Establishment and application of triplex RT-qPCR for detection of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus
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摘要:目的
建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus，PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。
方法选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因，设计3组特异性引物和探针，建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证，同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本，与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。
结果三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上，对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 µL−1级别，与单重法的检测灵敏度相当；与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应；Ct值批内、批间变异系数均在2%以内；可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型，具有群特异性；可有效检测血液中的病毒核酸，检测结果与单重法一致。
结论本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性，可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。
Abstract:ObjectiveTo establish triplex RT-qPCR detection technique for rapid screening and diagnosis of bluetongue virus (BTV), epizootic hemorrhagic disease virus (EHDV) and Palyam serogroup virus (PALV) infection.
MethodNS3 gene of BTV, NS1 gene of EHDV and VP7 gene of PALV were used as target genes to design three sets of primers and probes for the establishment of a triplex RT-qPCR assay. The sensitivity, specificity and repeatability of this assay were evaluated, meanwhile different BTV, EHDV, PALV serotype strains isolated in China and their corresponding positive blood samples, as well as reference strains of 24 BTV serotypes and six EHDV serotypes were used to verify detection effects of the assay.
ResultThe amplification efficiencies of the triplex RT-qPCR assay were all more than 90%, and the copy number detection limits of in vitro transcribed ssRNAs were all low to 10 μL−1, which was equivalent to those of single plex RT-qPCR assay for each virus. There was no cross reaction with akabane virus, peste des petits ruminants virus, foot-and-mouth disease virus and bovine ephemeral fever virus. The intra-assay and inter-assay variable coefficients of Ct value were all less than 2%. The established triplex RT-qPCR