Fermentation optimization and antioxidant activities of dark beer prepared with the addition of purple potato enzymolysis juice by freeze-thaw process
-
摘要:目的
冻融分离产生的汁液是固液分离法制备紫色马铃薯全粉的副产物，富含碳水化合物和花青素。为提高该汁液的利用价值，将酶解后的汁液作为辅料添加至麦芽汁中发酵制备浓色啤酒。
方法采用单因素结合正交试验优化浓色啤酒的发酵条件，分析其主要抗氧化成分含量及抗氧化能力。
结果添加紫色马铃薯酶解汁液制备浓色啤酒的最佳发酵条件为：马铃薯酶解汁液添加体积分数为25%，初始pH 6.5，接种2%(φ)的M21啤酒酵母，15 ℃条件下发酵10 d。所得啤酒呈琥珀色、晶莹剔透，酒香协调、入口柔顺，感官评分为86.9，酒精度[φ(乙醇)]5.84%，总酸体积分数15.6 mL/L，还原糖质量浓度18.69 mg/mL，色度37.71 EBC，总酚、绿原酸和花青素质量浓度分别为360.2、685.7和208.4 mg/L，每100 mL 啤酒中含啤酒10倍稀释液的总还原能力与0.150 mg/mL 维生素C相当，DPPH自由基清除率为49.9%，与质量浓度为0.043 mg/mL 维生素C相当，ABTS自由基清除率83.9%。
结论紫色马铃薯冻融分离酶解汁液可部分替代麦芽汁发酵高抗氧化活性的浓色啤酒。
Abstract:ObjectivePotato juice of freeze-thaw process is the liquid by-product derived from the production of purple potato flour by solid-liquid separation method, and it is rich in carbohydrates and anthocyanins. In order to increase the utilization value of the liquid by-product, the enzymolysis juice was added as supplementary ingredient into wort to prepare dark beer by fermentation.
MethodSingle factor test combining orthogonal experiment was performed to optimize the fermentation conditions. The contents and activities of antioxidant components in the dark beer were evaluated.
ResultThe optimum fermentation conditions for dark beer preparation with addition of purple potato enzymolysis liquid were as follows: Content of potato enzymolysis liquid was 25% (φ), initial pH was 6.5, inoculation of 2% (φ) M21 beer starter, and fermentation for 10 d under the temperature of 15 ℃. The prepared beer was amber color and crystal clear, had harmonious flavor and mellow taste. Its sensory score was 86.9, alcohol content was 5.84%, total acid content was 15.6 mL/L beer, total reducing sugar content was 18.69 mg/mL, chroma was 37.71 EBC, total phenol content was 360.2 mg/L, chlorogenic acid content was 685.7 mg/L, and anthocyanin content was 208.4 mg/L. The total reduction capacity of 10-fold diluent beer was equivalent to that of 0.150 mg/mL vitamin C, the scavenging rate of DPPH radical was 49.9%, which was equivalent to that of 0.043 mg/mL vitamin C, and the scavenging rate of ABTS+ was 83.9%.
ConclusionAddition of purple potato juice of freeze-thaw process can partially replace wort for brewing of dark beer with high antioxidant activities.
