蒽醌,二苯乙烯,多糖,单宁等成分组成,具有泻下攻积、抗菌、抗感染、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、保肝利胆等多种药理作用[2]。其中,蒽醌是大黄的主要活性成分,含量(w)约占其成分的3%~5%[3]。大黄酸(Rhein,RH)是大黄蒽醌的主要成分之一,结构式如图1所示,具有抗感染[4]、抗肿瘤[5]、抗糖尿病[6]、降脂[7]、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肾毒性等[8]多种药理作用。然而,大黄酸溶解度低、脂溶性差、毒性强、生物利用度差、易引起胃肠道不适,这些特性限制了其临床应用[9]。近年来,畜禽病原菌的抗生素耐药性逐渐变得严重,导致抗生素敏感性下降,研发抗生素增效剂、复方制剂等的防控策略逐渐成为应对畜禽耐药病原菌的研究热点。大黄酸对幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌等多种厌氧菌有强大的抑菌作用。对大黄酸进行结构改造,通过羟基、羧基取代成酯或酰胺等修饰,改善大黄酸理化性质,降低毒性,提高抗感染、抗癌、抗菌等活性,具有重要意义,可为畜禽病原菌耐药防控提供新思路,也为大黄酸类衍生物的进一步研究提供参考依据。

    图  1  大黄酸的结构式
    Figure  1.  Structural formula of rhein

    目前,大黄酸衍生物双醋瑞因是大黄酸最具代表性的衍生物之一,可阻滞白细胞介素−1β(Interleukin-1β,IL-1β)的作用,减少破骨细胞的形成和抑制吸收因子的合成在临床上广泛应用于治疗骨关节炎[10]。双醋瑞因的上市为后续大黄酸衍生物的研究和开发提供了理论依据;但是,双醋瑞因存在严重的毒副作用,为了控制其重度腹泻及影响肝脏的风险,对其临床使用设置了限制性条件。双醋瑞因又名1, 8−二乙酰基−3−羧基蒽醌,用乙酰氯对大黄酸第1、8位羟基进行保护。有研究表明,第1、8位羟基对大黄酸毒性的影响较小[11],因此,双醋瑞因对大黄酸毒性的改善并不明显。研究表明,大黄酸第3位羧基是大黄酸毒性的关键影响因素[11],对第3位羧基进行修饰能提高大黄酸的跨膜能力,从而可能提高大黄酸的抗感染效果[12]。据报道,游离的脂肪酸在肠道炎症反应中具有潜在的应用价值,它可以与肠道细胞膜的特异性受体结合从而发挥免疫保护作用,降低肠道促炎因子水平,以治疗肠道炎症[13]。一方面,脂肪酸作为能量物质,提供了成年人每日所需能量的30%[14];另一方面,脂肪酸参与生物膜的构成、受体激活、信号转导、神经系统发育和各种基因的调节[15]。脂肪酸衍生化可以使大黄酸具有更好的应用价值,保护大黄酸,避免其在体内快速代谢或降解,提高大黄酸稳定性[16];还可以增强大黄酸分子的亲脂性和跨膜转运能力[17];由于肿瘤组织对脂肪酸的吸收能力较强,也可以促进大黄酸分子对癌细胞的靶向积累。总之,通过脂肪酸对大黄酸进行衍生化具有广阔的应用前景。

    本研究前期工作发现,大黄酸与脂肪酸具有协同抗感染作用,并且脂肪酸能在一定程度上降低大黄酸的毒性;但是,大黄酸和脂肪酸在体内代谢速率、生物利用度等因素影响下很难发挥协同作用。因此,本研究通过对大黄酸第3位羧基与羟基癸酸和癸醇进行酯化衍生化,制备出4种大黄酸衍生物,通过核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)和傅里叶变换红外光谱(Fourier transforme infrared spectroscopy,FTIR)表征其结构,进一步探究其毒性、抗感染和抗氧化活性变化,筛选出具有应用前景的大黄酸衍生物,以期为大黄酸衍生物的结构设计及其生物活性等研究提供参考依据。

