Diversity of endophytic bacteria of Dendrobium officinale under different growth conditions and screening of active strains
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摘要:目的
比较和分析野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生细菌分布特点，筛选有较强定殖能力的活性菌株，为促进野生铁皮石斛驯化、提高药材品质奠定基础。
方法采用组织块分离法分离铁皮石斛根、茎、叶各部位的内生细菌，利用16S rDNA序列和系统发育树对分离菌株进行分析鉴定，体外筛选具有解磷、解钾、固氮、产铁载体、产IAA、拮抗病原菌的促生活性菌株，回接后再分离，观察内生细菌在组培苗中的定殖动态。
结果从铁皮石斛中分离到285株内生细菌，其中，217株分离自野生铁皮石斛，归类于3门9属，以芽孢杆菌属Bacillus和不动杆菌属Acinetobacter为优势菌群存在于根、茎、叶中，其菌株数分别占总分离菌株数的79.26%和8.76%；68株内生细菌分离自人工栽培铁皮石斛，归类于1门3属，以伯克霍尔德菌属Burkholderia和埃希菌属Escherichia为优势菌群存在于根、茎中，其菌株数分别占总分离菌株数的54.41%和30.88%。泛菌属Pantoea在野生和人工栽培铁皮石斛中均有分布。野生铁皮石斛内生细菌的物种数(9)和多样性指数(0.85)明显高于人工栽培铁皮石斛(物种数为3，多样性指数为0.61)。活性筛选共获得38株菌株，占筛选菌株的45%，4株野生铁皮石斛的活性内生细菌中有3株在人工组培苗具有较好的定殖性。
结论野生与人工栽培铁皮石斛内生细菌的类群结构和生物多样性具有明显差异，铁皮石斛内生细菌蕴含丰富的促生潜力。
Abstract:ObjectiveTo compare and analyze the distribution characteristics of endophytic bacteria in wild and cultivated Dendrobium officinale, and screen active strains with strong colonization ability. To lay the foundation for improving the domestication of wild D. officinale and the quality of medicinal materials.
MethodThe endophytic bacteria were isolated from the root, stem, leaf of D. officinale by tissue block separation method, and 16S rDNA sequence and phylogenetic tree were used to identify the isolated strains. The probioticactive bacterial strains with the abilities of phosphate-solubilizing, potassium-dissolving, nitrogen-fixing, siderophore-synthesizing, IAA-producting and antagonistic activity of pathogen were screened in vitro. The colonization dynamics of endophytic bacteria in tissue culture seedlings were observed after backgrafting and separation.
ResultA total of 285 endophytic bacteria strains were isolated from D. officinale, among which 217 were isolated from wild D. officinale, which were classified into three phylums and nine genera. Bacillus and Acinetobacter strains accounted for 79.26% and 8.76% of the total isolated strains respectively, and were the dominant bacteria. Only 68 endophytic bacteria strains were isolated from the cultivated D.officinale, which were classified into one phylum three genera, Burkholderia and Escherichia accounted for 54.41% and 30.88% of the total isolated strains respectively, and were the dominant bacteria. Only Pantoea was distributed in both wild and cultivated D. officinale. The number of endophytic species (9) and diversity index (0.85) of wild D. officinale were obviously higher than those of cultivated D. officinale (3 and 0.61 respectively). A total of 38 strains were obtained by active screening, accounting for 45% of the screened strains and three of four strains of endophytic bacteria from wild D. officinale showed good colonization in artificial tissue culture seedlings.
ConclusionThe biodiversity and community structure of endophytic bacteria of wild and artificially cultivated D. officinale are obviously different and the endophytic bacteria contains abundant potential of growth promotion.
