Isolation and identification of Mangshi virus in sentinel cattle from border areas of Yunnan Province
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摘要:目的
掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。
方法在云南省景洪市设立哨兵牛3头，每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定，采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。
结果2019年，在监测期第13周，从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019)，电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子，琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA，RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示，分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2 055和1 122 bp，编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa) 和VP7(298 aa)，基因节段Seg-2和Seg-9长度为3 055和1 076 bp，编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa) 和VP9(283 aa)；分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度在97.4% (Seg-9)~98.5% (Seg-2)之间，氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示，监测期的第11周，牛血液中病毒核酸检测呈阳性，病毒核酸含量在第13周达到高峰，随后快速降低，在第18周转为阴性；感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14)，在第16~18周处于高峰(1∶226)，至监测结束的第24周降低为1∶57。
结论本文从牛体中分离到了MSV，表明牛是MSV的易感动物之一，病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。
Abstract:ObjectiveTo analyze the diversity, dissemination risk of animal arboviruses in border areas of Yunnan Province.
MethodThree sentinel cattles were placed in Jinghong City, Yunnan Province and blood samples were weekly collected for arboviruses monitoring and virus isolation. The isolated virus was identified through agar-gel electrophoresis, electron microscopy, RT-PCR amplification, cloning and sequencing. The infection characteristics of the virus in infected cattle were retrospectively analyzed by qRT-PCR and serum neutralizing test (SNT).
ResultIn 2019, a virus strain (V301/YNJH/2019) which caused cytopathic effect on C6/36 cells, was isolated from blood sample collected from one of the cattle at the 13th week of monitoring period. Electron microscope observation revealed that the virions were icosahedral symmetry with a diameter of about 70 nm. The result of agar-gel electrophoresis showed that the viral genome was composed of double stranded RNA. The isolated virus was identified as Mangshi virus (MSV) by RT-PCR identification. Sequence analysis exhibited the lengths of Seg-4 and Seg-7 from the isolated virus were 2 055 and 1 122 bp respectively, encoding viral out-most shell VP4 (628 aa) and VP7 (298 aa) proteins, while Seg-2 and Seg-9 were 3 055 and 1 076 bp respectively in length encoding viral inner-core VP2 (956 aa) and VP9 (283 aa) proteins. Phylogenetic analysis showed that the isolated virus had the closest relationship with MSV/DH13M041 isolated from Mangshi of Yunnan Province, with their nucleic acid sequence similarities ranging from 97.4% (Seg-9) to 98.5% (Seg-2) and amino acid sequence similarities ranging from 96.4% (VP9) to 98.4% (VP2). Retrospective investigation results of the virus infection indicated that virus nucleic acid was first detected in the blood of the infected cattle at the 11th week of monitoring period. The virus nucleic acid in the blood reached the peak at the 13th week and dropped rapidly, becoming not detectable within 5 weeks. The results of SNT showed that neutralization antibody against V301/YNJH/2019 was first detected at the 13th week (antibody titer 1∶14), peaked from the 16thto 18thweek (antibody titer 1∶226) and decreased to 1∶57 when monitoring terminated at the 24thweek.
ConclusionThe MSV isolation from cattle indicating cattle is one of the susceptible animals of MSV. In naturally infected cattle, the virus is characterized by “transient infection” with no clinical symptoms. Our study imparts a foundation for study of epidemiology, pathogenicity, and diagnostic reagents of MSV.