    核磁共振波谱(德国Bruker公司);磁力搅拌器(上海龙跃仪器设备有限公司);流式细胞计数仪(美国贝克曼库尔特);傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher Nicolet公司);酶标定量测定仪(美国Beckman公司);CO2细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司);RT-qPCR仪(美国Bio-Rad生命医学产品有限公司);旋转蒸发仪N-1200B(日本EYELA东京理化);小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(武汉普诺赛生命科技有限公司);一氧化氮(NO)检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司);DMEM、特级胎牛血清、青链霉素(赛默飞生命科学产品与服务旗舰店);总RNA极速提取试剂盒(广州晖鼎生物科技有限公司);4−(二甲氨基)吡啶(4-Dimethylaminopyridine,DMAP)、N,N′−二环己基碳二亚胺(N, N′-Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)(上海麦克林生化科技有限公司);氘代二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(上海源叶生物科技有限公司);大黄酸(上海麦克林生化科技有限公司);1−癸醇(1-Decanol,DA)、10−羟基癸酸(10-Hydroxydecanoic acid,10-HA)、10−羟基−2−癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)、5−羟基癸酸钠(5-Hydroxydecanoate sodium,5-HD)(上海毕得医药科技股份有限公司)结构式如图2所示;双氯荧光黄乙酸乙酯(2, 7-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)(广州市齐云生物技术有限公司)。

    图  2  癸醇(A)和羟基癸酸(B、C、D)的结构式
    Figure  2.  Structural formulas of decanol (A) and hydroxydecanoic acid (B, C, D)

    精密称取0.5 g(1.70 mmol)大黄酸,置于20 mL DMSO溶液中,于50 ℃、200 r/min搅拌1 h,完全溶解后,加入DA/10-HA/10-HDA/5-HD、DCC 3.40 mmol和DMAP 0.85 mmol,反应摩尔比按照大黄酸∶DA/10-HA/10-HDA/5-HD∶DCC∶DMAP=1.0∶1.0∶2.0∶0.5。在50 ℃条件下反应,每间隔1 h,用薄层层析法监测反应情况,确认产物生成,直至产物不再增加(展开剂为乙酸乙酯和石油醚,体积比为2∶3),停止反应。大黄酸与羟基脂肪酸的反应结构式如图3所示。反应结束后待温度降至室温,将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液透析1 d (透析袋截留相对分子质量为500),去离子水透析2 d,每隔12 h更换透析液,除去未反应的物质。随后,在−75 ℃、0.001 MPa条件下冷冻干燥48 h,得到冻干粗产物。将上述得到的粗产品用38~48 μm孔径的硅胶柱层析进行干法上样,使样品层与硅胶层之间的高度比为1∶20。洗脱液乙酸乙酯∶石油醚=2∶3(V/V),直至监测到产物完全洗脱,获得最终产物。用旋转蒸发器除去溶剂,于50 ℃真空烘箱干燥24 h,得到黄色粉末固体产物。

    图  3  大黄酸与羟基脂肪酸的反应结构式
    F-A为接枝脂肪酸或癸醇,R为F-A反应掉羟基的部分结构,R-FA为接枝后的大黄酸衍生物。
    Figure  3.  Structural formula for the reaction of rhein with hydroxy fatty acids
    F-A is grafted fatty acid or decanol, R is the part of the structure where F-A reacts to drop the hydroxyl group, R-FA is the grafted rhein acid derivative.

    为验证大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率的影响,选用CCK-8试剂盒对RAW 264.7细胞存活率进行检测。分别用10~160 μmol/L的大黄酸及其衍生物处理RAW 264.7细胞24 h,10%($\varphi $) CCK-8试剂孵育0.5~4.0 h,酶标仪设定波长为450 nm,测定每孔光密度。

