脂肪酸是细胞生物主要的组成成分之一，是细胞膜磷脂、三酰甘油酯(脂肪)和糖脂的重要组分^[1]。按碳链是否有支链可分为直链脂肪酸和支链脂肪酸^[2]；按照主碳链的碳原子数目，可以分为偶数脂肪酸和奇数脂肪酸，其中细胞膜的主要成分多为偶数脂肪酸^[3]；按照含不饱和碳碳双键的数目，可以分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，生物体中单不饱和脂肪酸居多^[4]，按照双键构型，不饱和脂肪酸又可分为顺式脂肪酸和反式脂肪酸，生物体的不饱和脂肪酸主要为顺式不饱和脂肪酸^[5]。

细菌通过调节脂肪酸的种类和组成，调节细胞膜的流动性，适应不同的生长环境^[6-7]。此外脂肪酸还可以通过β–氧化途径为细菌提供大量的能量，是一种重要的储能物质^[8-9]。

细菌能够从头合成脂肪酸，除了为膜磷脂和糖脂的合成提供底物外，还可为硫辛酸、生物素、鼠李糖脂、聚羟基脂肪酸(PHA/PHB)、类脂A、N–脂酰高丝氨酸内酯类(AHLs)和可扩散信号分子(Diffusible signal factor, DSF)等的合成提供前体^{[3, 10-14]}。

目前对细菌脂肪酸合成系统已经进行了深入的研究，对一些关键酶的催化机理、生物学功能及其多样性也有众多的综合性论述，但鲜见3–酮脂酰ACP还原酶(3-oxoacyl-ACP-reductase，OAR)的系统性总结。本文对细菌3–酮脂酰ACP还原酶的研究进行系统性总结，以便为今后的科学研究提供参考。

1.   脂肪酸合成系统

细胞生物有2种类型的脂肪酸合成系统。哺乳动物、真菌以及分枝杆菌采用I型脂肪酸合成系统(Fatty acid synthesis I, FAS I)，特点为脂肪酸的合成由1个多结构域的复杂脂肪酸合酶催化，其中每个结构域催化1个特定的生化反应，而脂酰基团由酰基载体蛋白(Acyl carrier protein，ACP)结构域携带，在各结构域间传递脂酰基团^[15-16]。FAS I的最终产物一般为棕榈酸。另外，该系统不合成不饱和脂肪酸^[17]。

细菌和植物采用II型脂肪酸合成系统(Fatty acid synthesis II, FAS II)合成脂肪酸(图1A)^[18]。FAS II的每一步反应均由独立的酶催化完成，脂酰基团由酰基载体蛋白ACP携带，可产生各种类型的脂酰ACP，为不同的最终产物提供前体^[19-20]。同时，FAS II也可产生顺−3烯脂酰ACP，合成不饱和脂肪酸^{[5, 21-22]}。因此，虽然I型和II型脂肪酸合成系统的生化反应相似，但参与催化的酶在结构和组成上有很大差异，这使得细菌脂肪酸合成途径成为开发新型抗菌药物的热门靶点^[23-24]。

图  1  细菌脂肪酸合成途径(A)与OAR催化反应机制(B)

Figure  1.  The pathway of fatty acid biosynthesis in bacterial (A) and the reduction of 3-oxoacyl-ACP catalyzed by 3-oxoacyl-ACP reductase (B)