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Keywords:
- cattle /
- Mangshi virus /
- arboviruse /
- phylogenetic analysis /
- sentinel animal /
- infection characteristic /
- retrospective analysis
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番石榴Psidium guajava又名芭乐、鸡屎果，是桃金娘科Myrtaceae番石榴属Psidium的常绿灌木或小乔木，原产美洲热带地区，现已在广东、广西、福建、海南等地广泛种植[1-3]。番石榴果实营养丰富, 清香可口，富含多种人体所必需的营养成分及抗氧化物质，具有很高的食用和药用价值[4-5]，现已成为岭南地区果农增收的主要经济作物之一。
番石榴果实品质是决定其商品价值及能否推广的重要依据。进行果实品质的科学评价，对优化番石榴品种结构、筛选优良种质及创制新品种等具有重要意义。目前在番石榴果实品质评价研究中，大多数是基于对番石榴单一品种不同成熟期的品质评价或采后营养物质和生物活性功能研究[6-8]，而基于主成分分析方法探讨番石榴不同品种间的果实品质差异却鲜见报道。主成分分析法是剔除多个变量中相互重叠的信息，即通过降维的思想将多个信息转化为几个不相关的综合变量的多元统计方法[9]，适用于综合评价候选个体。这种方法既能把握待评类型的综合性状表现，又能简化评价程序，已被广泛应用于果蔬品质指标筛选和品质综合评价研究[10-13]。
转录组学是从RNA水平研究物种的基因表达，目前已成为挖掘植物功能基因、探索其有效成分的生物合成途径与调控机制、阐明基因功能的重要手段，不论是否存在参考基因组，均能获得转录本、差异基因表达、转录发生位点、次生代谢产物途径等信息，为理解物种的生物学及生物化学等信息提供技术手段[14]。鉴于此，本研究选用6个品种的番石榴果实为研究对象，对果实品质的11个指标进行测定，并结合主成分分析方法综合评价其品质优劣。同时进行RNA-seq分析，结合生物信息学方法对转录组数据的功能基因进行注释分类，并分析代谢通路，深入挖掘黄酮类化合物合成相关的功能基因，为番石榴品种选育、种植结构优化升级及分子育种提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料及试剂
6个品种‘红宝石’、‘西瓜红’、‘胭脂红’、‘珍珠’、‘水晶’和‘金斗香’的番石榴果实于2021年6月统一采收于广东省中山市坦洲镇，挑取大小一致、色泽和形状相近、九分成熟度且无病虫危害的番石榴果实。
试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司，常规试剂氢氧化钠、酚酞、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为国产分析纯，购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 果实品质测定
将6种番石榴果实，每种设3个生物学重复，每个重复10个果实，送往广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所，进行可溶性固形物、总酸、总糖、还原糖和蔗糖含量等果实品质测定。
1.2.2 总酚与类黄酮含量测定
分别按照植物总酚和植物类黄酮试剂盒说明书进行操作，计算公式如下：
$$ 总酚含量= 0.890 \times (D_{760 \;{\rm{nm}}}-0.001\;2) \div m_{干}， $$ (1) $$ 类黄酮含量= 0.797 \times (D_{760\; {\rm{nm}}} -0.000\;7) \div m_{干}， $$ (2) 式中，m干为样品干质量。
1.2.3 总抗氧化能力测定
根据总抗氧化能力(DPPH法和ABTS法)试剂盒说明书操作规程，总抗氧化能力计算公式如下：
$$ {\rm{DPPH}}清除能力=1.414 \times (D_{515 \;{\rm{nm}}} + 0.008\;1) \div m_{鲜}， $$ (3) $$ {\rm{ABTS}}清除能力=1.424 \times (D_{515 \;{\rm{nm}}} +0.001\;2) \div m_{鲜}， $$ (4) 式中，m鲜为样品鲜质量，以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的物质的量来表示样本的DPPH自由基清除能力和ABTS 自由基清除能力。
1.2.4 还原型抗坏血酸与单宁含量测定
分别根据还原型抗坏血酸(Ascorbic acid，AsA)和单宁含量测定试剂盒说明书进行操作，计算公式如下：
$$ {\rm{AsA}}含量=227.270 \times (D_{350\; {\rm{nm}}} +0.018) \div m_{鲜}， $$ (5) $$ 单宁含量=1.218 \times (D_{275 \;{\rm{nm}}} - 0.013\;4) \div m_{鲜}。 $$ (6) 1.2.5 RNA-seq分析
利用植物总RNA提取试剂盒抽提6个品种番石榴果实的总RNA，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序。将纯化后的总RNA检测其完整性后进行浓度测定，用合格的RNA样品构建文库。质检合格后进行Illumina测序，将预处理的数据进行过滤获得Clean reads，结合番石榴基因组，采用Trinity将Clean reads 进行拼接、组装，获得参考基因用于后续的定量差异分析。
