Study on sample preparation for the metabolomics of Metarhizium based on GC-MS
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摘要:目的
基于GC-MS技术对绿僵菌Metarhizium代谢物前处理技术进行优化，以期建立适用于绿僵菌的快速、准确的代谢组检测方法。
方法优化绿僵菌代谢物的淬灭、提取、衍生和检测方法，测定方法的稳定性。
结果40%(φ)冷乙醇溶液淬灭后核酸和蛋白回收率分别为9.63%和11.61%，淬灭效果优于其他淬灭剂；冷甲醇法可提取到代谢物109种，多于其他方法；衍生的时间越长，获得的代谢物越多，衍生1.5 h效果最好；气相色谱检测起始温度过高不利于代谢物的获得，50 ℃效果最好。最佳条件如下：40%(φ)冷乙醇溶液淬灭后用2 mL冷甲醇提取，离心后将上清液用N2吹干，加入20 mg/mL的甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液80 μL，剧烈振荡30 s后，在37 ℃环境中反应90 min，反应结束后冷却至室温，然后加入含1%(φ)TMCS的BSTFA衍生剂80 μL，在70 ℃条件下反应，衍生1.5 h后冷却至室温。
结论该方法简单、方便、重复性好。该方法的建立有助于开展更深入的代谢机制相关研究，为农、林领域开展病原微生物代谢组相关研究提供参考。
Abstract:ObjectiveThe metabolite pretreatment technology was optimized based on GC-MS to establish a rapid, accurate sample preparation protocol for metabolomics analysis in Metarhizium.
MethodSeveral sample preparation steps, including cell quenching, metabolite extraction, derivatization and detection were optimized, and the stability of this method was also determined.
ResultThe quenching effect of 40% cold ethanol was better than that of other quenching solutions, and the recoveries of nucleic acid and protein of Metarhizium were 9.63% and 11.61% respectively. Total 109 metabolites were obtained by cold methanol, more than those by other methods. The longer derivation time was, the more metabolites could be obtained, and 1.5 h was the best. Too high initial temperature of gas chromatography was not conducive to acquisition of metabolites, and 50 ℃ was the best. The optimal sample preparation conditions were as follows: After quenching with 40% cold ethanol, the supernatant was extracted with 2 mL cold methanol. After centrifugation, the supernatant was dried with N2, and then added with 80 μL 20 mg/mL methoxylamine hydrochloride pyridine solution. After severe oscillation for 30 s, the supernatant was reacted at 37 ℃ for 90 min, and cooled to room temperature. Then 80 μL BSTFA derivatization agent with 1%(φ) TMCS was added, the derivatization reaction continued for 1.5 h at 70 ℃, and solution cooled to room temperature.
ConclusionThe method is simple, convenient and reproducible, it is conducive to carry out more in depth studies on metabolic mechanisms, and provides references for related studies on metabolic groups of pathogenic microorganisms in agriculture and forestry.
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Keywords:
- metabolomics /
- Metarhizium /
- quenching /
- extraction /
- pretreatment /
- GC-MS
