Analyses of drug resistance, multi-locus sequence typing and genetic evolution of Peudomonas aeruginosa in pheasant farms
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摘要:目的
探究广东省七彩山鸡养殖场中铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的流行特点、耐药性、多位点序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)及遗传进化背景，为临床合理用药提供参考。
方法从广东省3个规模化七彩山鸡养殖场收集孵化死胚及周围环境样本进行铜绿假单胞菌的分离鉴定，采用K-B纸片扩散法测试其对22种抗菌药物的敏感性，利用MLST分析铜绿假单胞菌分离株的分子流行特点。将各ST型的7个管家基因序列按顺序拼接，用MEGA7软件对拼接好的序列进行遗传进化分析。
结果在采集的514份样本(死胚样本405份、环境样本109份)中共分离到铜绿假单胞菌145株(分离率28.2%)，其中，24株来源于环境样本(分离率22.0%，24/109)，121株来源于死胚样本(分离率29.9%，121/405)。145株铜绿假单胞菌除对氨苄西林、卡那霉素和萘啶酸天然耐药外，对复方新诺明、氯霉素和四环素的耐药性较强，耐药率分别为100%、80.0%和77.2%，其次为头孢噻肟(耐药率23.4%)。除天然耐药外，多重耐药的铜绿假单胞菌占比达73.1%（106/145），且对亚胺培南也显现出耐药性。MLST结果显示，89株耐药谱较广的铜绿假单胞菌可分为18个ST型，其中，6个ST型是本研究新发现的。铜绿假单胞菌死胚分离株的优势ST型是ST-260，环境分离株以ST-2100和ST-3202为主。遗传进化分析表明，环境和死胚样品中的铜绿假单胞菌具有较高的相似性。
结论本研究调查的3个七彩山鸡养殖场的死胚及周围环境中均存在不同程度的铜绿假单胞菌感染或污染，且分离株具有较强的耐药性；建议在养殖过程中不仅要加强饲养管理、提高生物安全意识，还应根据药敏试验结果合理选择抗菌药。
Abstract:ObjectiveTo investigate the epidemic characteristics, drug resistance, multi-locus sequence typing (MLST) and genetic evolution background of Pseudomonas aeruginosa in Guangdong Province, and provide a reference for clinical rational drug use.
MethodSamples from dead embryos of pheasant and their surrounding environment were collected for separation and identification of P. aeruginosa. The K-B paper disk diffusion method was used to analyze P. aeruginosa sensitivity to 22 kinds of antimicrobials. The MLST method was applied to analyze the molecular epidemiology of P. aeruginosa strains. Seven house-keeping genes of each ST type were spliced sequentially, and we used MEGA7 software to conduct genetic evolution analysis to the spliced sequence.
ResultA total of 145 P. aeruginosa strains (isolation rate 28.2%) were isolated from the collected 514 samples (405 dead embryo samples and 109 environment samples), including 24 strains from environmental samples (isolation rate 22.0%, 24/109) and 121 strains from dead embryos (isolation rate 29.9%, 121/405). Antibiotic drug sensitivity test showed that 145 strains of P. aeruginosa were naturally resistant to ampicillin, kanamycin and nalidixic acid, strongly resistant to complex sulfamethoxazole, chloramphenicol, tetracycline, followed by cefotaxime, with the drug resistance rates of 100%, 80.0%, 77.2% and 23.4% respectively. Except the natural drug resistance, the proportion of multiple drug resistant P. aeruginosa was up to 73.1% (106/145), and a certain proportion of P. aeruginosa strains which were resistant to imipenem appeared. MLST analysis showed that 89 P. aeruginosa strains with a broad spectrum of resistance were divided into 18 ST types, presenting high diversity. Among them, six ST types were the new types discovered in this study. The dead embryo isolates of P. aeruginosa were mainly ST-260, and the environmental sample isolates were mainly ST-2100 and ST-3202. Genetic evolution analysis showed that P. aeruginosa strains in environment were closely related to those in dead embryos.
ConclusionThere are different degrees of P. aeruginosa infection or contamination in dead embryos and surrounding environment of three pheasant farms, and the isolates have strong drug resistance. Therefore, it is recommended that we should not only strengthen the breeding management and raise the awareness of bio-safety in the process of breeding, but also use antibacterial drugs reasonably according to the results of the drug sensitivity test.