通过 FPKM 标准化对番石榴样本的基因表达量进行分析，然后利用edgeR软件进行差异基因的表达分析。将获得的原始reads进行标准化校正，随后通过统计学分析模型计算假设检验概率(P)，最后进行多重假设检验校正，得到FDR，基于FDR≤0.01和|log2FC|≥2 (FC为上下调倍数)筛选差异基因，建立差异表达基因(Differentially expressed gene，DEG)集，随后将DEG通过GOseq和KOBAS软件分别进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。
1.2.6 荧光定量PCR(qPT-PCR)分析
根据天根生化科技有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure的说明书进行总RNA抽提。参照FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒(TaKaRa)说明书的操作步骤进行反转录，以GAPDH作为内参基因，FLS、CYP73A、CYP75A和CHS基因的特异性引物均利用 NCBI 网站设计，委托上海生工生物工程股份有限公司进行引物合成，序列见表1。利用TaKaRa公司的 TB Green® Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒和Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪进行扩增，通过2−ΔΔCt方法计算出不同番石榴品种的基因表达量。
表 1 差异表达基因的qRT-PCR引物序列Table 1. Primer sequences of differentially expressed genes for qRT-PCR基因名称 Gene name 上游引物序列(5′→3′) Forward primer sequence 下游引物序列(5′→3′) Reverse primer sequence FLS ATGGAGGTGGAGAGAGTTCAAGC CTTAGCATATTCCTTGTTGGCCT CYP73A CAATTGAGACAACACTATGGTCGAT TTCTTCAGGGTTTTTCCAGTGG CYP75A TATGGTGTTTGCTCATTACGGATC AGCAACATGCTCCTCAATCATG CHS GTCCCTAAGCTAGGCAAAGAAGC CGAAGATGGGTTTCTCTCCGA DFR CTGACTCTCTGGAAGGCCGA GGATTCGCAGAGATCGTCGG E2.1.1.104 ATGGAAGAGAAAATGAAAGCAGCA TTTCCATCATCAGGAATTGCTAGG GAPDH TTGCTGGACGCGTCGCAC GGAGCAGCGGAAGTCGACG 1.3 数据分析
试验数据使用SPSS 22.0软件进行单因素ANOVA和主成分分析。
2. 结果与分析
2.1 番石榴果实品质分析
将6个品种番石榴果实的营养成分测定结果进行方差分析及 LSD多重比较(表2)，由表中数据可见，不同品种间变异系数较大。可溶性固形物含量由高到低依次为：‘珍珠’ > ‘红宝石’ > ‘水晶’ > ‘西瓜红’ > ‘胭脂红’ > ‘金斗香’，平均值为8.74%；总糖含量的平均值为65.06 mg/g，变化趋势类似可溶性固形物；蔗糖含量的平均值为18.26 mg/g，含量最高的‘红宝石’可达30.91 mg/g，是含量最低的‘西瓜红’(13.38 mg/g)的2.31倍；总酸含量最高的为‘金斗香’和‘胭脂红’，与其他4组相比差异显著( P<0.05)；总酚含量最高的为‘金斗香’(11.51 mg/g)，最低的为‘水晶’(7.67 mg/g)，两者差异显著，而‘红宝石’和‘珍珠’间差异不显著；类黄酮含量的平均值为7.75 mg/g，高含量组为‘金斗香’和‘胭脂红’，低含量组为‘水晶’和‘西瓜红’，两组差异显著；抗坏血酸含量最高为‘红宝石’，可达2.42 mg/g，与其他品种相比差异显著，最低的为‘水晶’，仅有1.09 mg/g；单宁含量由高到低依次为：‘水晶’ > ‘西瓜红’ > ‘红宝石’ > ‘金斗香’ > ‘胭脂红’ > ‘珍珠’，平均值为5.31 mg/g；ABTS清除能力的平均值为31.72 μmol/g，‘金斗香’和‘胭脂红’的ABTS清除能力较高，‘西瓜红’和‘水晶’的ABTS清除能力较低；DPPH清除能力最高的为‘胭脂红’(1004.30 μmol/g)，最低的为‘西瓜红’(333.77 μmol/g)，前者是后者的3.01倍。
表 2 番石榴果实的营养成分比较1)Table 2. Comparison of the nutritional components of guava fruits品种 Cultivar w/% w/(mg·g−1) 可溶性 固形物 Soluble solid 总酸 Total acid 总糖 Total sugar 还原糖 Reducing sugar 蔗糖 Sucrose 总酚 Total phenol 红宝石 Hongbaoshi 9.40±1.05c 0.14±0.02ab 69.09±7.52c 38.31±1.18a 30.91±1.54d 8.61±0.26b 西瓜红 Xiguahong 8.60±0.92b 0.18±0.04b 60.70±7.08ab 45.15±4.36b 13.38±0.44a 7.83±0.80a 胭脂红 Yanzhihong 8.23±0.31b 0.27±0.02d 65.84±5.12b 40.50±2.21ab 21.06±1.69c 11.25±0.70c 珍珠 Zhenzhu 9.87±0.80c 0.11±0.02a 70.25±2.38c 52.93±1.51c 17.48±0.85b 8.48±1.03b 水晶 Shuijing 8.99±0.79bc 0.23±0.02c 65.55±2.59b 42.41±2.15b 22.74±1.05c 7.67±1.11a 金斗香 Jindouxiang 7.34±0.66a 0.29±0.02d 58.91±2.79a 39.40±1.83a 16.97±0.40b 11.51±0.54c 平均值 Mean 