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Keywords:
- Dendrobium officinale /
- endophytic bacteria /
- diversity /
- growth promotion potential /
- colonization
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全球变暖和日益频繁的国际贸易活动加速了外来物种的入侵，且对当地生物多样性、生态系统和作物生产构成重大威胁，造成巨大的经济损失[1]。椰子织蛾Opisina arenosella 是近年来发现危害棕榈科植物的入侵性食叶害虫，最早于19世纪中期在印度和斯里兰卡被发现，此后相继在缅甸、印度、孟加拉、印度尼西亚、泰国、马来西亚、巴基斯坦等地发生为害[2-4]。在我国，该虫于2013年8月首次在海南省万宁市被发现，随后快速扩散至广东、广西和福建等地[5-6]。椰子织蛾可危害不同年龄的棕榈科Palmae植物，幼虫从棕榈科植物的下部老叶逐步向上取食，向新叶扩展，幼虫将叶肉吃光，形成干枯状，幼虫排出的粪便会在叶片背面形成织丝虫道，幼虫在里面潜行，危害严重时使下部的叶片焦枯如火烧状，甚至使植株整个树冠叶片干枯，在短期内就能造成树体死亡[4]。此外，椰子织蛾成虫具有较强飞翔能力，可进行远距离扩散[7]。
目前关于椰子织蛾的研究主要集中在化学防治[8]、生物防治[9-10]和生物学特性等[11-12]方面，有关地理种群的遗传结构以及分化方面的研究报道较少。分子标记技术已越来越多应用于入侵害虫的研究工作中，如美国白蛾Hyphantria cunea[13]、舞毒蛾Lymantria dispar[14]、瓜实蝇Bactrocera cucuribitae[15]和美洲斑潜蝇Liriomyza sativae[16]等。线粒体COI基因是目前使用最广泛的分子标记之一，常被应用于分析入侵物种的遗传变异、种群结构、系统发育和系统地理模式等，对于揭示入侵种群的起源、种群基因交流、灾变遗传机制与分子进化等具有重要意义[17-18]。
本研究采用COI基因片段对国内10个地区及国外3个地区的椰子织蛾种群进行单倍型检测，并与其他地区公布的椰子织蛾序列进行比较分析，探讨入侵中国的椰子织蛾的虫源信息，了解扩张历史，进一步预测该虫的入侵发展途径，为椰子织蛾综合防治策略的提出提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试虫源
本研究的椰子织蛾来自入侵地中国海南和广东以及马来西亚、泰国和原产地印度等16个地区，共采集172个样本，其中序号12~16的种群序列从GenBank下载获得。将采集的新鲜样品浸泡于无水乙醇，–20 ℃冰箱保存，备用。所采集的样本均有定位信息并进行了标注，详细样本采集信息列于表1。
表 1 不同地理种群椰子织蛾样本信息Table 1. Sample information of Opisina arenosella from different geographical populations序号
Serial
number种群代码1)
Population
code采集地点
Collecting place采集时间
Collecting time样本量
Sample
size经纬度
Longitude and latitude虫态
Insect stage寄主
Host1 HNHK 中国海南海口
Haikou, Hainan, China2018−08 17 110.32°E
20.07°N幼虫 Larva、
蛹 Pupa椰子 Cocos nucifera、
糖棕 Borassus flabellifer、
蒲葵 Livistona chinensis2 HNWC 中国海南文昌
Wenchang, Hainan, China2018−08 20 110.82°E
19.35°N幼虫 Larva、
蛹 Pupa椰子C. nucifera 3 HNQH 中国海南琼海
Qionghai, Hainan, China2018−08 23 110.44°E
19.25°N幼虫 Larva、
蛹 Pupa椰子 C. nucifera、
大王棕 Roystonea regia、
蒲葵 L. chinensi4 HNWN 中国海南万宁
Wanning, Hainan, China2018−08 14 110.24°E
18.49°N幼虫 Larva、
蛹 Pupa椰子C. nucifera 5 HNLS 中国海南陵水
Lingshui, Hainan, China2018−08 26 110.08°E
18.49°N幼虫 Larva、
蛹 Pupa椰子C. nucifera 6 HNSY 中国海南三亚
Sanya, Hainan, China2018−08 16 109.16°E
18.32°N幼虫 Larva、
蛹 Pupa椰子 C. nucifera、
蒲葵 L. chinensis7 HNDZ 中国海南儋州
Danzhou, Hainan, China2018−08 15 109.33°E
19.61°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 8 GDFS 中国广东佛山
Foshan, Guangdong, China2018-09 6 113.28°E
22.88°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 9 MLSY 马来西亚，吉隆坡
Kuala Lumpur, Malaysia2018-12 5 101.72°E
2.99°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 10 TLBB 泰国，北碧府