successfully detected viral strains belonging to 24 BTV serotypes, six EHDV serotypes and three PALV serotypes, indicating that this assay possessed remarkable group specificity. The established triplex RT-qPCR assay could effectively detect the positive blood samples collected from animals infected by BTV, EHDV and PALV, and the results were consistent with those of monoplex RT-qPCR assay.
ConclusionThe triplex RT-qPCR detection assay for BTV, EHDV and PALV has good sensitivity, specificity and repeatability, and can be used for the simultaneous diagnosis and screening of these three viruses in clinical samples.
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我国现代畜禽养殖正朝规模化、设施化、标准化与信息化方向快速发展，未来5~10年将是智慧畜牧业的快速发展阶段，但在生产方式转型升级过程中尚需解决相应的技术瓶颈，主要表现在：1)畜禽舍建筑与环境调控技术是畜禽品种发挥优良遗传潜力和生产效率的基础，传统畜禽舍建筑存在气密性差、多种通风模式并存且系统转换融合性差等问题，严重地影响了舍内热环境的均匀性与稳定性[1-2]；2)现有环境调控系统普遍基于温度、湿度或气体浓度进行单一指标的负反馈控制，但舍内温度、湿度、风速及空气质量等环境因子耦合作用显著，单一指标控制难以满足畜禽舍复杂环境调控需求[3-4]；3)畜禽自动饲喂与饮水装备的计量及信息采集不配套，难以实现智能化精准饲喂[1, 5]；4)规模畜禽生产清粪劳动强度大，现有机械清粪系统可靠性差、检修难[6-9]；5)养殖过程管理粗放、信息化技术跟不上[1, 2, 10]，导致畜禽养殖面临的整体效率低下、环境污染严重、设施设备落后等突出问题[1-11]。本文从畜禽装配式建筑、均匀环境调控、智能化饲喂与饮水、自动清粪、信息化智能管理等几个方面对近年来的研究进展进行了总结，重点分析了畜禽舍装配式建筑与热环境耦合调控技术，畜禽舍环境因子智能化监测与自动化调控技术，畜禽智能化饲喂、饮水装备，畜禽舍清粪工艺及自动化清粪装备，以及畜禽生产信息实时采集与智能管理技术等，并对中国畜牧业机械化与智能装备发展的方向进行了展望，为我国现代畜牧业生产模式的转型升级与提质增效提供参考，促进现代畜牧业的绿色高质量与健康可持续发展。
1. 畜禽舍建筑与热环境耦合调控技术
1.1 鸡舍建筑与热环境耦合调控技术
良好的保温隔热性能和气密性是畜禽舍热舒适性环境及均匀性调控的前提和基础。Wang等[12-18]建立了鸡舍热湿空气耦合传递的微环境模拟模型；分析了鸡舍温度波动的主要环境因子[12-15]；建立了不同地区无供暖系统蛋鸡舍外围护结构热阻及保温材料经济性模型，明确了不同气候区鸡舍围护结构的保温性能要求与蛋鸡饲养方式(密度)的关系[16-17]；探索了装配式鸡舍建筑外围护结构缝隙对舍内外压差、渗透风量和能耗的影响，明确了围护结构搭接缝隙气密性参数指标[18]；系统分析了鸡舍进风口及进风参数影响舍内气流组织的稳定性[19-22]。Wang等[19-20]基于非等温贴附射流理论设计舍内气流组织，明确了进风口位置、尺寸及进风参数对舍内贴附射流长度、温差衰减的影响规律，构建了回流区域内温度解析表达式，解析了基于鸡舍建筑与通风系统耦合作用的鸡舍稳温机理，并提出了降低温度波动及温差的纵墙湿帘风道布置与小窗均匀进风的通风模式(图1)。基于灰色预测理论和鸡舍微环境模型，王阳[22]提出了鸡舍热环境预测调控新方法，建立了密闭式鸡舍内不同环境参数指标的热环境灰色预测模型及调控规律，实现了单栋10万只以上规模鸡舍温差不超过3 ℃的稳温调控效果。
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图 1 纵墙湿帘缓冲室山墙排风系统[19]Figure 1. Sidewall inlets of the new ventilation system with surge chamber and bottom hinged flap1.2 猪舍通风及节能减排技术