8.74±1.84 0.20±0.01 65.06±7.35 43.12±8.01 18.26±5.89 9.23±3.44 变异系数 Variation coefficient 0.25 0.05 0.12 0.18 0.28 0.37 品种 Cultivar w/(mg·g−1) w/(μmol·g−1) 类黄酮 Flavonoids 抗坏血酸 Ascorbic acid 单宁 Tannin ABTS DPPH 红宝石 Hongbaoshi 7.73±0.20c 2.42±0.17c 5.22±0.02b 33.70±1.14bc 545.40±32.48b 西瓜红 Xiguahong 6.54±0.18b 1.40±0.10ab 6.17±0.40c 23.98±0.71a 337.77±32.50a 胭脂红 Yanzhihong 10.05±1.90d 1.53±0.15b 4.70±0.35b 36.79±1.60cd 1004.30±95.67e 珍珠 Zhenzhu 6.68±0.36b 1.27±0.31ab 3.80±0.96a 32.17±1.27b 726.83±47.06c 水晶 Shuijing 5.74±0.49a 1.09±0.02a 7.22±0.28d 25.02±3.15a 639.83±34.40c 金斗香 Jindouxiang 9.76±1.78d 1.54±0.14b 4.72±0.32b 38.65±1.81d 875.90±40.25d 平均值 Mean 7.75±4.01 1.54±0.46 5.31±1.21 31.72±5.87 688.34±227.40 变异系数 Variation coefficient 0.46 0.30 0.23 0.19 0.33 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， LSD法) 1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P < 0.05, LSD method) 2.2 番石榴品质指标的主成分分析及综合评价
采用SPSS 20.0软件对数据进行主成分分析，结果见表3。前3个主成分的累计方差贡献率达84.533%，可代表11个番石榴指标的绝大部分信息，能够作为番石榴选优、评价的综合指标。为更好地评价各参数与成分因子之间的关系，旋转处理所提取的主成分因子，使单个变量在较少的几个因子上具有较高的载荷，其载荷值的大小反映各变量在主成分中的重要程度[15](表4)。主成分1的主要正相关因素有可溶性固形物、总酸、总糖、蔗糖、还原糖、单宁、类黄酮和总酚含量，ABTS和DPPH清除能力。这些指标中，蔗糖含量的正向载荷最大；其次载荷较大的是DPPH清除能力、总酚及还原糖含量。主成分1主要展现的是番石榴的营养和口感，该评价结果与通常果实品质的评价结果一致；类黄酮含量和ABTS清除能力作为主成分2的代表指标；单宁含量作为主成分3的代表指标。
表 3 主成分的特征值、方差贡献率和累计方差贡献率Table 3. Eigenvalue, variance contribution rate and cumulative variance contribution rate of principal components成分 Component 特征值 Eigenvalue 方差贡献率/% Variance contribution rate 累计方差贡献率/% Cumulative variance contribution rate 1 4.531 41.194 41.194 2 2.854 25.950 67.144 3 1.913 17.389 84.533 4 0.883 8.026 92.560 5 0.358 3.259 95.819 6 0.155 1.413 97.232 7 0.121 1.104 98.336 8 0.076 0.693 99.029 9 0.048 0.437 99.466 10 0.045 0.412 99.878 11 0.013 0.122 100.000 表 4 番石榴果实主要质地参数相关矩阵的规格化特征向量Table 4. Normalized eigenvectors of correlation matrix of main textural parameters in guava fruits品质指标 Quality index 主成分 Principal component 1 2 3 可溶性固形物含量 Soluble solid content 0.736 −0.290 −0.509 总酸含量 Total acid content 0.520 0.654 0.464 总糖含量 Total sugar content 0.417 −0.477 −0.598 蔗糖含量 Sucrose content 0.913 −0.055 0.347 还原糖含量 Reducing sugar content 0.820 0.409 −0.195 类黄酮含量 Flavonoids content 0.206 0.932 0.136 抗坏血酸含量 Ascorbic acid content −0.685 0.382 0.004 总酚含量 Total phenol content 0.853 −0.152 0.167 ABTS清除能力 ABTS removing capacity 0.066 0.833 −0.427 DPPH清除能力 DPPH removing capacity 0.873 0.019 −0.077 单宁含量 Tannin content 0.184 −0.463 0.830 上述3个主成分能综合反映6个番石榴品种的果实品质指标。将主要品质指标原始数据标准化后，计算3个主成分的得分，以所选主成分对应的特征值占3个特征值总和的比例为权重，计算出不同番石榴品种的综合评价得分值(Y)，各得分值与相应特征值的方差贡献百分率的乘积累加得出不同番石榴品种的综合评价指数(S = 0.41194 Y1 + 0.25950 Y2 + 0.17389 Y3)，以此来评价不同番石榴品种的果实品质。由表5可知，6个番石榴品种中，综合品质排名依次为‘金斗香’、‘胭脂红’、‘红宝石’、‘珍珠’、‘西瓜红’和‘水晶’。
