Identification of an antagonistic strain Bacillus amyloliquefaciens E3 against Dickeya zeae and its antimicrobial activity
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摘要:目的
纯化和鉴定从柑橘根际土壤分离得到的可抑制水稻基腐病菌Dickeya zeae EC1生长的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，并解析其抑菌机制。
方法采用平板扩散法从根际土壤中筛选出1株拮抗D. zeae EC1的B. amyloliquefaciens E3菌株；根据细菌菌落表型、生理生化特征结合16S rDNA序列分析等方法对E3菌株进行分类鉴定；检测无菌E3培养液对D. zeae EC1侵染水稻种子能力的影响；盐酸沉淀结合丙酮抽提法提取E3菌株脂肽粗提物；采用平板对峙法测定E3菌株脂肽粗提物对病原真菌的抑菌活性，琼脂扩散法测定E3菌株脂肽粗提物对病原细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)；用Durashell C18柱对脂肽粗提物进行HPLC分离纯化；通过液相色谱−质谱联用(LC-ESI-MS)分析，鉴定抑菌物质的相对分子质量并推测其化学组成。
结果B. amyloliquefaciens E3菌株对茄病镰刀菌Fusarium solani、香蕉基腐病菌、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum等多种植物病原菌生长具有抑制作用，表现为广谱抗性；B. amyloliquefaciens E3菌株的无菌培养液能够抑制D. zeae EC1侵染萌发的水稻种子，显著提高水稻种子的萌芽率；B. amyloliquefaciens E3菌株的脂肽粗提物可以抑制D. zeae EC1的生长，其MIC为348.97 µg/mL；HPLC分离纯化结合LC-ESI-MS分析发现，B. amyloliquefaciens E3菌株分泌的主要抑菌活性物质包括Surfactin、Fengycin和Iturin 3类脂肽类抗生素。
结论B. amyloliquefaciens E3菌株具有作为生防菌的潜力，它可能通过分泌Surfactin、Fengycin和Iturin 3种脂肽类抑菌活性物质，拮抗水稻基腐病菌、茄科劳尔氏菌、茄病镰刀菌等多种植物病原菌。研究结果可为该菌的生物防治应用提供理论依据。
Abstract:ObjectiveTo isolate and identify Bacillus amyloliquefaciens strain which can inhibit the growth of Dickeya zeae EC1 from the rhizosphere soil of citrus plants, and analyze its antibacterial mechanism.
MethodThe B. amyloliquefaciens E3 strain antagonizing the growth of D. zeae EC1 was screened from the rhizosphere soil by plate diffusion method. The E3 strain was classified and identified based on colony phenotype, physiological and biochemical characteristics of bacteria and 16S rDNA sequence analysis. Effects of E3 sterile culture medium on the seeds germination ability of rice infected by D. zeae EC1 was detected. The crude lipopeptides of E3 strain was extracted by hydrochloric acid precipitation combined with acetone extraction. The antimicrobial activity of crude lipopeptides against pathogenic fungi were determined by plate confrontation method. The antimicrobial activity of crude lipopetides against pathogenic bacteria were determined by agar diffusion method, and the minimum inhibitory concentration (MIC) was obtained. The crude lipopeptides were separated and purified by HPLC with Durashell C18 column. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-ESI-MS) analysis was used to identify the molecular weights of the antimicrobial substances and speculate its chemical composition.
ResultB. amyloliquefaciens E3 strain had an inhibitory effect against Fusarium solani, D. zeae MS1 and Ralstonia solanacearum, etc, indicating that it had broad-spectrum resistance. The sterile culture medium of B. amyloliquefaciens E3 strain inhibited the infection of germinating rice seeds by D. zeae EC1 and significantly increased the seed germination rate. The crude lipopeptides of E3 strain inhibited the growth of D. zeae EC1 with the MIC of 348.97 µg/mL. HPLC combined with LC-ESI-MS analysis showed that the main antibacterial substances secreted by E3 strain included surfactin, fengycin and iturin.
ConclusionThe B. amyloliquefaciens E3 strain is potential to be a biocontrol agent. It can antigonize a variety of plant pathogens such as D. zeae EC1, R. solanacearum and F. solani by secreting three kinds of lipopeptides including surfactin, fengycin and iturin. The results provide a theoretical basis for the application of B. amyloliquefaciens E3 in biological control.
