Construction of AtLHT1 probe for its transport substrate screening based on FRET principle
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摘要:目的
为提高导向药物筛选通量，加快导向农药分子设计、合成、筛选等研发速度，构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白AtLHT1的荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）探针作为导向农药筛选平台。
方法构建CFP-LHT1-YFP的三明治探针，分别在大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3)原核细胞和BY4741酵母细胞中进行表达、鉴定和纯化。采用荧光酶标仪和激光共聚焦检测FRET效率的变化。
结果CFP-AtLHT1-YFP融合蛋白探针纯化后，分别与供试氨基酸和草甘膦混合，供试氨基酸和草甘膦的加入导致探针蛋白的FRET比率发生明显变化，草甘膦处理使D535 nm/D480 nm升高7%~12%，其变化趋势与阳性配体甘氨酸和谷氨酸接近，而加入阴性配体精氨酸则没有明显变化。同时，FRET比率呈现底物浓度依赖。样品中分别加入1、5和30 mmol/L的草甘膦溶液，20 min后检测到D535 nm/D480 nm分别升高3%、1%和13%，阳性配体也存在FRET比率随着底物浓度上升而升高的趋势，而阴性配体变化不规则。利用光漂白法检测到氨基酸或草甘膦处理后单个酵母细胞的FRET效率发生明显变化。加入阳性对照的甘氨酸和谷氨酸后，FRET效率变化明显，其中，甘氨酸和谷氨酸的FRET效率分别达到30%和26%；加入草甘膦处理的FRET效率与谷氨酸接近，达26%；含PBS的空白对照组没有明显的FRET效率变化。
结论AtLHT1-FRET探针可以与中性氨基酸甘氨酸和酸性氨基酸谷氨酸结合，但不结合碱性氨基酸精氨酸；FRET效率因不同底物有所差异，且具有一定的底物浓度依赖性；同时，证明了草甘膦能够被氨基酸转运蛋白AtLHT1转运。
Abstract:ObjectiveIn order to improve the efficiency of guided-pesticides screening and accelerate the research and development of molecular design, synthesis and screening of guided-pesticides, a fluorescence resonance energy transfer (FRET) probe based on Arabidopsis thaliana amino acid transporter AtLHT1 was constructed as guided-pesticide screening platform in this study.
MethodThe sandwich molecular probe of CFP-LHT1-YFP was constructed and expressed in prokaryotic cell of Escherichia coli BL21(DE3) and BY4741 yeast cell, respectively, then identified and purified. The change of FRET efficiency was detected with fluorescence microplate reader and laser scanning confocal microscope.
ResultThe CFP-AtLHT1-YFP fusion protein probe was purified and mixed with the tested amino acids and glyphosate, respectively. The addition of the tested amino acids and glyphosate resulted in significant changes in the FRET ratio of the probe protein. Glyphosate treatment resulted in the D535 nm/D480 nm increase of 7% to 12%. The similar tendency was also observed in the treatments of positive ligands using glycine and glutamic acid, but no obvious change was observed in the treatment of negative ligand using arginine. The FRET ratio showed substrate concentration dependence. At 20 min after the addition of 1, 5 and 30 mmol/L glycine, the increase of D535 nm/D480 nm were 3%, 1% and 13% respectively. FRET ratio increased with the increase of subatrate concentration in treatments with positive ligand, while the changes were not regular in treatments with negative ligand. Significant changes in FRET efficiency were also detected in individual yeast cells after treatment with amino acids or glyphosate using the photobleaching method. Changes in FRET efficiency were more pronounced with the addition of positive controls of glycine and glutamic acid, with 30% FRET efficiency for glycine and 26% for glutamic acid. The addition of glyphosate resulted in 26% FRER efficiency which was close to that of glutamic acid. The blank control containing PBS buffer showed no significant change in FRET efficiency.
ConclusionThe AtLHT1-FRET probe can bind to the neutral amino acid glycine and the acidic amino acid glutamic acid, but not to the basic amino acid arginine. The FRET efficiency varies among different substrates with some concentration dependence. It is demonstrated that glyphosate can be transported by the amino acid transporter protein AtLHT1.