    为验证大黄酸衍生物的抗感染效果,构建脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW 264.7细胞模型,测定大黄酸及其衍生物处理后RAW 264.7中NO释放量以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达量变化。用20 μmol/L的大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA在37 ℃、5%($\varphi $) CO2条件下预孵育8 h,加入LPS,终质量浓度为 1 μg/mL,在37 ℃、5%($\varphi $) CO2条件下孵育16 h(另外设置LPS阳性对照组,不加药物处理)。用细胞培养液上清液[DMEM+10% (φ) FBS溶液+1% (φ) 青链霉素溶液]稀释NaNO2标准品至0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL每孔,在96孔板中加入标准品及样品(每组设置3个复孔),用酶标仪于540 nm波长处测定光密度,计算NO含量。提取RAW 264.7的RNA,反转录,利用RT-qPCR测定肿瘤坏死因子−α (Tumour necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、白细胞介素−6 (Interleukin-6,IL-6)的表达量变化,具体步骤如下。首先,投入总量为1 μg的RNA,2 μL 4× gDNA wiper Mix,用RNase-free ddH2O定容至10 μL,充分混匀,于42 ℃离心2 min后,得到去DNA的反应液。然后,在上述反应液中加入4 μL 5× Hiscript Ⅲ qRT SuperMix,用RNase-free ddH2O定容至20 μL,得到反转录体系,充分混匀,短暂离心,经37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的PCR反应后,得到cDNA。最后,按照下述反应程序进行RT-qPCR:95 ℃ 30 s,循环1次;95 ℃ 10 s,循环40次;60 ℃ 30 s,循环40次;72 ℃ 30 s,循环40次。RT-qPCR反应体系中所需的引物序列见表1

    表  1  RT-qPCR引物
    Table  1.  RT-qPCR primer
    引物名称
    Primer name
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence
    扩增序列
    Amplified sequence
    GAPDH-F ACCCAGAAGACTGTGGATGG GAPDH mRNA
    GAPDH-R CACATTGGGGGTAGGAACAC GAPDH mRNA
    TNF-ɑ-F CTCTTCAAGGGACAAGGCTG TNF-ɑ mRNA
    TNF-ɑ-R CGGACTCCGCAAAGTCTAAG TNF-ɑ mRNA
    IL-6-F CCGGAGAGGAGACTTCACAG IL-6 mRNA
    IL-6-R TCCACGATTTCCCAGAGAAC IL-6 mRNA
    IL-1β-F GACCTTCCAGGATGAGGACA IL-1β mRNA
    IL-1β-R AGGCCACAGGTATTTTGTCG IL-1β mRNA
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    为验证大黄酸及其衍生物对LPS诱导的RAW 264.7细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生的影响,用20 μmol/L的大黄酸以及大黄酸衍生物处理RAW 264.7细胞。ROS荧光探针DCFH-DA可穿透活细胞膜进入细胞内,并可被细胞内的ROS氧化,生成氧化乙啶;氧化乙啶可嵌入染色体DNA中,产生红色荧光。根据此原理可以评估细胞内ROS含量及其变化情况。用DCFH-DA染色,通过流式细胞计数仪检测大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞中ROS产生的影响,评估大黄酸及其衍生物抗氧化水平。

    采用Orgin Pro 9.0和Graph Pad 8进行统计分析,试验分组均至少有3次重复,采用t检验比较组别之间的差异性。若P>0.05,则无统计学意义;若P<0.05、P<0.01或P<0.001,则其有显著差异;若P<0.000 1,则其有极显著差异。

    为了表征大黄酸衍生物是否成功合成,用FTIR和1H NMR表征其结构。R-5HD的FTIR表征结果如图4A所示。大黄酸的羟基(—OH)峰位于3 420.40 cm−1,羰基(—C=O)峰位于1 648.98 cm−1;5-HD的羟基峰位于3 410.34 cm−1,羰基峰位于1 703.44 cm−1;R-5HD的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基(—COOH)氢对应g1(13.79×10−6);5-HD碳链上的氢对应b2(2.33×10−6)、c2(1.54×10−6)、d2(1.38×10−6)、e2(3.10×10−6)、g2(1.38×10−6)、h2/i2(1.25×10−6)、j2(1.28×10−6)、k2(0.88×10−6),羟基氢对应f2(3.41×10−6),羧基氢对应a2(11.87×10−6)。由大黄酸衍生物R-5HD的1H NMR表征(图4B)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和5-HD碳链上的羟基峰消失,与5-HD对比,R-5HD中峰h3(4.02×10−6)发生明显的偏移。以上结果均表明R-5HD成功合成。

    图  4  大黄酸衍生物结构表征
    Figure  4.  Structural characterization of rhein derivatives

    R-DA的FTIR表征结果如图4C所示,大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1,羰基峰位于1 648.98 cm−1;R-DA的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6);DA碳链上的氢对应b2/d2/e2/f2(1.26×10−6)、g2(1.30×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.50×10−6)、j2(4.35×10−6),羟基氢对应k2(3.23×10−6)。由R-DA的1H NMR表征(图4D)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和DA碳链上的羟基峰消失,与DA对比,R-DA中羟基相邻烷烃链上氢对应的h3(4.33×10−6)发生明显偏移。以上结果均表明R-DA成功合成。