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谷子Setaria italica又称为粟，去壳后称为小米，在植物学上属禾本科Gramineae狗尾草属Setaria，起源于8 700年以前中国的黄河流域，栽培历史悠久[1-2]。小米营养丰富，除了富含碳水化合物、蛋白质、脂肪三大营养素和多种维生素、矿物质等微量营养物质外，小米特有的黄色素和小米多酚具有预防癌症、抗氧化和抑菌等生理保健功能[3-6]。但是，小米中赖氨酸含量远低于FAO/WHO建议的理想水平，所以在开发食品时研究人员常用赖氨酸含量较高的大豆进行复配[7]。
随着社会生活节奏的逐渐加快，耗时耗力的传统蒸煮烹饪方式已经不能适应当代人们的需求，方便速食粥的开发就变得尤为重要。方便粥的加工方式主要有生化法、浸泡法、喷雾干燥法、超高压法和挤压膨化法等，其中挤压膨化法由于其方便高效、生产成本低廉而被广泛应用[8-12]。食品挤压膨化技术属于高温高压加工技术，特指利用螺杆挤压方式，通过压力、剪切力、摩擦力及加温等作用所形成的对于固体原料的破碎、捏合、混炼、熟化、杀菌、预干燥和成型等加工处理方式[13]。本文以小米复配大豆为原料，利用双螺杆挤压加工方式，研发出一种升糖指数(Glycemic index，GI)较低的小米方便粥，为挤压方便粥的工业化生产提供一定的理论依据，具有一定的现实指导意义。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
试验用小米购于甘肃省庆阳市农科院，小米的淀粉质量分数为66.10%(以干基计)，小米经粉碎机粉碎后，过80目筛，于−4 ℃贮存备用，试验用脱脂大豆粉购于新龙亚洲(龙口)大豆食品有限公司，试验用PI-3200真空上料系统、FM50-24型挤压机、FMFC-600型流化床系统和FMDR-400型烤箱均由湖南富马科食品工程技术有限公司生产。
1.2 小米蛋白质含量测定、必需氨基酸分析及氨基酸评分(Amino acid score，AAS)的计算
委托黑龙江省出入境检验检疫局检验检疫技术中心进行蛋白质含量及必需氨基酸的检测，其中蛋白质含量根据《GB 5009.5—2016》[14]的方法进行测定，苯丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸含量根据《GB 5009.124—2016》[15]的方法进行测定，色氨酸含量根据《GB/T 18246—2019》[16]的方法进行测定。AAS计算公式如下[17]：
$$ {\rm{AAS}} = \frac{{100\;{\rm{g}}{\text{样品中蛋白质氨基酸含量}}}}{{100\;{\rm{g\;FAO}}/{\rm{WHO}}{\text{的标准氨基酸含量}}}} {\text{。}}$$ 1.3 小米方便粥的制备及其性质测定
1.3.1 小米方便粥制备工艺流程
小米方便粥制备工艺流程如图1所示。
1.3.2 单因素试验设计
利用单因素试验分别考察挤压温度(80、100、120、140和160 ℃)、物料含水量(w为8%、30%、32%、34%和36%)、螺杆转速(200、220、240、260和280 r/min)以及焙烤温度(160、180、200、220和240 ℃)对方便粥的糊化度、升糖指数、复水率的测定和感官品质的影响。各因素固定工艺条件为挤压温度120 ℃、物料含水量(w)32%、螺杆转速240 r/min、焙烤温度200 ℃，产品在烤箱中滞留时间约为20 s。
1.3.3 响应面优化试验设计
根据单因素试验结果和Box-Benhnken中心组合试验的设计原理，选取挤压温度、物料含水量和螺杆转速3个影响因子，各取3个水平，进行因素水平共17个试验点的响应面分析试验，并运用Minitable 15数据统计分析软件进行数据分析，进而得到最佳生产工艺条件。
试验因素水平见表1。
表 1 试验因素水平表Table 1. Factor levels of the test水平
Level挤压温度/℃
Extrusion
temperature
(A)螺杆转速/
(r·min−1)
Screw speed
(B)w(水) /%
Moisture
content
(C)−1 120 180 30 0 140 200 33 1 160 220 36 1.3.4 升糖指数的测定
采用Ferrer-Mairal等[18]的方法测定样品升糖指数。准确称取方便粥样品0.1~0.2 g(含淀粉约50 mg，精确到0.001 g)加入到10 mL 浓度为0.1 mol/L的HCl-KCl缓冲液(pH 1.5)中，然后加入1 mg/mL的胃蛋白酶溶液0.2 mL，在40 ℃水浴锅中保温1 h，并不停搅拌。然后将水浴锅温度调至37 ℃，向其中加入15 mL PBS缓冲溶液(pH 6.9)和5 mL α−淀粉酶(2.6 U)，方便速食粥样品中的淀粉酶解反应开始，此反应在37 ℃条件下保温3 h，每0.5 h取样一次，每次取样1 mL，将取出的样液在100 ℃水中加热5 min 使酶灭活，然后冷却至室温，在3 000 r/min下离心10 min，取上清液。采用DNS 法测待测液中的葡萄糖浓度。以酶解反应时间为横坐标，以淀粉水解率为纵坐标，进行淀粉水解曲线的绘制。其中淀粉水解率(SR)为：
