Isolation and identification of Mangshi virus in sentinel cattle from border areas of Yunnan Province
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摘要:目的
掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。
方法在云南省景洪市设立哨兵牛3头，每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定，采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。
结果2019年，在监测期第13周，从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019)，电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子，琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA，RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示，分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2 055和1 122 bp，编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa) 和VP7(298 aa)，基因节段Seg-2和Seg-9长度为3 055和1 076 bp，编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa) 和VP9(283 aa)；分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度在97.4% (Seg-9)~98.5% (Seg-2)之间，氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示，监测期的第11周，牛血液中病毒核酸检测呈阳性，病毒核酸含量在第13周达到高峰，随后快速降低，在第18周转为阴性；感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14)，在第16~18周处于高峰(1∶226)，至监测结束的第24周降低为1∶57。
结论本文从牛体中分离到了MSV，表明牛是MSV的易感动物之一，病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。
Abstract:ObjectiveTo analyze the diversity, dissemination risk of animal arboviruses in border areas of Yunnan Province.
MethodThree sentinel cattles were placed in Jinghong City, Yunnan Province and blood samples were weekly collected for arboviruses monitoring and virus isolation. The isolated virus was identified through agar-gel electrophoresis, electron microscopy, RT-PCR amplification, cloning and sequencing. The infection characteristics of the virus in infected cattle were retrospectively analyzed by qRT-PCR and serum neutralizing test (SNT).
ResultIn 2019, a virus strain (V301/YNJH/2019) which caused cytopathic effect on C6/36 cells, was isolated from blood sample collected from one of the cattle at the 13th week of monitoring period. Electron microscope observation revealed that the virions were icosahedral symmetry with a diameter of about 70 nm. The result of agar-gel electrophoresis showed that the viral genome was composed of double stranded RNA. The isolated virus was identified as Mangshi virus (MSV) by RT-PCR identification. Sequence analysis exhibited the lengths of Seg-4 and Seg-7 from the isolated virus were 2 055 and 1 122 bp respectively, encoding viral out-most shell VP4 (628 aa) and VP7 (298 aa) proteins, while Seg-2 and Seg-9 were 3 055 and 1 076 bp respectively in length encoding viral inner-core VP2 (956 aa) and VP9 (283 aa) proteins. Phylogenetic analysis showed that the isolated virus had the closest relationship with MSV/DH13M041 isolated from Mangshi of Yunnan Province, with their nucleic acid sequence similarities ranging from 97.4% (Seg-9) to 98.5% (Seg-2) and amino acid sequence similarities ranging from 96.4% (VP9) to 98.4% (VP2). Retrospective investigation results of the virus infection indicated that virus nucleic acid was first detected in the blood of the infected cattle at the 11th week of monitoring period. The virus nucleic acid in the blood reached the peak at the 13th week and dropped rapidly, becoming not detectable within 5 weeks. The results of SNT showed that neutralization antibody against V301/YNJH/2019 was first detected at the 13th week (antibody titer 1∶14), peaked from the 16thto 18thweek (antibody titer 1∶226) and decreased to 1∶57 when monitoring terminated at the 24thweek.
ConclusionThe MSV isolation from cattle indicating cattle is one of the susceptible animals of MSV. In naturally infected cattle, the virus is characterized by “transient infection” with no clinical symptoms. Our study imparts a foundation for study of epidemiology, pathogenicity, and diagnostic reagents of MSV.