-
Keywords:
- purple potato /
- freeze-thaw seperation /
- dark beer /
- fermentation condition /
- antioxidant activity
-
水稻Oryza sativa是世界上重要的粮食作物，是全球主要的食物来源之一，其产量的高低直接影响粮食安全。每年由细菌、真菌和病毒侵染造成的水稻减产高达30%~50%。其中稻瘟病对水稻生产造成的危害最为严重[1]，培育具有稻瘟病抗性的水稻品种是防治该病害最经济有效的方法[2]。然而，由于稻瘟病生理小种的迅速更替，许多抗病品种的抗病性在逐渐丧失[3]。目前已经被鉴定并克隆的稻瘟病抗性(R)基因有35个[4]，其中Pi2基因来自对稻瘟病具有高度抗性的哥伦比亚籼稻品种5173[5]，是一个广谱抗稻瘟病显性基因。该基因对13个国家的36个生理小种表现出高水平抗性[6]。针对我国华南籼稻区的稻瘟病优势生理小种，Pi2基因表现出良好的抗性[7- 8]，利用Pi2基因选育具有广谱抗性的水稻品种具有重要的应用价值。
随着生物技术的发展，利用分子标记进行分子标记辅助选择(Maker-associated selection, MAS)可以大大提高育种的效率和进程[9]。目前针对Pi2基因开发并应用于育种的分子标记大多数属于第2代分子标记，包括简单重复序列标记(Simple sequence repeats，SSR)、插入/缺失标记(Insert/Deletion，InDel)等，这类标记需要电泳技术进行检测，其操作过程较为繁琐，主要应用于基因定位和遗传图谱的绘制[10]，无法实现大批量的准确检测，严重妨碍了该基因在水稻育种中的应用。
第3代分子标记——单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)标记[11-13]的出现为快速检测相关基因开辟了一条新的途径。SNP是指分子水平上由单个核苷酸的改变即单个碱基的替换、插入或缺失，从而引起的DNA序列的多态性，被认为是水稻基因组中最丰富的标记类型[14]。SNP在生物基因组中数量多，分布广泛，遗传稳定性高，与性状表达密切相关，富有代表性。另外，SNP标记检测技术易于实现自动化高通量基因分型，可以有效缩短检测时间[15]。
近年来，竞争性等位基因聚合酶链式反应(Kompetitive allele specific PCR，KASP)技术已成为高效安全地检测SNP的新方法。KASP技术是一种基于SNP标记的高通量基因分型技术，通过识别相应的荧光共振能量转移，利用基因探针对广泛的基因组DNA样品，以及对目标SNPs和InDels进行精准的双等位基因分型[16]。该技术的检测过程无需电泳，可以有效地减少试验过程中有害物质的产生，现已广泛应用于各类作物的种质筛选工作[17-18]。针对Pi2基因，利用KASP技术开发的分子标记相较于普遍使用SSR标记具有稳定性好、检测效率高等优点，可以更加高效准确地鉴定抗病基因，为聚合多个优质基因、培育高产抗病水稻品种提供技术支持。
本研究通过对大量水稻种质资源的基因组测序数据分析，挖掘Pi2基因核心区域SNP并开发为KASP分子标记，进一步通过室内接种、病圃鉴定验证标记的可靠性，最终构建一套适合于Pi2基因的分型体系。研究结果将为利用稻瘟病抗性基因Pi2进行品种选育提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
本研究以华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心收集的593份水稻自然种质作为供试材料，该群体分为122个粳稻材料和471个籼稻材料。通过该群体的基因组测序信息筛选SNP位点，并利用H-74和H-78开发KASP标记。以该群体田间2021年早造和晚造材料以及阳江市2020年晚造病圃材料作为验证材料。以R1179作为抗病对照，‘日本晴’作为感病对照。材料采用水培法[19]种植，营养液参照国际水稻研究所(International Rice Research Institute，IRRI)的培养配方配制。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取方法
本研究采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)法提取DNA。具体流程如下：取少量幼嫩的叶片，放入2 mL离心管中，加入2×CTAB提取液800 mL，用高通量组织研磨仪(Geno/Grinder)以1 500 r/min充分研磨3 min，65 ℃水浴30 min；冷却后加入三氯甲烷︰异戊醇体积比为24︰1的混合液至满管(约900 μL)，混合均匀，8 000 r/min离心10 min，放入–20 ℃的冰箱中20 min，使DNA充分沉淀；10 000 r/min离心3 min，去除上清液，倒置1 min，加入φ为70%的乙醇溶液800 μL，10 000 r/min离心3 min，去除上清液，干燥后加入ddH2O100 μL，使DNA充分溶解，置于–20 ℃保存。