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FAS II可分为起始反应和循环反应2部分(图1A)^[18]。以大肠埃希菌Escherichia coli脂肪酸合成途径为例，起始反应的底物为乙酰–CoA，由乙酰辅酶A羧化酶(AccABCD)将其转化为丙二酸单酰–CoA，接着在丙二酸单酰辅酶A:ACP酰基转移酶(FabD)的催化下生产丙二酸单酰ACP，完成脂肪酸合成的起始反应^[25]。循环反应的第1次循环由3–酮脂酰ACP合成酶III(FabH)将丙二酸单酰ACP和乙酰–CoA缩合，生成3–酮基丁酰ACP开始^[26]；接下来由3–酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化，将3–酮基丁酰ACP还原为3–羟基丁酰ACP；然后由3–羟脂酰ACP脱水酶(FabA或FabZ)催化3–羟基丁酰ACP生成反–2–丁烯酰ACP^[27-28]；最后由烯脂酰ACP还原酶(FabI)催化反–2–丁烯酰ACP，生成丁酰ACP，至此完成第1次循环^[29-30]。接下来的循环反应，由3–酮脂酰ACP合成酶I或II(FabB或FabF)催化脂酰ACP与丙二酸单酰ACP缩合开始，之后经FabG还原，FabA或FabZ脱水和FabI再次还原完成^[31-32]。每一轮循环增加2个碳原子，直到合成棕榈酰ACP(C₁₆–ACP)或硬脂酰ACP(C₁₈–ACP)^[33]。在大肠埃希菌中不饱和脂肪酸也可由FAS II酶催化合成。当碳链延伸到反–2–癸烯酰ACP时，双功能酶FabA行使其癸烯酰ACP异构酶的功能将反–2–癸烯酰ACP异构为顺–3–癸烯酰ACP，顺3–癸烯酰ACP不能被FabI催化，而是被FabB缩合进入下个循环反应，最终保留双键形成棕榈油酰ACP(C_16:1)或异油酰ACP(C_18:1)^[34-35]。

2.   细菌脂肪酸合成中的3–酮脂酰ACP还原酶

细菌脂肪酸合成反应中，3–酮脂酰ACP还原酶(OAR)催化3–酮基脂酰ACP还原为3–羟基脂酰ACP。OAR是氧化还原酶，以NADPH为辅因子，极少数的OAR也可以利用NADH^[23，36-37]。与参与细菌脂肪酸合成的其他酶不同，细菌OAR较为保守，目前已经报道的参与细菌脂肪酸合成的OAR均为大肠埃希菌FabG的同源蛋白，且编码基因均处在脂肪酸合成簇中。

大肠埃希菌FabG是首个报道的OAR，也是研究最为透彻的OAR。fabG基因位于脂肪酸合成基因簇plsX-fabH-fabD-fabG-acpP-fabF中。Zhang等^[38]证明，fabG与上游的fabD基因共转录，在fabD与fabG的间隔序列中插入转录终止元件可使fabG无法转录。此外，转录终止元件的插入对大肠埃希菌是致死的，也证明了fabG是必需基因^[39]。Lai等^[40]构建了大肠埃希菌fabG的温度敏感突变菌株CL104。CL104在30 ℃时能够正常生长，在42 ℃时，由于FabG蛋白稳定性降低，菌体不能生长，这再次证明FabG是大肠埃希菌唯一参与脂肪酸合成的OAR。

类似的脂肪酸合成基因簇在细菌中广泛存在。王海洪课题组先后对乳酸乳球菌Lactococcus lactis、茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum、苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti、野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv. campestris和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa脂肪酸合成基因簇中的fabG基因开展研究，结果证明这些fabG均为必需基因，且参与脂肪酸合成(图2)^[41-45]。

图  2  不同细菌中的脂肪酸合成基因簇与OAR编码基因

Figure  2.  The fatty acid biosynthesis gene cluster and gene enconding 3-oxoacyl-ACP reductase in different bacteria

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除脂肪酸合成基因簇中的fabG被注释为OAR编码基因外，细菌基因组还有多个基因被注释为OAR编码基因。例如乳酸乳球菌基因组中有2个OAR编码基因：fabG1位于脂肪酸合成基因簇，fabG2所处的基因簇也与脂肪酸合成相关。但是研究表明只有fabG1编码的蛋白参与脂肪酸合成。茄科雷尔氏菌基因组包含1条染色体和1个巨质粒，生物信息学分析至少有4个基因被注释为OAR编码基因。fabG1(RSc1052)、fabG3(RSc0435)、fabG4(RSc0536)位于染色体上，而fabG2(RSp0359)位于巨质粒上。Feng等^[42]研究表明，fabG2虽然能被敲除，突变菌株的脂肪酸组成显著改变，3–羟基脂肪酸合成量减少，而不饱和脂肪酸合成量增加，但是发现只有fabG1是必需基因，不能被敲除。在野油菜黄单胞菌基因组有4个被标注为OAR家族的编码基因：fabG1(XCC1018)、fabG2(XCC0416)、fabG3(XCC4003)和fabG4(XCC0384)。研究显示FabG1是一个典型的OAR，与大肠埃希菌FabG的序列一致性达到69.1%。FabG1在体内和体外均能够将3–酮脂酰ACP还原为3–羟脂酰ACP，fabG1是必需基因，只有在过表达其他OAR时才能将其敲除^[44]。同样，铜绿假单胞菌中有12个基因被标注为OAR家族基因，然而只有位于脂肪酸合成基因簇的PA2967(fabG)参与脂肪酸合成^[45]；Cukier等^[46]也通过构建条件突变菌株证明fabG是铜绿假单胞菌的必需基因。