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Keywords:
- Fluorescence resonance energy transfer /
- AtLHT1 /
- FRET probe /
- Guided pesticide
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木麻黄Casuarina equisetifolia属木麻黄科Casuarinaceae木麻黄属常绿乔木或灌木，原产于澳大利亚、太平洋诸岛以及亚洲东南部[1-2]。木麻黄由于生长迅速、耐干旱、防风固沙、耐盐碱和生物固氮等特殊功能，广泛用于热带亚热带地区沿海防护林的建设，是我国东南沿海和华南地区不可替代的防护林树种，同时也是重要的经济林和园林绿化树种[3-6]。近年来，由于沿海木麻黄树种单一，缺少抗病品种以及自然灾害等因素的影响，木麻黄青枯病菌Ralstonia solanacearum的发生日趋严重，制约了沿海木麻黄防护林的发展，对我国东南沿海的生态环境和生态安全构成严重的威胁[7]。木麻黄青枯病是危害木麻黄最严重的一种细菌性土传病害[8]，作为木麻黄的“癌症”，目前尚无有效的防治方法。内生真菌作为一种新型的天然活性物质资源宝库，能够产生多种结构新颖的次生代谢产物，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤以及促进植物生长和提高植物抗病性等多种生物活性，近年来，从植物内生真菌中寻找具有开发潜能的生物活性物质引起了人们极大的兴趣[9-11]。木麻黄是一种特殊类型的共生营养型植物，它不仅具有由放线菌中的弗兰克氏菌共生形成的固氮根瘤，还有内生菌根(VA或AM菌)和外生菌根，共生固氮菌和菌根菌一直是木麻黄研究的热点[12]。王璇[13]利用传统经典法对不同林龄木麻黄根内生真菌进行分离，基于Biolog微生物自动分析系统鉴定出4株木麻黄根内生真菌，分别为棘孢曲霉、梅林青霉、新萨托菌属和离生青霉。林燕青等[14]从木麻黄根和枝条中分离得到65株内生真菌，并从中初步筛选出28株有促生作用的菌株。目前对木麻黄内生真菌次生代谢产物抗细菌和抗氧化活性的研究鲜见报道。本研究通过采集木麻黄的枝条和果实，采用组织块分离法分离枝条和果实中的内生真菌，并测定内生真菌次生代谢产物的抗细菌和抗氧化活性，从中筛选具有抗氧化和抗木麻黄青枯病菌的活性菌株，以期为木麻黄青枯病的防治以及内生真菌资源的综合开发和利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
健康的木麻黄枝条(2年生)和果实，2015年10月14日采自华南农业大学校园，标本由华南农业大学林学与风景园林学院李镇魁教授鉴定。
SHZ-D3循环水式多用真空泵(广州市臻胜仪器设备有限公司)；旋转蒸发器OSB-2100(东京理化器械株式会社)；SW-CJ-2G型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；LRH系列生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；HQ45恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)；JJ300型电子天平(苏制)；DSX-280KB30手提式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；ZF-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂)。
硫酸链霉素(美国Sigma公司，w=99%)；GF254薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；噻唑蓝(MTT)生物显色剂(Amresco公司)；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均为分析纯(天津富宇精细化工厂)；DNA抽提取试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌的分离和纯化
内生真菌的分离采用Shan等[15]的方法。将木麻黄枝条和果实用清水洗净，用φ为70%的乙醇溶液处理30 s后，再用w为0.2%的氯化汞溶液处理20 min，最后用无菌水冲洗3次，每次5 min，置于无菌滤纸上晾干。去除表皮后，将枝条分成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的块段，放在PDA培养基平板上(含500 μg/mL的硫酸链霉素)，3块/皿，在28 ℃恒温培养箱内暗培养，待内生真菌长出后，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到PDA培养基上，连续纯化多次，至菌落形态一致为止。4 ℃保存，备用。
1.2.2 内生真菌的鉴定