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Keywords:
- cattle /
- Mangshi virus /
- arboviruse /
- phylogenetic analysis /
- sentinel animal /
- infection characteristic /
- retrospective analysis
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温室控制系统通过多个传感器模块对环境因素进行数据采集，并对采集到的数据进行处理与分析。控制系统利用这些数据对温室中的各个因素进行调节与控制。由于传感器自身存在误差，并受到光照升温和长时间高湿状态等因素的影响，导致传感器采集到的温、湿度数据不准确[1]。目前对温室传感器的研究主要集中在硬件的优化、传感器的配置优化、温室数据融合等方向，对采集后的数据进行优化处理的应用较少。张敏等[2]采用MEMS集成的温湿度模块对端子箱中温、湿度同时进行测量，并使用温湿度自动补偿功能使测量更准确。该方法仅使用传感模块自带的温湿度自动补偿功能进行校准处理，无法完全消除由外在干扰引起的噪声，测试结果仍存在误差。尤其当环境湿度波动较大时，测量的湿度值误差也较大。于玉婷等[3]依据实测数据选用高斯函数对温室温度的日变化曲线进行最小二乘多峰拟合，将离散的数据点转化为连续的高斯函数。但在长时间高湿状态和持续存在噪声的环境下，拟合效果欠佳。Manoharan[4]利用监督学习算法对温室内环境参数进行分析并对后续采集的数据进行了自校正处理。监督学习的结果更好地展现了作物的生长环境，提高了温室环境中作物生产最优控制策略的效率。但该研究仅对短期温室环境数据进行了分析，缺少对持续高湿状态等恶劣环境的研究。
为提高温、湿度数据的精度与可信度，有必要对采集到的温、湿度数据进行降噪处理。由于传感器获取的环境温、湿度数据表现出非线性以及不稳定的特征。针对此类信号的分析，应采用时频分析方法。常采用的时频分析方法有短时傅里叶变换(Shorttime fourier transform, STFT)、小波变换(Wavelet transform,WT)、小波包变换(Wavelet packet transform)、经验模态分解(Empirical mode decomposition, EMD)、集合经验模态分解(Ensemble empirical mode decomposition, EEMD)和自适应噪音的完全集合经验模态分解(Complementary ensemble empirical mode decomposition with adaptive noise, CEEMDAN)。Liu等[5]使用EEMD方法对航空电磁数据进行去噪处理，结果显示，EEMD方法能够更准确地拟合运动噪声，提高信噪比，并在校正后的数据中几乎不会出现伪异常，从而更清晰地呈现地质构造。Thuc等[6]采用改进的自适应噪音EEMD算法结合显著性检验对局部放电信号进行降噪处理，提高了降噪效率。Vanus等[7]提出了一种基于人工蜂群算法对小波响应进行分类，以推荐的最合适小波对
$ {\mathrm{C}\mathrm{O}}_{2} $ 体积分数数据进行平滑处理，然后使用支持向量机预测$ {\mathrm{C}\mathrm{O}}_{2}\mathrm{体}\mathrm{积}\mathrm{分}\mathrm{数} $ 波形。结果显示，使用WT平滑处理后的数据预测结果精度更高。熊春宝等[8]提出了EEMD−小波阈值联合滤波方法来提高大跨径桥梁结构在环境激励下的振动响应信号的精度。该方法利用平均周期法和相关系数法去除分量中的噪音，在提高信号精度方面比单一方法更有效。由于温室系统不同位置采集到的数据可能存在差异，仅采集单一位置的环境温、湿度数据具有局限性。因此，可以采用多个传感器对相同数据进行采集，并使用数据融合技术对多个传感器数据进行融合，从而提高数据准确性和可信度。常用的空间融合方法包括加权平均法、目标跟踪、卡尔曼滤波、功能模型。Xia等[9]采用改进的无迹卡尔曼滤波器对传感器采集自温室的温度数据进行预处理。自适应加权数据融合算法能够自适应地调节数据来源的权重，而且可以处理非线性环境，并具有较小的响应延时。Wang等[10]提出了一种基于支持度和自适应加权的加权系数构造方法，研究结果表明，采用该方法的融合结果优于传统的平均估计融合和基于支持度的数据融合。
为解决传感器数据非线性和不稳定的问题，本研究采用EEMD联合小波包自适应阈值 (Wavelet packet adaptive threshold，WPT)的方法对融合后数据进行降噪处理，通过归一化自相关函数和互相关函数进行线性相关性分析，再结合均方根误差(RMSE)、信噪比(SNR)和相关性系数(R)等对降噪效果进行量化评估。最后，本研究采用卡尔曼滤波联合自适应加权平均算法，对降噪后的数据进行融合。
1. 材料处理与方法
1.1 温室数据采集