规模化母猪场妊娠母猪通常采用自动料线定位栏饲养，集约化、自动化程度较高，饲养数量和密度大，生产过程中产生大量的热量和气体污染物需及时排出[23-28]。国内规模化猪场采用的横向或纵向湿帘降温系统很难满足妊娠母猪对热环境和空气质量环境的需求，李修松等[26-27]对妊娠母猪舍采用湿帘与地道风相结合的湿帘降温系统进行夏季和冬季舍内环境连续监测，结果表明良好的通风系统能够为母猪提供适宜的生长环境，降低能源消耗，减少猪场运营成本。畜禽养殖用地紧张，规模化楼房猪场可通过提升土地利用效率在一定程度上降低成本(图2)。Wang等[23]利用CFD技术模拟评估楼房猪舍内气流环境发现，风井内不同压力分布导致每层的通风量存在差异，楼房猪舍一楼的通风量最低，楼层数的增高会对风机通风性能产生负面影响；增加风井宽度对风机性能产生正效果，尤其是增加处于低层楼房猪舍的通风量；精准通风可提高楼房猪舍内温度以及气流的稳定性和均匀性，减少猪舍的必要通风量和节约环境控制能耗。
1.3 奶牛热舒适评价方法
热应激严重影响奶牛的生产力、繁殖力和福利。为降低奶牛热应激的风险，国内外学者一直在寻求预测和评估热应激的方法，在诸多方法中综合多个环境因子的热应激指数模型最为常用[29-30]。为避免在指数选择上的盲目性，一些学者系统梳理了已有奶牛热应激指数评价方法并进行了分类，对比分析了不同评价指数在奶牛热应激时表征指标的差异，认为已有的指数普遍不能很好地反映奶牛与环境的换热机理，导致不同环境条件下评价结果差异较大[29-31]。为更好地开展奶牛热舒适环境评价方法的研究，严格齐等[31]在总结前人研究的基础上提出了一种结合体表温度的奶牛换热模型并进行了MatLab源代码编制。
2. 畜禽舍环境监测与调控装备
2.1 基于光谱技术的NH3和H2S检测装置
畜禽舍NH3浓度检测多采用电化学传感器，使用中普遍存在对畜禽舍复杂环境抗性低、易钝化、精度低、使用寿命短等问题，以致目前实际使用的畜禽舍环境调控系统在决策时无法采用NH3浓度作为调控指标。谭鹤群等[32]基于可调谐吸收光谱技术搭建了一套畜禽舍NH3浓度检测系统，该系统主要由激光发射单元、光路与气路单元、光电信号接收单元以及谐波信号处理单元4个部分组成，并研究了调制频率、调制幅值、谐波分析相位差、扫描频率等系统参数对检测系统精准度的影响，结果表明光谱检测系统的线性误差和重复误差均显著小于电化学检测仪，且与INNOVA检测仪相当，研究结果为畜禽舍NH3浓度实时在线监测设备的研发提供理论依据。基于光谱技术的NH3、H2S检测装置如图3所示。
2.2 基于LORA的畜禽舍环境参数实时采集系统
畜禽养殖环境下，现场监测布线复杂，传统的传输成本高、功耗大、距离短，采用无线传感器监测畜禽舍内环境参数，便于传感器组网，不需要布线，布点灵活，结合广域网通讯和云平台，可实现环境信息的远程实时监控[33-34]。华中农业大学和河北农业大学研究团队根据不同畜禽舍、不同用户对环境监测的需求，集成不同类型传感器，考虑到畜禽场地理位置的多样性，采用WIFI和LORA 2种舍内组网通讯方式，广域网通讯方式为有线网络和NB-IoT，研制了多种不同组合的监测设备(图4)，测试结果表明设备抗干扰能力和可靠性较高，能胜任养殖环境复杂条件下远距离无线信息传输工作。
2.3 基于多参数的牛舍环境精准调控系统
牛舍内环境因子耦合作用显著，现有的调控系统普遍基于单一指标的负反馈控制，难以满足复杂环境调控及动物环境舒适性需求。基于多元参数的环境综合评价指标与调控模型，已研发了用于牛舍的多参数环境精准调控系统(图5)[35-37]。该系统主要包括牛舍卷帘冬季调控策略、夏季感应喷淋装置、控制器及控制系统应用集成3个部分；考虑舍内的热舒适性、空气质量、气流模式和温度分布等因素，给出了母牛舍卷帘开度与开口方式相互作用的调控策略；考虑大多数条件下奶牛散栏饲养，为防止出现无牛喷淋，研发了感应喷淋装置，控制区域内喷头运行，实现了节水、节电；根据环境需要控制多组牛舍卷帘的开度和多组风机、喷淋的开关，实现了分区域的喷淋和风机控制。
3. 畜禽智能化饲喂和饮水装备
3.1 智能饲喂设备
针对畜禽不同生理生长阶段对养分的动态需求存在差异，综合考虑产品性质、用途、价格和销量，国内已设计开发了犊牛精准牛奶饲喂机、奶牛分群管理精准饲喂系统、自走式精准撒料机、母猪小群养智能饲喂站、智能化奶羊饲喂站等全新产品(图6)[38-40]。犊牛自动饲喂机对带有识别信号的犊牛进行自动饲喂，对加速牛群增殖、降低牧场成本和提高经济效益起到了重要作用。奶牛分群管理精准饲喂系统，根据牛只的生长情况为牛只的出入场、分群、转群、分栏提供数据支撑，也为日粮配方的改进提供了基础数据信息。自走式精准撒料机设备整体结构紧凑，撒料均匀，可随时调整出料量，方便使用。母猪小群养智能饲喂站，将妊娠母猪从定位栏中解放出来，适用于我国福利化舍饲散养工艺，增强了母猪自身体质和免疫力，可以实现猪场日常饲喂无人化。传统的定时定量投料饲喂会发生采食拱料及争食浪费现象，保育猪粥料智能饲喂器具有料位监测功能，低料位补料、高料位停料，可节约大量饲料，且用水拌料饲喂保育猪可以减少断奶应激，提高了保育猪成活率和生长速度，减少了呼吸道疾病的发病率。畜禽智能化精准饲喂装备的设计研发与应用已初步突破了家畜个体精准饲喂控制的难点，实现了畜禽智能化饲喂装备关键核心技术突破。
3.2 数字化饮水、加药和消毒设备