$$ {\rm{SR}} = \frac{{\left( {{C_{{t}}} - {C_0}} \right) \times 30.2 \times 0.9}}{{50}} \times 100{\text{%}} , $$ (1) 式中: Ct为在反应时间为t时反应溶液体系中葡萄糖质量浓度，mg/mL；C0为酶解反应开始时，即0 min时反应溶液体系中葡萄糖质量浓度，mg/mL；30.2为酶解反应初始体积，mL；0.9 为葡萄糖与淀粉的转化当量。
因为淀粉水解曲线方程符合一级反应方程，也就是葡萄糖生成曲线符合一级反应方程，所以将淀粉水解曲线转换成葡萄糖生成曲线后，按下式计算酶解反应常数：
$$ {C_t} - {C_0} = {C_{\max }} \times \left( {1 - {{\rm{e}}^{ - kt}}} \right), $$ (2) 式中: Cmax为生成葡萄糖最大质量浓度，mg/mL；k为酶解反应常数，min−1。当算得酶解反应常数后，按照下式计算淀粉水解曲线下面积(AUC)：
$$ {\rm{AUC}} = {C_{\max }} \times \left( {{t_{\rm{f}}}{\rm{ - }}{t_0}} \right) - {{{C}}_{\max} } \times \frac{{1 - {{\rm{e}}^{ - k\left( {{t_{\rm{f}}}{\rm{ - }}{t_0}} \right)}}}}{k}, $$ (3) 式中: tf为酶解反应结束时间，min; t0为酶解反应开始时间，min。然后计算GI ：
$$ {\rm{GI}} = 0.862 \times {I_{{\rm{Sh}}}} + 8.189 = 0.862 \times \frac{{{\rm{AU}}{{\rm{C}}_{\text{方便粥}}}}}{{{\rm{AU}}{{\rm{C}}_{\text{白面包}}}}} + 8.198, $$ (4) 式中: ISh为淀粉水解指数；AUC方便粥为方便粥AUC；AUC白面包为白面包AUC。
1.3.5 复水率的测定
准确称取方便粥的成品米粒质量(m1/g)，置于烧杯中，加5倍沸水后立即加盖，复水5 min后立即沥干水分，并用滤纸滤干表面水分，称质量为(m2/g)，复水率则用m1/m2表示[19]。
1.3.6 感官评分的确定
邀请10名食品专业的老师和同学对复水后的方便粥进行感官评价，评价指标及分值参考《GB/T15682—2008稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法》[20]。
1.4 数据分析
运用SPSS 20.0软件和Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，采用Origin 8.0软件作图。
2. 结果与分析
2.1 原料必需氨基酸评分
经测定，原料小米的蛋白质质量分数为11.96%，含有人体必需的8种氨基酸，但其含量不成比例。原料小米的氨基酸评分如表2所示。其中色氨酸和亮氨酸评分较高，赖氨酸却严重不足。复配了30%(w)大豆粉后的小米粉的氨基酸评分如表2所示，符合FAO/WHO的标准模式[17]。
表 2 小米方便粥原料的必需氨基酸评分Table 2. The scores of essential amino acids in raw materials of millet instant porridge原料
Raw material异亮氨酸 Ile 甲硫氨酸 Met 苯丙氨酸 Phe 色氨酸Try 苏氨酸Thr 亮氨酸Lue 赖氨酸Lys 缬氨酸Val 小米 Millet 1.22 1.25 1.86 2.32 1.31 2.66 0.42 1.46 小米−大豆(w=10%) Millet-defatted soybean flour 1.28 1.19 1.81 2.11 1.34 2.42 0.63 1.41 小米−大豆(w=20%) Millet-defatted soybean flour 1.33 1.11 1.74 2.04 1.36 2.28 0.91 1.39 小米−大豆(w=30%) Millet-defatted soybean flour 1.37 1.05 1.63 1.97 1.40 2.13 1.16 1.36 2.2 小米方便粥加工参数单因素试验
2.2.1 挤压温度对小米方便粥品质的影响
挤压温度对方便粥品质的影响如图2所示，随着挤压温度的升高，样品的糊化度先升高后降低，最大值出现在140 ℃，此时糊化度为87.62%；样品的复水率也有相同的趋势，最大值也出现在140 ℃，此时复水率为329%；样品的升糖指数随着挤压温度的升高而升高，低温时升高较明显；挤压温度对产品的感官品质影响也比较大，感官品质得分随着挤压温度的升高而先升高后降低，低温时升高较明显。
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图 2 挤压温度对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 2. Effects of extrusion temperature on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters above the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.2.2 螺杆转速对小米方便粥品质的影响