温室控制系统硬件组成如图1所示，主要由控制箱、工业空调、加湿设备、温湿度传感器等组成。温室数据采集模块利用传感器技术对温室环境数据进行采集。由于温室系统的多个传感器需要进行数据管理和执行器设备控制，通过CAN总线发送特定的控制命令，可以实现对温室传感器和节点的远程控制，从而提高温室数据采集和处理效率，因此使用CAN总线可以实现高效的数据收集和控制。CAN总线可以实现实时通信，但其抗干扰能力有限，缺乏可靠的时钟同步机制，可能导致数据丢失或错误等问题，从而影响通信数据的可靠性和稳定性。温室系统中各参数的精准控制依赖于准确可靠地采集数据，因此，对CAN总线传输后的数据进行有效的降噪处理，即降低干扰信号在原始信号中的比例，提高信噪比，将有助于提高数据的可信度和准确性。
本研究选取经CAN总线传输后的温、湿度数据作为研究对象。采集温、湿度数据的同时，本研究对空调、喷雾机、补光灯等设备进行了调节控制，以测得不同温湿度、温湿度持续变化和长时间高湿状态下的温、湿度数据。图1展示了使用传感器采集到的原始温、湿度数据。从图1中可以看出，在多种干扰的影响下，原始温、湿度数据出现连续波动和不稳定的情况。
本研究使用了一种分布式传感器节点的传感器网络，该网络由4个传感器节点1～4组成。所有的试验均在200 cm×200 cm×250 cm的温室中进行。将温室的长和宽边分别设为X和Y轴，高线设为Z轴。传感器节点的位置信息如图2所示。
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图 2 传感器节点在温室中的位置红色数字表示节点编号，括号中为节点位置Figure 2. Positions of sensor nodes in the greenhouseThe red number represents the node number, and the node position is indicated in parentheses1.2 温室数据预处理
当使用多个传感器采集温室系统数据时，通常存在绝对误差，例如每个传感器的测量偏差以及系统干扰。这些误差可能会导致数据不准确，甚至影响系统性能和决策结果。为解决该问题，本研究利用神经网络进行误差补偿。具体而言，首先，使用传感器在不同温度、湿度下测量数据，同时使用高精度温湿度传感器获取参考温、湿度值。其次，对采集到的数据进行归一化处理。再次，将测量的温、湿度值作为全连接神经网络的输入变量，将参考温、湿度值作为模型的输出变量进行训练。然后，使用K-fold交叉验证的准确率、精确率、召回率和F1-score作为方法性能评价指标。最后，将训练好的模型应用在温、湿度误差补偿中。模型和训练的超参数设置如表1所示。
表 1 模型和训练的超参数设置Table 1. Hyperparameter settings for models and training参数类型
Parameter type参数
Parameter参数值
Parameter value模型参数
Model parameter全连接神经网络的层数
The number of layers of a fully connected neural network3 输入维度 Input dimension 2 隐藏层维度
Hidden layer dimension10 输出维度 Output dimension 2 训练参数
Training parameter学习率 Learning rate 0.001 训练轮次 Training round 100 批量训练的批大小
Batch size for batch training32 交叉验证的 K-fold
Cross-validated K-fold5 优化器 Optimizer Adam 1.3 EEMD分解
EEMD是一种改进的EMD方法，其在每次经验模态分解的过程中叠加高斯白噪声，利用白噪声的统计特性，通过改变信号振幅的极值点特性来避免模态混叠的问题[11]。最终，EEMD对多次EMD分解得到的本征模态函数(Intrinsic mode function, IMF)进行平均处理，消除白噪声的影响，从而更加准确地分析信号的特性和特征。具体实现步骤如下：
1)设定总体平均次数M，确定分解的IMF数量J。
2)在原始信号
$ y(t) $ 上加上1个满足标准正态分布的白噪声序列$ n(t) $ ，得到含噪声的信号$ x(t) $ ：$$ x(t) = y(t) + n(t) 。 $$ (1) 3)对含噪声的信号
$ x(t) $ 进行EMD，得到分解出的IMF和残差项：$$ x(t) = \displaystyle\sum\limits_{{{j}} = 1}^J {{c_{i,j}}\left( t \right)} + {r_{i,j}}\left( t \right) \text{，} $$ (2) 式中，
${{{c}}_{i,j}}(t)$ 为第i次加入白噪声后分解得到的第j个IMF，${{{r}}_{i,j}}(t)$ 是残余函数，代表信号的平均趋势，J是IMF的数量。4)重复步骤2)和步骤3)M次，每次生成1个幅值不同的白噪声序列并加入到原始信号中进行分解，得到M组IMF：
${{{c}}_{1,j}}(t),$ ${{{c}}_{2,j}}(t),$ …,${{{c}}_{M,j}}(t)$ , j=1, 2, …, J。5)按照IMF的顺序，将每一组IMF按照序号求出其统计平均值，得到J个平均IMF。将M组IMF对应位置的平均值取平均，得到最终的IMF[12]，即：