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白叶枯是水稻生产中的三大传统细菌性病害(稻瘟病、白叶枯、纹枯病)之一，流行范围广，其发生流行会造成水稻10%~30%的减产，严重者减产90%以上[1-3]。近年来，随着无人机技术在农业生产领域的广泛应用，利用无人机搭载成像或非成像传感器组成的无人机遥感系统具有成本低、精准快速、非接触式等优点，在作物病虫害监测与识别方面显示出巨大潜力[4-6]。利用高分辨率RGB无人机获取可见光区域的真彩色图像，采用传统机器学习或深度学习方法提取图像的颜色、梯度、纹理、形状等视觉特征，构建模型可对植物疾病严重程度进行预测。Dehkordi等[7]研究发现根据绿、红、蓝光谱波段的不同组合可以鉴定小麦条锈病和叶锈病的感染等级；王震等[8]利用多旋翼无人机采集可见光图像，对水稻病害白穗图像提取Haar-like 特征，使用 Adaboosts 算法训练识别白穗，准确率达 93.62%；Wei等[9]基于无人机低空遥感图像，采用神经网络方法和机器学习方法监测水稻纹枯病的严重程度，效果较好； Dang等[10]利用无人机搭载
1200 万像素的RGB相机获取萝卜田图像，通过提取分割出的ROI图像的Lbp特征和Lab颜色特征构建Softmaxt分类器，获得令人满意的分类结果。随着光谱技术的发展，人们将多光谱技术应用于农作物病虫害识别，多光谱能反映除可见光以外的其他光谱段，应用在作物病虫害识别中准确率较高[11-14]。无人机多光谱遥感系统多使用约120万像素的多光谱相机，相比千万级像素的RGB成像系统，分辨率较低[15-16]，许多研究人员采用高分辨率RGB图像辅助多光谱图像的方法识别作物疾病[17-19]。通过高分辨率图像与无人机图像结合，可以弥补分辨率不足的问题，实现作物病虫害更准确的监测效果。然而，不同飞行高度对无人机遥感系统影像的处理及识别影响较大。飞行高度越低，图像分辨率越高，获得的稻田图像越多，对图像进行初始化、辐射校正、特征点匹配等处理量也越大，虽然精度较高但处理速度较慢，效率低下。飞行高度越高，图像分辨率越低，获得的待处理稻田图像越少，处理速度较快，但是大量重要信息捕获不到，识别精度降低[20-22]。以上研究基本都没有说明无人机飞行高度的选择依据，也没有提及无人机不同飞行高度对监测结果的影响。
综上，为了实现根据水稻白叶枯感染等级从而进行农药精准喷施，及确定无人机的最佳飞行高度。本文通过装备高分辨率RGB的无人机获取受白叶枯胁迫的水稻冠层高分辨率图像，通过提取颜色和纹理特征构建白叶枯感染等级预测模型。基于高分辨率RGB遥感图像，进一步构建不同地面分辨率(Ground sampling distances，GSD)的白叶枯回归模型，以期为无人机可见光及多光谱遥感监测田间水稻白叶枯提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地
试验点位于广东省广州市增城区朱村街的试验田(23°17′33″N，113°49′45″W)，南亚热带海洋性季风气候，气候温和，日照充足，雨量充沛，年均日照量
1906 h，年降雨量1800 mm。以自然条件下感染了白叶枯的水稻为研究对象，水稻品种为‘丝苗’，于4月初移栽到试验田，8月上旬收获。1.2 冠层数据获取
本文使用的无人机低空遥感系统由 DJI Mavic 3T(DJI Company, 深圳)搭载可见光传感器组成。试验于2023年6月展开，无人机飞行高度为5 m，速度为1.6 m/s，于当地时间10:00—16:00，针对水稻试验田的白叶枯感染区进行成像操作。其中，可见光传感器尺寸为1/2 英寸，分辨率为
4000 ×3000 ，焦距为29.9 mm，以JPG 24 bit格式记录，无损压缩方式存储。1.3 数据处理与分析
1.3.1 数据处理
双边滤波可以在去除噪音的同时保留图像的细节和边缘信息。对获取的无人机图像进行裁剪、双边滤波等预处理后，获得覆盖面积约为50 cm×50 cm的子图像，并通过重采样将图片像素尺寸缩放到500×500的图像，总共获得92张GSD为0.1 cm的图像。RGB色彩空间中3个分量相关性较高，不利于白叶枯信息的提取，多通过转换成HSV空间或者Lab颜色空间提取感染信息。色彩空间变换可以改善图像信息，更有利于发现作物生长发育的异常，尤其在作物病虫害的识别与监测方面[23]。本文将RGB图像转换为Lab颜色空间，采用自适应阈值法对L分量进行二值化，将获得的二值图像分为感染和未感染区域。参考文献[18]中对棉花叶片枯萎病的感染级别划分方法，并综合考虑水稻叶片及白叶枯疾病的特点，对水稻白叶枯感染等级进行划分：健康(感染率为0)、轻微感染(0<感染率≤5%)、中度感染(5<感染率≤10%)、严重感染(感染率>10%)。最后提取图像颜色和纹理特征构建回归模型，并对模型进行评估。
1.3.2 特征提取
本文选择2类图像特征监测水稻白叶枯。首先，将RGB图像转换成HSV颜色空间，提取水稻白叶枯图像的一阶矩阵和二阶矩阵作为颜色特征，计算公式见式(1)~(6)。
$$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}}=\dfrac{1}{N}{\displaystyle\sum} _{P=1}^{N}{{\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}}\text{，} $$ (1) $$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}}=\dfrac{1}{N}\displaystyle\sum\nolimits _{P=1}^{N}{{\boldsymbol{S}}}_{{\boldsymbol{P}}} \text{，} $$ (2) $$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{V}}}=\dfrac{1}{N}{\displaystyle\sum} _{P=1}^{N}{{\boldsymbol{V}}}_{{\boldsymbol{P}}} \text{，} $$ (3) $$ {{{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{H}}}}=\Bigg[\dfrac{1}{N}{\displaystyle\sum} _{P-1}^{N}{({\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}}-{{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}}{)}^{2}\Bigg]^{1/2} \text{，} $$ (4) $$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{S}}}=\Bigg[\dfrac{1}{N}{\displaystyle\sum} _{P-1}^{N}{({\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}}-{{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}}{)}^{2}\Bigg]^{1/2} \text{，} $$ (5) $$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{V}}}=\Bigg[\dfrac{1}{N}{\displaystyle\sum} _{P-1}^{N}{({\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}}-{{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}}{)}^{2}\Bigg]^{1/2} \text{，} $$ (6) 式中，
$ {{\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ 、$ {{\boldsymbol{S}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ 、$ {{\boldsymbol{V}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ 分别表示图像H、S、V颜色分量，$ {\boldsymbol{\mu}} $ 表示HSV各分量的一阶矩阵，$ {\boldsymbol{\delta}} $ 表示HSV各分量的二阶矩阵。提取到的水稻白叶枯图像H、S、V一阶矩阵、二阶矩阵结果如表1所示。表 1 水稻白叶枯HSV颜色特征参数1)Table 1. HSV color features parameters of rice bacterial blight叶片感染等级
Infection level of rice leaves$ {{\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ $ {{\boldsymbol{S}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ $ {{\boldsymbol{V}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ $ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ $ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ $ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ $ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ $ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{V}}} $ $ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{V}}} $ 健康 Healthy 44.33 1110.57 129.16 8109.449 95.41 7645.89 轻微 Slight 41.73 1241.46 139.03 9516.93 83.03 7882.55 中度 Moderate 40.59 1164.32 143.80 9241.22 88.44 8289.44 严重 Serious 39.62 1166.58 148.84 9263.31 89.82 8817.79 1) $ {{\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}} $、$ {{\boldsymbol{S}}}_{{\boldsymbol{P}}} $、$ {{\boldsymbol{V}}}_{{\boldsymbol{P}}} $分别表示图像H、S、V颜色分量；$ {\boldsymbol{\mu}} $表示HSV各分量的一阶矩阵；$ {\boldsymbol{\delta}} $表示HSV各分量的二阶矩阵。
1) $ {{\boldsymbol{H}}}_{{\boldsymbol{P}}} $, $ {{\boldsymbol{S}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ and $ {{\boldsymbol{V}}}_{{\boldsymbol{P}}} $ represent the color components H, S, and V of the image, respectively; μ represents the first-order moment of each HSV component, and δ represents the second-order moment of each HSV component.其次，根据灰度共生矩阵(Gray-level co-occurrence matrix, GLCM)，从图像R、G、B 3个分量中分别提取对比度(Contrast，CON)、自相关(Correlation，COR)、能量 (Energy，EN) 以及同质性(Homogeneity，HO)4个纹理特征，总共12个特征。CON 能反映出图像的灰度分布均匀程度和纹理粗细度，COR 能反映出矩阵元素在行或列方向上的相似程度，EN为矩阵中所有元素的平方和，HO表示矩阵元素相对于对角线分布的紧密度。GLCM 的参数采用3个不同距离1、2、3和4个不同角度0、
$ {\text{π}}/4 $ 、$ {\text{π}}/2 $ 、3$ {\text{π}}/4 $ ，最后总共获得144个纹理特征。提取的144个纹理特征为CON_R(ij)、CON_G(ij)、CON_B(ij)、COR_R(ij)、COR_G(ij)、COR_B(ij)、EN_R(ij)、EN_G(ij)、EN_B(ij)、HO_R(ij)、HO_G(ij)、HO_B(ij)。其中，CON、COR、EN、HO分别后缀R、G、B，表示不同颜色通道的不同特征；i为1~3；j表示1~4；ij表示不同距离和角度的组合。1.3.3 特征选择