    R-10HA FTIR结构表征如图4E所示。大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1,羰基峰位于1 648.98 cm−1;10−HA的羟基峰位于3 410.34 cm−1,羰基峰位于1703.44 cm−1;R-10HA的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6);10-HA碳链上的氢对应c2(1.54×10−6)、d2(1.33×10−6)、e2/f2(1.26×10−6)、g2(1.30×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.58×10−6)、j2(3.62×10−6),羟基的氢对应k2(4.7×10−6),羧基的氢对应a2(11.87×10−6)。由R-10HA的1H NMR 表征(图4F)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和10-HA碳链上的羟基峰消失,与10-HA对比,R-10HA中峰h3(4.02×10−6)发生明显的偏移。以上结果均表明R-10HA成功合成。

    R-10HDA FTIR表征结果如图4G所示,大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1,羰基峰位于1 648.98 cm−1;10-HDA的羟基峰位于3 410.34 cm−1,羰基峰位于1 703.44 cm−1;R-10HDA的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6);10-HDA碳链上的氢对应b2(6.02×10−6)、c2(7.11×10−6)、d2(2.16×10−6)、e2(1.29×10−6)、f2(1.33×10−6)、g2(1.26×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.58×10−6),羟基的氢对应k2(4.70×10−6),羧基的氢对应a2(12.05×10−6)。由R-10HDA的1H NMR表征(图4H)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和10-HDA碳链上的羟基峰消失,与10-HDA对比,R-10HDA中峰h3(4.02×10−6)发生明显偏移。以上结果均表明R-10HDA成功合成。

    结果如图5所示,大黄酸浓度高于40 μmol/L时具有明显的毒性,RAW 264.7细胞存活率降低至60%;DA浓度为160 μmol/L时,RAW 264.7细胞存活率降低至60%。而R-DA、R-10HA、R-10HDA、R-5HD浓度为160 μmol/L时,RAW 264.7细胞存活率仍接近100%。由此可见,大黄酸衍生物显著降低大黄酸的细胞毒性。

    图  5  不同浓度大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率的影响
    “*”“**”“***”分别表示相同处理浓度大黄酸衍生物组与大黄酸组在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。
    Figure  5.  Effect of different concentrations of rhein and its derivatives on survival rates of RAW 264.7 cells
    “*” “**” “***” indicate significant differences between rhein derivative group and rhein group at 0.05, 0.01 and 0.001 levels respectively in the same treatment concentration (t test).

    大黄酸及其衍生物对NO释放量的影响如图6A所示。与空白对照组(CK)相比,阳性对照组(LPS模型组)NO释放量极显著增加(P<0.0001)。与LPS模型组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均能够极显著抑制LPS诱导的RAW 264.7中NO的释放量,说明4种大黄酸衍生物均具有较强的抗感染活性,对第3位羧基进行结构修饰不会丧失大黄酸的抗感染活性。

    图  6  大黄酸及其衍生物的抗感染作用
    “*”“**”“***”“****”分别表示与LPS组(阳性对照组)在0.05、0.01、0.001和0.000 1水平差异显著(t检验)。
    Figure  6.  Anti-inflammatory effects of rhein and its derivatives
    “*” “**” “***” “****” indicate significant differences differed from LPS group (positive control group) at 0.05, 0.01, 0.001 and 0.000 1 levels respectively (t test).

    大黄酸及其衍生物均能显著降低LPS诱导的RAW 264.7中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量,结果如图6B~6D所示。与空白对照组(CK)相比,阳性对照组(LPS组)的TNF-α mRNA表达水平增加了47倍;与LPS组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了TNF-α mRNA表达水平(P<0.05)。LPS组的IL-1β mRNA表达水平比CK增加了8 813倍;与LPS组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了IL-1β mRNA表达水平。LPS组的IL-6表达水平比CK增加了4 885倍;与LPS组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了IL-6 mRNA表达水平。以上结果表明,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA和R-10HDA均能显著抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平,对大黄酸进行结构修饰使其抗感染效果更强,且R-DA的抗感染效果最强。