表 5 不同番石榴品种的主成分得分与综合评价指数Table 5. Scores of principal components and synthetic analysis indexes for different guava cultivars品种 Cultivar 主成分得分 Score of principal component 综合评价指数 Synthetic analysis index Y1 Y2 Y3 红宝石 Hongbaoshi 1.424 −1.133 0.943 0.450 西瓜红 Xiguahong 0.110 −0.829 −1.939 −0.500 胭脂红 Yanzhihong 0.369 1.230 0.078 0.484 珍珠 Zhenzhu −1.079 −0.671 0.852 −0.472 水晶 Shuijing −1.397 0.140 0.135 −0.513 金斗香 Jindouxiang 0.572 1.262 −0.068 0.551 2.3 黄酮类物质生物合成相关基因挖掘
将6个品种番石榴转录组数据进行功能注释后筛选出DEG。基于GO和KEGG 数据库，对DEG可能参与的生物过程和信号通路进行富集分析，结果见表6和表7。根据 KEGG分类，DEG主要注释到了苯丙烷的生物合成途径、淀粉和蔗糖的代谢途径以及植物激素信号转导；DEG的GO分析结果显示，3450个DEG，被分配到生物学过程的有321个，占总数的9.30%；被分配到细胞学组分的有74个，占总数的2.14%；被分配到分子功能的有3055个，占总数的88.55%(表7)。
表 6 番石榴果实差异表达基因(DEG)的KEGG 信号通路富集分析Table 6. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs) in guava fruit类别 Term DEG个数 DEG number 基因总数 Total gene number P 苯丙烷的生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis 42 111 0.000 角质、亚硫酸和蜡的生物合成 Cutin, suberine and wax biosynthesis 11 18 0.004 淀粉和蔗糖的代谢 Starch and sucrose metabolism 46 158 0.011 花青素生物合成 Anthocyanin biosynthesis 7 12 0.025 乙醛酸酯和二羧酸酯代谢 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 27 87 0.026 ABC转运蛋白 ABC transporters 13 37 0.054 类黄酮生物合成 Flavonoid biosynthesis 10 26 0.057 半乳糖代谢 Galactose metabolism 20 66 0.059 不饱和脂肪酸的生物合成 Biosynthesis of unsaturated fatty acids 10 27 0.068 脂肪酸降解 Fatty acid degradation 14 43 0.071 氰基氨基酸代谢 Cyanoamino acid metabolism 14 43 0.071 二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣酚的生物合成 Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis 6 13 0.075 植物激素信号转导 Plant hormone signal transduction 48 197 0.096 色氨酸代谢 Tryptophan metabolism 9 26 0.105 柠檬烯和蒎烯的降解 Limonene and pinene degradation 5 11 0.105 油菜素内酯生物合成 Brassinosteroid biosynthesis 4 8 0.118 α−亚麻酸代谢 α-Linolenic acid metabolism 11 35 0.118 苯丙氨酸代谢 Phenylalanine metabolism 14 48 0.124 脂肪酸生物合成 Fatty acid biosynthesis 12 40 0.131 戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化 Pentose and glucuronate interconversions 18 66 0.132 将差异基因进行聚类，根据DEG表达量热图(图1a)可知，‘红宝石’和‘西瓜红’的DEG聚为一类，‘胭脂红’和‘金斗香’的DEG聚为一类。深入分析黄酮类化合物的生物合成途径，发现基因CHS、CYP73A、FLS、CYP98A3、DFR、E2.1.1.104、E1.14.11.19和CYP75A在‘胭脂红’和‘金斗香’中显著上调表达(图1b)。通过qRT-PCR验证表明FLS基因在‘胭脂红’中表达量最高，‘西瓜红’中表达量最低，前者表达量是后者的10倍以上，CYP73A、CYP75A、E2.1.1.104和CHS基因均在‘金斗香’中表达量最高，‘珍珠’中表达量最低，其中CYP73A和CYP75A基因在‘金斗香’的中的表达量是‘珍珠’的30倍以上，而DFR基因在‘胭脂红’中表达量较高，‘金斗香’中表达量较低(图2)。这一结果不仅证实了转录组数据的可靠性，同时更好地解释了表2 中‘胭脂红’和‘金斗香’2组的类黄酮含量显著高于其他各组的原因。
![图 1 6个品种番石榴果实差异基因(DEG)的表达情况]()