根据“1.3.2”可获得6个颜色特征和144个纹理特征。通过降维去除纹理特征中的冗余信息，提取出对白叶枯较敏感的纹理特征，减少数据的存储和处理量，进而降低模型的复杂度，提升模型性能。降维方法采用随机森林(Random forest，RF)和自动编码器(Autoencoder，AE)2种方法，最终提取5个纹理特征。RF是一种基于决策树的集成学习方法，从多个决策树模型中选取一个最佳模型进行预测。RF可以评估每个特征对模型的重要性，在数据维度较高时，可以通过特征数据对模型的重要性筛选出较为重要的特征。AE是一种无监督学习的神经网络模型，用于实现数据的降维和特征提取。AE主要包括编码器和解码器2个部分。编码器通过多个隐藏层和激活函数来实现非线性变换，将输入特征数据映射到潜在空间非线性变换，将输入特征数据映射到潜在空间的低维表示。解码器则将低维表示映射回原始输入的重构，其结构与编码器相似[10, 24-25]。本文根据RF获得纹理特征之间的相互作用，确定每个特征对模型的重要程度，筛选出较重要的特征。进一步通过AE将这些特征映射到低维空间中，以减少特征数量和计算成本。通过RF选出34个重要性大于0.01的纹理特征，然后通过AE降维后，获得5个对白叶枯较为敏感的纹理特征作为模型输入。
1.3.4 模型建立与评估
本文利用颜色和纹理特征对水稻白叶枯进行监测，探究了不同特征对白叶枯监测的重要性，并建立白叶枯感染不同等级评估模型。将上节中的特征作为自变量(X)，水稻白叶枯的感染率作为因变量(
$ \gamma $ )，构建多元回归模型，公式如下所示：$$ \gamma ={\beta }_{0}+{\beta }_{1}{X}_{1}+{\beta }_{2}{X}_{2}+{\beta }_{3}{X}_{3}+...+{\beta }_{n}{X}_{n} \text{，} $$ (7) 式中，
$ {\beta }_{0} $ 为截距，$ {\beta }_{i} $ 和$ {X}_{i} $ (i=0，1，2，...，n)分别是斜率系数和自变量。为了建立稳定的白叶枯评估模型，以决定系数(R2)、均方根误差(Root mean square error，RMSE)和相对均方根误差(Relative RMSE，RRMSE)为参数对模型精度进行评估，相关计算公式如下所示。$$ {R}^{2}=1-\dfrac{{\displaystyle\sum} _{i=1}^{n}{({y}_{i}-{y}_{i}')}^{2}}{{\displaystyle\sum} _{i=1}^{n}{({y}_{i}-\bar {{y}_{i}})}^{2}} \text{，} $$ (8) $$ {\mathrm{RMSE}}=\sqrt{\dfrac{1}{n}{\displaystyle\sum} _{i=1}^{n}{({y}_{i}-{y}_{i}')}^{2}} \text{，} $$ (9) $$ {\mathrm{RRMSE}}=\dfrac{{\mathrm{RMSE}}}{\bar {{y}_{i}}}\times 100{\text{%}} \text{，} $$ (10) 式中，
$ {y}_{i} $ 、$ {y}_{i}' $ 、$ \bar {{y}_{i}} $ 分别表示真实的、预测的以及平均测量的白叶枯感染等级，n是样本数。2. 结果与分析
2.1 白叶枯感染等级
自适应阈值法是数字图像处理中的一种二值化方法，可以自动找到最佳的阈值，从而使得将原始图像转换成二值图像后，将目标区域的像素点尽可能地保留，而背景区域的像素点尽可能地过滤掉。本文将图像转换为Lab色彩空间，采用自适应阈值法获得叶片与病害的mask图像，通过与原始图像相乘获得去背景图像。对去背景图片进行分割获得感染白叶枯叶片的二值图像，将像素分为感染像素(白色区域)和未感染像素(黑色区域)，流程图如图1所示。将白叶枯感染像素占总像素的比例作为感染率，将病害严重程度分为健康、轻微、中度、严重共4个等级，如图2所示。
统计所有图像中白叶枯感染率，将92张图像根据感染等级分为4组，其中，健康组包含12张图片，轻度组包含27张图片，中度组包含28张图片，重度组包含25张图片。将其按照2∶1的数量比例划分成训练集和验证集，分别包含图像60、32张图片。
2.2 白叶枯感染等级预测模型
2.2.1 颜色特征模型
数据集划分成训练集和测试集，包含健康、轻度、中度、重度组，其样本数分别为8、18、18、16，总共60个样本。采用皮尔逊相关性分析法获得感染率与颜色特征的相关系数和显著性。测得多重相关系数约为 0.97，表示自变量与因变量之间存在较强的线性相关性；R2为 0.93，说明模型可以解释因变量约 93% 的变异性，回归方程对数据的拟合程度较高。
通过皮尔逊相关性分析得到白叶枯的感染率与颜色特征
$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{V}}} $ 的相关性P<0.001，说明显著相关，选取这几个特征作为白叶枯感染率的敏感特征，建立回归模型。使用验证集中28个白叶枯感染图像对模型的预测精度进行验证，得到的R2、RMSE和RRMSE分别为86.12%、1.42和15.1%。使用$ {{{X}}}_{1} $ 、$ {X}_{2} $ 、$ {X}_{6} $ ，即$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{V}}} $ 作为自变量，多元回归模型如方程(11)所示，得到的R2、RMSE和RRMSE分别为85.9%、1.43和19.1%，与$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\delta}}}_{{\boldsymbol{V}}} $ 作为自变量时的结果相差不大，此时白叶枯感染率的测量值与预测值的拟合结果如图3a所示。![]()