2.1   细菌3–酮脂酰ACP还原酶结构特点

细菌脂肪酸合成中的OAR属于短链醇脱氢酶/还原酶(Short chain dehydrogenase/reductase, SDR)超家族^[47]。SDR超家族是最大的蛋白质超家族之一，至少有160 000的蛋白属于此家族^[48]。根据催化底物和关键活性残基的不同，SDR超家族可分为7个大类，464个家族。SDR超家族蛋白一级结构的序列一致性仅为15%~30%，但在序列和结构上有一些共同的特征。SDR超家族蛋白具有典型的Rossmann折叠结构，中心为6~7个β折叠，两侧各有3~4个α螺旋^[49]；催化活性残基为Tyr、Lys、Ser和Asn；辅因子为NADH或NADPH，辅因子结合位点位于N端^[50]。与中链醇脱氢酶/还原酶(Medium chain dehydrogenase/reductase, MDR)超家族蛋白催化需要金属离子作为辅因子不同，SDR超家族蛋白催化不需要金属离子^[51]。

OAR单体含有1个典型的Rossmann折叠结构，核心为7~8个β链构成的扭曲、平行的β折叠， 8个α螺旋依附于两侧。OAR的辅酶结合位点Gly-Xaa3-Gly-Xaa-Gly位于N端，中部含有Ser-Xaa12-Tyr-Xaa3-Lys催化基序。以上信息表明，OAR的序列和结构符合SDR超家族蛋白典型特征，属SDR家族中的129C亚家族^[48]。

科学家们已经对大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella enterica serovar Typhimurium、炭疽杆菌Bacillus anthracis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii、结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis等超过20个细菌的OAR进行了结构分析，所有的OAR都有着类似的三级结构^{[50, 52-56]}。OAR一般为D2对称性的四聚体，即2个单体首先形成二聚体，2个二聚体再形成对称的四聚体。OAR结合NADPH后，形成3–酮基脂酰ACP-OAR-NADPH的复合体，OAR的构象发生改变，以容纳底物和辅因子，并传递电子^[57]。

大肠埃希菌FabG是研究最为透彻的OAR，OAR的众多关键活性位点均是在FabG中报道的。Price等^[54]首先解析了大肠埃希菌FabG的蛋白结构，FabG是典型的四聚体结构，4个单体形成2个二聚体界面，进而形成四聚体。FabG单体含有1个典型的Rossmann折叠结构，核心为7个β链构成的扭曲、平行的β折叠，通过8个α螺旋依附于亚基的两侧。2个单体的α4，α5螺旋和α4′，α5′螺旋形成疏水口袋，容纳3–酮基脂酰ACP的脂酰链。2个单体的β7折叠和α6/α7螺旋形成亲水的口袋，在结合NADPH及后续的构象改变中起着非常重要的作用(图3)。

图  3  大肠埃希菌FabG的单体(A)和四聚体(B)晶体结构

Figure  3.  The crystal structures of Escherichia coli FabG monomer (A) and tetramer (B)

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Price等^[54]进一步解析了FabG的活性位点，Tyr229在空间上位于α6/α7螺旋相对的亲水口袋中，参与了氢键网络的形成，Arg129和Arg172在脂酰ACP和FabG的相互作用上起着重要作用。Price等^[54]证明 Ser138、Tyr151和Lys155的突变体蛋白与NADPH的结合能力减弱、对乙酰乙酰辅酶A的催化活性急剧降低。保守基序Ser 138，Tyr151和Lys155是必需氨基酸，均集中在α5/β5催化口袋附近，在NADPH结合和电子传递中起着重要的作用。NADPH的结合会增强FabG对脂酰ACP的亲和力，降低最大结合浓度，引起蛋白构象的变化，导致Ser138、Tyr151和Lys155的重排。NADPH中核糖结构上的羟基、Ser-Tyr-Lys基序和四分子水形成质子传递通路。质子由NADPH提供，Tyr151羟基介导，最终完成3−酮脂酰ACP还原(图4A)^[58]。