图 1 6个品种番石榴果实差异基因(DEG)的表达情况a：差异基因表达量热图；b：类黄酮合成信号通路中的DEG； G1：红宝石，G2：西瓜红，G3：胭脂红，G4：珍珠，G5：水晶，G6：金斗香Figure 1. The expressions of differential genes (DEGs) in fruits of six guava cultivarsa：Heat map of differential gene expression; b: The DEGs in flavonoid synthesis signaling pathway; G1: Hongbaoshi, G2: Xiguahong, G3: Yanzhihong, G4: Zhenzhu, G5: Shuijing, G6: Jindouxiang![图 2 差异表达基因的qRT-PCR分析]()
图 2 差异表达基因的qRT-PCR分析G1：红宝石；G2：西瓜红；G3：胭脂红；G4：珍珠；G5：水晶；G6：金斗香Figure 2. The qRT-PCR analysis of differentially expressed genesG1: Hongbaoshi; G2: Xiguahong; G3: Yanzhihong; G4: Zhenzhu; G5: Shuijing; G6: Jindouxiang表 7 番石榴果实差异表达基因(DEG)的GO 生物功能分析Table 7. GO biofunctional analysis of differentially expressed genes (DEG) in guava fruit类型 Type GO 名称 GO name DEG个数 DEG number 校正P Corrected P 生物学过程 Biological process 多细胞生物过程 Multi-cellular organism process 34 0.0008 授粉 Pollination 30 0.0016 花粉−雌蕊相互作用 Pollen-pistil interaction 30 0.0016 花粉识别 Recognition of pollen 30 0.0016 防御反应 Defense response 100 0.0019 细胞识别 Cell recognition 30 0.0019 生物刺激反应 Response to biotic stimulus 67 0.0019 细胞学组分 Cellular component 细胞外基质 Extracellular matrix 39 0.0029 蛋白质的细胞外基质 Proteinaceous extracellular matrix 35 0.0184 分子功能 Molecular function 血红素的结合 Heme binding 92 0.0003 四吡咯的结合 Tetrapyrrole binding 93 0.0008 催化活性 Catalytic activity 2073 0.0008 氧化还原酶活性、作用于配对供体、合并或还原分子氧 Oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen 87 0.0037 水解酶活性、水解邻糖基化合物 Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds 130 0.0037 作用于糖基键的水解酶活性 Hydrolase activity, acting on glycosyl bonds 139 0.0047 碳水化合物结合 Carbohydrate binding 53 0.0278 核酸结合转录因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity 194 0.0335 转录因子活性、序列特异性DNA结合 Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding 194 0.0335 3. 讨论与结论
番石榴作为岭南地区的特色水果之一，其全身皆宝。番石榴叶被加入到民间药物中用来降血糖和降血压[16]，番石榴果实具有治疗腹泻、痔疮，抑菌，抗氧化及抗肿瘤等多种活性[17-18]。番石榴品种众多且栽培历史悠久，在不同栽培环境下生长状态不同，外观色泽、风味也存在差异[19]，品质良莠不齐。对番石榴果实进行综合评价，是有效利用和选择优异种质资源并推广栽培的基础和前提。本文选取了华南地区最常见的6个番石榴品种‘金斗香’、‘胭脂红’、‘水晶’、‘西瓜红’、‘珍珠’和‘红宝石’为研究对象，对其果实品质的11个指标进行全面分析，结合主成分分析方法，筛选得到‘金斗香’和‘胭脂红’的综合品质较佳，‘水晶’和‘西瓜红’较差，‘珍珠’和‘红宝石’居中。‘金斗香’番石榴是广东省农业科学院果树研究所在2018年从本地番石榴实生苗中选育出的新品种，该品种肉质细嫩软滑、香气浓郁且风味独特[20]。‘胭脂红’番石榴是广东著名的传统品种，近年来由于品种退化、管理放松、病虫害严重等原因，栽培面积和产量日渐减少。相比传统番石榴品种，大果番石榴(‘水晶’、‘西瓜红’、‘珍珠’和‘红宝石’)产量较高、早结丰产，但综合品质不及‘金斗香’和‘胭脂红’，尤其是类黄酮含量及自由基清除能力显著低于这2个品种。可见，‘金斗香’和‘胭脂红’可作为研究番石榴抗氧化活性遗传特性的重要资源。
黄酮类化合物是番石榴中重要的生物活性物质，其不仅是植株重要的抗逆物质，也是其果实发挥食用和药用价值的重要原因[21-22]。近年来的研究表明，不同果树品种黄酮类化合物的含量差异较大，如文良娟等[23]研究了不同品种芒果黄酮的抗氧化活性，发现不同品种间的抗氧化活性显著不同；曾少敏等[24]在不同品种梨的多酚类物质的抗氧化活性研究中也发现不同梨品种间的抗氧化能力存在差异；以及在柑橘、荔枝研究中发现的不同品种间黄酮类化合物的差异性[25-26]。本文研究发现6个品种番石榴间类黄酮含量差异较大，变异系数为0.46，变化范围在5.74~10.05 mg/g，‘金斗香’和‘胭脂红’的类黄酮含量较高，分别为9.76和10.05 mg/g，是‘水晶’(5.74 mg/g)的1.5倍以上。因果实中总酚含量和DPPH 清除能力与类黄酮含量存在显著正相关性[27]，故本文中测得的总酚含量和DPPH清除能力的变异系数也较大。