$$ {c_j}\left( t \right) = \dfrac{{\text{1}}}{M}\displaystyle\sum\limits_{{{i}} = 1}^M {{c_{i,j}}\left( t \right)} , $$ (3) 式中，
$ {{{c}}_j}(t) $ 是EEMD分解的第j个IMF，i=1, 2, …, M, j=1, 2, …, J。1.4 WPT降噪
WPT降噪是一种基于小波包变换的信号降噪方法。该方法将小波系数分为噪声和信号两部分，从而实现信号的去噪。通过选择合适的阈值，可有效保留信号的瞬态和细节部分，并消除随机噪声的影响，提高信号的精确度和可靠性。
WPT降噪基本流程如下：1)使用小波包分解对信号进行处理，获得一组小波包系数。2)对于每个小波包系数，采用不同的阈值处理方法。固定阈值处理方法将每个小波包系数与预设的阈值比较，小于阈值的系数被置零，大于阈值的系数被保留；软阈值处理方法根据小波包系数的统计特性对小于阈值的系数进行缩小到零，对大于阈值的系数进行缩小到阈值以下；硬阈值处理方法类似于软阈值，但是小于阈值的系数会被直接置零；自适应阈值方法则根据小波包系数的统计特性动态地确定阈值。3)重构处理过的小波包系数，以获得降噪后的信号。
1.5 EEMD联合WPT降噪
EEMD算法能够更好地处理瞬态和非周期信号，而小波包分解则更适用于周期性信号的处理。联合使用这2种方法可以去除多种噪音，具有更好的去噪效果。具体步骤如图3所示。
EEMD可以生成多个IMF分量，每个IMF分量都有明显的局部特征，而小波包分解可以将IMF分量进一步分解成多个子带，提供更精细的频率信息。联合使用这2种方法可以更好地提取信号的局部和频率特征，保留信号的细节和特征信息。
2. 仿真分析
为了验证本研究算法对含噪温、湿度数据的降噪效果，采用MATLAB模拟包含噪声的温、湿度数据，并进行降噪试验。以温度数据为例(图4)，具体而言，首先生成一组范围为[20, 30]、样点数为6000的纯净温度数据，然后根据现场采集到的温度数据特征，在纯净数据上加上一组范围为[−1, 1]、样点数为6000的高斯白噪音，得到含噪温度数据(图4)。
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图 4 纯净温度数据(A)与含噪温度数据(B)Figure 4. Pure temperature data (A) and temperature data with noise (B)目前常用的降噪方法包括以下9种：最小均方算法(Least mean square, LMS)自适应滤波[13]、有限脉冲响应(Finite impulse response, FIR)低通滤波[14]、无限脉冲响应(Infinite impulse response, IIR)滤波[15]、变分模态分解(Variational mode decomposition, VMD)-WT降噪[16]、VMD降噪[17]、WPT降噪[18]、EMD-WPT降噪[19]、EEMD-WPT降噪[20]、CEEMDAN-WPT降噪[21]。本研究使用上述9种算法对含噪温、湿度数据进行仿真降噪试验，并比较它们的降噪效果。
以温度数据进行降噪的结果(图5)为例，经EMD-WPT、EEMD-WPT和CEEMDAN-WPT降噪算法处理，含噪温、湿度数据的噪声被有效去除，降噪效果明显。降噪后的含噪温、湿度数据得到明显的优化，输出信号与原始信号之间差别相对较小。
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图 5 不同算法对温度数据降噪处理的仿真结果Figure 5. Simulation results of different algorithms for noise reduction processing of temperature data本研究选取RMSE、SNR和R等指标作为评价温、湿度数据降噪效果的标准。其中，RMSE是衡量实测信号与降噪处理后的信号之间的偏差，SNR是信号与噪音的比例，SNR越高说明降噪效果越好。而R则是衡量实测信号与降噪处理的信号之间的相关程度。
降噪前含噪数据的信噪比为32.88 dB。经过EEMD-WPT降噪算法处理后的数据SNR为56.91 dB，SNR提升了24.03 dB。如表2所示，EEMD-WPT算法相比于WPT算法处理后的数据SNR提高了40.31%，RMSE降低了84.75%。同时，与EMD-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了23.40%。而与CEEMDAN-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了35.71%。经EEMD-WPT算法降噪后的数据比其他算法具有更高的SNR、更小的RMSE和更大的R，从而得到了最佳的降噪效果。
表 2 不同算法温度数据输出结果的RMSE、SNR和RTable 2. The RMSE, SNR and R of the temperature data output result of each algorithm算法 Algorithm RMSE SNR/dB R LMS 0.219 41.20 0.999 FIR 0.112 47.05 0.999 IIR 0.189 42.52 0.998 VMD-WT 0.136 45.33 0.999 VMD 0.155 44.23 0.999 WPT 0.236 40.56 0.997 EMD-WPT 0.047 54.61 1.000 EEMD-WPT 0.036 56.91 1.000 CEEMDAN-WPT 0.056 53.10 1.000 3. 试验验证