1.2.2 KASP标记开发
在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)下载Pi2序列(Genbank登录号：DQ352453)以及与Pi2互为等位基因的Pi9(Genbank登录号：DQ285630.1)和Pigm序列(Genbank登录号：KU904633.2)。分别利用程序VISTA tools(https://genome.lbl.gov/vista/index.shtml)与Softberry(http://www.softberry.com/berry.phtml)在线分析，获得序列组成和基因结构信息。对H-74和H-78材料进行单倍型分析，获取Pi2抗性位点核心区域和重要SNP差异位点，并根据样品材料的相似性判断目标基因是否存在。结合单倍型分析结果获得的Pi2基因抗性位点核心区域的物理区间，利用程序Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools)和软件Premier5设计普通PCR引物。H-74和H-78这2个材料各设置2个重复，对目标物理位置进行扩增并测序。对上述获得的测序结果进行比对，分析差异SNP，优先选择单碱基突变、SNP突变位点位于编码区且周边没有其他的差异SNP位点，利用这些位点基于KASP技术设计成若干KASP分子标记。
1.2.3 KASP基因分型
将待检测的DNA样品稀释至50 mg/L，加入96孔PCR板中。配制KASP扩增反应体系20 μL(DNA 5 μL、引物Mix 0.4 μL、2×KASP Master Mix 4.6 μL，矿物油10 μL)。KASP扩增反应程序：95 ℃预变性180 s，循环1次；95 ℃变性10 s，63.4 ~ 56.2 ℃退火/延伸30 s(–0.8 ℃/循环)，循环9次；95 ℃变性10 s，55 ℃退火/延伸30 s，循环29次。待PCR扩增程序结束后，用荧光检测仪(FLUOstar Omega SNP)进行荧光检测，获得基因分型结果。
1.2.4 稻瘟病菌接种鉴定
使用开发的KASP标记进行基因分型后，选择检测结果为阳性和阴性的材料各3份，以及已知具有Pi2基因的材料R1179作为阳性对照和无Pi2基因的材料‘日本晴’作为阴性对照。将种子浸种催芽处理，待种子浸种露白后，以8×8的规格种植于30 cm×20 cm的盆中，每个品种种植4株，重复2次，待水稻生长至3~4叶期，参照韩美丽等[20]的方法离体单菌接种稻瘟病菌GDYJ7，6~7 d后调查。
自然诱发病圃设置在广东省阳江市阳江农业科学研究所白沙试验场，该病圃常年处于高温高湿的气候环境中，具有发病的地理环境条件，是广东省具有代表性的稻瘟病区。试验材料按单本种植，每份材料种5行，每行6株，行距23.3 cm，株距16.7 cm，四周种植诱发品种‘Co39’。病圃全生育期防虫不防病。在成熟期，以‘Co39’充分发病为准，对供试材料进行穗颈瘟调查，按IRRI 0~9级的分级标准进行记录(0级：无病；1级：抗；3级：中抗；5级：中感；7级：感；9级：高感)。
2. 结果与分析
2.1 Pi2基因核心SNP筛选
基于593份自然群体的全基因组重测序结果，结合Pi2基因序列，利用MEGA X64构建系统进化树，根据进化树分布密度，分为7个部分(图1A)。从中选择2个抗性不同且亲缘关系较远的材料H-74和H-78，其中H-74为抗病材料，与R1179等抗病材料在III区；H-78为感病材料，与‘日本晴’、‘丽江新团黑谷’等感病材料在II区。Pi2基因第2外显子上第787~788位密码子位置的核苷酸变异与稻瘟病抗性密切相关[21-24]。因此对H-74和H-78这2个材料，在Pi2基因区段以及基因上下游100 kb区域进行单倍型分析，确定Pi2基因抗性位点核心区域的物理位置在10386510~10389466 bp的范围内。单倍型分析结果中发现该区域内含有99个重要的SNP突变位点。根据材料测序结果与分析结果中位点突变情况的相似性判断H-74材料含有Pi2基因，H-78材料不含有Pi2基因。进一步利用593份自然群体的全基因组重测序结果，分析区域范围内的所有差异SNP位点，共筛选出175个SNP位点，并获得这些位点的碱基分布情况(图1B)。
![]()
