Regulatory role of circRIPK2 in proliferation and differentiation of chicken primary myoblasts
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摘要:目的
探索circRIPK2在鸡骨骼肌生长发育中的功能及作用机制。
方法依据反向剪切位点设计收敛、发散引物,并结合Sanger测序验证circRIPK2的环形结构。利用RT-PCR探究不同发育时期circRIPK2的表达水平。通过构建过表达载体,结合EdU、流式细胞术和RT-PCR,探究circRIPK2对鸡原代成肌细胞增殖分化的影响。
结果PCR电泳结果及Sanger测序证明circRIPK2环化位点真实存在。RT-PCR结果表明,和对照组相比,过表达circRIPK2后,对细胞增殖有抑制作用的标记基因p21的mRNA表达上调20%,对细胞增殖有促进作用的标记基因Cyclin B2、Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA的mRNA表达分别下调39%、22%、29%和45%;肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达分别上调了39%、56%和25%。EdU检测细胞增殖和流式细胞术检测细胞周期变化的结果表明,circRIPK2抑制细胞增殖进程。
结论circRIPK2可能通过抑制成肌细胞增殖、促进成肌细胞分化,从而影响鸡骨骼肌的生长发育过程。
Abstract:ObjectiveTo explore the function and molecular mechanism of circRIPK2 on the growth of chicken skeletal muscle.
MethodThe convergent and divergent primers were designed according to the back-splicing site, and the circular structure of circRIPK2 was verified by Sanger sequencing. RT-PCR was used to explore the expression level of circRIPK2 at different developmental stages. The circRIPK2 overexpression vector was constructed. The effect of circRIPK2 on the proliferation and differentiation of chicken primary myoblasts were detected using EdU, flow cytometry and RT-PCR technology.
ResultThe electrophoresis of PCR product and Sanger sequencing proved the existence of circRIPK2. RT-PCR result showed that comparing with control, overexpression of circRIPK2 up-regulated the mRNA expression of cell cycle-inhibiting gene p21by 20%, down-regulated the mRNA expressions of cell cycle-promoting genes Cyclin B2, Cyclin D1, Cyclin D2 and PCNA by 39%, 22%, 29% and 45% respectively, and up-regulated the mRNA expressions of differentiation marker genes MyHC, MYOG and Myomakerby 39%, 56% and 25% respectively. The EdU assay and flow cytometry analysis also indicated that circRIPK2 inhibited cell proliferation.
ConclusionCircRIPK2 may inhibit myoblast proliferation and promote myoblast differentiation, thus affecting the growth and development of chicken skeletal muscle.
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Keywords:
- circRIPK2 /
- chicken /
- skeletal muscle /
- myoblast /
- cell proliferation /
- cell differentiation /
- circular RNA