3.1 数据预处理
试验使用全连接神经网络建立了温、湿度误差补偿模型，如图6所示。从图6中可以看出预测值与参考值2个变量之间呈现出高度线性的关系，且该模型在测试数据集上的RMSE仅为0.0395。
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图 6 温度(A)和相对湿度(B)误差补偿模型Figure 6. Temperature (A) and relative humidity (B) error compensation models从图7可以看出，温、湿度误差分布直方图的峰值均位于误差为0左右，且温度的误差范围集中在[−0.04, 0.04]，湿度的误差范围集中在[−0.05, 0.05]，均在误差允许范围内。因此利用神经网络补偿多个传感器间存在的绝对误差具有可行性。
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图 7 温度(A)和相对湿度(B)误差分布直方图Figure 7. Temperature (A) and relative humidity (B) error distribution histogram3.2 EEMD分解
将原始温、湿度数据经过EEMD分解得到多个IMF分量和残余分量，而后使用WPT对IMF分量和残余分量进行降噪处理，能够得到更加精细和含噪信号更少的信号。原始信号经EEMD分解可以得到IMF分量，如图8、9所示。在选择IMF分量进行WPT降噪时，本算法将保留R较高的IMF分量，而对R较低的IMF分量进行降噪处理。最终，使用降噪后的IMF分量以及保留的IMF分量重构数据，从而得到降噪后的结果。
3.3 WPT降噪
WPT降噪方法的实现首先需要选择合适的小波基和分解尺度。通常在工程中，使用 db、sym、coif 等小波系作为小波基。为更好地选择小波基来拟合信号并提高小波变换的精度，需要分析不同小波基函数在WPT降噪中能够达到的最优降噪效果。在试验中，使用SNR作为评价指标，并对温度数据和湿度数据使用 db、sym、coif这3种小波系进行WPT降噪处理。经试验验证后，对于温度数据的WPT降噪选择使用 db3 作为小波基的分解形式，将分解尺度设为 5 层。对于湿度数据的WPT降噪，选择使用 db2 作为小波基的分解形式，将分解尺度设为 3 层。
小波包经分解后，需要对各个尺度上的小波包系数进行阈值量化处理，所以阈值函数的选择对降噪效果具有较大的影响。使用固定阈值法时，由于不同尺度的小波包系数适用的阈值不同，因此缺乏灵活性；软阈值法获得的重构信号具有更好的光滑性，但误差相对较大；硬阈值法获得的重构信号具有更好的逼近性，但存在周围振荡；自适应阈值法能够为各尺度上的小波包系数选择最佳的阈值，适应性更好。
试验分别采用固定阈值、软阈值、硬阈值和自适应阈值法对原始温度数据进行降噪处理。结果如图10所示。本研究对不同阈值的去噪方法进行了RMSE、SNR和R等指标的评估，如表3所示。试验结果显示，自适应阈值去噪处理比其他阈值方法具有更高的SNR，更小的RMSE和更强的相关性。因此，本研究选择自适应阈值作为小波包降噪的阈值函数，对温度数据进行降噪处理。
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图 10 温度数据不同阈值降噪效果对比Figure 10. Comparison of noise reduction effects of different thresholds for temperature data表 3 不同阈值去噪方法温度数据输出结果的RMSE、SNR和RTable 3. RMSE, SNR and R of temperature data output results of different threshold denoising methods去噪方法 Denoising method RMSE SNR/dB R 硬阈值去噪 Hard threshold denoising 0.224 40.69 0.996 软阈值去噪 Soft threshold denoising 0.224 40.70 0.995 固定阈值去噪 Fixed threshold denoising 0.224 40.70 0.996 自适应阈值去噪 Adaptive threshold denoising 0.169 43.13 0.998 试验对湿度原始数据进行了相同的降噪处理，结果如图11所示。评估了不同阈值去噪处理后的RMSE、SNR和R，如表4所示。试验结果显示自适应阈值降噪处理方法的SNR更高、RMSE更小、相关性更强，因此本研究选择将湿度数据的自适应阈值作为小波包的去噪阈值函数。