图 1 系统进化树及差异SNP位点分析A：593份材料系统进化树（Ⅰ~Ⅶ：分布密度不同的7个部分）；B：593份材料在Pi2抗性位点核心区域的差异SNP及其碱基分布情况；C：H-74和H-78材料在Pi2抗性位点核心区域差异SNP位点分布(黄色竖线区域表示两者差异SNP位点分布情况)Figure 1. Phylogenetic tree and analysis of different SNP sitesA: Phylogenetic tree of 593 materials (Ⅰ−Ⅶ: Seven parts with different distribution density); B: Distributions of different SNPs and their bases in the core region of the Pi2 resistance locus for the 593 materials; C: Distribution of different SNP sites in the core region of the Pi2 resistance locus for H-74 and H-78 materials (The yellow vertical line area indicates the distribution of SNP sites that are different between them)根据物理位置10386510~10389466 bp，利用软件Primer5设计引物(表1)，分别利用3对引物对H-74和H-78材料的目标片段进行扩增和测序，测序结果进行序列比对分析，以获得更加精确的SNP位点及其分布和碱基突变情况(图1C，图2)。结合593份材料中发现的175个SNP位点与单倍型分析获得的99个SNP位点，过滤数据，在10386510~10389466 bp的区间内共筛选出28个关键SNP位点，其中9个位于内含子，19个位于外显子。
表 1 测序引物Table 1. Sequencing primers引物
名称
Primer
name序列(5′→3′)
Sequence预期片段
大小/bp
Expected
fragment sizePi2-F1 AAGCCTATGATTGGTTTCT 2 098 Pi2-R1 ACTGCCCTTCTTATTGTTC Pi2-F2 AACAATAAGAAGGGCAGTC 1 516 Pi2-R2 GAGGAGGAGATGAAATAGAAT Pi2-F3 AAGGTGGTGGTGCAAGTAC 258 Pi2-R3 CAATGTTATGGCATCGTTC ![]()
图 2 Pi2基因差异位点序列比对a：H-74材料，b：包含Pi2基因的材料，c：H-78材料，d、e：确定没有Pi2基因的材料；1和2表示材料的2个重复Figure 2. Sequence alignment analysis of the different sites of Pi2 genea: Material H-74, b: Material containing Pi2 gene, c: Material H-78, d and e: Material without Pi2 gene; 1 and 2 represent two repetitions of the material2.2 KASP标记开发
以不含有Pi2基因的‘日本晴’基因组作为参考序列，将H-74材料与‘日本晴’基因组序列进行比对，对上述的28个关键SNP位点进一步筛选，剔除相同的突变SNP位点。最后获得5个关键的SNP位点，分别在10388566、10388841、10389007、10389256和10389341 bp发生SNP变异，利用这5个SNP位点设计KASP引物(表2)。
表 2 KASP引物Table 2. KASP primers引物名称
Primer name检测位点
Detection site序列(5′→3′)
SequencePi2-C1-F1 A GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATGAACAA Pi2-C1-F2 C GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATGAACAC Pi2-C1-R A/C TGTCCTTAGTAGGGGAGGAGG Pi2-C2-F1 C GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTATGATTCAACGATCAAGAGTGGGCAC Pi2-C2-F2 T GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTATGTATTTAAAACACAGCATGGT Pi2-C2-R C/T CCTGTCTCGAGATTGAAACTGTG Pi2-C3-F1 T GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGGAGTATGTCCTGCAAAACT Pi2-C3-F2 A GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGGAGTATGTCCTGCAAAACA Pi2-C3-R T/A CAAACTGCATGTGCTAGACTCTTGGGTC Pi2-C4-F1 G GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATTGGTAAACTACAGGGCCTACAG Pi2-C4-F2 A GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTGGTAAACTACAGGGCCTACAA Pi2-C4-R G/A CACTTGGTAGTGCTGCAATGTATGTGCTC Pi2-C5-F1 A GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATGTCTGCATACTCTTCGTTGTATAA Pi2-C5-F2 G GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGTCTGCATACTCTTCGTTGTATAG Pi2-C5-R A/G AGGCATATTGTGTTAGTTATGCACTTCATTGGGTG 以含有Pi2基因的水稻材料R1179为阳性对照，不含Pi2基因的‘日本晴’为阴性对照，ddH2O为空白对照，在同一批593份自然群体材料中随机选取84份，利用上述引物对其进行KASP基因分型检测。待测样品扩增产物的荧光信号显示为蓝色圆点，且靠近X轴，则表明该材料包含Pi2基因，即T/T基因型；如果待测的扩增产物荧光信号显示为红色圆点，且靠近Y轴，则表明该材料不包含Pi2基因，即A/A基因型。
如图3所示，引物Pi2-C1、Pi2-C2和Pi2-C3的基因分型中有着分群聚集的趋势，引物Pi2-C4和Pi2-C5分型结果不够明确(图3)。为进一步确认这5个引物的可行性，利用3个已知包含Pi2基因的样品材料和3个已知不包含Pi2基因的样品材料作为阴、阳对照，同样以ddH2O作为空白对照，对其进行KASP基因分型检测，结果如图4所示。引物Pi2-C3可以成功将阴、阳对照及空白对照和检测样品材料分开。基因分型结果和预期结果相匹配，初步判断引物Pi2-C3的可行性。然而利用引物Pi2-C3的分型结果较为分散，为获得较为直观和清晰的图片，在原有的检测PCR程序基础上加4个循环，获得新的KASP基因分型结果(图5)。
![]()
图 3 KASP引物基因分型效果A~E对应的引物分别为Pi2-C1、Pi2-C2、Pi2-C3、Pi2-C4、Pi2-C5Figure 3. Genotyping effects of KASP primersPrimers corresponding to A−E are Pi2-C1, Pi2-C2, Pi2-C3, Pi2-C4 and Pi2-C5 respectively![]()
图 4 对照KASP基因分型结果A~E对应的引物分别为Pi2-C1、Pi2-C2、Pi2-C3、Pi2-C4、Pi2-C5Figure 4. KASP genotyping results for control samplesPrimers corresponding to A−E are Pi2-C1, Pi2-C2, Pi2-C3, Pi2-C4 and Pi2-C5 respectively![]()
图 5 利用引物Pi2-C3增加PCR循环数后KASP基因分型结果Figure 5. KASP genotyping results after increasing PCR cycles by primer Pi2-C32.3 KASP标记鉴定效果分析
为评估KASP标记Pi2-C3的检测效果，本研究基于全基因组重测序结果选取了6个基因型为T/T的材料作为阳性对照、4个基因型为A/A的材料作为阴性对照，ddH2O作为空白对照，对84个田间水稻材料，分别利用设计的KASP分子标记Pi2-C3和已报道的SSR标记M-Pi2(Pi2-F：5′-CAGCGATGGTATGAGCACAA-3′，Pi2-R：5′-CGTTCCTATACTGCCACATCG-3′)进行检测，并对两者的检测结果进行比较。SSR标记扩增后，含有Pi2基因的片段大小为450 bp，不含Pi2基因的片段大小为282 bp[25]。结果如图6A 所示，KASP标记的基因分型结果中，有50个材料的荧光信号点为蓝色，38个材料的荧光信号点为红色，4个材料的荧光信号点为绿色，前后进行2次检测，分型结果一致，表明KASP标记Pi2-C3具有较好的重复性和稳定性。将上述结果与SSR标记的电泳结果(图6B)相比较，两者有95%的相似性，并且在两者的结果中，10个对照材料的检测结果与前期测序结果一致。因此可初步判断，KASP标记Pi2-C3可以成功区分纯合型T/T、A/A和杂合型T/A这3种基因型。
![]()