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金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus是一种革兰阳性球菌，可引起肺和皮肤组织感染，甚至危及生命。作为一种机会致病菌，金葡菌已成为外科手术感染及医疗器械污染中最常见的病原体[1-3]。近年来，随着抗生素的大量使用，金葡菌耐药性逐渐增强，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的出现引起了全球的广泛关注。有研究表明，金葡菌可通过噬菌体、质粒、转座子及葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)等方式进行耐药基因的水平转移[4-6]。mecA作为MRSA菌株携带的耐药基因，已有研究表明mecA主要通过SCCmec元件进行水平转移[7-8]。
SCCmec是一种具有高度多样性的移动遗传因子。1999年首次测定了1982年分离的日本金葡菌N315菌株的mec整体结构及DNA序列。1年后，mecDNA被发现是由2个位点特异性重组酶基因ccrA和ccrB驱动的新基因元件，命名为SCCmec[9]。SCCmec (SCC家族的主要成员)是一种携带mec基因(mecA、mecB和mecC)以及控制其表达的基因mecR1(编码信号转导蛋白mecR1)和mecI(编码抑制蛋白mecI)的移动遗传元件，并作为葡萄球菌菌株间基因信息交换的载体。SCCmec位于葡萄球菌染色体复制起点附近，插入在插入位点attB (orfX的3'端)。SCCmec有3个基本的遗传因素：ccr基因复合体(由ccrAB或ccrC及其周围的ORFs组成)、mec基因复合体(由mec基因、插入序列和周围的ORFs组成)和连接区(J区)。在ccr基因复合体中，通过ccrAB或ccrC位点特异性重组，可以将多个耐药和耐重金属基因插入SCCmec中，SCCmec可通过ccrAB或ccrC的精确切除和整合，整合到葡萄球菌菌株的染色体上；因此，不同的葡萄球菌菌株交换遗传信息，以适应不同的环境和抗生素选择的压力[10]。SCCmec编码一种新的特异性青霉素结合蛋白(PBP2a)，与金葡菌内源性青霉素结合蛋白相比，PBP2a与β–内酰胺的结合亲和力降低，导致抗生素失活。与其他对β–内酰胺类抗生素的抑制机制不同，MRSA还能够通过PBP2a持续合成独特的细胞壁成分。由于获得了SCCmec元件，甲氧西林敏感金葡菌(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)进化为MRSA[11]。根据各类型SCCmec在J区域的差异，将SCCmec分为不同的型和亚型。III型SCCmec在巴西、波兰、伊朗、土耳其、马来西亚、泰国、中国和中国台湾等国家或地区为主要检出类型[12]。本研究通过对实验室60株二代测序金葡菌基因组序列SCCmec元件进行比对分析，发现CRISPR阳性(CRISPR+)和CRISPR阴性(CRISPR−)不同菌株中都携带SCCmec元件，SCCmec元件的主要类型为III型，另外有1株为VIII型，1株为XII型，与报道结果一致。
成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是存在于原核生物中的一种适应性免疫系统。有研究表明，约50%的细菌携带CRISPR/Cas系统[13]。它能够靶向切割核酸序列，从而抵御噬菌体、质粒等外源基因的入侵，保持细菌自身遗传结构的稳定[14]。CRISPR/Cas系统能否限制细菌耐药基因和毒力基因的水平转移，目前还没有明确的结论。Marraffini等[15]发现表皮葡萄球菌RP62a菌株的CRISPR/Cas系统可以阻止质粒的结合转移。张蒙蒙等[16]发现葡萄球菌中CRISPR/Cas系统可以限制mecA等耐药基因的转移。目前，金葡菌中CRISPR/Cas系统对细菌耐药基因和毒力基因的影响还不清楚。本研究以NCBI数据库575株金葡菌的基因组序列为研究对象，探讨CRISPR结构对其耐药基因和毒力基因的影响，并通过对实验室分离菌株二代测序基因组序列进行分析，做进一步验证。
1. 材料与方法
1.1 材料
575株金葡菌基因组序列下载自NCBI数据库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/154)，60株金葡菌基因组为本研究前期临床分离菌株的二代测序数据。
1.2 方法
1.2.1 CRISPR位点的识别与提取
通过CRISPRs finder ( https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)在线进行，统计具有CRISPR位点的金葡菌，将金葡菌基因组分为CRISPR+和CRISPR− 2大类。
1.2.2 金葡菌多位点序列分型及系统发育树的构建
对575株金葡菌通过Center for Genomic Epidemiology在线网站( http://www.genomicepidemiology.org/)进行多位点序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)，构建系统发育树。对CRISPR+和CRISPR−菌株ST型别进行韦恩图的绘制，分析二者的相关性。
1.2.3 耐药基因、毒力基因的统计
通过Center for Genomic Epidemiology网站下载整理耐药基因和毒力基因数据库，预测金葡菌基因组的ORF，利用blastn软件进行耐药基因和毒力基因的比对(序列一致率>80%，覆盖率>70%)。
1.2.4 原噬菌体和接合质粒的比对分析