畜禽通过饮水投药易造成药物浪费和饮用药物不均等问题，自动加药装置改变了将兽药加入饮水的传统做法，通过控制搅拌速率、搅拌时间将固体兽药直接与饲料混合，加药装置通过电机控制绞龙叶，根据实际情况调整药物的流量，可避免兽药的浪费。养殖场定期防疫或疫病爆发期，定时按需投药存在投药不均、劳动强度大的问题，畜禽饲料加药装置通过控制搅拌的速率及时间，实现了自动加药，有效地解决了兽药混合不均等问题。
畜禽养殖过程存在消毒防疫频繁、细菌耐药性强和用药量大等问题，微酸性电解水可在畜禽养殖的环境净化、饮水系统及物品等消毒环节中替代化学消毒剂，微酸性电解水消毒及环境净化技术已应用在畜禽养殖场环境净化、通道、设备、鸡蛋及饮水管线消毒等各个方面[41-43]。微酸性电解水属于绿色、环保、安全、高效的杀菌消毒剂，稳定性好，杀菌能力强，其杀菌能力是次氯酸钠的80倍，且微酸性电解水机(图7)以氯化钠溶液和稀盐酸为原料，价格相对较低。
4. 畜禽舍自动清粪系统
4.1 猪场自动清粪系统
粪污清理是生猪养殖过程中的重要环节，传统的定时清粪易导致舍内粪污堆积，从而使有害气体大量排放，严重影响猪只的健康和周边环境。利用BP神经网络构建粪污量预测模型，实时预测当前时刻猪舍内粪污量并及时进行清理，可有效降低粪污在猪舍内的累积和有害气体的长时排放[44-45]。猪场虹吸式清粪及转运系统可提高规模化猪场的清粪效率、节约养殖场的劳动力成本；通过结合不同地域气候条件，优化了虹吸式管道排污系统的设计及安装工艺[44-49]。利用台达DOPSoft 2.00.07和WPLSoft2.48软件研发的猪场自动清粪系统信息平台(图8)，不仅提高了清粪效率，也提高了设备的稳定性和维修、维护效率，为降低猪场疫病防控风险提供了数据支撑，可以解决猪场清粪过程中因信息化程度不足而导致的数据获取少、预警不及时和检修频繁进场等问题[44-49]。
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图 8 猪场自动清粪系统信息平台Figure 8. The information platform of automatic manure cleaning system in swine farm4.2 家禽传送带自动清粪系统
近年来，家禽的多层立体叠层饲养在我国得到快速发展，采用各层网下传送带清粪不仅解决了禽与粪的及时分离难题，还实现了粪不落地、日产日清，显著提升了舍内空气质量。由于水禽粪便的含水量高，如何解决传送带清粪的漏水问题是养殖业关注的焦点，水禽场高效清粪系统创新了对辊驱动，增加了敷胶工艺及自动纠偏机构，实现了联动和可拆卸功能，大大改善了粪带性能，延长了粪带的使用寿命，清粪速度提高了30%~40%，解决了由于禽粪湿度差异所造成的清粪难题，有效地提高了清粪带的清洁度，减少了舍内禽粪滞留时间。家禽场传送带自动清粪系统设计了清粪端刮粪板整体调节装置和可拆卸刮粪板装置，将多层刮粪板连接形成联动装置，确保多层刮粪板整体胀紧，方便清理刮板与粪带之间的积粪[50-52]。
5. 畜禽生产信息实时采集与智能管理技术
5.1 家禽安全高效养殖智能信息管理系统
家禽安全高效养殖智能信息管理系统包括家禽养殖信息实时监测、疾病预警系统、养殖智能信息管理系统。Cuan等[53]建立了基于机器视觉的笼养和散养家禽异常行为检测方法。对笼养家禽的站立或卧倒姿态(行为)进行识别，判断其是否属于疑似病禽，实现家禽的异常行为检测；对散养家禽进行非接触式检测，通过判断家禽行为(啄食行为、正常行为和异常行为)实现健康鸡和疑似病鸡的检测；设计了去噪方法，对选出的声音事件进行噪声分数检测，去除在家禽叫声频域范围之外有较高能量的噪声事件，对获取的家禽叫声进行变换[53-54]。
5.2 牛安全高效养殖智能信息管理系统
Kang等[55]分析跛行奶牛行走运动模型，提出了基于支撑时相的奶牛跛行检测方法和算法，为奶牛跛行检测提供了新的技术。康熙等[56]提出的基于热红外相机的奶牛跛行检测系统，减少了跛行对奶牛健康及产奶量影响，提高了奶牛跛行运动特征获取的准确性。张旭东等[57-58]提出了基于深度学习网络EFMYOLOv3(Enhanced Fusion MobileNetV3 You Only Look Once v3)的多目标检测方法，搭建了基于热红外相机的奶牛乳腺炎检测系统，并融合于奶牛疾病检测系统，为奶牛乳腺炎检测提供了新的技术。基于SVM(Support vector mechines)和经验小波的奶牛动态称质量方法以及三维重建的奶牛体质量预估方法，为养殖场奶牛称质量提供了新的思路，提高了称质量效率，减少了称质量过程中奶牛的应激反应，提高了奶牛福利[59-62]。任晓惠等[63]提出了一种基于机器学习算法的SVM和贝叶斯分类算法的奶牛行为自动识别方法，对奶牛的发情行为、反刍行为、进食行为和饮水行为进行分类和识别，为进一步开展奶牛异常行为检测、疾病的智能化预警研究提供了技术支持。
5.3 畜禽规模化安全高效养殖大数据平台