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图 11 相对湿度(RH)数据不同阈值降噪效果对比Figure 11. Comparison of noise reduction effect of different thresholds for realative humidity (RH) data表 4 不同阈值去噪方法相对湿度数据输出结果的RMSE、SNR和RTable 4. RMSE, SNR and R of relative humidity data output results of different threshold denoising methods去噪方法 Denoising method RMSE SNR/dB R 硬阈值去噪 Hard threshold denoising 0.335 46.45 0.951 软阈值去噪 Soft threshold denoising 0.336 46.45 0.950 固定阈值去噪 Fixed threshold denoising 0.162 52.76 0.989 自适应阈值去噪 Adaptive threshold denoising 0.120 55.40 0.994 通过观察图10、11可以发现，相比于硬阈值、软阈值和固定阈值，自适应阈值的降噪效果显著提高。虽然采用WPT降噪处理后的信号的降噪效果有所改善，但仍存在一些噪音毛刺，这可能是由于噪音信号的复杂性所致。
采用仿真试验所用的9种算法对实际采集的温、湿度数据进行降噪处理，试验结果如图12、13所示。通过观察图12、13可知，EEMD-WPT算法对噪声具有较好的抑制作用。该算法在去除噪声干扰的同时，保留了大量的原始信号波形特征。同时该算法数据图形变化较为平缓，可以较好地估计原始数据的特征。
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图 12 不同算法对温度数据降噪处理结果Figure 12. Results of noise reduction processing of temperature data by different algorithms![]()
图 13 不同算法对相对湿度(RH)数据降噪处理结果Figure 13. Results of noise reduction processing of relative humidity (RH) data by different algorithms4. 温室数据融合
对降噪后的数据采用卡尔曼滤波与自适应加权平均算法相结合的方法，将温室内多组传感器数据进行空间数据融合，从而使来自不同位置的传感器或设备数据融合在一起，以获得更为全面、准确的信息。
卡尔曼滤波结合自适应加权融合算法进行数据融合具体步骤如下：
1)对不同来源的数据，通过自适应加权平均算法进行加权融合。首先对不同来源的数据分配相同的初始权重。然后根据每个数据点的误差大小动态调整权重。最后根据新的权值重新计算加权平均值。
2)将得到的加权平均值作为卡尔曼滤波算法的观察值，进行卡尔曼滤波计算，得到优化后的融合结果。
3)根据融合结果的准确性、可靠性等指标，适时调整自适应加权平均算法的权重系数，以进一步优化融合效果。
温、湿度数据融合结果如图14、15所示，对降噪后的多源数据进行空间数据融合处理，能够有效减少数据中的噪声和不确定性，从而提高数据的质量和可靠性，进一步提升数据处理和分析的效果和准确率。
5. 结论
本研究以温室系统中的采集数据为研究对象，提出了EEMD联合WPT算法对数据进行降噪处理。在数据降噪后计算评价指标并进行对比，得出以下结论：
1)使用EEMD将CAN传输后的温、湿度数据分解，并对分解出的IMF分量进行小波包分解，然后应用自适应阈值降噪技术对小波包系数进行去噪处理，最终将数据进行重构。降噪后的温、湿度数据的SNR、RMSE和R均优于其他算法。通过EEMD-WPT算法，降噪后的数据SNR相较于降噪前提升了73.08%。该算法相对于WPT算法处理后的数据SNR提高了40.31%，RMSE降低了84.75%。同时，与EMD-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了23.40%。而与CEEMDAN-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了35.71%。因此，EEMD-WPT算法降噪后的数据拥有更高的SNR、更小的RMSE和更大的R，表现出较优的降噪效果。
2)对温室系统中不同位置的传感器所采集到的数据进行降噪处理后，本研究采用卡尔曼滤波和自适应加权平均算法相结合的方法进行数据融合。该方法充分考虑每个传感器可能受到的不同干扰和误差，以及检测数据的可用范围的限制。通过数据融合技术，可以纠正或筛选掉低质量的数据，从而提高数据质量的可靠性。同时，该技术还可以整合多个传感器的数据，进一步扩大监测范围，从而获取更全面、更准确、更详细的信息。
3)本研究创新地将时频分析方法引入温室传感器数据的研究中，在温、湿度持续变化，长时间高湿状态等恶劣环境下，能消除温、湿度数据中的绝大部分的噪声，从而显著提高了SNR和数据的准确性。这为温室内温、湿度数据的处理提供了新的方法。
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图 1 V301/YNJH/2019毒株接种C6/36细胞后引起的细胞病变
A：对照C6/36细胞；B~D：分别为V301/YNJH/2019感染C6/36细胞48、96和120 h
