Development of ERA detection method for African swine fever virus based on B646L, EP402R and MGF360/505 genes
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摘要:目的
建立一种基于酶促重组酶扩增(Enzymatic recombinase amplification，ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) DNA快速检测方法。
方法参考ASFV B646L基因、EP402R基因和多基因家族成员MGF360/505基因保守序列，设计特异性的ERA探针和引物，经过反应条件的优化，建立42 ℃等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。
结果ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF 3个检测方法分别在16、7和13 min内即可得出检测结果；特异性强，对阳性样品拷贝数的检测下限均为102 μL−1；与我国非洲猪瘟诊断技术标准中的方法对比，结果符合率为100%。
结论本研究建立的 ERA检测方法可以用于ASFV的快速检测，为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。
Abstract:ObjectiveTo establish a rapid detection method of African swine fever virus (ASFV) DNA based on enzymatic recombinase amplification (ERA) technology.
MethodSpecific ERA probes and primers were designed according to the conserved sequences of B646L and EP402R genes, and MGF360/505 gene which was one of the ASFV multigene family members. Through optimizing reaction conditions, the ERA method for detecting ASFV DNA was finally established under the isothermal condition of 42 ℃.
ResultThe detection results of three methods of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF could be obtained within 16, 7 and 13 min respectively. The copy number detection limitation of positive sample was all 102 μL−1. The coincidence rate was 100% compared with the common method in the technical standard of ASFV diagnosis in China.
ConclusionThe established ERA method can be used for rapid detection of ASFV, and provides an effective rapid detection method for epidemiological investigation and field detection.
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图 1 PCR扩增产物结果(A~C)以及质粒鉴定结果(D~F)
M：DS2000 marker；M1：DS10000 marker；1：B646L；2：EP402R；3：MGF360/505
Figure 1. PCR amplification product results (A−C) and plasmid identification results (D−F)
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图 2 普通PCR对不同引物的检测结果
M：DS2000 marker；1：B646L-ERA-F1/R1；2：B646L-ERA-F2/R2；3：B646L-ERA-F3/R3；4：EP402R-ERA-F1/R1；5：EP402R-ERA-F2/R2；6：EP402R-ERA-F3/R3；7：MGF-ERA-F1/R1；8：MGF-ERA-F2/R2；9：MGF-ERA-F3/R3
Figure 2. Normal PCR detection results of different primers
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图 3 常规ERA对不同引物的检测结果
Figure 3. Routine ERA detection results of different primer pairs
B1: B646L-ERA-F1/R1; B2: B646L-ERA-F2/R2; B3: B646L-ERA-F3/R3; E1: EP402R-ERA-F1/R1; E2: EP402R-ERA-F2/R2; E3: EP402R-ERA-F3/R3; M1: MGF-ERA-F1/R1; M2: MGF-ERA-F2/R2; M3: MGF-ERA-F3/R3
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图 4 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的特异性检测
PRRSV：猪繁殖和呼吸综合征病毒，PRV：伪狂犬病毒，CSFV：猪瘟病毒
Figure 4. The specificity detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods
PRRSV: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRV: Pseudorabies virus, CSFV: Classical swine fever virus
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图 5 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的灵敏性检测
Figure 5. The sensitivity detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods
表 1 ERA探针序列与构建目的片段的引物序列
Table 1 ERA probe sequence and primer sequence for constructing target fragment
引物/探针
Primer/probe序列(5′→3′)
Sequence产物长度/bp
Product sizeB646L-ERA-probe CTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCT(FAM-dT)(THF)
(BHQ1-dT)CTCTGCGTGGTGAGTGG-C3-spacerB646L-ERA-F1 CGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGG 173 B646L-ERA-R1 GATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAAC B646L-ERA-F2 ACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTA 135 B646L-ERA-R2 CGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGG B646L-ERA-F3 CGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGG 137 B646L-ERA-R3 GAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTA EP402R ERA-probe CATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG(FAM-dT)(THF)
(BHQ1-dT)AATACACCTATTTAC-C3-spacerEP402R-ERA-F1 CCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATG 188 EP402R-ERA-R1 CACGGTTTAGGTAAGGGAAATGGGTTGAGT EP402R-ERA-F2 CGGTTTAGGTAAGGGAAATGGGTTGAGTGG 195 EP402R-ERA-R2 CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAG EP402R-ERA-F3 CCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAG 197 EP402R-ERA-R3 CACGGTTTAGGTAAGGGAAATGGGTTGAGT MGF-ERA-probe CAGCGCGTAACAGTAATATATTGTTAATGGAT(FAM-dT)(THF)
(BHQ1-dT)TATCCTTGGTAGAAGC-C3-spacerMGF-ERA-F1 TTGTACTGAAGTAAGCATAGCTTGGTTGAT 194 MGF-ERA-R1 GAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTAT MGF-ERA-F2 GAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTAT 192 MGF-ERA-R2 TATTGTACTGAAGTAAGCATAGCTTGGTTG MGF-ERA-F3 GTACTGAAGTAAGCATAGCTTGGTTGATGT 196 MGF-ERA-R3 GAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTAT B646L-18t-F TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCTGAAC 1 941 B646L-18t-R ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTAT EP402R-18t-F TAAAATGATAATACTTATTTTTTTAAT 1 087 EP402R-18t-R TTAAATAATTCTATCTACGTGAATA MGF-18t-F GTGTTGACAGATACCAGCCCGTAG 2 559 MGF-18t-R GTAAAGGCCGTGAAGAGCGATAA 
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表 2 L9(33)试验方案
Table 2 L9(33) experimental program
序号
Order numberθ/℃ 探针体积/μL
Probe volume引物体积/μL
Primer volume激活剂体积/μL
Activator volume1 37 0.24 0.84 1 2 37 0.48 2.10 2 3 37 0.72 3.15 3 4 39 0.24 2.10 3 5 39 0.48 3.15 1 6 39 0.72 0.84 2 7 42 0.24 3.15 2 8 42 0.48 0.84 3 9 42 0.72 2.10 1
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表 3 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的重复性检测
Table 3 The repeatability detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods
方法
Method标准质粒拷贝数/μL−1
Standard plasmid copy number循环数
Cycle number变异系数/%
Coefficient of variationERA-ASFV-B646L 105 6.71 5.54 104 8.79 6.15 103 13.86 10.57 ERA-ASFV-EP402R 105 6.64 1.20 104 8.30 9.15 103 8.64 10.45 ERA-ASFV-MGF 105 6.92 5.95 104 9.64 1.72 103 11.73 5.61
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