黄酮类化合物的生物合成途径目前已基本清楚，各步骤催化反应所需的酶及其基因均有大量研究[28-29]。为解析不同番石榴品种间黄酮类化合物的差异机理及挖掘其合成的关键基因，本文进一步通过转录组测序技术分析6个品种番石榴的差异表达基因，发现黄酮类化合物生物合成途径中的关键基因CHS、FLS、CYP73A、CYP98A3、DFR、E2.1.1.104、E1.14.11.19和CYP75A在‘金斗香’和‘胭脂红’2个品种中明显上调，其中查尔酮合成酶(CHS)基因参与此生物合成途径中的多步反应，可见这8个基因在番石榴黄酮类化合物的生物合成过程中起关键作用，但具体的调控机制有待深入研究。本研究不仅为番石榴的品种选育和品种改良等提供理论基础，还为后续开展黄酮类物质的合成和积累等相关研究奠定基础。
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图 1 V301/YNJH/2019毒株接种C6/36细胞后引起的细胞病变
A：对照C6/36细胞；B~D：分别为V301/YNJH/2019感染C6/36细胞48、96和120 h
Figure 1. Cytopathic effect of C6/36 cells after inoculated with V301/YNJH/2019 strain
A: Control C6/36 cells; B−D: C6/36 cells inoculated with V301/YNJH/2019 for 48, 96 and 120 h respectively
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图 2 V301/YNJH/2019毒株的基因组琼脂糖凝胶电泳(A)与电镜观察(B)
图A中1~4分别为V301/YNJH/2019、BAV/SC043、BTV-4/YTS4与EHDV-10/V277毒株纯化后的基因组dsRNA
Figure 2. Agarose gel electrophoresis (A) and electron microscopic observation (B) of genomic dsRNA from V301/YNJH/2019 strain
1−4 in figure A indicate purified genomic dsRNA of V301/YNJH/2019, BAV/SC043, BTV-4/YTS4 and EHDV-10/V277 strains respectively
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图 3 V301/YNJH/2019毒株4个基因节段全长序列的RT-PCR扩增
Figure 3. RT-PCR amplification products for four full length segments of V301/YNJH/2019 strain
M：DNA marker DL5000， 1:Seg-2, 2:Seg-4, 3:Seg-7, 4:Seg-9
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图 4 基于邻接法构建V301/YNJH/2019毒株4个基因节段的系统发生树
系统发生树用MAGA X[21]构建，自举检验重复1 000次，树图中节点的数字表示进化分支的自举检验值；比例尺表示每个位点核苷酸的替代数；本研究分离的V301/YNJH/2019毒株以红点表示，其他东南亚十二节段RNA病毒毒株以“GenBank登录号_ 病毒名称缩写_ 毒株名”表示；MSV：芒市病毒，BAV：版纳病毒，KDV：卡皮罗病毒，LNV：辽宁病毒
Figure 4. Phylogenetic trees of four segments of V301/YNJH/2019 using Neighbor-joining method
The phylogenetic trees were constructed by MEGA X[21] with 1 000 bootstrap replicates, and the number at the point of each branch indicates a bootstrap value; Scale bars indicate nucleic acid substitutions per site; V301/YNJH/2019 strain is depicted with a red dot and other strains of genus Seadornavirus are indicated as “GenBank accession number _abbreviation of virus name _name of strain”; MSV: Mangshi virus, BAV: Banna virus, KDV: Kadipiro virus, LNV: Liaoning virus
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图 5 自然感染V301/YNJH/2019毒株哨兵牛血液中病毒核酸与中和抗体监测
黑色箭头表示该时间点采集的血液样品中分离出病毒
Figure 5. Monitoring of viral nucleic acid and neutralization antibodies in the blood samples collected from sentinel cattle naturally infected with V301/YNJH/2019 strain