Kanchanaburi, Thailand2018-12 2 99.52°E
14.03°N蛹 Pupa 椰子C. nucifera 11 IDKL 印度，喀啦啦，加瑟勒戈德
Kerala, Kasaragod, India2019-04 10 74.99°E
12.51°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 12 IDSR* 印度，安得拉, 斯里加古兰
Srikakulam, Andhra, India2016 3 80.85°E
16.19°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 13 IDVZ* 印度, 安得拉, 维济亚讷格勒姆
Vizianagaram, Andhra, India2016 4 83.39°E
18.11°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 14 IDVS* 印度, 安得拉, 维沙卡帕特南
Visakhapatnam, Andhra, India2016 5 82.00°E
16.90°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 15 IDEG* 印度, 安得拉, 东戈达瓦里
East Godavari, Andhra, India2016 2 82.23°E
16.85°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 16 IDWG* 印度, 安得拉, 西戈达瓦里
West Godavari, Andhra, India2016 4 81.76°E
16.59°N幼虫 Larva 椰子C. nucifera 1)“*”表示该种群的序列从GenBank下载获得；IDSR的序列号为KP995715~KP995717，IDVZ的序列号为KP995718~KP995721，IDVS的序列号为KP995722~KP995726，IDEG的序列号为KP995727~KP995728，IDWG的序列号为KP995729~KP995732
1) “*”indicates the sequence of the population is downloaded from GenBank; The serial number of IDSR is KP995715-KP995717, IDVZ is KP995718-KP995721, IDVS is KP995722-KP995726, IDEG is KP995727-KP995728, and IDWG is KP995729-KP9957321.2 DNA提取、PCR扩增及序列测定
基因组DNA的提取参考印红等[19]、张德华等[20]的方法。所有样品的DNA质量在超微量紫外分光光度计(生产于上海尤尼柯UV-3802S)下测定，D260 nm/D280 nm比值均在1.7~2.0，提取的DNA稀释至500 ng /μL，−20 ℃条件下保存，备用。
根据NCBI数据库椰子织蛾线粒体COI基因序列，设计扩増片段长度为1 152 bp特异性引物。引物序列分别为正向引物: 5′-TTTTTGGAATTTGAGCAGGA-3′，反向引物: 5′-GGGATAATCCGGTAAAAAGAGG-3′。COI基因PCR反应体系为20 μL，包括2×Taq Plus Master Mix 10.0 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、Template 1.0 μL (0.1 μg)、ddH2O 7.4 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，15个循环(每个循环降1 ℃)；95 ℃预变性30 s，50 ℃变性30 s，72 ℃退火60 s，28个循环；72 ℃延伸10 min，最后修复延伸10 min。委托上海美吉生物医药科技有限公司测序。
1.3 数据分析
利用BioEdit软件对测序获得的COI基因序列进行人工修正和序列对比[21]。使用TCS 1.21构建置信度为90%的简约单倍型网络[22]。基于等位基因频率的方法，运用 Dna SP v5.10软件对入侵地区的种群进行中性检验，分析群体历史动态，同时分析每个地理种群中的单倍型组成及各个单倍型在所有地理种群中的分布情况。
2. 结果与分析
本研究共获得172条来自16个不同地理种群的椰子织蛾线粒体COI序列，其中154条在本次试验中获得，经过比对和引物删除，片段长度约为1 080 bp；18条从GenBank下载获得，片段长度为625 bp。172条序列共鉴定出12个单倍型(图1)，构成2个明显的单倍型分支，其中1个分支为单倍型HAP，由144个样本共享，包括海南琼海(HNQH)、海南陵水(HNLS)、海南海口(HNHK)、海南文昌(HNWC)、海南万宁(HNWN)、海南三亚(HNSY)、广东佛山(GDFS)，以及马来西亚吉隆坡(MLSY)、泰国北碧府(TLBB)(表2)；另1个分支由11个单倍型IN1-IN11组成，均来自印度种群，单倍型IN1是印度6个地区椰子织蛾的共享单倍型，IN2-IN11均为独享单倍型，不与其他种群共享。
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图 1 椰子织蛾12个COI单倍型网络进化关系图Figure 1. Evolution diagram of 12COI haplotypes of Opisina arenosella表 2 椰子织蛾12个COI单倍型在不同地区的分布Table 2. Distribution of 12 OpisinaarenosellaCOI haplotypes in different regions单倍型