图  4  大肠埃希菌FabG假定催化机制(A)与突变体蛋白重建脂肪酸合成反应(B)

Figure  4.  The postulated catalytic mechanism of Escherichia coli FabG (A) and reconstruction of fatty acid by mutant protein (B)

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Ser138、Tyr151和Lys155突变体蛋白虽然对乙酰乙酰辅酶A的催化活性急剧降低，但FabG的天然底物是3−酮脂酰ACP而非脂酰辅酶A^[59]。对茄科雷尔氏菌FabG1的研究表明突变Ser-Tyr-Lys任意残基并不会丧失OAR的功能，在42 ℃依然能够恢复大肠埃希菌CL104生长^[42]。Hu等^[60]对大肠埃希菌FabG催化活性位点展开研究，发现Ser138Ala、Tyr151Phe和Lys155Ala突变体蛋白在体外和体内都保有足够的OAR催化活性(图4B)。突变体蛋白不仅能互补大肠埃希菌CL104菌株，而且能互补鼠伤寒沙门氏菌温度敏感突变菌株CL65。在CL65中纯化表达突变体蛋白，突变体蛋白在体外能够在起始反应和延伸反应中完成脂肪酸合成。进一步以3−酮脂酰ACP为底物测定突变体蛋白活性，发现相对于野生型FabG，Ser138Ala、Tyr151Phe和Lys155Ala分别有82%、59%和50%的活力。这表明Ser138、Tyr151和Lys155并不是EcFabG的催化活性中心，更可能是作为维持催化中心结构的氨基酸存在。以上研究结果表明，OAR可能存在不同于典型SDR超家族蛋白的电子传递机制和保守催化活性中心。

2.2   细菌3−酮脂酰ACP还原酶的抑制剂研究

相比于细菌脂肪酸合成系统的其他成员，OAR在不同细菌间较为保守，是非常优良的广谱抗生素开发靶位点^[61]。有关筛选细菌OAR抑制剂的工作也取得积极进展^[62-63]。

植物多酚类物质，尤其是黄酮类化合物对OAR具有抑制效果，如绿茶中的焙儿茶素(Epigallocatechin gallate，EGCG)及儿茶素是优良的抑菌剂。EGCG及儿茶素以FAS II系统作为抑制靶点，有效地抑制了脂肪酸延伸过程中FabG和FabI所催化的还原反应^[64]。单宁酸及枫叶提取物革兰阳性菌的抗菌活性也来自对OAR的抑制^[65]。有研究表明，类黄酮和大环内酰亚胺对FabG有抑制作用，且为非特异性抑制，所以不能应用于临床^[66]；鲎素能够抑制4种革兰阴性细菌的OAR，但存在细胞毒性和溶血作用^[67]。反式肉桂酸及其衍生物也有很显著的OAR抑制能力，这些化合物不仅能阻遏NADPH结合，还能够与多个重要的氨基酸活性残基结合，阻止底物的靠近^[68]。

Cukier等^[46]筛选到16个铜绿假单胞菌FabG蛋白抑制物，其IC₅₀仅为nmol级，是极具潜力的铜绿假单胞菌抗菌药物，对这些抑制物的结合位点进行分析，发现抑制剂均结合在FabG亚基相邻界面的变构位点；此外他们还发现抑制剂在FabG的结合主要依赖于疏水相互作用，但也有抑制剂依赖于特定的氢键与FabG结合。抑制剂一旦与FabG结合，蛋白–抑制剂复合物的构象发生改变，无法与NADPH结合^[24]。然而这些化合物对其他OAR的抑制效果并不好。

Vella等^[56]筛选出一系列IC₅₀在μmol级的抑制物，并且证明了这些抑制物与铜绿假单胞菌筛选到的抑制物一样，结合在亚基界面的变构位点上，尤其是α4/α5螺旋；通过对变构位点的研究证明Asn86羰基、侧链基团Tyr151和Lys155参与结合NAPDH的氢键形成，而多肽链骨架上的Gly182和Ile184也可能参与；抑制剂的结合位点主要由疏水残基组成，通过一个额外的极性相互作用作用于亚基表面，抑制物主要阻遏NADPH和OAR的相互作用。