实验室60株金葡菌基因组通过PHASTER在线网站( http://phaster.ca/)比对原噬菌体的携带情况，统计结果为完整噬菌体序列。通过Center for Genomic Epidemiology在线网站比对接合质粒存在情况(序列一致率>95%)。
1.2.5 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，CRISPR+和CRISPR−与耐药基因和毒力基因之间的关系采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 金葡菌基因组中CRISPR结构分布概况
公共数据库575株金葡菌中有62株(11%)含有确证的CRISPR位点(CRISPR+)，513株(89%)无或仅含有可疑的CRISPR结构(CRISPR−)。实验室60株金葡菌中有14株(23%)含有确证的CRISPR位点(CRISPR+)，46株(77%)无或仅含有可疑的CRISPR结构(CRISPR−)。
2.2 金葡菌MLST型别及相关性分析
对575株金葡菌基因组进行MLST分型，536株可以进行ST分型，共得到81个ST型别。对基因组进行系统发育树的构建，如图1A所示。我们将ST型别数量≥10的菌株标注不同的颜色，其他型别菌株以白色显示，同时将新ST型菌株以黑色标注。系统发育树显示，ST8型别的菌株所占的比例最高，为19%(111/575)；其次是ST5，占比达到13%(77/575)。在CRISPR+菌株中，最具有代表性的型别是ST398；CRISPR−菌株中，最具有代表性的型别是ST8。通过绘制韦恩图来分析CRISPR+与CRISPR−菌株的关系，如图1B所示，CRISPR+与CRISPR−之间有11个共同的ST型，菌株之间具有相关性。
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图 1 公共数据库基因组CRISPR+和CRISPR−金葡菌MLST型别系统发育树(A)和ST型别交叉情况(B)Figure 1. Phylogenetic tree (A) and ST type crossover (B) of CRISPR+ and CRISPR−Staphylococcus aureus MLST types in public database genome2.3 金葡菌耐药基因的分析
2.3.1 金葡菌耐药基因分布
公共数据库基因组中，62株CRISPR+金葡菌中阳性率最高的耐药基因是tet(38)，占比高达90%(56/62)；其次是blaZ，占比60%(37/62)。与CRISPR+菌株相比，513株CRISPR−菌株中ant(4')-Ib、aph(3')-Ⅲa、aad(6)和msr(A)的阳性率高(P<0.05)。CRISPR−菌株耐药基因的种类多于CRISPR+菌株(表1)。
表 1 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1)Table 1. Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome耐药基因 Drug resistance gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion ant(4')-Ⅰb 2 3 72 14 0.014 ant(9)-Ⅰa 9 15 126 25 0.078 aac(6')-le-aph(2")-Ⅰa 5 8 82 16 0.100 aph(3')-Ⅲa — — 102 20 0.000 aad(6) 1 2 58 11 0.013 ant(6)-Ⅰa 2 3 3 1 0.164 mecA 33 53 285 56 0.727 mecR1 4 6 99 19 0.013 mecⅠ 2 3 74 14 0.009 blaZ 37 60 292 57 0.679 mecC 3 5 4 1 0.032 cfr(A) — — 2 0 1.000 erm(A) 10 16 135 26 0.081 erm(B) 1 2 12 2 1.000 erm(C) 4 6 29 6 0.772 erm(T) 1 2 — — 0.206 Isa(E) 2 3 4 1 0.259 Isa(B) — — 1 0 1.000 msr(A) — — 60 12 0.009 msr(F) — — 1 0 1.000 optr(A) — — 1 0 1.000 vga(A)LC 3 5 3 1 0.014 vga(E) 3 5 4 1 0.032 vga(A)v 1 2 — — 0.206 tet(38) 56 90 491 96 0.063 tet(K) 16 26 50 10 0.000 tet(L) 3 5 6 1 0.063 tet(M) 19 31 71 14 0.001 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 实验室菌株基因组中，14株CRISPR+金葡菌中阳性率最高的耐药基因是blaZ，占比57%(8/14)。与CRISPR+菌株相比，46株CRISPR−菌株中ant(6)-Ia、cfr、mecA的阳性率高(P<0.05)。CRISPR+菌株的耐药基因种类少于CRISPR−菌株(表2)。