将内生真菌菌株接种于PDA平板上，28 ℃恒温培养5~10 d，观察、记录菌落形态并拍照，在光学显微镜下观察菌丝和产孢情况。内生真菌的分子生物学鉴定参照冯皓等[16]的方法，将纯化后的菌株(在PDA平板生长5 d)接种到马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养5 d，4层纱布过滤并用无菌水冲洗掉残留PDB，然后用滤纸吸干获得菌丝。用液氮将菌丝充分研磨至粉末状，采用试剂盒法提取DNA。采用真菌的通用引物ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) 和ITS5 (5´-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3´)扩增ITS序列。反应体系为：2×Taq PCR MasterMix (含染料) 25 μL，ITS4 (10 μmol/L) 1 μL，ITS5 (10 μmol/L) 1 μL，模板 DNA (10 ng/μL) 3 μL，双蒸水补足到 50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃ 保存。将测序成功的序列使用DNAMAN软件进行互补拼接，将正向与反向引物互补序列两端加上引物序列拼接成完整序列，将扩增所得的rDNA-ITS序列在NCBI网站上进行Blast，在GenBank数据库中进行相似性检索，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，使用MAFTT version 7进行序列处理后，用MEGA 7.0.26软件采用最大似然法(Maximum likelihood)构建系统发育树，其中Bootstrap method中重复抽样次数设置500，模式为General time reversible model。将最终的鉴定结果和所得的rDNA-ITS序列提交到GenBank 数据库，获得其登录号。
1.2.3 内生真菌次生代谢产物的制备
内生真菌的发酵培养采用大米固体培养基，先将内生真菌菌株活化3~5 d，采用PDB培养基培养种子，将培养好的种子接入已灭菌的大米培养基中，培养温度为28 ℃，培养时间为60 d。发酵产物用乙酸乙酯和丙酮的混合液冷浸提取3次，每次7 d。将提取液减压浓缩得到其次生代谢产物，4 ℃保存备用。
1.2.4 抗细菌活性的测定
供试细菌分别为根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens(G−)、大肠埃希菌Escherichia coli(G−)、青枯病菌(G−)、黄瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans(G−)、番茄疮痂病菌Xanthomonas vesicatoria(G−)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(G+)和溶血葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus(G+)。采用TLC-MTT-生物自显影法测定内生真菌次生代谢产物对不同供试细菌的抑制活性[17]。将次生代谢产物溶解，用直径为0.5 mm的毛细管在薄层层析板上点样，点样量为5 μL。采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行薄层层析，薄层层析后在薄层板的一侧原点处点5 μL的0.2 mg/mL硫酸链霉素作为阳性对照。向灭菌的LB半固体培养基(琼脂质量浓度为5 g/L)中加入一定量准备好的菌液(45 mL LB+5 mL菌液)，调至约108 CFU/mL，振荡摇匀。用喷样器将制备好的菌悬液均匀喷洒到层析后的硅胶板上；待培养基在硅胶板上冷却后，将硅胶板置于培养皿中于4 ℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的扩散；然后将培养皿置于28 ℃下保湿培养，12 h后取出硅胶板，在其上均匀喷洒噻唑蓝(MTT)，约10 min后观察试验结果。有抗菌活性成分处，供试细菌由于受到活性成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试细菌正常生长，MTT显色后显蓝色。通过抑菌斑的迁移率(Rf)评价样品中抗菌化合物的极性，根据抑菌斑的大小和多少评价活性化合物的抑菌活性和数量。
$$ {R_{\rm{f}}} = \frac{{\text{斑点与点样处之间的距离}}}{{\text{展开剂前沿与点样处之间的距离}}}\text{。} $$ (1) 1.2.5 抗氧化活性的测定
采用多孔板−DPPH显色法[18]测定内生真菌次生代谢产物对DPPH的清除率，以IC50来表示内生真菌次生代谢产物的抗氧化能力。用DMSO配制质量浓度为100 mg/mL的母液，然后采用倍半稀释法依次稀释成质量浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 mg/mL的样品溶液。阳性对照为BHT，初始质量浓度为2.0 mg/mL，采用倍半稀释法依次稀释成1~0.031 25 mg/mL的阳性对照溶液。向96微孔板中加入80 μL质量浓度为0.2 mg/mL的DPPH无水乙醇溶液，再加入20 μL系列质量浓度的待测样品溶液或阳性对照溶液，振荡摇匀，在37 ℃下水浴30 min，517 nm下测定光密度(D517 nm)。以20 μL DMSO溶液代替样品溶液作为空白对照，每个处理3个重复，供试样品对DPPH清除率的有效中浓度(IC50)计算公式如下：