Varakala等^[67]通过高通量从细菌中筛选出43个可以抑制多个FabG的合成物，其中14个为吲哚类，29个为酰胺类；对药物动力学的研究表明，其中7个可以在μmol级抑制多个FabG的活性；5–溴–2–(噻吩–2–甲酰胺)苯甲酸和6–溴–2–(二甲氨基)甲基)–5–羟基–1–苯基–1H–吲哚–3–甲酸乙酯能够抑制6个FabG，且IC₅₀为7~70 μmol/L，2–(2,6–二氯苄基)硫代)吡唑[1,5–a][1,3,5]三嗪–4(3H)–酮能够抑制4个FabG。

3.   其他类型的3–酮脂酰ACP还原酶

许多细菌基因组中，除了fab基因簇的fabG基因外，还有多个基因被标注为OAR编码基因。这些基因大体可分为2类：一类编码的蛋白在体外和体内均具有OAR活性，但它们不参与脂肪酸合成，而是专一地参与一些次生代谢物的合成，执行特殊的生物学功能；另一类编码的蛋白没有OAR活性，具体的生物学功能有待深入研究。

3.1   分枝杆菌的MabA参与分枝酸的合成

分枝酸是分枝杆菌属细菌细胞壁的特殊成分，是一类含60~90个碳原子的长链3–羟基脂肪酸。研究证明分枝杆菌的膜磷脂脂肪酸由I型脂肪酸合成系统(FAS I)生成，而分枝酸的合成则由FAS II催化。分枝杆菌首先通过FAS I以乙酰–CoA为底物合成16~26碳的脂肪酸链，接下来利用FAS II将碳链进一步延伸到48~60个碳，进而形成分枝酸。分枝杆菌的FAS II 相关基因包括fabD-acpM-kasA-kasB-accA基因簇和mabA-inhA基因簇。

Banerjee等^[69]克隆了结核分枝杆菌的mabA(Rv1483，MtFabG1)，并纯化得到MabA蛋白，MabA蛋白能够消耗NADPH，并还原乙酰乙酰辅酶A。这表明MabA蛋白具有OAR活性。Marrakchi等^[70]证实MabA参与结核分枝杆菌的分枝酸合成，对短链的3–酮脂酰脂肪酸的亲和力很低，而对长链(C8~C16)的3–酮脂酰脂肪酸的亲和力较高。Parish等^[71]证实inhA与mabA共转录；且只有在外源携带有编码mabA-inhA基因簇的质粒存在时才能将染色体上的mabA敲除，这表明mabA是必需基因。此外Parish等^[71]也发现大肠埃希菌fabG并不能替换结核分枝杆菌的mabA，而耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis的mabA可以替换结核分枝杆菌mabA，并且替换菌株的分枝酸和细胞通透性没有改变。这表明分枝杆菌FAS II系统有独特的OAR，参与分枝酸的合成。

3.2   苜蓿中华根瘤菌NodG参与结瘤因子合成

除染色体外，苜蓿中华根瘤菌还有1个巨质粒SymA，与共生结瘤相关的nod基因簇位于该巨质粒上。nod基因簇中的nodG被标注为OAR，其编码的蛋白与大肠埃希菌FabG的序列一致性达到53%。nodG不是苜蓿中华根瘤生长的必需基因，敲除后并不影响菌体脂肪酸生成。但是体外和体内试验显示NodG具有OAR活性(图5A)。同时证明，在过表达nodG的情况下可以敲除fabG，且突变菌株的脂肪酸组成与野生菌株一致。这表明nodG在苜蓿中华根瘤菌中行使与fabG相似的功能。然而遗传学的研究发现nodG缺失会导致苜蓿结瘤效率降低，并证明其专一性地参与结瘤因子的合成(图5B)^[43]。

图  5  苜蓿中华根瘤菌NodG具有OAR活性并参与苜蓿结瘤

A：苜蓿根瘤菌FabG与NodG具有OAR活性；1：C8:0-ACP，2：EcFabG，3：苜蓿根瘤菌FabG，4：苜蓿根瘤菌NodG，5：不添加FabG蛋白，6：C8:0-ACP。B：NodG相关菌株结瘤效率；S. meliloti 1021/pSRK-Gm：野生型菌株携带空质粒，LF1：苜蓿根瘤菌nodG突变菌株，LF2：苜蓿根瘤菌nodG/fabG双突变菌株携带苜蓿根瘤菌nodG质粒，LF3：苜蓿根瘤菌nodG/fabG双突变菌株携带苜蓿根瘤菌fabG质粒， “*”“**”分别表示0.05和0.01水平差异显著^[43]，每个试验有8个重复