表 2 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1)Table 2. Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome耐药基因 Drug resistance gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion lnu(A) 2 14 5 11 0.660 lnu(B) — — 9 20 0.100 lsa(E) — — 9 20 0.100 erm(A) 1 7 1 2 0.955 erm(B) 4 29 20 43 0.368 erm(C) 6 43 28 61 0.234 erm(T) 1 7 4 9 1.000 fexA 2 14 35 76 0.000 fexB 1 7 1 2 0.955 aac(6')-aph(2'') — — 16 35 0.013 aph(2'')-Ia 4 29 18 39 0.542 aadD 2 14 32 70 0.000 ant(6)-Ia 3 21 25 54 0.004 ant(9)-Ia 1 7 1 2 0.955 tet(K) 3 21 14 30 0.737 tet(L) 3 21 25 54 0.004 tet(M) 1 7 7 15 0.667 tet(S) 2 14 14 30 0.314 tet(T) — — 1 2 1.000 blaZ 8 57 17 37 0.180 str — — 3 7 0.779 cfr 2 14 23 50 0.028 mecA1 2 14 17 37 0.189 sal(A) 2 14 17 37 0.189 optrA 2 14 17 37 0.189 mecA 3 21 25 54 0.004 msr(A) — — 1 2 1.000 dfrG 1 7 15 33 0.086 qacG 2 14 — — 0.079 fosD 1 7 13 28 0.154 fosB5 — — 2 4 1.000 fosB4 1 7 0 0 0.525 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 2.3.2 金葡菌耐药基因数目
在菌株携带耐药基因的数量方面，CRISPR+菌株携带的耐药基因数量更少。公共数据库基因组CRISPR+菌株中，有58%(36/62) 的菌株携带耐药基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(77%，395/513)；实验室菌株基因组CRISPR+菌株中，有29%(4/14) 的菌株携带耐药基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(74%，34/46)(表3)。
表 3 公共数据库与实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因数目比较Table 3. Comparison of the number of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database and the laboratory genomes基因组 Genome 耐药基因数目 Number of drug resistance gene 占比/% Proportion CRISPR+ CRISPR− 公共数据库 Public database ≥5 95 100 ≥10 58 77 ≥15 11 38 ≥20 0 6 实验室 Laboratory ≥5 36 76 ≥10 29 74 ≥15 7 50 ≥20 0 17 同时，我们分别对2组数据中CRISPR+和CRISPR−菌株携带耐药基因数目进行箱线图绘制。公共数据库基因组中，CRISPR+菌株整体携带耐药基因数量的平均值低于CRISPR−菌株，差异极显著(P<0.01)(图2A)。实验室基因组中，CRISPR+菌株整体携带耐药基因数量的平均值低于CRISPR−菌株，差异显著(P<0.05)(图2B)。
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图 2 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+与CRISPR−菌株整体携带耐药基因数目平均值比较“*”和“**”分别表示在P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验)Figure 2. Comparison of the average number of drug resistance genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database (A) and the laboratory(B) genomes“*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test)2.4 金葡菌毒力基因的分析
2.4.1 金葡菌毒力基因分布
由表4可知，公共数据库基因组中，CRISPR+金葡菌阳性率最高的毒力基因是hlgB、hlgC，占比高达100%(62/62)；其次是aur，占比98%(61/62)。与CRISPR+菌株相比，CRISPR−菌株中splA、splB的阳性率高(P<0.05)。CRISPR−菌株毒力基因的种类多于CRISPR+菌株。