$$ {\rm{I}}{{\rm{C}}_{{\rm{50}}}} = \frac{{{\text{空白对照}}{D_{517\;{\rm{nm}}}} - {\text{样品溶液}}{D_{517\;{\rm{nm}}}}}}{{{\text{空白对照}}{{{D}}_{517\;{\rm{nm}}}}}} \times 100{\text{%}}\text{。} $$ (2) 所得数据采用Excel软件进行作图分析，供试样品浓度取对数(X)，抑制率换算成几率值(Y)，求得抗氧化活性的回归方程(Y=aX+b)。
2. 结果与分析
2.1 木麻黄内生真菌的分离和鉴定结果
采用组织块分离法从木麻黄枝条和果实中分离内生真菌，从枝条中分离到33株，从果实中分离到20株，通过菌落形态观察，初步合并相同的菌株，从木麻黄枝条和果实中共分离得到12株形态各异的内生真菌，分别命名为Cef-1~Cef-12，其菌落形态如图1所示。由图1可见，木麻黄内生真菌菌落规则圆形，气生菌丝发达，多为白色，Cef-6为灰色，Cef-5边缘白色，中间灰色；除Cef-3、Cef-5和Cef-6外，其他内生真菌生长迅速，尤其是Cef-4，3 d即可长满培养皿(直径为7.5 cm)，后期在菌落表面产生淡绿色的霉层，为分生孢子。光学显微镜下发现所有内生真菌菌丝均有隔膜，为有隔菌丝，但多数内生真菌未见产孢。
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图 1 从木麻黄枝条和果实中分离到的12株内生真菌Figure 1. Twelve strains of endophytic fungi isolated from branches and fruits of Casuarina equisetifoliaa:Cef-1, b:Cef-2, c:Cef-3, d:Cef-4, e:Cef-5, f:Cef-6, g:Cef-7, h:Cef-8, i:Cef-9, j:Cef-10, k:Cef-11, l:Cef-12通过形态学很难进行准确的鉴定，因此采用分子生物学方法进一步对筛选出的形态各异的内生真菌进行鉴定。通过PCR扩增、测序后，将拼接完整的ITS序列提交至GenBank，获得其登录号，并构建系统发育树(图2)，综合菌落形态和显微观察以及构建的系统发育树，木麻黄内生真菌的最终鉴定结果如表1所示。从木麻黄枝条和果实中共鉴定出12株不同的内生真菌，其中从枝条和果实中各鉴定出7株，Cef-1(Pseudofusicoccum sp.)和Cef-7(Pestalotiopsis sp.)为枝条和果实共有菌株。从分离到的内生真菌可以看出，木麻黄内生真菌存在明显的生物多样性，且不同部位的内生真菌存在明显差异。12株内生真菌主要分布于Pseudofusicoccum、葡萄座腔菌属Botryosphaeria、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis、木霉属Trichoderma、曲霉属Aspergillus、裂菌属Rhytidhysteron、拟茎点霉属Phomopsis、镰刀菌属Fusarium和炭疽菌属Colletotrichum等9个不同的属中。葡萄座腔菌属种类最多，有3株菌株，分别为Cef-2(KX960803)、Cef-10(KX960811)和Cef-12(KX960815)，说明葡萄座腔菌属菌株为木麻黄内生真菌的优势种群；其次是拟盘多毛孢属真菌，有Cef-3(Pestalotiopsis sp.)和Cef-7共2株菌株；其他属的内生真菌均为1株。BLAST的结果显示，所有菌株相似性均在99%以上，5株(Cef-2、Cef-6、Cef-10、Cef-11和Cef-12)内生真菌的相似性为100%(图2)。
表 1 木麻黄内生真菌及分布Table 1. Endophytic fungi of Casuarina equisetifolia and distribution菌株
Strain登录号
Accession number鉴定结果
Identification result最大相似菌株
Closest related species相似性/%
Similarity分离部位
SeparatedpartCef-1 KX960802 Pseudofusicoccum sp. MF281194.1 Pseudofusicoccum ardesiacum 99 枝条，果实 Branch，fruit Cef-2 KX960803 Botryosphaeria sp. KX538959.1 Botryosphaeria sp. 100 枝条 Branch Cef-3 KX960804 Pestalotiopsis sp. HQ607992.1 Pestalotiopsis disseminata 99 枝条 Branch Cef-4 KX960805 Trichoderma sp. FJ478135.1 Trichoderma lixii 99 枝条 Branch Cef-5 KX960806 Aspergillus sp. HQ832960.1 Aspergillus sp. 99 枝条 Branch Cef-6 KX960807 Rhytidhysteron sp. FJ037729.1 Rhytidhysteron sp. 