    图7所示,DCFH-DA探针孵育后,空白对照组(CK)的荧光强度为1 319.66;经过LPS刺激后细胞内ROS水平显著升高,荧光强度为60 968.00,比空白对照组增加了46倍(P<0.0001)。药物处理后大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA以及R-10HDA组的荧光强度均显著下降,且R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA的抑制效果均优于大黄酸。以上结果表明,修饰后的R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA显著增强了大黄酸的抗氧化活性。

    图  7  大黄酸及其衍生物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放ROS的影响
    “**”“***”“****”分别表示与LPS组(阳性对照组)在0.01、0.001和0.000 1水平差异显著(t检验)。
    Figure  7.  Effect of rhein and its derivatives on LPS-induced ROS release from RAW 264.7 cells
    “**” “***” “****” indicate significant differences differed from LPS group (positive control group) at 0.01, 0.001 and 0.000 1 levels respectively (t test).

    本研究以大黄酸为原料,以羟基癸酸和癸醇为修饰物,经一步酯化反应合成了4种大黄酸衍生物(R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA),通过FTIR以及1H NMR对合成的化合物进行结构鉴定,证实4种衍生物合成成功,经对大黄酸及其衍生物进行毒性研究以及抗感染、抗氧化活性研究,主要结论及其分析如下。

    通过大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率影响的分析,经过羟基癸酸和癸醇修饰之后的大黄酸衍生物对RAW 264.7细胞的毒性降低,安全性增加。羟基癸酸和癸醇与药物分子的化学偶联可能会引起它们在体内的药效学/药代动力学变化,从而降低它们的毒性。经羟基癸酸和癸醇修饰之后的大黄酸衍生物具有更强的抗感染效果,能显著降低LPS诱导的NO释放水平和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的转录水平。综合来讲,在体外炎症模型下,R-DA的抗感染效果最为突出。

    ROS作为LPS诱导炎症的重要中介,可引起DNA、蛋白质和脂质的损伤[18]。此外,过量的ROS产生和积累可诱导细胞损伤和氧化应激[19]。本研究中,LPS刺激后,ROS水平显著升高,经大黄酸以及4种衍生物孵育后,LPS诱导的RAW 264.7细胞中ROS水平显著降低,R-DA抑制ROS效果与大黄酸有显著差异,相比其他3种衍生物有更好的ROS抑制效果。有研究发现,大黄酸可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶的表达起到抗感染作用,经修饰后的大黄酸衍生物作用后,细胞NO释放水平显著降低[20],这与Ge等[21]研究结果一致。

    在大黄酸构效关系研究中,大黄酸分子上第3位碳上的取代基是羧基,增大了大黄酸的极性,是溶解性的关键基团,因此,本研究采用酯化反应的方法,将第3位碳上的羧基转化为酯键,以制备具有良好脂溶性和抗感染活性的大黄酸衍生物。据调查,对蒽醌类药物的修饰改性主要是通过在羟基和羧基引入侧链基团增加药物的吸收,引入脂肪酸可以克服母体药物的脂溶性、吸收率、生物利用度等限制。此外,多数脂肪酸具有抗菌、抗感染、抗氧化活性,例如Omega-3和Omega-6等,在人体内发挥至关重要的作用。通过引入脂肪酸可以增强大黄酸的抗感染活性,降低毒性,同时也为机体的正常运转和代谢提供必需的化学物质。前期工作中经对大黄酸衍生物的抗菌活性进行初步验证,发现其能显著增强大黄酸对金黄色葡萄球菌和肠球菌的抗菌活性,相关研究后续将继续展开,为畜禽耐药性防控提供思路,也为大黄酸进一步的研究提供基础数据。

    在体外抗感染过程中,R-DA可能通过抑制NF-κB途径减少LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子的产生,也可能是由于R-DA中羟基癸醇的脂溶性作用,与细胞膜上的蛋白受体靶向结合,增加细胞膜的通透性,使药物进入细胞内发挥作用,从而起到抗感染、抗氧化的作用。

    本研究中,虽然制备的大黄酸衍生物具有更低的毒性以及更优的抗感染效果,但大黄酸衍生物的纯化方法、合成产率需要进一步优化和提高。因此,在本文的基础上,仍有许多工作值得深入探究,并且要对衍生物的抗感染机制做深入性研究,如衍生物的抗感染机制是否与大黄酸的作用机制一致,以及通过结构修饰后衍生物的生物利用度是否有所增加,以期为新药的开发利用提供参考价值。