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人类基因组约70%~90%可以转录成RNA,然而仅有不足2%的基因具备编码能力[1]。众多不具备编码能力的RNA都被归作转录噪音或者剪接副产品。尽管早期研究明确显示非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)在自然界真实存在,它们的潜在作用仍没有被充分证实[2]。随着20世纪以来计算机技术的迅猛发展,人们发现这些非编码RNA在不同的生理或者病理过程中发挥着重要的调控作用[3]。环状RNA(Circular RNA,circRNA)是内源性非编码RNA家族的一员,大概40年前,研究人员逐渐关注这种具有共价闭环结构的新兴RNA分子。研究表明,circRNA在细胞中广泛分布,和线性RNA相比,不易受RNA外切酶影响,具有更高的稳定性[4]。近年来有关circRNA的生物学功能研究受到广泛关注,其作用方式多种多样,包括作为miRNA海绵、调控亲本基因转录、和蛋白质相互作用、甚至翻译小肽等方式发挥功能[5-8]。目前对circRNA生物学功能的理解仍处于早期,除了对衰老、癌症等疾病具有重要调控作用外,circRNA在肌肉发育过程中也具有重要作用。通过对不同动物的骨骼肌和成肌细胞进行circRNA测序,发现在肌肉中高表达且具有调控作用的多个circRNA,例如circFUT10、circLMO7、circRBFOX2、circFGFR4等,它们通过结合miRNA参与成肌细胞的增殖分化进程[9-12];另外也有研究发现circZNF609可以翻译微肽,且调控成肌细胞的增殖过程[8]。
RIPK2是RIP家族的一员,RIPK2的N端包含1个丝氨酸/苏氨酸结构域,C端为半胱氨酸蛋白水解酶募集域[13],研究表明,RIPK2在维持免疫系统稳态或者调节脂肪代谢等方面发挥重要作用[14-15]。Ouyang等[11]前期对不同发育时期鸡的骨骼肌进行circRNA测序,通过对测序结果的分析筛选,发现circRIPK2在3个时期差异表达,因此推测circRIPK2可能在鸡肌肉发育过程中具有重要作用。本研究利用PCR扩增、Sanger测序验证circRIPK2的存在,同时利用定量PCR、EdU试验、流式细胞术等探究circRIPK2对鸡原代成肌细胞的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
鸡胚来源于珠海市裕禾农牧有限公司。
主要试剂:DNA抽提试剂盒购自OMEGA公司;RNA反转录试剂盒购自莫纳生物科技有限公司;荧光定量PCR酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司;环状RNA过表达载体pCD2.5-ciR购自吉赛生物科技有限公司;核质分离试剂盒、FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI购自Thermo公司;RNAiso Plus购自TAKARA公司;凝胶DNA小量回收试剂盒、低内毒素质粒抽提试剂盒均购自Magen公司;转染试剂Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司;Opti-MEM无血清培养基、RPMI1640细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、马血清均购自Gibco公司;EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 鸡原代成肌细胞的分离与培养
采集11胚龄鸡胚的腿肌组织,用手术剪刀和镊子剔除可见的骨骼和皮肤组织,剩余肌肉组织剪至肉糜状,然后用胰蛋白酶在37 ℃培养箱内消化15~20 min,用完全培养基(体积分数为20%的胎牛血清+体积分数为79.5% 的RPMI+体积分数为0.5%的青霉素、链霉素)终止消化。使用70 μm过滤网过滤后,1 500 r/min离心5 min,用完全培养基对细胞进行重悬、并接种到无菌培养皿中、差速贴壁2次,获取纯化的成肌细胞,细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱内培养。
1.2.2 circRIPK2过表达载体构建
根据circRNA的测序数据,通过Ensemble数据库下载circRIPK2的基因序列,应用DNASTAR软件设计全长序列的引物(表1)。通过PCR反应获得circRIPK2的全长序列。使用FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI酶切PCR扩增产物及pCD2.5-ciR载体,酶切产物纯化后利用T4连接酶连接、22 ℃条件下放置1 h。取10 μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中,转化完成后涂板,37 ℃培养箱培养12~14 h后挑取单克隆菌落培养,菌液鉴定后,送擎科生物技术有限公司测序,比对circRIPK2基因序列和测序序列,选取结果吻合的单克隆菌落留用。
表 1 引物信息Table 1. Primers used in this study引物名称
Primer name引物序列(5′ → 3′)
Primer sequence退火温度/℃
Annealing temperature用途
ApplicationC-circRIPK2-F GCATGTCAAAATGGCGTGTCA 56 成环鉴定(收敛引物)
Verification of circRIPK2 (Convergent primers)C-circRIPK2-R ACAAGAGCTCGATGCGGAATG D-circRIPK2-F TGAATCGCCGTGTATCCACAA 56 成环鉴定(发散引物)