Figure  5.  The Sinorhizobium meliloti NodG maintains OAR activity and involves in alfalfa nodulation

A: Sinorhizobium meliloti FabG and NodG maintain the OAR activity; 1: C8:0-ACP, 2: Product of EcFabG, 3: Product of SmFabG, 4: Product of SmNodG, 5: No FabG addition, 6: C8:0-ACP. B: Nodulation efficiency of Sinorhizobium meliloti mutant strains; S. meliloti 1021/pSRK-Gm: Wild type strain carrying plasmid pSRK-Gm, LF1: Sinorhizobium meliloti nodG mutant strain, LF2: Sinorhizobium meliloti nodG/fabG double mutant strain carrying SmnodG ecoding plasmid, LF3: Sinorhizobium meliloti nodG/fabG double mutant strain carrying SmfabG ecoding plasmid, “*” and “**”indicate significant differences at levels of 0.05 and 0.01, respectively, Every experiment has eight replicates

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3.3   野油菜黄单胞菌FabG2是一种新型OAR

可扩散信号分子DSF介导黄单胞菌的群体感应调控，目前在黄单胞菌中已经鉴定到4种DSF类信号，它们的化学本质是主碳链含12个碳原子的顺–2–不饱和烯酸^[72-73]。Yu等^[13]研究表明野油菜黄单胞菌的3–酮脂酰ACP合成酶III能以支链CoA为底物合成支链脂肪酸，同时决定了野油菜黄单胞菌产生多种类型的DSF类信号。

在野油菜黄单胞菌中，与fabG1不同，fabG2是1个独立基因，其编码的蛋白与大肠埃希菌FabG的序列一致性仅为32.4%。Hu等^[44]的研究发现FabG2对短链3–酮脂酰ACP的催化活性低，单独fabG2不能恢复大肠埃希菌fabG温度敏感突变菌CL104的生长，也不参与野油菜黄单胞菌脂肪酸的从头合成。然而在与哈氏弧菌Vibrio harveyi脂酰ACP合成酶基因(aasS)共转录，并外源添加辛酸后，fabG2可以使CL104在非许可温度生长，表明FabG2对中长链的3–酮脂酰ACP具有较强的催化活性(图6A)。另外研究发现，在添加有辛酸时，过表达fabG2能够获得fabG1敲除突变菌株(图6B)。更为重要的是敲除XccfabG2导致野油菜黄单胞菌的DSF类信号合成量显著降低(图6C)。这表明FabG2是1个专一性参与DSF类信号合成调控的新型OAR。

图  6  XccfabG2互补OAR突变菌株及参与Xcc DSF类信号分子合成

A：XccfabG2互补大肠埃希菌fabG温度敏感突变菌株CL104；EcfabG：质粒携带有大肠埃希菌fabG基因，Vector：空质粒载体，fabG2：质粒携带有XccfabG2基因，AasS：质粒携带有哈氏弧菌aasS基因，AasS+ fabG：质粒携带有哈氏弧菌aasS和XccfabG2基因。B：XccfabG2互补XccfabG1突变菌株；WT：Xcc野生型，∆fabG1+pfabG2：XccfabG1突变菌株携带有XccfabG2表达质粒。C: XccfabG2突变菌株的DSF类信号分子产量；DSF：11−甲基−顺−2−月桂酰烯酸，BDSF：顺−2−月桂酰烯酸，空柱：Xcc野生型，黑柱：XccfabG2突变菌株，灰柱：XccfabG2突变菌株携带有XccfabG2表达质粒，条状柱：XccfabG2突变菌株携带有XccfabG1表达质粒

Figure  6.  XccfabG2 complements OAR mutant strain and invovles in DSF signal synthesis in Xcc