图 3 基于颜色特征(a)、纹理特征(b)和两者融合(c)的白叶枯感染率预测模型精度检验Figure 3. Accuracy evaluation of prediction model of bacterial blight infection rate based on color features (a), texture features (b) and their fusion (c)$$\begin{split} Y= & -20.437\;9-0.637\;77{X}_{1}+0.165\;06{X}_{2}+ \\ & 0.003\;66{X}_{6} 。 \end{split} $$ (11) 2.2.2 纹理特征模型
采用皮尔逊相关性分析法获得感染率与纹理特征的相关系数和显著性。测得多重相关系数约为 0.95，表示自变量与因变量之间存在较强的线性相关性；R2为 0.90，说明模型可以解释因变量约 90% 的变异性，表明回归方程对数据的拟合程度很高。通过皮尔逊相关性分析得到白叶枯的感染率与5个纹理特征的相关性P<0.001，说明显著相关，将5个纹理特征作为自变量，建立回归模型。
$$ \begin{split} Y=& -7.928-0.018\;42{X}_{1}+0.022\;75{X}_{2}-0.012\;22{X}_{3}+\\ & 0.007\;43{X}_{4}-0.011\;94{X}_{5} 。 \end{split} $$ (12) 使用验证集中28个白叶枯感染图像对模型的预测精度进行验证，得到的R2、RMSE和RRMSE分别为83.5%、1.02和14.45%，拟合结果如图3b所示。
2.2.3 颜色和纹理特征融合模型
已知无人机图像的颜色特征
${{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、${{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ 、${{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{V}}} $ 和5个纹理特征对水稻白叶枯感染等级较为敏感，选取3个颜色特征和5个纹理特征，构建特征与白叶枯感染等级间的多元回归模型，测得多重相关系数和R2分别为 0.977和0.954，拟合程度较高，回归模型如式(13)所示。使用验证集中28个白叶枯感染图像对模型的预测精度进行验证，得到的R2、RMSE和RRMSE分别为89.6%、1.06和15.1%，拟合结果如图3c所示。$$\begin{split} Y=& -23.48-0.417\;8{X}_{1}+0.134\;2{X}_{2}+0.002\;8{X}_{3}-\\ & 0.003\;4{X}_{4}+0.005\;4{X}_{5}-0.008\;6{X}_{6}+\\ & 0.005\;5{X}_{7}-0.004\;4{X}_{8} 。 \end{split} $$ (13) 2.3 模型结果及分析
上述3个回归模型的结果证明了HSV颜色空间的一阶矩阵和二阶矩阵特征与水稻白叶枯为害等级相关，通过
$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{H}}} $ 、$ {{\boldsymbol{\mu}} }_{{\boldsymbol{S}}} $ 和$ {{\boldsymbol{\delta}} }_{{\boldsymbol{V}}} $ 3个颜色特征能实现白叶枯的准确预测(R2=0.859，RMSE=1.43，RRMSE=19.1%)。与基于颜色特征的预测相比，基于灰度共生矩阵获得纹理特征的预测(R2=0.835，RMSE=1.02，RRMSE=14.14%)的R2减少2.4个百分点，准确率有所下降。然而，无论是仅使用颜色特征还是纹理特征都能获得较令人满意的预测结果。基于颜色和纹理特征融合的预测(R2=0.896，RMSE=1.06，RRMSE=15.1%)与仅颜色特征的预测相比，R2提高了3.7个百分点，RMSE降低了0.37，RRMSE减少了4.0个百分点；与仅纹理特征的预测相比，R2提高了6.1个百分点，预测精度有较大的提升。这些结果说明基于无人机低空遥感图像的颜色和纹理特征监测水稻白叶枯具有巨大潜力。2.4 不同分辨率模型构建及分析
要实现稻田快速无损的检测，需要对无人机的飞行高度进行合理设置，不合理的飞行高度不仅会增加后续无人机遥感数据处理的工作量，还会严重影响识别效率和准确度。为了解决这个问题，将“1.3.1”预处理后的图像(GSD为0.1 cm)重采样至GSD分别为0.2、0.5、0.8、1.0 cm，图像大小依然调整为500×500，重采样后的部分图像样本如图4所示。根据得到的对白叶枯较敏感特征，提取不同GSD图像颜色和纹理特征，分别构建颜色特征、纹理特征、颜色和纹理特征融合的白叶枯预测模型，结果如表2所示。由表2可知基于颜色特征的白叶枯感染等级模型的整体预测精度高于基于纹理特征的，2种特征相融合的预测模型比单一种类特征的精度更高。颜色、纹理以及融合特征3种模型预测精度随着GSD的增加，呈先增后减趋势。GSD不大于0.8 cm时，能得到较好的预测结果，特别是在GSD为0.2 cm时，与0.1 cm相比有所提升，可能高分辨率图像包含大量冗余信息和噪音，重采样GSD至0.2 cm后改善了图像质量，从而提高了预测精度。当图像重采样GSD至0.5和0.8 cm后，图像中的部分信息丢失，预测精度有所下降，但是基本都在80%以上，结果依然令人满意。重采样GSD至1.0 cm后，信息大量丢失，颜色特征、纹理特征和2种特征融合3种模型预测精度分别为74.0%，68.8%和73.8%，精度较低，RRMSE甚至达到62%。
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图 4 不同GSD条件下白叶枯4个感染等级样本Figure 4. Samples of four infection levels in rice bacterial blight under different GSD conditions表 2 不同GSD条件下白叶枯感染等级预测精度Table 2. Prediction accuracy of bacterial blight infection levels under different GSD conditions特征
Feature地面分辨率/cm
GSD决定系数/%
R2均方根误差
RMSE相对均方根误差/%
RRMSE颜色
Color0.1 85.9 1.43 19.1 0.2 88.1 1.19 18.6 0.5 85.8 0.86 25.9 0.8 80.9 0.51 28 1.0 74.0 0.43 62.0 纹理