  • 图  1   不同LPS质量浓度和作用时间下BMECs生物学活性

    Figure  1.   BMECs bioactivities under different concentrations and action time of LPS

    图  2   不同LPS质量浓度对BMECs炎症因子基因表达的影响

    “**”表示处理与对照在P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  2.   Effects of different LPS concentrations on the gene expression of inflammatory factor in BMECs

    “**” indicates significant difference at P<0.01 level between the treatment and control (t test)

    图  3   不同质量浓度LPS刺激的BMECs细胞形态(a)及细胞核形态(b)变化

    Figure  3.   Cell morphology (a) and nuclear morphology (b) changes of BMECs stimulated by different concentrations of LPS

    图  4   AS-IV、APS、青霉素、林可霉素对BMECs存活率的影响

    “*”和“**”分别表示处理与对照在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  4.   Effects of AS-IV, APS, penicillin and lincomycin on the viabilities of BMECs

    “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively between the treatment and control (t test)

    图  5   AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs损伤的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ;“*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  5.   Effects of AS-IV and APS interference on LPS damaging BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test)

    图  6   AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs中炎症因子基因相对表达量的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ;“*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  6.   Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating relative expression of inflammatory factor genes in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+ethanol (φ=1%), G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test)

    图  7   AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs炎症因子表达量的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+乙醇(φ为1%),G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ;“*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  7.   Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating the expression of inflammatory factors in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+ethanol (φ=1%), G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively(t test)

    图  8   AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs凋亡因子mRNA相对表达量的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/LAPS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ;“*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  8.   Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating relative expression of apoptosis factor mRNA in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol , G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively(t tset)

    图  9   AS-IV、APS干预对LPS刺激BMECs凋亡蛋白表达的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ

    Figure  9.   Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating expression of apoptotic protein in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol, G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ

    图  10   AS-IV、APS干预LPS对BMECs凋亡蛋白表达量的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ;“*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  10.   Effect of AS-IV and APS intervention on LPS affecting expression of apoptotic protein in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol , G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively(t test)

    图  11   AS-IV和APS对BMECs 中 TGF-βERK1/2CSN2 相对表达量的影响

    “*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  11.   Effects of AS-IV and APS on relative expression level of TGF-β, ERK1/2 and CSN2 in BMECs

    “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively(t test)

    图  12   AS-IV和APS对BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β–酪蛋白表达的影响

    Figure  12.   Effects of AS-IV and APS on expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein proteins in BMECs

    图  13   AS-IV和APS对BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β–酪蛋白表达的影响

    “*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t检验)

    Figure  13.   Effects of AS-IV and APS on expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs

    “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively(t test)

    图  14   4种药物干预对LPS刺激BMECs 中TGF-β、ERK1/2、β−酪蛋白表达量的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ

    Figure  14.   Effect of four drugs intervention on LPS stimulating the protein expression of TGF-β, ERK1/2 andβ-casein in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol, G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ

    图  15   4种药物干预对LPS刺激BMECs中TGF-β、ERK1/2、β–酪蛋白表达量的影响

    A:阴性对照,B:LPS,C:LPS+1 g/L APS,D:LPS+50 mg/L林可霉素,E:LPS+50 mg/L青霉素,F:LPS+1%(φ)乙醇,G:LPS+50 mg/L AS-Ⅳ,H:LPS+75 mg/L AS-Ⅳ,I:LPS+100 mg/L AS-Ⅳ;“*”和“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平差异显著(t 检验)

    Figure  15.   Effect of four drugs intervention on LPS stimulating expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs

    A: Negative control, B: LPS, C: LPS+1 g/L APS, D: LPS+50 mg/L linkomycyna, E: LPS+50 mg/L penicillin, F: LPS+1%(φ) ethanol , G: LPS+50 mg/L AS-Ⅳ, H: LPS+75 mg/L AS-Ⅳ, I: LPS+100 mg/L AS-Ⅳ; “*” and “**” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels respectively(t test)