The black arrow indicates the virus was isolated from the blood sample collected at this time
表 1 本研究中使用的引物与探针序列
Table 1 Primers and probe used in this study
病毒1)
Virus靶基因节段
Target gene segment引物或探针
Primer or probe引物序列(5′→3′)
Primer sequence引物位置
Location of
primer产物大小/bp
Product size引物用途
Use of primerMSV Seg-12 MSV-S12-F AGGCTCTTTGACAACTCTACGA 34~55 631 MSV鉴定
MSV identificationMSV-S12-R GTCTCCGTCTGATAGTGTACTCT 645~664 BAV Seg-12 BAV-S12-F TGTGAGGGTCCAAGTCACGAC 116~136 653 BAV鉴定
BAV identificationBAV-S12-R AGCATAAGAWGCATGGCGACCT 746~768 KDV Seg-12 KDV-S12-F ATATCGGCTGTTTCAGCTAGTG 127~148 602 KDV鉴定
KDV identificationKDV-S12-R GATCCAAAGTGGTAACCCAAATG 706~728 LNV Seg-12 LNV-S12-F GGAGGAAGAATCAATGCCGTAG 76~97 599 LNV鉴定
LNV identificationLNV-S12-F AAGTTGTGAGTGTTGCTTGGTT 653~674 MSV Seg-2 MSV-S2-F GTAAAGAATTATACGCTGATGACATAC 1~27 3 055 MSV Seg-2全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-2MSV-S2-R GTCGTTTTTCGAATCTTGCTAAGG 3 032~3 055 MSV Seg-4 MSV-S4-F GTAAAGAATTTTATAGATTTTTCATCATG 1~29 2 046 MSV Seg-4全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-4MSV-S4-R GTCGTTCCTTTCATGACGTTCAT 2033~2 046 MSV Seg-7 MSV-S7-F GTAAAGATTTTTCAAGGAATATTCACTGA 1~29 1 122 MSV Seg-7全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-7MSV-S7-R GTCAGTCATTCTCACGGGGTC 1 102~1 122 MSV Seg-9 MSV-S9-F GTAAAGATTTTTTGTAGGAAAACATGAT 1~28 1 076 MSV Seg-9全长序列扩增
Full length amplification for MSV Seg-9MSV-S9-R GTCGGTCATTCTTGCTCAGTG 1 056~1 076 MSV Seg-12 MSV-S12/YG-F GCCAACTAAGCGTATTTACC 497~516 85 MSV qRT-PCR MSV-S12/YG-R ACCACTTCGTTTGTCAATTAATAG 558~581 MSV-S12/Probe CCAACAGCACCTCCTGACCATACC 531~554 1) MSV：芒市病毒，BAV：版纳病毒，KDV：卡皮罗病毒，LNV：辽宁病毒
1) MSV: Mangshi virus, BAV: Banna virus, KDV: Kadipiro virus, LNV: Liaoning virus
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表 2 V301/YNJH/2019毒株4个基因节段以及编码蛋白的序列特征
Table 2 Characteristics of four gene segments and their encoded proteins of V301/YNJH/2019 strain
项目
Item序列名称
Sequence
name序列长度
Sequence
length与其他东南亚十二节段RNA病毒的最高相似度1)/%
Highest sequence similarity with other SeadornavirusORF区
ORF
regionUTR区长度/bp
Length of UTRMSV BAV KDV LNV 5′ UTR 3′ UTR 基因节段
Gene segmentSeg-2 3740 bp 98.5 52.1 39.3 38.9 89~2953 88 99 Seg-4 2055 bp 98.3 42.7 45.1 52.7 27~1907 26 145 Seg-7 1122 bp 97.7 33.0 35.0 34.0 32~922 31 197 Seg-9 1076 bp 97.4 43.8 28.9 30.5 24~872 23 201 蛋白 Protein VP2 956 aa 98.4 45.8 24.8 26.3 VP4 628 aa 98.2 31.5 32.0 47.8 VP7 298 aa 98.9 10.1 23.5 23.1 VP9 283 aa 96.4 36.1 20.0 17.9 1) MSV：芒市病毒，BAV：版纳病毒，KDV：卡皮罗病毒，LNV：辽宁病毒
1) MSV: Mangshi virus, BAV: Banna virus, KDV: Kadipiro virus, LNV: Liaoning virus
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