螺杆转速对产品品质的影响如图3所示，开始时随着螺杆转速的增加物料的糊化度、复水率和升糖指数随之增加，这说明在低转速下剪切作用的增强有利于淀粉的糊化和复水，在螺杆转速达到200 r/min时，物料的糊化度、升糖指数和复水率均达到最大值，分别为84.22%，67.42和316%。随后，物料的糊化度、升糖指数和复水率随着螺杆转速的升高而迅速下降。随着螺杆转速的增加，感官评分呈先升高后降低的趋势，并在240 r/min时达到最佳。
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图 3 螺杆转速对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 3. Effects of screw speed on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters on the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.2.3 物料水分含量对小米方便粥品质的影响
物料水分含量对产品品质的影响如图4所示，随着进料水分的增加，糊化度先快速升高，在水分含量(w)为30%时糊化度达到83.56%，随后样品的糊化度升高不明显；升糖指数在含水量(w)为33%时达到最大值，随后略有降低；复水率在开始时随物料含水量升高而升高，含水量(w)为33%时达到最大值，随后降低，这是因为虽然物料含水量进一步升高，但是糊化度的升高导致产品黏性过大，反而使复水率有所下降；物料的水分含量越高产品的感官得分越高。
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图 4 物料含水量对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 4. Effects of moisture content of material on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters on the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.2.4 焙烤温度对小米方便粥品质的影响
焙烤是样品加工的最后一道工序，起到使样品二次膨化和干燥并延长样品货架期的重要作用，焙烤温度对产品品质的影响如图5所示。与其他加工条件相比焙烤温度对产品的糊化度、升糖指数和复水率影响不大，其分别为80.23%~83.56%、63.21~67.52和306%~312%，而对感官品质影响极大。
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图 5 焙烤温度对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 5. Effect of baking temperature on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters on the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.3 小米方便粥加工工艺条件优化
为了得到更加精确的方便小米粥加工工艺条件，使用Design-Expert软件，设计了3因素3水平响应面分析试验，试验结果如表3所示。由表3可以看出，第1组试验条件下的糊化度最高，第3组试验条件下的升糖指数最低，第4组试验条件下的复水率最大，第17组试验条件下的感官评分最高。
表 3 方便粥加工工艺三因素三水平的响应面分析结果Table 3. Response surface analysis results of three factors and three levels of instant porridge processing technology序号
No.挤压温度/℃
Extrusion
temperature螺杆转速/(r·min−1)
Screw
speedw(水)/%
Moisture
content糊化度/%
Degree of
gelatinization升糖指数
Glycemic
index复水率/%
Rehydration
rate感官评分
Sensory
score1 160 200 36 92.15 77.54 328 87 2 140 200 33 88.06 80.97 332 91 3 140 220 36 91.41 56.88 316 94 4 120 220 33 84.67 60.02 334 89 5 140 200 33 85.31 81.27 328 93 6 120 200 30 85.56 72.25 326 86 7 140 200 33 85.36 81.24 333 90 8 120 200 36 86.25 70.56 315 88 9 160 180 33 85.24 74.23 325 87 10 120 180 33 83.06 64.31 320 87 11 140 180 30 87.62 67.58 321 90 12 140 200 33 85.29 80.52 327 91 13 140 200 33 85.27 80.97 332 92 14 140 220 30 85.47 77.12 329 90 15 160 200 30 84.22 80.62 327 80 16 160 220 33 84.06 66.31 331 87 17 140 180 36 91.52 66.12 316 95 通过Design-Expert软件，对方便小米粥的糊化度(Y1)、升糖指数(Y2)、复水率(Y3)和感官评分(Y4)进行回归分析，得到各自的二次回归方程，如表4所示。