我国畜禽养殖行业转型阶段，畜禽安全高效养殖大数据平台的开发及示范应用为畜禽养殖企业提供了有效的智能养殖管理，可以减少企业养殖人员投入，降低人与畜禽的接触频率，保障养殖场的生物安全，实现畜禽养殖的少人化、远程化、数据化管理[1-3, 11]。猪安全高效养殖管理平台通过连接猪场的物联网设备，构建养殖企业猪舍实时监测系统、疾病预警及智能信息管理系统等，实现猪场管理数字化、在线化，通过大数据技术分析，为猪场提供生产、经营的最佳解决方案，使得猪场管理更加标准和规范，实现了生猪全过程生产信息化管理。蛋鸡安全高效养殖管理平台系统实现了不同来源数据的互联互通，同步实时预警多单位多鸡场管理、养殖异常现象、推送饲养方案及汇总分析生产数据。通过PC端和手机端应用，用户可随时查看批次日、周、月成绩数据，做到蛋品可全程追溯，提升生产效率。
6. 结论与展望
6.1 结论
现代畜禽舍建筑与环境调控技术设备是现代畜禽设施化养殖的前提条件，也是保障高产畜禽品种发挥遗传潜力和生产效率的基础，越来越受到重视与关注。适宜的畜禽养殖用地逐渐减少，提升土地利用效率可一定程度上降低成本，规模化楼房猪场为现代集约化猪场开辟出了新道路，为设计适合中国国情的规模化猪场提供了参考依据。规模养殖场中使用劳动力最多、劳动强度最大且作业环境差的2个环节为饲喂和清粪，从饲喂和清粪角度创制关键装备，可有效解决畜禽场对人工的依赖、提高劳动效率、降低末端粪污处理难度，并通过精准饲喂控制，提升生产效率、实现节本增效，促进现代畜禽生产向信息化与智能化方向发展。畜禽养殖信息采集、挖掘与集成优化是促进产业由数字化向网络化、智能化方向升级的关键环节，基于物联网和大数据挖掘技术，建立集饲养规划、生产管理、可追溯于一体的畜禽高效安全养殖信息管理系统，可实现规模畜禽健康养殖过程的智能化管理。本文以畜禽健康养殖的空间环境需求为切入点，从装配式畜禽舍与热环境调控、环境自动化控制系统、智能饲喂与饮水装备、自动清粪系统、智能管理系统5个方面对畜禽养殖智能装备与信息化技术研究与应用进行了分析，为构建我国畜禽健康高效养殖智能装备与信息化技术体系提供关键支撑，为中国现代畜牧业生产模式的转型升级与提质增效提供了参考依据，有利于促进现代畜牧业的健康可持续发展。
6.2 展望
《国务院关于加快推进农业机械化和农机装备产业转型升级的指导意见》(国发〔2018〕42号)中明确提出，到2025年畜牧业机械化率总体达50%以上，且要以畜牧业机械化向全程全面高质高效转型升级为主线，以推进机械装备与养殖工艺相融合、畜禽养殖机械化与信息化相融合、设施装备配置与养殖场建设相适应、机械化生产与适度规模养殖相适应，为畜牧业高质量发展、加快现代化步伐提供有力支撑。畜牧业加快向标准化规模养殖转型升级，装备总量持续增长，机械化水平不断提升，但不同地区、畜种、养殖规模和生产环节机械化发展不平衡不充分，畜牧业机械化总体水平还不高，科技创新能力不强、部分技术装备有效供给不足、养殖工程与设施装备集成配套不够等问题突出。机械化是畜牧业现代化的重要基础和重要标志，养殖智能装备与信息化技术是加快机械化发展的有力支撑。畜禽养殖将向绿色高质量模式转型发展，以标准化、规模化、超大规模化、生态化、福利化、养殖无抗化以及数字化、信息化和管理智能化为方向，未来中国畜牧业机械化与智能装备发展主要集中解决畜牧装备产业的薄弱环节和卡脖子问题，具体包括提高中小规模养殖场(户)的机械化水平、畜牧业机械化与环境保护、疫病防控与机械化水平以及人才培养和人才队伍建设等方面；畜牧业信息化将以数字化、网络化、智慧化、智能化、信息化阶段升级发展为主要趋势，数字化阶段以畜禽生产过程及设施设备信息资源的实时准确可靠采集为主，网络化集中于信息资源的融合，数据挖掘和智慧管理是智慧化的必经之路，畜禽养殖数字化是智能化的基础，在机器深度学习人工智能的基础上实现智能化发展。
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图 1 三重RT-qPCR特异性试验
BTV：蓝舌病病毒；EHDV：流行性出血病病毒；PALV：帕利亚姆血清群病毒
Figure 1. Specificity test of triplex RT-qPCR
BTV: Bluetongue virus; EHDV: Epizootic hemorrhagic disease virus; PALV: Palyam serogroup virus
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图 2 蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒体外转录ssRNA对三重RT-qPCR灵敏性评价
曲线上数字0~10分别代表ssRNA拷贝数为1×100~1×1010 μL−1
Figure 2. Sensitivity evaluation of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus in vitro transcribed ssRNA to triplex RT-qPCR
The numbers from 0 to 10 on the curves indicate ssRNA copy numbers of 1×100−1×1010 μL−1 respectively