Figure 1. Cytopathic effect of C6/36 cells after inoculated with V301/YNJH/2019 strain
A: Control C6/36 cells; B−D: C6/36 cells inoculated with V301/YNJH/2019 for 48, 96 and 120 h respectively
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图 2 V301/YNJH/2019毒株的基因组琼脂糖凝胶电泳(A)与电镜观察(B)
图A中1~4分别为V301/YNJH/2019、BAV/SC043、BTV-4/YTS4与EHDV-10/V277毒株纯化后的基因组dsRNA
Figure 2. Agarose gel electrophoresis (A) and electron microscopic observation (B) of genomic dsRNA from V301/YNJH/2019 strain
1−4 in figure A indicate purified genomic dsRNA of V301/YNJH/2019, BAV/SC043, BTV-4/YTS4 and EHDV-10/V277 strains respectively
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图 3 V301/YNJH/2019毒株4个基因节段全长序列的RT-PCR扩增
Figure 3. RT-PCR amplification products for four full length segments of V301/YNJH/2019 strain
M：DNA marker DL5000， 1:Seg-2, 2:Seg-4, 3:Seg-7, 4:Seg-9
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图 4 基于邻接法构建V301/YNJH/2019毒株4个基因节段的系统发生树
系统发生树用MAGA X[21]构建，自举检验重复1 000次，树图中节点的数字表示进化分支的自举检验值；比例尺表示每个位点核苷酸的替代数；本研究分离的V301/YNJH/2019毒株以红点表示，其他东南亚十二节段RNA病毒毒株以“GenBank登录号_ 病毒名称缩写_ 毒株名”表示；MSV：芒市病毒，BAV：版纳病毒，KDV：卡皮罗病毒，LNV：辽宁病毒
Figure 4. Phylogenetic trees of four segments of V301/YNJH/2019 using Neighbor-joining method
The phylogenetic trees were constructed by MEGA X[21] with 1 000 bootstrap replicates, and the number at the point of each branch indicates a bootstrap value; Scale bars indicate nucleic acid substitutions per site; V301/YNJH/2019 strain is depicted with a red dot and other strains of genus Seadornavirus are indicated as “GenBank accession number _abbreviation of virus name _name of strain”; MSV: Mangshi virus, BAV: Banna virus, KDV: Kadipiro virus, LNV: Liaoning virus
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图 5 自然感染V301/YNJH/2019毒株哨兵牛血液中病毒核酸与中和抗体监测
黑色箭头表示该时间点采集的血液样品中分离出病毒
Figure 5. Monitoring of viral nucleic acid and neutralization antibodies in the blood samples collected from sentinel cattle naturally infected with V301/YNJH/2019 strain
The black arrow indicates the virus was isolated from the blood sample collected at this time
表 1 本研究中使用的引物与探针序列
Table 1 Primers and probe used in this study
病毒1)
Virus靶基因节段
Target gene segment引物或探针
Primer or probe引物序列(5′→3′)
Primer sequence引物位置
Location of
primer产物大小/bp
Product size引物用途
Use of primerMSV Seg-12 MSV-S12-F AGGCTCTTTGACAACTCTACGA 34~55 631 MSV鉴定