分析表4中的数据可知：糊化度(Y1)回归方程的显著性F值为10.55，对应的P为0.002 6(P<0.01)，说明此模型拟合性极显著；失拟项F为0.49，对应的P为0.710 5(P>0.05)，说明失拟性不显著，在试验范围内误差较小，回归模型与实际情况拟合程度很高。R2越接近1，模型拟合度越好，糊化度(Y1)回归方程的R2为0.934 1，表明此模型可以解释响应值93.41%的变化。综上所述，此模型方程可以很好地分析和预测糊化度指标。同理，对其他3个模型方程进行相应的分析，由表4结果可知，这3个模型方程也都可以对升糖指数、复水率和感官评价进行很好地预测和分析。
表 4 单指标回归方程及分析结果Table 4. Regression equation of single index and analysis result指标
Indicator模型方程1)
Model equationF P 失拟项 Lack of fit R2 F P 糊化度(Y1)
Degree of gelatinizationY1=85.86+0.77A−0.23B+2.31C−0.7AB+
1.81AC+0.51BC−1.78A2+0.18B2+3.97C210.55 0.002 6 0.49 0.710 5 0.934 1 升糖指数(Y2)
Glycemic indexY2=80.99+3.95A−1.36B−3.43C−0.91AB−
0.35AC−4.45BC−3.10A2−11.67B2−2.65C212.50 0.001 6 232.05 0.065 2 0.940 3 复水率(Y3)
Rehydration rateY3=345.60+0.5A−3.50B−5.00C−2.00AB−
2.00BC−8.80A2−9.30B2−15.80C241.18 <0.000 1 1.55 0.332 4 0.983 8 感官评分(Y4)
Sensory scoreY4=91.40−1.13A+0.13B+2.25C−0.50AB−
0.25BC−5.54A2+1.55B2−0.70C215.93 0.000 7 1.09 0.449 5 0.953 5 1)A：挤压温度/℃；B：螺杆转速/(r·min−1)；C：w(水)/%
1)A: Extrusion temperature; B: Screw speed; C: Moisture content另外，通过比较各模型方程回归系数绝对值的大小可以得出结论：挤压温度(A)、螺杆转速(B)、水分含量(C) 对糊化度(Y1) 影响程度的排序为C>A>B，对升糖指数 (Y2) 影响程度的排序为A>C>B，对复水率 (Y3) 影响程度的排序为C>B>A，对感官评分 (Y4) 影响程度的排序为C>A>B。
本文将这4个指标的重要性设置为1∶1∶1∶1。通过响应面试验最终获得糊化度较高、升糖指数较低、复水率较高并且感官评分较好的加工参数为：挤压温度144.53 ℃、螺杆转速220 r/min、w(水)35.12%。但考虑实际的加工情况，将最终的加工参数调整为：挤压温度145 ℃、螺杆转速220 r/min、w(水)35%、焙烤温度200 ℃。预测试验结果为：糊化度89.54%，升糖指数61.53，复水率324%，感官评分93。
以优化出的条件进行试验，重复3次，获得挤压方便粥的各项指标为：糊化度86.72%(与预测值相差3.14%)，升糖指数63.21(与预测值相差 2.73%)，复水率305% (与预测值相差6.05%)，感官评分93(与预测值吻合)。最终得到结果与预测较接近，说明通过模型得到的优化条件具有实用价值。
3. 讨论与结论
通过单因素试验可以看出：挤压温度在120~160 ℃范围内，产品的糊化度、复水率和感官评分达到最佳值，但是产品的升糖指数偏高。当挤压温度在100 ℃以下时，样品的糊化度仅为60%左右，不能达到作为速食粥的要求，所以选择120~160 ℃范围进行响应面试验；螺杆转速在180~220 r/min范围内产品的糊化度和复水率达到最佳值，升糖指数偏高，螺杆转速对产品感官品质影响不明显，所以综合考虑选择该螺杆转速范围进行响应面试验；w(水)为30%~36%范围内产品的糊化度、复水率和感官品质达到最佳值，升糖指数偏高，所以综合考虑选择该水分含量范围进行响应面试验；焙烤温度仅对产品的感官品质影响显著，在200 ℃时达到最佳，所以确定焙烤温度200 ℃对前3个因素进行响应面试验。