Verification of circRIPK2 (Divergent primers)D-circRIPK2-R AAATCTGCAATCTGATGAGA CircRIPK2-F ATTGCAGATTTTGGCATGTC 58 克隆 Cloning CircRIPK2-R CTGATGAGAGGATATTACACT QcircRIPK2-F CGACTCAAATCTCTTCCCCAG 60 RT-PCR QcircRIPK2-R TCATGTTTCACACTTGCCCG Cyclin B2-F CAGTAAAGGCTACGAAAG 60 RT-PCR Cyclin B2-R ACATCCATAGGGACAGG Cyclin D1-F CAGAAGTGCGAAGAGGAAGT 60 RT-PCR Cyclin D1-R CTGATGGAGTTGTCGGTGTA Cyclin D2-F: AACTTGCTCTACGACGACC 60 RT-PCR Cyclin D2-R: TTCACAGACCTCCAACATC PCNA-F GTGCTGGGACCTGGGTT 60 RT-PCR PCNA-R CGTATCCGCATTGTCTTCT p21-F GAAGAGTTGTCCACGATAAGC 60 RT-PCR p21-R TTCCAGTCCTCCTCAGTCC MyHC-F CTCCTCACGCTTTGGTAA 60 RT-PCR MyHC-R TGATAGTCGTATGGGTTGGT Myomaker-F TGGGTGTCCCTGATGGC 60 RT-PCR Myomaker-R CCCGATGGGTCCTGAGTAG GAPDH-F TCCTCCACCTTTGATGCG 60 RT-PCR GAPDH-R GTGCCTGGCTCACTCCTT U6-F CAAGGACCCATCGTTCCACA 60 RT-PCR U6-R CCATTGGACACGCAGAATGC 1.2.3 细胞转染试验
当原代成肌细胞密度(显微镜视野下的细胞占比)超90%时,将细胞接种于12孔板,RPMI1640完全培养基培养细胞。12孔板细胞密度为70%~80%时,使用转染试剂Lipofectamine 3000转染过表达载体pCD2.5-circRIPK2和对照空载质粒pCD2.5-ciR,转染6 h后更换培养基,待贴壁生长细胞密度为90%~100%时,使用分化培养基(体积分数为2%的马血清+体积分数为97.5%的RPMI+体积分数为0.5%的青霉素、链霉素)诱导成肌细胞分化。
1.2.4 RNA提取及实时荧光定量PCR检测
分别取100 mg不同胚龄和日龄的肌肉组织样品,加入1 mL RNAiso Plus试剂后研磨匀浆。同时收集增殖分化不同时期的成肌细胞,用RNAiso Plus试剂吹打细胞,RNAiso Plus处理后进行总RNA抽提,然后取0.5 μg总RNA,依据Monad反转录试剂盒说明书将其反转录为cDNA,反转录程序为37 ℃ 2 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min。以反转录生成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-PCR),PCR反应体系:上、下游引物各0.3 μL、SYBR Green qPCR Mix 5 μL、cDNA 1 μL、双蒸水3.5 μL。PCR反应条件为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40个循环;溶解曲线程序为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 1 s。以GAPDH作为内参基因,检测circRIPK2基因、细胞增殖相关标记基因及肌分化标志基因的表达。
1.2.5 EdU试验、流式细胞术检测细胞增殖
转染过表达载体circRIPK2和pCD2.5-ciR,每组设置6个重复,24 h后收集细胞,用流式细胞仪检测并分析细胞周期变化;转染48 h后参考锐博EdU试剂盒说明书对细胞进行孵育、固定、通透等处理,染色完成后加PBS缓冲液避光保存待用,在荧光显微镜下观察。
1.2.6 核质定位分析
分离原代成肌细胞后用完全培养基培养,待细胞密度达100% 时,使用核质分离试剂盒回收细胞核和细胞质RNA,然后利用RT-PCR技术检测circRIPK2在细胞质、细胞核中的表达量。
1.2.7 统计学分析
试验分组中每组包含3个重复,采用GraphPad Prism8软件绘图和数据统计分析,2组数据比较采用t检验分析。
2. 结果与分析
2.1 circRIPK2的鉴定及细胞定位
用不同胚龄(11胚龄、16胚龄、1日龄)杏花鸡腿肌进行高通量测序,Ouyang等[11]鉴定发现了13 377个cricRNA,根据上述测序数据,本研究选取在3个时期差异表达的circRIPK2作为候选研究基因,描述了circRIPK2的成环来源示意图(图1)。针对RIPK2接头序列预测位点设计收敛引物、发散引物各1对(表1),利用反转录后的cDNA、gDNA为模板进行PCR扩增,结果显示只有以cDNA为模板时,发散引物才可以扩增出明亮的条带(图2)。同时Sanger测序结果显示circRIPK2的环化位点真实存在(图3)。使用核质分离试剂盒,分别回收细胞核和细胞质RNA,采用RT-PCR对circRIPK2进行细胞定位,结果(图4)表明circRIPK2在核质中均存在,其中细胞质占比为72%,细胞核占比为28%。
图 2 circRIPK2收敛引物和发散引物的PCR扩增1和2使用cDNA模板,利用收敛引物和发散引物分别扩增;3和4使用gDNA模板, 利用收敛引物和发散引物分别扩增; M: DL2000 DNA markerFigure 2. PCR amplification of circHIPK2 by convergent primers and divergent primers1 and 2 used cDNA template, and amplified by using convergent primers and divergent primers respectively; 3 and 4 used gDNA template, and amplified by using convergent primers and divergent primers respectively; M: DL2000 DNA marker2.2 circRIPK2的时空表达谱分析