MSV identificationMSV-S12-R GTCTCCGTCTGATAGTGTACTCT 645~664 BAV Seg-12 BAV-S12-F TGTGAGGGTCCAAGTCACGAC 116~136 653 BAV鉴定
BAV identificationBAV-S12-R AGCATAAGAWGCATGGCGACCT 746~768 KDV Seg-12 KDV-S12-F ATATCGGCTGTTTCAGCTAGTG 127~148 602 KDV鉴定
KDV identificationKDV-S12-R GATCCAAAGTGGTAACCCAAATG 706~728 LNV Seg-12 LNV-S12-F GGAGGAAGAATCAATGCCGTAG 76~97 599 LNV鉴定
LNV identificationLNV-S12-F AAGTTGTGAGTGTTGCTTGGTT 653~674 MSV Seg-2 MSV-S2-F GTAAAGAATTATACGCTGATGACATAC 1~27 3 055 MSV Seg-2全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-2MSV-S2-R GTCGTTTTTCGAATCTTGCTAAGG 3 032~3 055 MSV Seg-4 MSV-S4-F GTAAAGAATTTTATAGATTTTTCATCATG 1~29 2 046 MSV Seg-4全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-4MSV-S4-R GTCGTTCCTTTCATGACGTTCAT 2033~2 046 MSV Seg-7 MSV-S7-F GTAAAGATTTTTCAAGGAATATTCACTGA 1~29 1 122 MSV Seg-7全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-7MSV-S7-R GTCAGTCATTCTCACGGGGTC 1 102~1 122 MSV Seg-9 MSV-S9-F GTAAAGATTTTTTGTAGGAAAACATGAT 1~28 1 076 MSV Seg-9全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-9MSV-S9-R GTCGGTCATTCTTGCTCAGTG 1 056~1 076 MSV Seg-12 MSV-S12/YG-F GCCAACTAAGCGTATTTACC 497~516 85 MSV qRT-PCR MSV-S12/YG-R ACCACTTCGTTTGTCAATTAATAG 558~581 MSV-S12/Probe CCAACAGCACCTCCTGACCATACC 531~554 1) MSV：芒市病毒，BAV：版纳病毒，KDV：卡皮罗病毒，LNV：辽宁病毒
1) MSV: Mangshi virus, BAV: Banna virus, KDV: Kadipiro virus, LNV: Liaoning virus
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表 2 V301/YNJH/2019毒株4个基因节段以及编码蛋白的序列特征
Table 2 Characteristics of four gene segments and their encoded proteins of V301/YNJH/2019 strain
项目
Item序列名称
Sequence
name序列长度
Sequence
length与其他东南亚十二节段RNA病毒的最高相似度1)/%
Highest sequence similarity with other SeadornavirusORF区
ORF
regionUTR区长度/bp
Length of UTRMSV BAV KDV LNV 5′ UTR 3′ UTR 基因节段
Gene segmentSeg-2 3740 bp 98.5 52.1 39.3 38.9 89~2953 88 99 Seg-4 2055 bp 98.3 42.7 45.1 52.7 27~1907 26 145 Seg-7 1122 bp 97.7 33.0 35.0 34.0 32~922 31 197 Seg-9 1076 bp 97.4 43.8 28.9 30.5 24~872 23 201 蛋白 Protein VP2 956 aa 98.4 45.8 24.8 26.3 VP4 628 aa 98.2 31.5 32.0 47.8 VP7 298 aa 98.9 10.1 23.5 23.1 VP9 283 aa 96.4 36.1 20.0 17.9 1) MSV：芒市病毒，BAV：版纳病毒，KDV：卡皮罗病毒，LNV：辽宁病毒
1) MSV: Mangshi virus, BAV: Banna virus, KDV: Kadipiro virus, LNV: Liaoning virus
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