表 4 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较1)Table 4. Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome毒力基因 Virulence gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion aur 61 98 503 98 0.855 splA 18 29 368 72 0.000 splB 21 34 381 74 0.000 splE 19 31 66 13 0.000 sak 4 6 — — 0.000 scn 4 6 — — 0.000 sea 4 6 103 20 0.009 seb 1 2 44 9 0.074 sec 10 16 58 11 0.267 sed — — 28 5 0.061 seg 15 24 221 43 0.004 seh — — 23 4 0.159 sei 15 24 227 44 0.003 sej — — 39 8 0.015 sek 4 6 137 27 0.000 sel 10 16 54 11 0.185 sem 15 24 229 45 0.002 sen 14 23 225 44 0.001 seo 15 24 229 45 0.002 sep 2 3 62 12 0.033 seq 5 8 131 26 0.002 ser — — 38 7 0.025 seu 15 24 115 22 0.752 tst 4 6 67 13 0.135 hlgA 60 97 507 99 0.192 hlgB 62 100 512 100 0.728 hlgC 62 100 512 100 0.728 lukD 24 39 386 75 0.000 lukE 25 40 378 74 0.000 lukF 7 11 124 24 0.022 lukS — — 28 5 0.061 lukF-PV 7 11 124 24 0.022 lukS-PV — — 28 5 0.061 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 实验室菌株基因组中，CRISPR+金葡菌阳性率最高的毒力基因是aur、hlgA、hlgB和hlgC，占比71%(10/14)。与CRISPR+菌株相比，CRISPR−菌株中sei、sem、sen、seo和seu的阳性率高。CRISPR+菌株的毒力基因种类少于CRISPR−菌株(表5)。
表 5 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较Table 5. Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome毒力基因 Virulence gene CRISPR+1) CRISPR− P 数量 Quantity 占比% Proportion 数量 Quantity 占比% Proportion aur 10 71 22 48 0.121 splA 1 7 12 26 0.264 splB 2 14 10 22 0.713 splE 2 14 9 20 1.000 sak 6 43 9 20 0.078 scn 7 50 14 30 0.179 hlgA 10 71 22 48 0.121 hlgB 10 71 22 48 0.121 hlgC 10 71 22 48 0.121 lukD 1 7 12 26 0.264 lukE 1 7 12 26 0.264 sea — — 1 2 1.000 seg — — 9 20 0.100 seh — — 2 4 1.000 sei — — 10 22 0.098 sem — — 10 22 0.098 sen — — 10 22 0.098 seo — — 10 22 0.098 seu — — 10 22 0.098 edinA — — 1 2 1.000 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 2.4.2 金葡菌毒力基因数目
在菌株携带毒力基因的数量方面，CRISPR+菌株携带的毒力基因更少。公共数据库基因组CRISPR+菌株中，有35%(22/62) 的菌株携带毒力基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(73%，374/513)；实验室菌株基因组CRISPR+菌株中，有7%(1/14)的菌株携带毒力基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(41%，19/46)(表6)。
表 6 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因数目比较Table 6. Comparison of the number of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome基因组 Genome 毒力基因数目 Number of virulence gene 占比/% Proportion CRISPR+ CRISPR− 公共数据库 Public database ≥5 68 96 ≥10 35 73 ≥15 6 15 ≥20 3 0 实验室 Laboratory ≥5 50 48 ≥10 7 41 ≥15 0 13 ≥20 0 7 同时，我们分别对2组数据中CRISPR+和CRISPR−菌株携带毒力基因数目进行箱线图绘制。公共数据库基因组中，CRISPR+菌株整体携带毒力基因数目的平均值低于CRISPR−菌株，差异极显著(P<0.01)(图3A)。实验室基因组中，CRISPR+菌株整体携带毒力基因数目的平均值低于CRISPR−菌株，差异显著(P<0.05)(图3B)。
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图 3 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+和CRISPR−菌株整体携带毒力基因数目平均值比较“*”和“**”分别表示在 P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验)Figure 3. Comparison of the average number of virulence genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome (A) and the laboratory genome (B)“*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test)2.5 原噬菌体和接合质粒的比对分析