随着挤压温度的升高，产品的4个指标均有明显的升高。物料中淀粉的糊化是在适当的温度并吸收足够热量的条件下进行的，只有吸收了足够的热量，才能完成淀粉的糊化。但是机筒温度过高时可能会造成原料中的蛋白质与淀粉降解的糖发生美拉德反应，导致糊化度和复水率的降低，高温下产品过度膨化，产生裂纹会导致产品的感官品质降低[21]。随着螺杆转速的增加，产品的糊化度、升糖指数和复水率呈逐渐下降的趋势，这是由于螺杆转速的提高缩短了物料在挤压机机筒内的滞留时间，与剪切作用相比，滞留时间产生的作用占据了更主要的因素，这与王东[22]的研究基本一致。然而螺杆转速对产品的感官品质影响不明显，这可能是因为这些性质的变化对于产品的口感、气味等因素影响不明显，所以评价人员无法识别其中的差异所致。随着物料含水量的增加，产品的感官品质逐渐提高，这可能是由于物料的含水量越高，在高温作用下的产品外表较圆润，裂纹较少，所以有良好的外观和较好的适口性。改变焙烤温度，对产品的糊化度、升糖指数和复水率影响不明显，是因为产品在烤炉中停留时间较短，无法对产品内部产生大的影响[23]，而随着焙烤温度的升高，产品的色泽逐渐变黄加深，但是当温度高于200 ℃时产品色泽逐渐变为深褐色，并且产生焦糊等对产品不利的气味，所以对产品最终的感官品质影响极大。
目前，通过优化挤压工艺生产低升糖指数食品的研究还鲜有报道，所以挤压加工参数对食品升糖指数的影响机理还需更深入的研究。但近年来，有研究学者通过添加辅料的方式来实现降低食品的升糖指数。例如，蔡乔宇等[24]最新研究发现，挤压重组米可以通过添加0.35%(w)的芦丁或富铬酵母改善体外的消化情况，从而减缓糖的吸收；马艳丽等[25-26]揭示了白芸豆提取物(白芸豆α-AI)对α−淀粉酶的抑制作用机制，并将其应用到低升糖指数方便粥的研发当中，发现将白芸豆α−淀粉酶抑制剂按3.0%(w)的添加量添加到方便粥(燕麦粥、青稞粥和莲子粥)中，升糖指数显著降低。此外，在方便粥的生产工艺中加入乳化剂、增稠剂和营养物质(例如B族维生素)等添加剂可以获得具有更好感官品质和营养价值的方便粥产品，此类问题还有待于进一步研究。
本文采用单因素试验探讨工艺条件对挤压方便粥品质的影响后，通过响应面法进行挤压参数优化，得到最佳的加工工艺条件为：挤压温度145 ℃、螺杆转速220 r/min和水分含量35%(w)。以优化出的条件进行验证试验，获得挤压方便粥的各项指标为：糊化度86.72%，升糖指数63.21，复水率 305%，感官评分93分。低升糖指数小米方便粥的开发不但创新了小米的精深加工方式，丰富了方便谷物食品的种类，同时还会对肥胖和二型糖尿病的预防起到一定的积极作用。
致谢：感谢国家粮食和物资储备局科学研究院刘明博士和谷伊家(山东)食品有限公司给予的支持和帮助！
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图 2 依据16S rDNA序列构建的E3菌株系统发育树
Figure 2. The phylogenetic tree of E3 strain based on 16S rDNA sequence
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图 3 β-甘露聚糖酶基因序列特异性扩增电泳结果
M：DS 5000 marker；1：16S rDNA；2：枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因；3：解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因
Figure 3. The electrophoresis results of specific amplification of β-mannanase gene sequence
M：DS 5000 marker；1：16S rDNA；2：β-mannanase gene from Bacillus subtilis；3：β-mannanase gene from B. amyloliquefaciens
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图 4 以无细胞上清液的抗菌活性为指标的培养基优化结果
Figure 4. Results of medium optimization based on the antibacterial activity of cell-free supernatant
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图 5 Bacillus amyloliquefacions E3菌株无菌培养液对Dickeya zeae EC1抑制水稻种子萌芽率的拮抗效果
“*”、“**”、“***”分别表示0.05、0.01和0.000 1水平的差异显著性(t检验)
Figure 5. Antagonism effect of the sterile culture medium of Bacillus amyloliquefaciens E3 strain on the inhibition of rice seeds germination by Dickeya zeae EC1
“*”，“**”，“***” indicate significance differences at the levels of 0.05，0.01 and 0.000 1 respectively (t test)
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图 6 Bacillus amyloliquefaciens E3菌株粗提脂肽的抑菌活性
A：甲醇；B：无菌上清液；C：粗提脂肽类物质