A: XccfabG2 complement E. coli fabG temperature sensitive strain CL104; EcfabG: CL104 carrying plasmid expressing EcfabG, Vector: CL104 carrying empty plasmid, fabG2: CL104 carrying plasmid expressing XccfabG2, AasS: CL104 carrying plasmid expressing Vibrio harzii aasS, AasS+ fabG2: CL104 carrying plasmid expressing Vibrio harzii aasS and XccfabG2. B: XccfabG2 complement XccfabG1 mutant strain; WT: Wild type X. campestris pv. campestris strain, ∆fabG1+pfabG2: XccfabG1 mutant strain carrying XccfabG2 expressing plasmid. C: The DSFs production of XccfabG2 mutant strains; DSF: cis-11-methyl-2-dodecenoic acid, BDSF: cis-2-dodecenoic acid, White column: Wild-type X. campestris pv. campestris strain, Black column: XccfabG2 mutant strain, Gray column: XccfabG2 mutant strain carrying a plasmid encoding XccfabG2, Stippled column: XccfabG2 mutant strain carrying a plasmid encoding XccfabG1

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3.4   野油菜黄单胞菌FabG3参与菌黄素合成

在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中，已经鉴定了3个OAR的生物学功能。FabG1参与脂肪酸合成，FabG2参与DSF类信号分子合成调控，而fabG3位于菌黄素合成基因簇中。Yu等^[74]的研究结果表明，FabG3在体外和体内均能行使OAR的功能(图7A)，但fabG3的缺失并不会导致Xcc的生长或脂肪酸组成发生改变；然而突变菌株菌黄素合成受阻，同时证明这一性状不能由其他OAR编码基因互补恢复，只能由fabG3互补恢复(图7B)。这些研究结果表明，FabG3是一种专一性参与菌黄素合成的OAR。

图  7  XccfabG3互补CL104并参与菌黄素合成

A：XccfabG3互补大肠埃希菌fabG温度敏感突变菌株CL104；EcfabG:质粒携带有大肠埃希菌fabG基因，fabG1：质粒携带有XccfabG1基因，Vector：空质粒载体，fabG3：质粒携带有XccfabG3基因，CL104：无外源质粒。B： XccfabG3突变菌株的菌黄素产量；Xcc WT：Xcc野生型，Xcc YH1：XccfabG3突变菌株，Xcc YH2：XccfabG3突变菌株携带有XccfabG3表达质粒，Xcc YH6：XccfabG3突变菌株携带有XccfabG1表达质粒，Xcc YH10：XccfabG3突变菌株携带有XccfabG2表达质粒，Xcc YH7：XccfabG3突变菌株携带有EcfabG表达质粒，Xcc YH1+3-HBA：XccfabG3突变菌株添加3−羟基丁酸

Figure  7.  XccfabG3 complements CL104 and invovles in xanthomonadin synthesis in Xcc

A: XccfabG3 complement Escherichia coli fabG temperature sensitive strain CL104; EcfabG: CL104 carrying plasmid expressing EcfabG, fabG1: CL104 carrying plasmid expressing XccfabG1, Vector: CL104 carrying empty plasmid, fabG3: CL104 carrying plasmid expressing XccfabG3, CL104: CL104 without plasmid. B: Xanthomonadin production in XccfabG3 mutant; Xcc WT: Wild-type X. campestris pv. campestris strain, Xcc YH1: XccfabG3 mutant, Xcc YH2: XccfabG3 mutant carrying XccfabG3 ecoding plasmid, Xcc YH6: XccfabG3 mutant carrying XccfabG1 ecoding plasmid, Xcc YH10: XccfabG3 mutant carrying XccfabG2 ecoding plasmid, Xcc YH7: XccfabG3 mutant carrying EcfabG ecoding plasmid, Xcc YH1+3-HBA: XccfabG3 mutant supplemented with 3-hydroxybutyric acid

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3.5   其他OAR编码基因功能

铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，脂肪酸合成系统在铜绿假单胞菌的多种致病过程中起重要作用。在PAO1的基因组中，有42个SDR超家族基因，12个标注为OAR家族基因。Guo等^[45]对铜绿假单胞菌基因组中的候选基因进行了系统研究，结果发现除fabG外，只有PA4389和PA4786具有OAR的活性；PA4389和PA4786在体内和体外均能行使OAR功能。然而，PA4389和PA4786并不参与铜绿假单胞菌的脂肪酸合成，这2个基因突变后，铜绿假单胞菌的脂肪酸组成并没有显著改变，但信号分子2–庚基–3–羟基–4–喹诺酮类(PQS)合成量减少50%以上。这表明PA4389和PA4786虽然不直接参与铜绿假单胞菌的脂肪酸合成，却影响其信号分子的合成。