Texture0.1 83.5 1.02 14.5 0.2 84.6 0.93 13.2 0.5 82.4 0.67 19.1 0.8 74.6 0.17 12.1 1.0 68.8 0.15 22.6 颜色和纹理融合
Fusion of color and texture0.1 89.6 1.06 15.1 0.2 91.9 1.15 14.7 0.5 86.6 0.32 10.1 0.8 84.9 0.98 41.7 1.0 73.8 0.12 23.1 以上试验结果说明，在使用无人机搭载RGB相机尤其是多光谱相机快速监测整个稻田的白叶枯流行状况时，可设置无人机在合适的高度获得图像GSD为0.8 cm的图像进行数字正射影像图(Digital orthophoto map，DOM)的构建，提取图像颜色纹理2种特征融合后构建多元回归模型对白叶枯的感染等级进行预测，预测精度可达80%以上；如果能够融合多光谱中除R、G、B的其他波段以及一些常用的植被指数，将会获得更高的预测精度。以本文所用无人机遥感系统为例，根据以上研究计算出DJI Mavic 3T监测水稻白叶枯时较佳的飞行高度为23 m。
3. 白叶枯感染等级分布
为了验证前面试验结果对于稻田白叶枯的快速无损检测的可行性，根据“2.4”获得的白叶枯敏感特征以及最佳地面分辨率，对水稻田块进行区域尺度的白叶枯感染等级监测。无人机飞行高度设为22 m，焦距为4.4 mm，获得地面分辨率约为0.8 cm的高分辨率图像。对图像进行裁剪，去除背景(裸地)等预处理后，获得尺寸为
2600 ×1900 的图像。对预处理后的图像划分成尺寸为100×100的栅格，并根据栅格将图像裁剪为100×100的子图像，共获得子图像494张。构建白叶枯感染回归模型，获得子图像中白叶枯感染率，进而推断出子图像感染严重程度，最终获得整个区域水稻白叶枯的分布结果(图5)。由图5可知，在整个区域中，22.9%的区域为无感染区域，37.4%的区域为轻度感染区域，21.1%的区域为中度感染区域，18.6%的区域为严重感染区域。由图5可知，严重感染区域主要分布在裸地较多的区域，此时白叶枯感染严重已造成水稻植株枯萎。中度感染区域分布在严重感染区域周围，符合白叶枯从点到面的感染规律。结果说明通过多元回归模型可以实现区域尺度的白叶枯感染预测。
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图 5 区域尺度水稻白叶枯感染等级分布Figure 5. Regional scale distribution of rice bacterial blight infection levels4. 结论
本文通过利用高分辨率RGB无人机获取白叶枯胁迫的水稻冠层高分辨率图像，通过提取颜色特征和纹理特征构建白叶枯感染等级模型，实现对白叶枯感染等级的预测。通过构建不同GSD的白叶枯监测模型，对合适的GSD进行探究。结论如下：
从无人机高分辨率图像中提取的颜色特征和纹理特征对水稻白叶枯病感染等级的预测都能取得到较好的效果。基于颜色特征的监测模型的R2、RMSE、RRMSE分别为85.9%、1.43、19.1%，R2比基于纹理特征的模型高出2.4个百分点，RRMSE高了4.6个百分点。基于颜色和纹理特征融合的预测模型(R2=0.896，RMSE=1.06，RRMSE=15.1%)与仅颜色特征的预测模型相比，
$ {R}^{2} $ 提高了3.7个百分点，RMSE降低了0.37，RRMSE减少了4.0个百分点；与仅纹理特征的预测模型相比，R2提高了6.1个百分点，预测精度有较大的提升。将图像进行重采样，得到GSD分别为0.2、0.5、0.8、1.0 cm的水稻冠层图像，对不同GSD的图像提取颜色和纹理特征，分别构建单一种类特征模型和2类特征融合模型，发现当GSD为0.2、0.5或0.8 cm时，模型精度与直接提取特征构建的模型精度相差不大，R2均在80%以上，当GSD为1.0 cm时，模型精度大幅下降，不能对水稻白叶枯进行准确监测。
基于无人机低空遥感图像的颜色和纹理特征监测水稻白叶枯具有巨大潜力；利用无人机遥感监测水稻白叶枯时，可根据最佳GSD以及所搭载传感器型号，获得适宜的无人机飞行高度，研究可为无人机遥感系统快速监测水稻田白叶枯提供依据。
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图 1 不同淬灭剂处理后菌液的D260 nm和D280 nm
1、2、3分别表示体积分数为60%, 40% 和20%的甘油溶液；4、5、6分别表示体积分数为60%, 40% 和20%的甲醇溶液；7、8分别表示体积分数为60%和40%的乙醇溶液；各图中的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 1. D260 nm and D280 nm of bacterial fluid with different quenching solutions
1, 2 and 3 represent glycerol solutions with volume fractions of 60%, 40% and 20%, respectively; 4, 5 and 6 represent methanol solutions with volume fractions of 60%, 40% and 20%, respectively; 7, 8 represent ethanol solutions with volume fractions of 60% and 40%, respectively; Different lowercase letters in each figure indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
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图 2 不同离子盐加入后菌液的D260 nm和D280 nm
各图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 2. D260 nm and D280 nm of bacterial fluid added with different ionic salt