实验室60株金葡菌基因组原噬菌体比对结果显示，CRISPR+金葡菌中原噬菌体的携带率为29%(4/14)，CRISPR−金葡菌中原噬菌体的携带率为67%(31/46)。CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05)。接合质粒的分析结果显示，CRISPR+金葡菌中接合质粒的携带率为86%(12/14)，CRISPR−金葡菌中接合质粒的携带率为80%(37/46)。CRISPR−和CRISPR+菌株基本一致，无显著差异(P>0.05)。
3. 讨论与结论
3.1 讨论
CRISPR/Cas系统作为原核生物的一种适应性免疫系统，能抵御外来基因元件如噬菌体、质粒的入侵，保持细菌自身遗传结构的稳定。日本学者于1987年首次在大肠埃希菌中发现该结构[17]，Barrangou等[13]首次用试验证明CRISPR/Cas系统具有抵御外来噬菌体干扰的功能。本研究结果显示，CRISPR+金葡菌菌株大多含有较少的耐药基因和毒力基因，CRISPR结构能够限制耐药基因、毒力基因的水平转移，使细菌的遗传结构保持稳定[18]。
但是，从进化的角度看，基因的水平转移可以使细菌获取新的遗传物质，有利于细菌在复杂的环境中生存[19-20]。本研究在对毒力基因进行分析的过程中发现，极少数CRISPR+金葡菌携带的毒力基因数目高于CRISPR−菌株，这与Palmer等[21]的研究一致，说明在外源基因获取压力下，CRISPR/Cas系统往往处于失活状态。
细菌耐药性的产生主要依赖于耐药基因的水平转移，CRISPR/Cas系统是否能够限制耐药、毒力基因的水平转移，不同研究有不同的报道。有研究表明，一些种类的细菌几乎不携带CRISPR/Cas系统[22]；同时，也有相关研究表明，宿主菌可以通过丢失CRISPR结构来获得高度有益的外源DNA[23]。Touchon等[24]分析了263株大肠埃希菌的CRISPR/Cas系统，对CRISPR结构与耐药性的关系进行了分析，结果表明，CRISPR结构的存在并不能阻止耐药基因和质粒的水平转移。洪丽娟等[25]发现志贺菌中CRISPR结构对菌株耐药基因和耐药表型均无影响。然而，张蒙蒙等[16]发现葡萄球菌基因组中CRISPR/Cas系统携带率低，且基因座、Cas基因的结构和功能均不完善，仅较少的菌株中含有完整的CRISPR/Cas系统，完整的葡萄球菌CRISPR/Cas系统可能限制mecA基因的水平转移。Palmer等[21]发现CRISPR/Cas系统的存在限制了粪肠球菌中来自可移动元件的耐药基因间的水平传播。Marraffini等[15]通过试验证明葡萄球菌RP62a的CRISPR/Cas系统能够抵御噬菌体的入侵。同时，Watson等[26]研究表明CRISPR/Cas系统可以通过转导增强基因的水平转移。对于CRISPR结构与毒力基因的关系，Wiedenheft等[27]研究表明铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统的存在与小鼠中某些毒力基因的表达密切相关。
3.2 结论
本研究通过对公共数据库金葡菌基因组中CRISPR/Cas系统、耐药基因和毒力基因进行比对分析，并利用实验室金葡菌基因组进行验证，发现金葡菌中CRISPR结构的存在可能影响金葡菌耐药、毒力基因的水平转移。CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，表明CRISPR−菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究结果对进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播有参考意义。
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图 1 NAC固体培养基上铜绿假单胞菌的形态特征
Figure 1. Morphological characteristics of Pseudomonas aeruginosa on NAC solid medium
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图 2 oprI基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
M：DNA marker，1：铜绿假单胞菌分离株，2：阴性对照
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of PCR product for oprI gene
M: DNA marker, 1: Pseudomonas aeruginosa isolate, 2: Negative control
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图 3 死胚和环境样品中不同铜绿假单胞菌ST型的遗传进化分析
“■”：铜绿假单胞菌死胚分离株所属的ST型；“□”：铜绿假单胞菌环境样品分离株所属的ST型；“▲”：2种样品共有的ST型
Figure 3. Genetic evolution analysis of different Pseudomonas aeruginosa ST types isolated from dead embryo and environment samples