以11胚龄、16胚龄、1日龄小鸡腿肌的cDNA作模板,通过RT-PCR技术比较不同胚龄circRIPK2的表达水平变化,发现circRIPK2在不同时期表达存在差异(图5A)。同时,试验分析了circRIPK2在原代成肌细胞增殖分化不同时期的表达变化,发现与成肌细胞密度约为50%的增殖期相比,分化期第1天至第6天circRIPK2的表达均显著上调,在分化期第6天circRIPK2表达达到最高水平,这提示circRIPK2可能在细胞分化过程中起重要作用(图5B)。
图 5 circRIPK2的时空表达谱分析A图中,E11:11胚龄,E16:16胚龄,P1:1日龄;B图中,G1:成肌细胞密度约为50%的增殖期,G2:成肌细胞密度约为100%的增殖期,D1~D6:分化期第1天至第6天;“*”和“**”分别表示与P1(图A)或与G1(图B)差异达到0.05和0.01的显著水平(t检验)Figure 5. Analysis of the expression of circRIPK2 at different stagesIn graph A, E11:11 embryo age, E16:16 embryo age, P1: 1-day post-hatch;In graph B, G1: Myoblast proliferation stage and the cell density was about 50%, G2: Myoblast proliferation stage and the cell density was about 100%, D1−D6: The first day to sixth day of myoblast differentiation; “*”and“**”indicate significant difference from P1 (graph A) or G1 (graph B) at 0.05 and 0.01 levels respectively (t test)2.3 抑制原代成肌细胞增殖
在原代成肌细胞中过表达circRIPK2,利用RT-PCR技术证实过表达效果显著(图6A),可进行下一步试验。转染48 h后,和对照组比较,过表达circRIPK2的原代成肌细胞中p21的mRNA表达水平上调20%,而Cyclin B2、Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA的mRNA表达水平分别下调39%、22%、29%和45%(图6B)。此外,通过流式细胞术检测对细胞周期的影响(图7、图8),结果表明过表达circRIPK2后,处于S期细胞显著减少,处于G2/M期细胞显著增多(图8);采用EdU染色检测细胞增殖情况(图9、图10),对EdU渗入细胞数目进行统计、分析,结果发现过表达circRIPK2后,EdU渗入的细胞总数明显低于对照组,细胞增殖水平受到抑制(图10)。以上结果表明circRIPK2对成肌细胞的增殖过程具有显著抑制作用。
2.4 circRIPK2促进原代成肌细胞分化
转染过表达载体pCD2.5-circRIPK2、pCD2.5-ciR至鸡原代成肌细胞中,待细胞密度为90%~100%时,将培养基更换为分化培养基以诱导成肌细胞分化。诱导分化第2天提取细胞总RNA并进行RT-PCR。试验结果显示过表达circRIPK2后肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达水平显著上调39%、56%和25%(图11)。
3. 讨论与结论
作为非编码RNA家族的重要成员,circRNA广泛参与基因表达调控和疾病发生过程[16-17]。有证据表明circRNA不但在动物骨骼肌中例如牛骨骼肌、家禽骨骼肌、小鼠骨骼肌、猪骨骼肌等大量存在,而且具有较高的表达水平[11, 18-21]。这表明除了生肌调控因子、成肌增强因子、PAX家族等调控骨骼肌发育过程之外,circRNA在调控肌肉发育过程中也扮演重要角色[22-24]。多项研究发现,骨骼肌中的circRNA可通过作为miRNA海绵来调控骨骼肌的生长发育[25]。根据前期测序,本研究筛选出在3个时期差异表达的候选环状RNA-circRIPK2,并且通过PCR和Sanger测序等技术验证circRIK2由RIPK2基因第4至第9外显子反向剪切形成。RT-PCR发现circRIPK2在3个时期中差异表达,这提示circRIPK2可能在鸡骨骼肌发育过程具有一定的调控作用。
有关circRNA对于成肌细胞的增殖已有多篇文献报道。在家禽骨骼肌中,RBFOX2基因的不同外显子能够环化形成circRBFOX2.2-3、circRBFOX2.2-4,两者均可以吸附miR-1a、miR-206来调控鸡成肌细胞增殖过程[11]。另外,在牛骨骼肌中发现,circLMO7可以充当miR-378a-3p海绵,通过作为竞争性内源RNA来促进成肌增殖[10]。在对circRIPK2研究中,我们发现过表达circRIPK2后,和对照组比较,对细胞增殖有促进作用的相关基因(Cyclin B2、Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA)的mRNA表达水平显著降低,然而对细胞增殖有抑制作用的标记基因(p21)mRNA水平显著上调。同时通过流式细胞术、EdU试验检测其对细胞周期的影响,结果也表明circRIPK2抑制成肌细胞的增殖。
circRNA除了调控肌肉细胞增殖,它对于肌肉细胞的分化也具有重要的作用。Li等[12]研究发现,circFGFR4在牛肌肉中高表达,它可以通过作为miR-107的分子海绵调控WNT3A的表达,从而间接促进成肌细胞的分化。在小鼠中circZfp609可以吸附miR-125b解除对下游靶基因BCLAF1的抑制作用,并且通过影响Myf5和MYOG的表达间接抑制成肌细胞的分化[26]。此外,在羊骨骼肌中,circFOXO3对成肌细胞的分化过程也具有抑制作用[27]。本试验表明过表达circRIPK2后,肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达水平上调,这证明过表达circRIPK2对成肌细胞的分化具有显著抑制作用。