Different lowercase letters in each figure indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
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图 3 不同气相色谱条件检测出的总离子流图
A：起始温度50 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至150 ℃保持5 min，5 ℃/min升至200 ℃保持5 min，10 ℃/min升至280 ℃保持5 min；B：起始温度70 ℃保持4 min，以3 ℃/min升至200 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持5 min；C：初始温度70 ℃保持2 min，以3 ℃/min至133 ℃，以2 ℃/min升至200 ℃，以3 ℃/min升至220 ℃，以5 ℃/min升至280 ℃；D：起始温度65 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至185 ℃，以1 ℃/min升至200 ℃，以15 ℃/min升至280 ℃保持5 min；E：起始温度70 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至280 ℃保持4 min
Figure 3. Graph of total ion current (TIC) under different chromatographic conditions
A: The initial temperature was 50 ℃ for 3 min, then increased to 150 ℃ for 5 min at 10 ℃/min, then increased to 200 ℃ at 5 ℃/min and maintained for 5 min, and finally increased to 280 ℃ at 10 ℃/min and maintained for 5 min; B: The initial temperature was 70 ℃ for 4 min, then increased to 200 ℃ at 3 ℃ /min and then increased to 280 ℃ at 10 ℃ /min for 5 min; C: The initial temperature was 70 ℃ for 2 min, the temperature rose to 133 ℃ at 3 ℃/min, then rose to 200 ℃ at 2 ℃/min, then rose to 220 ℃ at 3 ℃/min, and finally rose to 280 ℃ at 5 ℃/min; D: The initial temperature was 65 ℃ for 2 min, then increased to 185 ℃ at 5 ℃/min, 200 ℃ at 1 ℃/min, and finally increased to 280 ℃ at 15 ℃/min for 5 min; E: The initial temperature was 70 ℃ for 4 min, and then increased to 280 ℃ at 5 ℃/min and maintained for 4 min
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图 4 不同提取方法检测出的总离子流图
Figure 4. Graph of total ion current (TIC) using different extraction methods
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图 5 不同衍生时间的总离子流图(TIC)
Figure 5. Graph of total ion current (TIC) at different derivative time
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图 6 不同衍生时间的有效峰
图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 6. Effective peak at different derivative time
Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05，Duncan’s test)
表 1 不同淬灭剂处理后核酸和蛋白的回收率
Table 1 The recovery rates of nucleic acid and protein using different quenching solutions
淬灭剂
Quenching solution回收率/% Recovery rate η260 nm η280 nm 40%(φ)乙醇溶液 Ethanol solution 9.63 11.61 20%(φ)甘油溶液 Glycerol solution 14.53 14.68 60%(φ)甲醇溶液 Methanol solution 23.37 23.24 60%(φ)乙醇溶液 Ethanol solution 28.71 35.78 40%(φ)甘油溶液 Glycerol solution 31.55 39.96 60%(φ)甘油溶液 Glycerol solution 52.00 61.23 40%(φ)甲醇溶液 Methanol solution 58.94 56.12 20%(φ)甲醇溶液 Methanol solution 71.03 59.10 
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表 2 绿僵菌代谢物检测最适方法保留时间的重复性
Table 2 Repeatability of the retention time for the optimal method of Metarhizium metabolites detection