图 6 84个田间材料Pi2-C3 KASP分子标记的验证A：Pi2 KASP基因分型检测结果；B：SSR标记检测结果(Marker位于胶图中央，大小为2 000 bp，a、 c、 d区域中相应位置片段大小与b区域标示相同)Figure 6. Verification of Pi2-C3 KASP molecular marker for 84 field samplesA: KASP genotype detection results for Pi2; B: SSR marker detection results (marker is located in the center of the rubber map, with the size of 2 000 bp, and the corresponding fragment sizes in areas a, c and d are the same as that in area b)从593份材料中对该位点进行筛选，挑选出基因型为T/T的2份材料607-557和RT1031-69；基因型为A/T的22份材料，包括京农大‘W030’、‘早粳占’、CT15672-3-2-3-2-2-M、‘华粳籼74’、白水糯、雪华新占、海南糯、1641选、远野4号、‘黄广华占1号’、黑糯47、Getu、海南黑、本地糯(阳春三甲)、黑节早、广粳籼165、观音稻、IRRI129、黄广软占、‘大丰糯’、‘鹏稻2号’、‘凤新丝苗-1’；其余材料基因型为A/A。从基因型为A/A的材料中随机挑选出60个材料，再加上挑选出的基因型为T/T和A/A的24份材料，对这84个材料进行KASP基因分型检测，进一步验证KASP标记的可靠性。如图7A所示，a-1和a-2对应基因型为T/T的2个材料，与检测结果保持一致。a-3至b-12对应基因型为A/T的22个材料，基因型数量比T/T︰A/A＝13︰6，初步判断这22个材料后代发生性状分离。c-1至g-12对应基因型为A/A的60个材料，54个检测为A/A，6个检测为T/T，准确率为93%(图7B)。
![]()
图 7 593份材料中部分材料KASP基因分型结果A：Pi2基因KASP基因分型结果；B：Pi2基因KASP基因分型与实际基因型比对分析Figure 7. KASP genotyping results of partial materials of the 593 materialsA: KASP genotyping results for Pi2 gene; B: Comparison analysis between Pi2 gene KASP genotyping and actual genotype2.4 抗稻瘟病表型鉴定
为进一步验证基因分型结果的准确性，以R1179与‘日本晴’分别作为阳性对照与阴性对照，对基因分型中确定含有Pi2基因的种质(H-11、H-12和H-94)与基因分型中确定不含有Pi2基因的种质(H-14、H-15和H-151)进行稻瘟病离体打孔接种试验，5~7 d后调查接种表型，根据叶片病斑大小分析材料的抗病性。结果(图8)表明，H-11、H-12和H-94对稻瘟病具有抗性而H-14、H-15和H-151对稻瘟病表现高感。表明抗性表型与基因分型结果一致，Pi2基因KASP标记Pi2-C3具有较高的可靠性。
利用开发的Pi2-C3抗性标记对2020年晚造中阳江市病圃的84份材料进行KASP基因分型，确定供试材料中Pi2基因的存在情况，同时进行田间病圃抗性评价(表3)。从阳江市病圃材料中，检测到携带Pi2抗性基因的材料46份，占54.76%，未携带Pi2抗性基因的材料38份，占45.24%。结合病圃表型观察，抗性材料68份，包括高抗材料16份、中抗材料25份；感病材料16份，包括高感材料5份、中感材料5份。在后续对病圃检测结果的验证中表明，携带Pi2基因的材料对稻瘟病表现为抗性，其中5份材料表现为高抗，7份表现为中抗。
表 3 广东阳江病圃材料Pi2基因检测结果及抗性评价Table 3. Pi2 gene detection results and resistance evaluation of materials from the Yangjiang disease nursery in Guangdong编号
NumberPi2基因检测
Pi2 gene detection抗性评价
Resistance evaluation编号
NumberPi2基因检测
Pi2 gene detection抗性评价
Resistance evaluationJ-201 − 中感 J-217 + 抗 J-202 + 抗 J-218 + 抗 J-203 + 抗 J-219 − 抗 J-204 + 抗 J-220 + 中抗 J-205 + 抗 J-221 − 中抗 J-206 − 抗 J-222 − 中抗 J-207 + 抗 J-223 − 中抗 J-208 + 抗 J-224 + 抗 J-209 + 高抗 J-225 + 抗 J-210 + 高抗 J-226 − 中抗 J-211 + 抗 J-227 − 中抗 J-212 − 中感 J-228 − 中感 J-213 + 抗 J-229 − 中抗 J-214 − 抗 J-230 − 中抗 J-215 + 抗 J-231 − 中抗 J-216 + 高抗 J-232 − 中感 J-233 + 抗 J-259 + 高抗 J-234 + 抗 J-260 + 高抗 J-235 − 抗 J-261 + 抗 J-236 + 高抗 J-262 + 高抗 J-237 + 高抗 J-263 − 中感 J-238 + 中抗 J-264 − 高感 J-239 − 中抗 J-265 + 