以上结果表明circRIPK2在骨骼肌生长发育过程中具有调控作用,然而circRIPK2参与骨骼肌调控的具体机制尚未阐释,有待后续进一步探究。
研究表明circRIPK2在细胞核、细胞质中均有表达,其中在细胞质中的占比高于在细胞核中的占比,同时通过在鸡原代成肌细胞过表达circRIPK2检测相关标记基因表达,证实circRIPK2可能通过抑制成肌细胞的增殖,正向调控成肌细胞分化进程,从而参与骨骼肌调控过程。
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图 2 circRIPK2收敛引物和发散引物的PCR扩增
1和2使用cDNA模板,利用收敛引物和发散引物分别扩增;3和4使用gDNA模板, 利用收敛引物和发散引物分别扩增; M: DL2000 DNA marker
Figure 2. PCR amplification of circHIPK2 by convergent primers and divergent primers
1 and 2 used cDNA template, and amplified by using convergent primers and divergent primers respectively; 3 and 4 used gDNA template, and amplified by using convergent primers and divergent primers respectively; M: DL2000 DNA marker
图 5 circRIPK2的时空表达谱分析
A图中,E11:11胚龄,E16:16胚龄,P1:1日龄;B图中,G1:成肌细胞密度约为50%的增殖期,G2:成肌细胞密度约为100%的增殖期,D1~D6:分化期第1天至第6天;“*”和“**”分别表示与P1(图A)或与G1(图B)差异达到0.05和0.01的显著水平(t检验)
Figure 5. Analysis of the expression of circRIPK2 at different stages
In graph A, E11:11 embryo age, E16:16 embryo age, P1: 1-day post-hatch;In graph B, G1: Myoblast proliferation stage and the cell density was about 50%, G2: Myoblast proliferation stage and the cell density was about 100%, D1−D6: The first day to sixth day of myoblast differentiation; “*”and“**”indicate significant difference from P1 (graph A) or G1 (graph B) at 0.05 and 0.01 levels respectively (t test)
表 1 引物信息
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name引物序列(5′ → 3′)
Primer sequence退火温度/℃
Annealing temperature用途
ApplicationC-circRIPK2-F GCATGTCAAAATGGCGTGTCA 56 成环鉴定(收敛引物)
Verification of circRIPK2 (Convergent primers)C-circRIPK2-R ACAAGAGCTCGATGCGGAATG D-circRIPK2-F TGAATCGCCGTGTATCCACAA 56 成环鉴定(发散引物)
Verification of circRIPK2 (Divergent primers)D-circRIPK2-R AAATCTGCAATCTGATGAGA CircRIPK2-F ATTGCAGATTTTGGCATGTC 58 克隆 Cloning CircRIPK2-R CTGATGAGAGGATATTACACT QcircRIPK2-F CGACTCAAATCTCTTCCCCAG 60 RT-PCR QcircRIPK2-R TCATGTTTCACACTTGCCCG Cyclin B2-F CAGTAAAGGCTACGAAAG 60 RT-PCR Cyclin B2-R ACATCCATAGGGACAGG Cyclin D1-F CAGAAGTGCGAAGAGGAAGT 60 RT-PCR Cyclin D1-R CTGATGGAGTTGTCGGTGTA Cyclin D2-F: AACTTGCTCTACGACGACC 60 RT-PCR Cyclin D2-R: TTCACAGACCTCCAACATC PCNA-F GTGCTGGGACCTGGGTT 60 RT-PCR PCNA-R CGTATCCGCATTGTCTTCT p21-F GAAGAGTTGTCCACGATAAGC 60 RT-PCR p21-R TTCCAGTCCTCCTCAGTCC MyHC-F CTCCTCACGCTTTGGTAA 60 RT-PCR MyHC-R TGATAGTCGTATGGGTTGGT Myomaker-F TGGGTGTCCCTGATGGC 60 RT-PCR Myomaker-R CCCGATGGGTCCTGAGTAG GAPDH-F TCCTCCACCTTTGATGCG 60 RT-PCR GAPDH-R GTGCCTGGCTCACTCCTT U6-F CAAGGACCCATCGTTCCACA 60 RT-PCR U6-R CCATTGGACACGCAGAATGC -
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