100 枝条 Branch Cef-7 KX960808 Pestalotiopsis sp. LC206586.1 Pestalotiopsis cocculi 99 枝条，果实 Branch，fruit Cef-8 KX960809 Phomopsis sp. GU595059.1 Phomopsis sp. 99 果实 Fruit Cef-9 KX960810 Fusarium sp. HQ630966.1 Fusarium sp. 99 果实 Fruit Cef-10 KX960811 Botryosphaeria sp. KF531822.1 Botryosphaeria mamane 100 果实 Fruit Cef-11 KX960812 Colletotrichum sp. KR445677.1 Colletotrichum siamense 100 果实 Fruit Cef-12 KX960815 Botryosphaeria sp. GU594225.1 Botryosphaeria dothidea 100 果实 Fruit ![]()
图 2 依据木麻黄内生真菌rDNA-ITS序列构建的系统发育树Figure 2. Phylogenetic tree of endophytic fungi in Casuarina equisetifolia based on rDNA-ITS sequence2.2 内生真菌次生代谢产物的抗细菌活性
采用TLC-MTT-生物自显影法测定了木麻黄内生真菌次生代谢产物对7种供试细菌的抑制活性(表2)。由表2可见，除内生真菌Cef-3和Cef-6(Rhytidhysteron sp.)未表现出任何抗菌活性外，其他内生真菌提取物均表现出一定的抑菌活性，且对不同的供试细菌抑菌活性差异较大。Cef-2 (Botryosphaeria sp.)表现出最强的抑制活性，对所有供试细菌的抑菌斑直径均大于10 mm，且强于阳性对照硫酸链霉素，Rf的范围也最大，在0.00~0.58的范围内均有抑菌活性。多数内生真菌抑菌斑的Rf在0~0.20之间，Rf越小，化合物的极性越大，说明具有活性的化合物多为极性较大的化合物。内生真菌Cef-2在Rf为0.38~0.58的范围内也表现出较好的抗菌活性，属于中等极性的化合物。Cef-1、Cef-4、Cef-5、Cef-8、Cef-9、Cef-10和Cef-11等7种内生真菌对所有供试细菌均表现出抑制活性；Cef-12仅对大肠埃希菌、黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌表现出抑制活性；Cef-7对青枯病菌和溶血葡萄球菌未表现出抑制活性。从对青枯病菌的抑制活性来看，内生真菌Cef-2的抑制活性最强，抑菌斑直径大于10 mm，Rf为0.00~0.22和0.43~0.58；Cef-1、Cef-4、Cef-5、Cef-8、Cef-9和Cef-10对青枯病菌也表现出较好的抑制活性，抑菌斑的最大直径在5~10 mm之间。不同内生真菌提取物对革兰阳性菌和革兰阴性菌的抑制活性无明显差异。
表 2 木麻黄内生真菌提取物对不同供试细菌的抑制活性(Rf)1)Table 2. Antibacterial activities of endophytic fungus crude extracts of Casuarina equisetifolia against different tested bacteria供试菌株
Tested
strain青枯病菌
Ralstonia
solanacearum根癌土壤杆菌
Agrobacterium
tumefaciens枯草芽孢杆菌
Bacillus
subtilis大肠埃希菌
Escherichia
coli黄瓜角斑病菌
Pseudomonas
lachrymans番茄疮痂病菌
Xanthomonas
vesicatoria溶血葡萄球菌
Staphylococcus
haemolyticusCef-1 0.00~0.18++ 0.00~0.17++ 0.00~0.18+++ 0.00~0.17+++ 0.00~0.18+++ 0.00~0.18++ 0.00~0.20++ Cef-2 0.00~0.22+++，0.43~0.58+++ 0.00~0.17+++，0.40~0.55+++ 0.00~0.18+++，0.34~0.37++，0.40~0.55+++ 0.00~0.18+++，
0.38~0.52+++0.00~0.22+++，0.32~0.58+++ 0.00~0.17+++，0.38~0.52+++ 0.00~0.17++，0.42~0.55+++ Cef-3 — — — — — — — Cef-4 0.00~0.13++ 0.00~0.03+ 0.00~0.13++ 0.00~0.05++ 0.00~0.12++ 0.00~0.15++ 0.00~0.15++ Cef-5 0.00~0.12++ 0.00~0.1++ 0.00~0.13++ 0.00~0.12++ 0.00~0.12++ 0.00~0.12++ 0.00~0.12++ Cef-6 — — — — — — — Cef-7 — 0.00~0.03+ 0.00~0.08+ 0.00~0.03+ 0.00~0.07++ 0.00~0.08+ — Cef-8 0.00~0.15++ 