Figure 6. Antimicrobial activity of crude lipopeptides extracted from Bacillus amyloliquefaciens E3 strain
A：Methanol；B：Sterile supernatant；C：The crude lipopeptides
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图 7 Bacillus amyloliquefaciens E3菌株脂肽粗提物对Dickeya zeae EC1的抑制作用
“*”、“**”分别表示0.05和0.000 1水平的差异显著性(t检验)
Figure 7. Inhibitory effect of crude lipopeptides extracted from Bacillus amyloliquefaciens E3 strain against Dickeya zeae EC1
“*”，“**” indicate significance differences at the levels of 0.05 and 0.000 1 respectively (t test)
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图 8 Bacillus amyloliquefaciens E3菌株的抗真菌谱
A：茄病镰刀菌Fusarium solani；B：黄曲霉Aspergillus flavus；C：黑曲霉Aspergillus niger；D：雪腐镰刀菌Fusarium nival；E：大肠埃希菌Escherichia coli；F：柑橘溃疡菌Xanthomonas citri pv. citri；G：水稻基腐病菌 Dickeya zeae EC1；H：茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum；I：洋葱伯克氏菌Burkholderia cenocepacia；J：香蕉基腐病菌Dickeya zeae MS1
Figure 8. The antimicrobial spectrum of strain Bacillus amyloliquefaciens E3 strain
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图 9 HPLC 纯化分离抑菌物质各馏分活性检测图
1~8：HPLC收集的馏分；9：脂肽粗提物；10：甲醇
Figure 9. Determination of antibacterial activity of each fraction isolated and purified by HPLC
1−8: Fractions collected by HPLC; 9: Crude lipopeptides; 10: Methanol
表 1 水稻基腐病菌拮抗菌 E3菌株的主要生理生化特性
Table 1 The main physiological and biochemical characteristics of Bacillus amyloliquefaciens E3 strain
测定指标
Detected index生化反应
Biochemical
reaction测定指标
Detected index生化反应
Biochemical
reaction接触酶 Contact enzyme 阳性 Positive 苯丙氨酸脱氢酶 Phenylalanine dehydrogenase 阴性 Negative 氧化酶 Oxidase 阴性 Negative 2%(w) NaCl耐盐试验 Salt tolerance test with 2% NaCl 阳性 Positive 明胶水解 Gelatin hydrolysis 阴性 Negative 5%(w) NaCl耐盐试验 Salt tolerance test with 5% NaCl 阳性 Positive V-P试验 V-P test 阳性 Positive 7%(w) NaCl耐盐试验 Salt tolerance test with 7% NaCl 阳性 Positive 丙酸盐利用 Propionate utilization 阴性 Negative 10%(w) NaCl耐盐试验 Salt tolerance test with 10% NaCl 阳性 Positive 脲酶试验 Urease test 阴性 Negative 淀粉水解 Starch hydrolysis 阳性 Positive 吲哚试验 Indole test 阴性 Negative 葡萄糖产酸 Glucose acidogenesis 阳性 Positive 硝酸盐还原 Nitrate reduction 阳性 Positive 柠檬酸盐利用 Citrate utilization 阳性 Positive 酪氨酸水解 Tyrosine hydrolysis 阴性 Negative 酪素水解 Casein hydrolysis 阳性 Positive pH5.7肉汤 pH5.7 Broth 阳性 Positive pH6.8肉汤 pH6.8 Broth 阳性 Positive 
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