Haplotype种群分布
Population distribution国别
Country种群代码1)
Population codeHAP 中国 China HNQH(23)、HNLS(26)、
HNHK(17)、HNWC(20)、
HNWN(14)、HNSY(16)、
GDFS(6)马来西亚 Malaysia MLSY(5) 泰国 Thailand TLBB(2) IN1 印度 India IDKL(8)、IDSR(2)、
IDVS(2)、IDEG(1)、
IDWG(3)、IDVZ(2)IN2 印度 India IDSR(1) IN3 印度 India IDVS(1) IN4 印度 India IDEG(1) IN5 印度 India IDWG(1) IN6 印度 India IDVZ(1) IN7 印度 India IDKL(1) IN8 印度 India IDKL(1) IN9 印度 India IDVS(1) IN10 印度 India IDVS(1) IN11 印度 India IDVZ(1) 1)括号中数据为共享单倍型的样本数
1)Numbers of samples sharing haplotypes are shown in parentheses序列对比显示COI单倍型包含15个变异位点(图2)，其中，73%是碱基转换，27%是碱基颠换。11个来自印度的单倍体（IN1~IN11）与分布在中国、马来西亚和泰国的单倍体HAP存在4个变异位点，位点17的碱基为嘌呤转换，位点161、257和608的碱基为嘧啶转换。
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图 2 椰子织蛾COI单倍型变异位点分布Figure 2. Variable site distribution of Opisina arenosella COI haplotypes in different regions对入侵地区椰子织蛾种群基于等位基因频率的中性检验并结合错配分布的分析结果显示，Tajima’s D 值为 −1.159 67( P>0.05)，Fu’s Fs值为−3.515(P>0.05)，二者均为负值，但分化值不显著。错配分布图(图3)显示，16个种群的所有单倍型的歧点先形成L形，而后出现单峰分布曲线，表明椰子织蛾在整体水平上并未出现快速扩张等历史事件。
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图 3 基于等位基因频率的172个椰子织蛾样本的错配分布图Figure 3. Distribution of mismatch in 172 Opisina arenosella samples based on allele frequency3. 讨论与结论
本研究对16个椰子织蛾种群的172个样本COI序列进行分析，所有序列无插入或缺失现象，并且 A+T 平均占比为68.9%，明显高于G+C 占比(31.1%)，表现出A+T碱基偏嗜，符合昆虫线粒体 DNA碱基组成结构[23]。将所有个体作为整体进行中性检测分析，种群未经历大规模的扩张，单倍型IN1在印度种群中广泛分布，并作为中心向其他单倍型发散，推断IN1是祖先单倍型；单倍型HAP则形成另一分支，并由中国、马来西亚和泰国的种群共享，表明入侵地区的椰子织蛾种群为同一基因类型或者有相同的入侵源，且该基因型在入侵地区快速繁殖和扩散，说明具有较高的适应和竞争能力。椰子织蛾在入侵地区未形成遗传分化，分析原因可能是椰子织蛾入侵我国的时间较短，新栖息地的地理环境相似，尚未积累丰富的遗传变异。
遗传变异是物种适应环境的基础，当面临新的环境条件时，丰富的遗传变异为物种适应新环境提供了选择材料。因此，较高的遗产变异可以增强环境适应能力。然而，高水平的遗传多样性并非成功入侵的必要条件[24]。外来物种在入侵过程中常伴随奠基者效应，导致遗传多样性水平降低[25-26]。一些入侵物种遗传多样性的降低反而促进其成功入侵。如阿根廷蚂蚁 Linepithema humile 入侵北美，其遗传多样性的降低减少了种群内部斗争，因此提高了种群的生存与繁殖能力，在数量上占据优势，从而形成了有利于在新环境中竞争的行为特性[27]。在本研究中，入侵中国、马来西亚、泰国等地区的椰子织蛾种群中仅检测到一种COI基因型，原产地印度椰子织蛾种群的多态位点显著多于入侵地区种群的，表明椰子织蛾入侵后遗传多样性下降，种群经历了奠基者效应。一些理论研究表明，入侵过程的瓶颈效应可以增加性状的遗传变异[28]或改变遗传背景[29]。外来物种在入侵过程中通过与转座子的相互作用影响基因组结构、组织和功能，从而促进快速适应，特别是在遗传多样性低的群体中。应激诱导的转座子活性变化可以改变基因作用，并促进遗传变异，有助于遗传多样性低的物种能够在新环境中快速适应[30-31]，使群体达到新的适应高峰。入侵地区与原产地印度的椰子织蛾单倍型均存在4个碱基位点的差异，推测是椰子织蛾种群受环境选择压力影响，在新栖息地产生了新的突变或杂交。有研究已证实线粒体的基因突变可以影响与生物学特性有关的表型变化，如灰飞虱Laodelphax striatellus在我国存在2种不同的线粒体单倍型群(HGI、HGII)，而这2种单倍型灰飞虱在产卵量和寿命等方面存在显著差异，灰飞虱线粒体DNA的变异导致了DNA复制能力的提高，使其能够抵御遗传漂变作用而被保留下来；同时这些变异带来了生殖和耐寒力方面的优势，使其能够在种群中得到扩散[32]。