“■”: ST type of Pseudomonas aeruginosa strain isolated from dead embryo; “□”: ST type of P. aeruginosa strain isolated from environment sample; “▲”: The common ST type of P. aeruginosa strain isolated from dead embryo and environment sample
表 1 不同七彩山鸡养殖场中铜绿假单胞菌临床分离株的数量及分离率
Table 1 Quantity and isolation rate of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa from different breeding poultry farms
养殖场
Poultry
farm样本类型
Sample type样品采集数
Collected sample number阳性样品数
Positive sample number分离率/%
Isolation rateA 死胚
Dead embryo222 85 38.3
(87/227)环境
Environment5 2 B 死胚
Dead embryo96 24 21.2
(28/132)环境
Environment36 4 C 死胚
Dead embryo87 12 19.4
(30/155)环境
Environment68 18 合计
Total514 145 28.2
(145/514)
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表 2 死胚和环境样品中耐药铜绿假单胞菌菌株数量及占比1)
Table 2 Number and proportion of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa strain in dead embryo and environment samples
抗菌药
Antimicrobial死胚
Dead embryo环境
Environment总计
TotalAMP 121(100.0) 24(100.0) 145(100.0) NA 121(100.0) 24(100.0) 145(100.0) K 121(100.0) 24(100.0) 145(100.0) SXT 121(100.0) 24(100.0) 145(100.0) C 92(76.0) 24(100.0) 116(80.0) TE 90(74.4) 22(91.7) 112(77.2) CTX 27(22.3) 7(29.2) 34(23.4) LEV 7(5.8) 11(45.8) 18(12.4) CIP 7(5.8) 9(37.5) 16(11.1) TOB 7(5.8) 6(25.0) 13(9.0) CN 8(6.6) 5(20.8) 13(9.0) PRL 10(8.3) — 10(6.9) CFP 7(5.8) 3(12.5) 10(6.9) ATM 7(5.8) 1(4.2) 8(5.5) CAZ 5(4.1) — 5(3.5) FEP 4(3.3) — 4(2.8) TZP 3(1.9) — 3(2.1) IPM 1(0.8) 1(4.2) 2(1.4) MER — — — AMI — — — CES — — — POB — — — 1) AMP：氨苄西林，SXT：复方新诺明，NA：萘啶酸，K：卡那霉素，TE：四环素，C：氯霉素，PRL：哌拉西林，CTX：头孢噻肟，FEP：头孢吡肟，CAZ：头孢他啶，CFP：头孢哌酮，IPM：亚胺培南，ATM：氨曲南，TZP：哌拉西林/他唑巴坦，TOB：妥布霉素，CN：庆大霉素，CIP：环丙沙星，LEV：左氧氟沙星，IPM：亚胺培南，MER：美罗培南，AMI：阿米卡星，CES：头孢哌酮/舒巴坦，POB：多黏菌素B；括号内数据为占比；“—”表示未检测到耐药菌株
1) AMP: Ampicillin, SXT: Complex sulfamethoxazole, NA: Nalidixic acid, K: Kanamycin, TE: Tetracycline, C: Chloramphenicol, PRL: Piperacillin, CTX: Cefotaxime, FEP: Cefepime, CAZ: Ceftazidime, CFP: Cefoperazone, IPM: Imipenem, ATM: Aztreonam, TZP: Piperacillin/tazobactam, TOB: Tobramycin, CN: Gentamicin, CIP: Ciprofloxacin, LEV: Levofloxacin, IPM: Imipenem, MER: Meropenem, AMI: Amikacin, CES: Cefoperazone/sulbactam, POB: Polymyxin B; The data in brackets are proportions; “—” indicates no drug-resistant isolate
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表 3 铜绿假单胞菌的耐药谱及对应菌株数量
Table 3 Drug resistance spectrum and strain quantity of Pseudomonas aeruginosa
耐药数
Drug-resistant number耐药谱1)
Drug resistance spectrum菌株数量