名称
Name分子式
Formula保留时间/s Retention time 相对标准偏差/%
Relative standard deviation重复1 Repeat 1 重复2 Repeat 2 重复3 Repeat 3 硼烷四氢吡啶 C5H8BN 3.1749 3.1769 3.1805 0.000893 N-Difuorophosphoxy-O-trimethylsilylhydroxylamine C3H10F2NO2PSi 3.2892 3.2755 3.2987 0.003547 N,N−二甲基乙醇胺 C4H11NO 3.5455 3.5479 3.5472 0.000348 2−二甲胺基乙硫醇 C4H11NS 4.0018 3.9991 3.9949 0.000869 氨基磺酸 H3NO3S 4.0513 4.0543 4.0528 0.000370 N−乙烯基吡啶溴化铵 C7H8BrN 4.0649 4.0792 4.0990 0.004195 甜菜碱 C5H11NO2 5.1147 5.1380 5.1264 0.002272 顺丁烯二酸二丁基锡 C12H20O4Sn 5.3026 5.2618 5.2822 0.003862 2−甲氨基乙醇 C4H11NO 6.4913 6.4917 6.5010 0.000845 1,2−丙二烯−1,3−二酮 C3O2 7.0261 6.9981 7.0121 0.001996 3,6,9−三噁十一烷二酸 C8H14O7 7.9223 7.9183 7.9203 0.000252 甘露糖胺 C6H13NO5 8.6969 8.6872 8.6921 0.000557 鸟嘌呤 C10H13N5O5 9.4114 9.3677 9.3682 0.002673 1−氧−3−氨基吡嗪 C4H5N3O 9.5307 9.4940 9.5124 0.001929 1,2,3−三唑−4−联苯甲醛 C3H3N3O 10.0717 10.0699 10.0708 0.000089 二乙基二甲基锡烷 C6H16Sn 10.4308 10.4281 10.4295 0.000129 L−高丝氨酸 C6H11NO2 10.4546 10.4630 10.4622 0.000443 1，3−二癸炔 C6H16Sn 10.6731 10.6717 10.6714 0.000085 1−哌嗪乙醇 C8H9BN2 10.9266 10.9298 10.9288 0.000149 甘露醇 C6H10O4 11.6747 11.6409 11.6275 0.002088 亮氨酸 C4H10Si 11.6378 11.6347 11.6393 0.000201 2,5−二甲基苯甲醛 C9H10O 11.6923 11.6955 11.6939 0.000136 异硫氰酸异丁酯 C5H9NS 14.0125 14.0328 14.0531 0.001446 2−甲基 −2−异氰酸丙烷 C5H9NO 14.1314 14.1048 14.2224 0.004357 硼酸三乙酯 C6H15BO3 14.2657 14.2609 14.2807 0.000723 N−二乙氨乙基−端粒酶−丁基−异丙基磷 C10H24NP 14.3573 14.3526 14.3351 0.000815 3−(二乙基硼氧基)− 1−丙硫醇 C7H17BOS 15.8069 15.7658 15.8480 0.002600 2,4−二−3−丁基酚 C14H22O 16.8852 16.8860 16.8856 0.000023 10,12−二十三碳二炔酸 C6H11N3O4 18.0846 18.0822 18.0834 0.000066 9,12−十八烯酸 C8H12N2O2 22.6812 22.8048 22.7430 0.002717 精氨酸 C6H14N4O2 23.5295 23.2586 23.3941 0.005789 L−脯氨酰基−L− 缬氨酸 C10H16N2O2 25.2445 25.2353 25.2399 0.000182 花生四烯酸 C20H32O2 27.6091 27.6176 27.6018 0.000286 5,8,11−二十碳三烯酸 C4H6N6O 27.8460 27.8163 27.9191 0.001898 棕榈酸甲酯 C17H34O2 27.9531 27.9876 27.9704 0.000616 D−α−阿拉伯呱喃糖 C17H42O5Si4 28.1760 28.1761 28.1760 0.000002 癸酸 C10H19AgO2 28.5201 28.5239 28.5220 0.000066 D−盐藻糖醇 C21H54O5Si5 28.5610 28.6237 28.5924 0.001096 肌醇 C24H60O6Si6 33.1030 33.1003 33.1017 0.000040 大麦芽碱 C10H15NO 36.3261 36.5231 36.3994 0.002734 (8, 11−十七二烯)4,5−二氰恶唑 C20H35NO 37.0850 37.0833 37.0842 0.000022 9−十八烯酰胺 C18H35NO 37.8143 37.8053 37.8251 0.000262 2−异氰−1 3−二甲基苯 C9H9N 39.2796 39.4483 39.3640 0.002142 氯化磷酸二乙酯 C6H14ClO3P 39.4663 39.4687 39.4495 0.000265 白桦脂醇 C30H50O2 40.3501 40.3509 40.3545 0.000058 十八烯酸单甘油酯 C21H40O4 41.0059 41.0365 41.0212 0.000372 环己烷 C3H12Si3 41.2616 41.2442 41.2529 0.000210 苯甲酰甘氨酸 C9H9NO3 41.2707 41.2523 41.2615 0.000222 十四烷酸乙酯 C16H32O2 41.3497 41.3536 41.3517 0.000047 十八碳二烯酸甲酯 C19H34O2 42.2349 42.2371 41.3508 0.012185
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