在我国，椰子织蛾主要分布在纬度23.5°N以南的局部地区，且暴发为害多发生在以棕榈植物种植为主的公园、国道以及滨江滨海绿化带[33]。据报道，椰子织蛾分布最北的地区为印度德里，纬度约为28.6°N[34]。因此，椰子织蛾在我国可能向北持续扩散，且随着全球变暖日益严重，该虫向北扩散蔓延的速度将进一步加快。本研究分析了3个入侵国家的椰子织蛾单倍型，该信息对精准监测椰子织蛾，综合分析其侵入来源和扩散路径具有重要指导意义。
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图 1 基于16S rDNA建立的部分铁皮石斛内生细菌系统发育树
Figure 1. Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of partial endophytic bacteria isolated from the Dendrobium officinal
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图 2 野生铁皮石斛可培养内生细菌在属水平的相对丰度
Figure 2. The relative abundance of cultivatable endophytic bacteria isolated from wild Dendrobium officinale at the genus level
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图 3 人工栽培铁皮石斛可培养内生细菌在属水平的相对丰度
Figure 3. The relative abundance of cultivatable endophytic bacteria isolated from artificial cultivation Dendrobium officinale at the genus level
表 1 铁皮石斛内生细菌的多样性1)
Table 1 The diversity of endophytic bacteria in Dendrobium officinale
生境
Habitat植株部位
Plant part物种数
No. of bacteria
species多样性指数
Shannon-Wiener
diversity index (H′)均匀度指数
Evenness
index (E)相似性系数
Similarity coefficient (C)根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 野生
Wild根 Root 6 0.75b 0.42b 0.72 0.60 茎 Stem 9 0.80b 0.36b 0.72 0.65 叶 Leaf 5 1.02a 0.63a 0.60 0.65 整株 Whole plant 9 0.85 0.39 人工栽培
Artificial cultivation根 Root 2 0.47b 0.68b 0.44 0.70 茎 Stem 3 0.87a 0.80a 0.44 0.64 叶 Leaf 3 0.93a 0.84a 0.70 0.64 整株 Whole plant 3 0.61 0.56 1)相同生境同列数据后的不同小写字母表示植株不同部位间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column of the same habitat indicate significant differences among different plant parts (P<0.05, Duncan’s test)
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表 2 内生菌在铁皮石斛组培苗中的定殖动态1)
Table 2 Colonization trends of endophytic bacteria in potted seedling of Dendrobium officinale
回接菌株
Backgrafted strain回接后3 d
Three days after backgrafting回接后10 d
10 days after backgrafting回接后20 d
20 days after backgrafting回接后30 d
30 days after backgrafting根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 根 Root 茎 Stem 叶Leaf Pantoea sp.B28 − + − + + + + + + + + + Acinetobacter sp.B48 − − + + + + − + + − + − Bacillus sp.B70 + + + + + + − + − − + − Curtobacterim sp.B81 − − − − − − − − − − − − 1)“−”表示没有分离到回接菌，“+”表示分离到回接菌
1) “−”denotes no isolation of inoculated bacteria; “+”denotes isolation of inoculated bacteria
下载: 导出CSV
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期刊类型引用(1)
1. 杨帆，李优佳，SHAMEER K S，阎伟，吕宝乾，蒋方一丁，章雨璐，涂艳，齐可欣. 原产地与入侵地椰子织蛾遗传分化特征. 福建农林大学学报(自然科学版). 2021(02): 178-183 . 
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