表 2 蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR的引物与探针
Table 2 Primers and probes used for detecting bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus by triplex RT-qPCR
引物/探针
Primer/Probe扩增或标记位置
Amplification or
label location扩增或标记长度/bp
Amplification or
label length引物或探针序列(5′→3′)
Primer or probe sequenceBTV-NS3-F Seg-10 189~207 TGGAYAAAGCGATGTCAAA BTV-NS3-R Seg-10 266~285 ACATCATCACGAAACGCTTC BTV-NS3-Probe Seg-10 243~264 FAM-ARGCTGCATTCGCATCGTACGC-BHQ1 EHDV-NS1-F Seg-5 12~32 TCTTCGTCGACTGCCATCGAG EHDV-NS1-R Seg-5 66~94 AACATTTTGACATGATTKGCRTARTAACT EHDV-NS1-Probe Seg-5 34~63 TAMRA-TGGAGCGCTTTTTGAGAAAATACAACATGA-BHQ1 PALV-VP7-F Seg-7 275~295 CATCAATGGCAACAATCGGTG PALV-VP7-R Seg-7 346~369 ATTCAGCATACCTGTAATTCGTAC PALV-VP7-Probe Seg-7 314~341 VIC-TTCCATATACAACGTCGGCAATGACAAG-BHQ1 
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表 1 中国分离的不同蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒血清型代表毒株信息
Table 1 Representative strains of different serotypes of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus isolated in China
血清型 Serotype 毒株 Strain 分离年份 Isolation year 分离地点 Isolation place 来源动物 Animal source BTV-1 V147 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 绵羊 Sheep BTV-2 V146 2013 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-3 V025 2013 云南德宏 Dehong, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-4 V030 2013 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-5 V084 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-7 V089 2014 广东汕头 Shantou, Guangdong 黄牛 Cattle BTV-9 V008 2013 云南德宏 Dehong, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-12 V007 2012 广西南宁 Nanning, Guangxi 黄牛 Cattle BTV-15 V061 2014 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle BTV-16 V109 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 绵羊 Sheep BTV-21 V057 2013 江苏须臾 Xuyu, Jiangsu 黄牛 Cattle BTV-24 V015 2013 云南德宏 Dehong, Yunnan 黄牛 Cattle EHDV-1 V128 2013 广东汕头 Shantou, Guangdong 奶牛 Cow EHDV-5 V127 2015 广西融水 Rongshui, Guangxi 水牛 Buffalo EHDV-6 V274 2014 云南普洱 Puer, Yunnan 黄牛 Cattle EHDV-7 V296 2013 云南师宗 Shizong, Yunnan 水牛 Buffalo EHDV-10 V280 2017 云南师宗 Shizong, Yunnan 黄牛 Cattle CHUV V144 2012 云南师宗 Shizong, Yunnan 黄牛 Cattle DAV V157 2015 云南红河 Honghe, Yunnan 水牛 Buffalo BCV V252 2016 广东汕头 Shantou, Guangdong 奶牛 Cow