    表  1   细胞炎症因子基因表达变化 RT-qPCR引物

    Table  1   RT-qPCR primers for expression changes of inflammatory genes

    基因名称
    Gene name
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence (5′→3′)
    产物长度/bp
    Product length
    IL-1β F:ATGAAGAGCTGCATCCAACACCTG 110
    R:ACCGACACCACCTGCCTGAAG
    TNF-α F:CTGGCGGAGGAGGTGCTCTC 85
    R:GGAGGAAGGAGAAGAGGCTGAGG
    IL-6 F:CACTGACCTGCTGGAGAAGATGC 115
    R:CCGAATAGCTCTCAGGCTGAACTG
    IL-8 F:AGTGGGCCACACTGTGAAAA 113
    R:CCCACAGTACATACATGAGGCA
    β-Actin F:CGTCCGTGACATCAAGGAGAAGC 143
    R:GGAACCGCTCATTGCCGATGG
    下载: 导出CSV

    表  2   细胞凋亡相关基因表达变化RT-qPCR引物

    Table  2   RT-qPCR primers for expression changes of apoptosis related genes

    基因名称
    Gene name
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence (5′→3′)
    产物长度/bp
    Product length
    Caspase 3 F:GAACCAACGGACCCGTCAAT 163
    R:GCCATGTCATCCTCAGCACC
    Caspase 8 F:GCTTCATCTGCTGCATCCTCACC 198
    R:AGTCGGTCTCAACGGCTACACC
    Caspase 9 F:GACGCTGGTTCTGGAGGATTCAC 132
    R:GCGGCAGAAGTTCACGTTGTTG
    β-Actin F:CGTCCGTGACATCAAGGAGAAGC 143
    R:GGAACCGCTCATTGCCGATGG
    下载: 导出CSV

    表  3   TGF-βERK1/2CSN2表达变化RT-qPCR引物

    Table  3   RT-qPCR primers for TGF-β, ERK1/2 and CSN2expression changes

    基因名称
    Gene name
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence (5′→3′)
    产物长度/bp
    Product length
    TGF-β F:CTGTGCTGAATGGCTCTTG 153
    R:CATCATCGCTGTCCACACCT
    ERK1/2 F:GACGCAACACCTCAGCA 162
    R:GCCAAGCCAAAGTCACAG
    CSN2 F:TGGGCAAAGGGGTGGATT 139
    R:ACCTGGTGAGATTGTGGAAAGC
    β-Actin F:CGTCCGTGACATCAAGGAGAAGC 143
    R:GGAACCGCTCATTGCCGATGG
    下载: 导出CSV
  • [1]

    LI D, FU Y, ZHANG W, et al. Salidroside attenuates inflammatory responses by suppressing nuclear factor-κB and mitogen activated protein kinases activation in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice[J]. Inflammation Research, 2013, 62(1): 9-15. doi: 10.1007/s00011-012-0545-4

    [2] 赖金伦, 刘玉辉, 陈颖钰, 等. 中药防治奶牛乳腺炎的临床应用及作用机制研究进展[J]. 中国兽医学报, 2017, 37(2): 381-385.
    [3] 蒋微, 蒋式骊, 刘平. 黄芪甲苷的药理作用研究进展[J]. 中华中医药学刊, 2019, 37(9): 2121-2124.
    [4] 姜辉, 顾胜龙, 张玉婷, 等. 黄芪化学成分和药理作用研究进展[J]. 安徽中医药大学学报, 2020, 39(5): 93-96. doi: 10.3969/j.issn.2095-7246.2020.05.022
    [5] 王凤鸽. 黄芪甲苷对氨诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡的缓解作用及其机制研究[D]. 长春: 吉林大学, 2019.
    [6] 曾涵芳, 张林, 陈孟姣, 等. 黄芪多糖对H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响[J]. 南京农业大学学报, 2019, 42(5): 903-910. doi: 10.7685/jnau.201809040
    [7] 张小强, 宣小龙. 黄芪多糖提高干奶期奶牛乳腺免疫力试验[J]. 中国草食动物, 2010, 30(4): 55-57.
    [8] 宣小龙. 黄芪多糖提高干奶期奶牛乳腺免疫力试验[J]. 草业与畜牧, 2011(2): 4-6.
    [9] 连慧香. 发酵黄芪粉对奶牛产奶量及乳成分的影响研究[J]. 粮食与饲料工业, 2015(1): 46-48.
    [10]