0.00~0.08++，0.48~0.58+ 0.00~0.08++ 0.00~0.27++ 0.00~0.12+++ 0.00~0.08++ 0.00~0.10++ Cef-9 0.00~0.18++ 0.00~0.15++ 0.00~0.13++ 0.00~0.18+++ 0.00~0.18++ 0.00~0.17++ 0.00~0.17++ Cef-10 0.00~0.10++ 0.00~0.17++ 0.00~0.17+++ 0.00~0.12++ 0.00~0.17++ 0.00~0.15+ 0.00~0.17++ Cef-11 0.0~0.12+ 0.00~0.13++ 0.00~0.10+ 0.00~0.10++ 0.00~0.12++ 0.00~0.12+ 0.00~0.17++ Cef-12 — — — 0.00~0.07++ 0.12~0.15++ 0.00~0.22++ — CK ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ 1) “—” 表示无抗菌活性；“+” 表示抗菌斑最大直径(d)<5 mm，“++” 表示 5 mm≤d<10 mm，“+++” 表示d≥10 mm；CK：阳性对照硫酸链霉素，仅在原位点样
1) “—”: Inhibition spot was not observed; “+”: The maximum diameter of inhibition spot (d)<5 mm; “++”: 5 mm≤d <10 mm; “+++”: d≥10 mm; CK: the positive control streptomycin sulfate which was only sampled on TLC plate2.3 内生真菌次生代谢产物的抗氧化活性
采用多孔板−DPPH显色法测定了内生真菌次生代谢产物的抗氧化活性，结果如图3所示。由图3可见，内生真菌Cef-2的抗氧化活性最好，IC50为0.80 mg/mL，但弱于阳性对照BHT (IC50为0.18 mg/mL)；内生真菌Cef-4、Cef-11和Cef-6也表现出较好的抗氧化活性，IC50均小于2.00 mg/mL；Cef-1、Cef-3和Cef-7的抗氧化活性相对较弱，IC50均大于10.00 mg/mL。其他内生真菌的IC50在2.00~4.00 mg/mL之间。
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图 3 木麻黄内生真菌次生代谢产物对DPPH自由基的清除活性CK：阳性对照BHT；1~12分别表示菌株Cef-1、Cef-2、Cef-3，Cef-4、Cef-5、Cef-6、Cef-7、Cef-8、Cef-9、Cef-10、Cef-11和Cef-12Figure 3. DPPH free radical scavenging activities of secondary metabolites from endophytic fungi of Casuarina equisetifoliaCK: The positive control BHT; 1−12 were Cef-1, Cef-2, Cef-3, Cef-4, Cef-5, Cef-6 , Cef-7, Cef-8, Cef-9, Cef-10, Cef-11 and Cef-12, respectively3. 讨论与结论
内生真菌在植物中广泛存在，但不同植物以及同一植物不同部位内生真菌的种类和数量均存在较大差异。本研究从木麻黄枝条和果实中分离、纯化和鉴定得到12株内生真菌，鉴定结果表明枝条和果实中内生真菌的种类存在较大差异，相同的菌株只有2株，可能与不同部位的生存环境有关。葡萄座腔菌属为木麻黄内生真菌的优势种群，葡萄座腔菌属是多种植物的内生真菌。Ibrahim等[19]从阿尔卑斯山脉的花白蜡树Fraxinus ornus中分离到Botryosphaeria dothidea，且为该树的优势内生真菌菌株；Aghdam等[20]从酸樱桃树Prunus cerasus中分离到内生真菌B. dothidea；Zhong等[21]从药食两用植物苦荞麦Fagopyrum tataricum中分离到Botryosphaeria sp. KC218456，同时也分离到镰刀菌属等多种内生真菌。内生真菌和病原菌之间往往存在竞争关系，对病原菌表现出一定的抗性，植物病原真菌也许可以看成是一类特殊的“内生真菌”[22]。本研究分离到拟茎点霉属、葡萄座腔菌属、镰刀菌属和炭疽菌属等多种内生真菌，其中拟茎点霉属可引起核桃枝枯病[23]，此外还会侵染果实等，引起果腐、溃疡等症状[23-24]；葡萄座腔菌属是多种树木溃疡病和枝枯病的病原菌，在世界范围内分布广泛[25-26]；镰刀菌属和炭疽菌属更是人们熟知的植物病原菌，可引起多种植物的枯萎和叶片坏死[27-28]。内生真菌在某种寄主中共生、在另外的一些寄主中又成为病原菌的这种转变机制现在仍不明确，未来也是研究的热点。