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表 3 单重和三重RT-qPCR方法Ct值比较1)
Table 3 Ct value comparison between monoplex and triplex RT-qPCR
核酸拷贝数/μL−1
Nucleic acid copy number蓝舌病病毒
Bluetongue virus流行性出血病病毒
Epizootic hemorrhagic disease virus帕利亚姆血清群病毒
Palyam serogroup virus单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex 1×1010 8.57 9.00 9.05 9.15 6.47 6.80 1×109 11.63 12.17 12.23 12.26 9.22 9.20 1×108 15.43 15.72 15.71 15.76 13.75 13.45 1×107 18.83 19.11 19.35 19.04 16.83 17.05 1×106 22.30 22.34 22.59 22.48 20.92 21.01 1×105 25.40 25.75 26.15 26.12 24.59 24.55 1×104 28.50 28.87 29.47 29.59 28.09 28.13 1×103 31.75 32.10 32.65 33.17 31.03 30.96 1×102 34.38 35.04 35.51 36.03 34.28 34.61 1×101 37.78 38.11 38.28 38.64 37.48 37.66 1×100 — — — — — — 1×10−1 — — — — — — 1) “—”表示未检测出
1) “—”indicates not detectable
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表 4 混合病毒核酸样品单重和三重RT-qPCR检测结果
Table 4 Results of mixed virus nucleic acid samples detected by monoplex and triplex RT-qPCR
样品
Sample病毒1)
Virus核酸拷贝数/ μL−1
Nucleic acid copy numberCt 单重 Monoplex 三重 Triplex 1 BTV 1×106 23.20 23.24 EHDV 1×104 30.45 30.57 PALV 1×102 35.33 35.66 2 BTV 1×104 29.48 29.85 EHDV 1×102 37.01 37.08 PALV 1×106 21.82 21.91 3 BTV 1×102 35.43 36.09 EHDV 1×106 23.49 23.38 PALV 1×104 29.07 29.11 1) BTV：蓝舌病病毒；EHDV：流行性出血病病毒；PALV：帕利亚姆血清群病毒
1) BTV: Bluetongue virus; EHDV: Epizootic hemorrhagic disease virus; PALV: Palyam serogroup virus
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表 5 三重RT-qPCR重复性试验中Ct值与变异系数
Table 5 Means and coefficients of variation in repeatability tests of triplex RT-qPCR
病毒
Virus核酸拷贝数/μL−1
Nucleic acid copy numberCt1) 变异系数/% Coefficient of variation 批内 Intra-assay 批间 Inter-assay 批内 Intra-assay 批间 Inter-assay BTV 1×107 18.61±0.19 18.89±0.29 1.05 1.54 1×105 25.39±0.26 25.32±0.40 1.03 1.58 1×103 31.37±0.43 32.54±0.46 1.37 1.40 EHDV 1×107 19.32±0.25 19.12±0.30 1.30 1.59 1×105 26.28±0.32 26.66±0.48 1.22 1.82 1×103 32.62±0.35 33.17±0.40 1.08 1.19 PALV 1×107 16.85±0.20 17.15±0.24 1.16 1.38 1×105 24.58±0.27 24.43±0.40 1.10 1.64 1×103 30.91±0.32 30.55±0.50 1.03 1.44 1)表中数据为平均值±标准差