Guo等^[45]研究表明其他的OAR家族候选基因虽然不具备OAR活性，但在其他代谢途径中发挥作用。PA3128与苜蓿中华根瘤菌参与TCA循环的关键基因SMc02486的氨基酸序列有60%的一致性。PA3128被敲除后，突变菌株的PQS合成量提高了20%，弹性蛋白酶水解酶LasB的活性降低20%。在基础培养基上，以L–丙氨酸或D–海藻糖为碳源时，PA3128的突变菌株生长缓慢，最终得到的生物量仅为野生型的20%~40%，而以D–天冬氨酸为唯一碳源时，PA3128的突变菌株完全不能生长。以上结果表明PA3128可能也参与铜绿假单胞菌的TCA循环。而PA0182和PA1470在铜绿假单胞菌利用L–丝氨酸、L–天冬氨酸、L–谷氨酸和L–组氨酸时发挥重要作用，任何单突变菌株均不能利用以上氨基酸。PA3387(RhlG)曾认为参与铜绿假单胞菌重要致病因子鼠李糖脂的合成，然而Zhu等^[33]的研究表明无论在体外还是体内RhlG都不能催化3–酮基癸酰ACP还原为3–羟基癸酰ACP，并不参与鼠李糖脂的合成。

在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor中，脂肪酸可以用于次级代谢产物十二烷基二苷酸的生物合成。天蓝色链霉菌基因组的3个OAR候选基因编码的蛋白均能够催化β–酮脂酰–N–乙酰半胱氨酸。其中SOC1815是脂肪酸合成的关键酶；而SOC1345能够区分β–酮脂酰–N–乙酰半胱氨酸–ACP和β–酮脂酰–ACP；SOC1846的生物学功能尚不清楚^[75]。

4.   总结与展望

细菌脂肪酸合成机制高度保守，这不仅表现在不同细菌脂肪酸合成相关酶的蛋白序列高度相似，而且相关编码基因在染色体上的排列顺序也非常相似。但是研究发现不同细菌的脂肪酸合成机制存在差异，主要体现在：1)同种细菌中催化同一生化反应的酶有多种；2)不同细菌催化同一生化反应的酶的结构不同；3)不同细菌合成同样产物的方式和机制不同。

生物信息学分析显示细菌基因组中有许多注释为OAR的编码基因，这些基因编码的蛋白有些具有OAR活性，且能够遗传互补大肠埃希菌fabG温敏突变菌株，但是研究证明真正参与细菌脂肪酸合成的OAR由位于脂肪酸合成基因簇(fab)中的fabG编码。fabG是细菌的必需基因，突变该基因致死细菌。虽然有些OAR的编码基因，例如中华苜蓿根瘤菌nodG和野油菜黄单胞菌fabG2，在某些特殊条件下能够替代fabG，合成脂肪酸，维持菌体生长，但是NodG和FabG2不是FabG的同工酶，它们各自有自己的生物功能，催化不同物质的合成。因此，与参与细菌脂肪酸合成的其他酶不同，OAR只有FabG类同工酶，因此，FabG是一个理想的抗菌药物筛选靶标，可用于广谱抗菌药物的筛选。

除了参与细菌脂肪酸合成的FabG外，细菌中还有一些具有OAR活性的蛋白，目前研究证明这些OAR往往专一地参与脂肪酸相关物质的合成，如分枝酸、结瘤因子、菌黄素等。这表明这些酶对3–酮基脂酰基团具有还原能力。因此，对这些OAR功能的鉴定将有助于研究一些与脂肪酸相关物质合成，至少可以推测这些物质合成中可能有3–酮基脂酰基团的还原反应。

FabG作为一个潜在的优良广谱抗菌药物的开发靶点，虽然引起了科学家们的高度关注，并据此筛选或设计了一些药物，但目前鲜见临床应用或工业化生产的报道。Ser-Tyr-Lys基序是SDR超家族蛋白的结构特征之一，也是该类蛋白的催化活性中心，然而大肠埃希菌FabG催化机制研究证明，Ser-Tyr-Lys基序在FabG催化3–酮基脂酰ACP还原中并不起关键作用，这表明FabG可能采用有别于一般SDR家族蛋白的催化机制。这也要求对FabG更深入地研究，进一步解析FabG的结构特点和催化特性，为以FabG为靶点开展药物设计奠定基础。