Strain number4 AMP+K+NA+SXT 14 5 AMP+K+TE+NA+SXT 7 AMP+K+C+NA+SXT 18 6 AMP+K+TE+C+NA+SXT 59 AMP+CTX+K+TE+NA+SXT 6 7 AMP+CTX+K+TE+C+NA+SXT 12 AMP+PRL+CTX+CFP+K+NA+SXT 1 AMP+K+TE+C+NA+LEV+SXT 3 8 AMP+K+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 5 AMP+CTX+CFP+K+TE+C+NA+SXT 1 AMP+CTX+ATM+K+TE+C+NA+SXT 1 9 AMP+PRL+K+TOB+CN+TE+C+NA+SXT 2 10 AMP+PRL+CTX+K+TOB+CN+TE+C+NA+SXT 1 AMP+K+TOB+CN+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 2 AMP+CTX+K+CN+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 1 AMP+CTX+K+TOB+CN+TE+C+NA+CIP+SXT 1 AMP+CFP+K+TOB+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 1 11 AMP+PRL+CTX+CAZ+CFP+ATM+K+TE+C+NA+SXT 1 AMP+PRL+CTX+FEP+CAZ+CFP+ATM+K+TE+NA+SXT 1 AMP+CTX+K+TOB+CN+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 3 13 AMP+PRL+CTX+FEP+CAZ+CFP+ATM+TZP+K+TE+C+NA+SXT 3 AMP+CTX+IPM+ATM+K+TOB+CN+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 1 15 AMP+PRL+CTX+CFP+IPM+ATM+K+TOB+CN+TE+C+NA+CIP+LEV+SXT 1 1)AMP：氨苄西林，SXT：复方新诺明，NA：萘啶酸，K：卡那霉素，TE：四环素，C：氯霉素，PRL：哌拉西林，CTX：头孢噻肟，FEP：头孢吡肟，CAZ：头孢他啶，CFP：头孢哌酮，IPM：亚胺培南，ATM：氨曲南，TZP：哌拉西林/他唑巴坦，TOB：妥布霉素，CN：庆大霉素，CIP：环丙沙星，LEV：左氧氟沙星
1) AMP: Ampicillin, SXT: Complex sulfamethoxazole, NA: Nalidixic acid, K: Kanamycin, TE: Tetracycline, C: Chloramphenicol, PRL: Piperacillin, CTX: Cefotaxime, FEP: Cefepime, CAZ: Ceftazidime, CFP: Cefoperazone, IPM: Imipenem, ATM: Aztreonam, TZP: Piperacillin/tazobactam, TOB: Tobramycin, CN: Gentamicin, CIP: Ciprofloxacin, LEV: Levofloxacin
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表 4 89株铜绿假单胞菌菌株各ST型菌株数量及来源
Table 4 Quantity and source of each ST type in 89 Pseudomonas aeruginosa strains
ST型1)
ST type菌株数量
Strain number来源
SourceST型1)
ST type菌株数量
Strain number来源
SourceST-260 43 死胚 Dead embryo ST-3203 1 地面积水 Excess surface water ST-2100 15 死胚/孵化机
Dead embryo/IncubatorST-876 1 孵化机污垢 Incubator filth ST-3202 10 孵化机污垢 Incubator filth ST-1336 1 饲料Fodder ST-1971 5 死胚 Dead embryo ST-2640 1 死胚 Dead embryo ST-3200 2 死胚 Dead embryo ST-898 1 笼架污垢 Cage shelf filth ST-3201 2 饮水 Drinking water ST-1965 1 死胚 Dead embryo ST-3199 1 死胚 Dead embryo ST-3204 1 地面积水 Excess surface water ST-234 1 地面灰尘 Ground dust ST-1054 1 机械部件污垢
Mechanical component filthST-2552 1 笼架污垢 Cage shelf filth ST-2670 1 地面灰尘 Ground dust 1)ST-3199、ST-3200、ST-3201、ST-3202、ST-3203、ST-3204为本研究新发现的ST型
1)ST-3199, ST-3200, ST-3201 and ST-3202, ST-3203 and ST-3204 are the ST types discovered in this research
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1. 李轩宇，郑天尧，王越. 基于深度学习的视频信号降噪技术研究. 电视技术. 2025(01): 220-222 . 
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