1)The data are mean ± standard deviation
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表 6 单重和三重RT-qPCR检测中国分离的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒毒株及对应阳性血液样本的验证试验
Table 6 Demonstration tests of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease and Palyam serogroup virus strains isolated in China and corresponding blood samples by monoplex and triplex RT-qPCR
血清型
Serotype毒株
StrainCt(病毒样品 Virus sample) Ct(血液样品 Blood sample) 单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex BTV-1 V147 16.21 16.79 32.01 32.63 BTV-2 V146 22.12 22.60 30.89 30.67 BTV-3 V025 19.03 18.87 30.02 29.82 BTV-4 V030 23.13 23.45 31.52 31.76 BTV-5 V084 20.57 21.67 31.87 32.21 BTV-7 V089 25.23 25.12 31.13 30.53 BTV-9 V008 17.55 17.63 30.21 29.98 BTV-12 V007 21.06 20.15 28.03 27.69 BTV-15 V061 18.73 18.67 32.89 33.13 BTV-16 V109 20.12 19.32 33.34 34.27 BTV-21 V057 24.32 25.07 32.08 31.45 BTV-24 V015 17.55 17.34 34.67 35.24 EHDV-1 V128 18.67 18.69 30.34 29.68 EHDV-5 V127 20.23 20.12 29.76 30.20 EHDV-6 V274 22.95 23.32 34.32 34.46 EHDV-7 V296 15.15 14.67 33.58 32.14 EHDV-10 V280 16.07 16.12 30.31 29.07 CHUV V144 21.22 20.69 31.68 30.57 DAV V157 16.32 15.32 30.57 31.75 BCV V252 23.46 24.54 31.76 32.62
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表 7 单重和三重RT-qPCR检测蓝舌病病毒和流行性出血病病毒参考毒株的验证试验
Table 7 Demonstration test of reference strains of bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus by monoplex and triplex RT-qPCR
血清型
SerotypeCt 血清型
SerotypeCt 单重 Monoplex 三重 Triplex 单重 Monoplex 三重 Triplex BTV-1 17.09 16.72 BTV-16 19.66 20.07 BTV-2 20.62 21.45 BTV-17 15.08 14.86 BTV-3 21.09 22.63 BTV-18 18.60 17.32 BTV-4 18.32 17.82 BTV-19 22.23 21.12 BTV-5 20.44 19.31 BTV-20 21.15 20.67 BTV-6 21.16 20.08 BTV-21 26.04 27.62 BTV-7 22.67 23.43 BTV-22 22.62 23.51 BTV-8 15.96 15.67 BTV-23 25.34 26.02 BTV-9 22.26 21.30 BTV-24 20.26 19.09 BTV-10 20.68 21.67 EHDV-1 19.68 18.93 BTV-11 21.75 22.52 EHDV-2 21.79 22.22 BTV-12 21.63 20.03 EHDV-5 18.60 17.45 BTV-13 22.78 23.12 EHDV-6 19.73 18.96 BTV-14 24.06 23.56 EHDV-7 20.62 19.65 BTV-15 23.12 22.67 EHDV-8 19.63 20.05
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