内生真菌与宿主植物在长期的协同进化过程中，形成了相互稳定的生态关系，内生真菌不仅可以给植物提供所需的营养物质，还参与植物的防卫功能，增强植物抗逆境、抗病害的能力[29]。地中海松Pinus halepensis内生真菌木霉属Trichoderma spp.、出芽短梗霉Aureobasidium pullulans等均可有效抑制枯梢病病斑的扩展[30]。小麦Triticum aestivum内生菌钩状木霉Trichoderma hamatum、青霉属Penicillium sp．和淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus能够显著抑制小麦黄斑叶枯病病原菌菌落的生长[31]。内生真菌具有丰富的多样性，部分内生真菌在代谢过程中产生的活性物质在药物研发、植物病害生物防治等方面表现出了巨大的经济价值及应用前景[32]。目前从柴胡、红景天、北五味子、枸杞、刺五加、郁金、藏红花等药用植物中均分离到具有抗氧化活性物质的内生菌[33]。本研究从木麻黄枝条中分离到的内生真菌Cef-2 (Botryosphaeria sp.)对青枯病菌表现出最强的抑制活性，其次是Cef-1(Pseudofusicoccum sp.)和Cef-9(Fusarium sp.)，能否作为抗木麻黄青枯病的生防菌还有待于进一步研究。Cef-2表现出较好的抗氧化活性，在以后的研究中可作为候选菌株，进一步分离、纯化和鉴定其中的活性成分，为将来生物农药的大规模开发应用和病害的生物防治奠定基础。此外，并不是所有内生真菌都能在PDA或人工培养基上培养，因此分离到的这12株内生真菌只是木麻黄内生真菌的一部分。在后续的研究中可以尝试采用不同的培养基，分离得到尽可能多的内生真菌，并比较不同培养基内生真菌的分布和生长情况。
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图 1 CFP-LHT1-YFP三明治探针表达载体的构建
Figure 1. Construction of expression vector of CFP-LHT1-YFP sandwich probe
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图 2 目的基因片段的获取及表达载体的构建
M1：DL 2 000 DNA marker; M2：5 000 DNA marker;1~2：CFP-linker片段；3~4：linker-YFP片段；5~8：CFP-linker-YFP片段；9：线性载体pDR196-CFP-linker-YFP
Figure 2. Acquisition of target gene fragment and construction of expression vector
M1：DL 2 000 DNA marker; M2：5 000 DNA marker;1~2：CFP-linker fragment；3~4：linker-YFP fragment；5~8：CFP-linker-YFP fragment ；9：Linear vector pDR196-CFP-linker-YFP
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图 3 原核表达分析
M：180 000 蛋白marker；Mr：蛋白相对分子质量；1~6分别表示0、1、3、4、5、6 h诱导蛋白；7~10分别表示0、1、3、5 h诱导蛋白Western blot验证
Figure 3. Prokaryotic expression analysis
M：Blue plus 180 000 marker；Mr：Relative molecular weight of protein；1-6: Induced protein at 0, 1, 3, 4, 5, 6 h；7-10: Western blot validation of induced protein at 0, 1, 3, 5 h
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图 4 不同底物对LHT1-FRET探针光强变化
不同小写字母者表示0.05水平差异显著（Duncan’s法）
Figure 4. Changes in light intensity of the LHT1-FRET probe with different substrates
Different lowercase letters indicate siginificant difference at 0.05 level (Duncan’s method)
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图 5 不同底物浓度对LHT1-FRET探针光强变化（D535 nm/D480 nm）的影响
Figure 5. Effects of substrate concentrations on the light intensity (D535 nm/D480 nm) of the LHT1-FRET probe
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图 6 荧光分子漂白（514 nm激光）前、后的光强变化
Figure 6. Changes of light intensity in fluorescent molecules before and after 514 nm laser bleaching
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