    JIA F, MA W W, ZHANG X J, et al. Matrine and baicalin inhibit apoptosis induced by Panton-Valentine leukocidin of Staphylococcus aureus in bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of Dairy Science, 2020, 103(3): 2731-2742. doi: 10.3168/jds.2019-17619

    [11] 李莹莹. TGFβ1对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞增殖的影响及其信号机制的初步研究[D]. 长春: 吉林大学, 2014.
    [12] 卢金霞. 苦参碱干预金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞粘附作用的研究[D]. 银川: 宁夏大学, 2017.
    [13] 霍楠. PURB在氨基酸调节BMECs乳合成中的作用和分子机理[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2018.
    [14] 解颖颖, 胡学权, 崔京春, 等. 脂多糖诱导哺乳期SD大鼠乳腺炎模型的建立[J]. 动物医学进展, 2017, 38(2): 46-50. doi: 10.3969/j.issn.1007-5038.2017.02.010
    [15]

    GAO X J, GUO M Y, ZHANG Z C, et al. Bergenin plays an anti-inflammatory role via the modulation of MAPK and NF-κB signaling pathways in a mouse model of LPS-induced mastitis[J]. Inflammation, 2015, 38(3): 1142-1150. doi: 10.1007/s10753-014-0079-8

    [16]

    SONG X J, ZHANG W, WANG T C, et al. Geniposide plays an anti-inflammatory role via regulating TLR4 and downstream signaling pathways in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice[J]. Inflammation, 2014, 37(5): 1588-1598. doi: 10.1007/s10753-014-9885-2

    [17] 齐宏亮, 李婧, 张涌, 等. 乳房炎奶牛组织和血液病理学研究进展[J]. 动物医学进展, 2014, 35(8): 99-102. doi: 10.3969/j.issn.1007-5038.2014.08.022
    [18] 胡晓宇. 奶牛瘤胃菌群紊乱与乳腺炎的关联性及机制研究[D]. 长春: 吉林大学, 2020.
    [19]

    KOBAYASHI K, OYAMA S, UEJYO T, et al. Underlying mechanisms involved in the decrease of milk secretion during Escherichia coli endotoxin induced mastitis in lactating mice[J]. Veterinary Research, 2013, 44: 119. doi: 10.1186/1297-9716-44-119.

    [20]

    SKELLY D T, HENNESSY E, DANSEREAU M A, et al. A systematic analysis of the peripheral and CNS effects of systemic LPS, IL-1Β, TNF-α and IL-6 challenges in C57BL/6 mice[J]. PLos One, 2013, 8(7): e69123. doi: 10.1371/journal.pone.0069123

    [21] 林杰. 植物精油对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2016.
    [22] 田青, SPITZER A J, 赵凤启. 脂多糖对大鼠乳腺上皮细胞酪蛋白基因表达的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(7): 3365-3373.
    [23]

    IONKOVA I, SHKONDROV A, KRASTEVA I, et al. Recent progress in phytochemistry, pharmacology and biotechnology of Astragalus saponins[J]. Phytochemistry Reviews, 2014, 13(2): 343-374. doi: 10.1007/s11101-014-9347-3

    [24]

    GONG A, DUAN R, WANG H, et al. Evaluation of the pharmaceutical properties and value of Astragali Radix[J]. Medicines, 2018, 5(2). doi: 10.3390/medicines5020046.

    [25]

    WU F, CHEN X. A review of pharmacological study on Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2004, 27(3): 232-234.

    [26]

    FU J, WANG Z, HUANG L, et al. Review of the botanical characteristics, phytochemistry, and pharmacology of Astragalus membranaceus (Huangqi)[J]. Phytotherapy Research, 2014, 28(9): 1275-1283. doi: 10.1002/ptr.5188

    [27] 葛增广, 佟慧丽, 秦君, 等. 不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β−酪蛋白表达的影响[J]. 东北农业大学学报, 2009, 40(1): 66-71. doi: 10.3969/j.issn.1005-9369.2009.01.015
    [28] 李楠, 高学军, 关力. 中药王不留行对奶牛乳腺细胞增殖及泌乳的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(6): 45-48.
图(15)  /  表(3)
计量
  • 文章访问数:  190
  • HTML全文浏览量:  11
  • PDF下载量:  431
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2021-06-21
  • 网络出版日期:  2023-05-17
  • 刊出日期:  2022-07-09

目录

/

返回文章
返回