高抗 J-240 + 抗 J-266 − 高感 J-241 + 高抗 J-267 − 高感 J-242 − 高感 J-268 + 抗 J-243 + 抗 J-269 + 抗 J-244 − 感病 J-270 + 抗 J-245 + 中抗 J-271 − 抗 J-246 + 抗 J-272 + 抗 J-247 − 高感 J-273 + 抗 J-248 − 中抗 J-274 + 高抗 J-249 + 抗 J-275 − 抗 J-250 + 中抗 J-276 − 中抗 J-251 − 抗 J-277 − 中抗 J-252 + 高抗 J-278 − 感病 J-253 + 高抗 J-279 − 感病 J-254 − 中抗 J-280 − 感病 J-255 + 高抗 J-281 − 中抗 J-256 + 高抗 J-282 − 感病 J-257 + 高抗 J-283 + 抗 J-258 − 抗 J-284 − 感病 3. 讨论与结论
3.1 Pi2基因分子标记的开发和应用
培育和种植抗稻瘟病水稻品种可以有效减少稻瘟病造成的损失，利用与抗稻瘟病基因连锁的分子标记进行辅助选择可以提高品种选育的效率。针对抗稻瘟病基因Pi2，先后有不同的研究人员开发了不同类型的分子标记用于该基因的分型。Wu等[26]利用Pi2基因的SSR标记AP22，对277份优质中国水稻亲本材料进行了检测；高利军等[25]基于Pi2基因与日本晴基因序列的差异开发共显性分子标记M-Pi2；李潜龙[27]基于Pi2基因1543~1545处3个碱基的缺失，开发Indel功能标记Pi2-1，使用功能标记Pi2-1辅助选择育种改良文香1号的稻瘟病抗性，抗性表型的选择准确率在90%以上；李冰等[28]利用Pi2位点Nbs4-Pi2及其复等位基因Pi9、Pigm位点Pigm-R2 DNA序列比对结果，开发了Indel标记Pi2-CM1，该标记可有效区分Pi2与其等位基因Pi9和Pigm。除了传统的二代标记，已有研究人员针对Pi2基因开发了一系列SNP标记。华丽霞等[23]开发的dCAPS标记，在PCR扩增后需要通过酶切和电泳进行检测，操作复杂，而金名捺等[24]开发的HRM标记，对PCR扩增体系要求较高，不适合进行大批量筛选。基于KASP的基因分型技术无需电泳，稳定性好，可以有效解决以上问题，杨义强等[29]利用高抗稻瘟病品种‘黄广油占’与高感品种‘广陆矮4号’Pi2基因第787和788密码子上的突变，开发了Pi2基因特异性KASP标记W-Pi2，通过对40个品种和部分F2分离群体的检测发现该标记可以实现对Pi2基因的准确分型。邓钊等[30]利用基于KASP技术开发的针对16个稻瘟病抗性基因的标记组合对隆两优和晶两优系列杂交稻品种及其亲本进行基因型检测，Pia、Pita、Pi2、Pi5和Piz基因在品种中的检出频率相对较高，均达到50%以上，其中Pi2在父本中的检出率达到了71.2%。
本研究在593份自然群体材料中筛选出2个表型不同、亲缘关系较远的材料H-74和H-78，进一步对这2个材料进行单倍型分析，获得Pi2基因抗性位点的核心区域和99个重要SNP位点。结合593份材料的全基因组重测序结果，筛选出关键SNP位点，最后成功开发出KASP特异性分子标记Pi2-C3。该标记被应用于已知基因型的84个自然群体材料的检测中，显示出较高的准确度。同时，从阳江市病圃材料中，选出84份材料进行KASP基因分型和抗性评价，发现46份材料携带Pi2抗性基因，占总体的54.76%，而38份材料未携带Pi2抗性基因，占45.24%。本研究开发的KASP标记专门针对Pi2基因进行检测。然而，在被检测的病圃材料中未携带Pi2抗性基因的材料可能由于携带Pi1、Pita及Piz-t等其他抗性基因而表现出稻瘟病抗性。与以往的研究相比，本研究开发的KASP标记Pi2-C3不需要进行电泳，准确度较高，并且易于实现高通量和自动化。另外，相较于其他KASP分子标记，本研究基于Pi2抗性位点的核心区域进行标记的开发，确保了标记的真实性和可靠性。
3.2 KASP基因分型技术的应用前景
目前，SSR标记鉴定体系已被广泛应用，显著提高了品种鉴定的效率和准确性。然而，在水稻基因组中，具有多个等位基因的位点增加了构建DNA指纹库的难度，需要频繁更新数据以避免转换错误。一些通量化的SSR标记检测技术缺乏稳定性。相比之下，SNP标记仅有3个基因型，不受扩增片段大小的影响，可广泛用于DNA指纹图谱的构建，推动了检测技术的发展。基于PCR原理的KASP基因分型技术具有直观的检测结果，适用于高通量检测。与同为SNP检测技术的高分辨率熔解曲线(High resolution melting，HRM)相比，KASP技术成本更低，操作更简便。本研究开发的KASP标记Pi2-C3和SSR标记M-Pi2分别对包含阴阳对照的96个材料进行检测，2种标记检测结果高达95%的一致性。由于KASP和SSR标记是基于不同的原理和标记位点设计的，SSR不是基于基因的标记，其多态性不能完全反映基因的存在，而KASP是基于SNP差异开发的，具有更高的准确性。此外，Pi2区域的某些位点可能在个别个体中呈现差异，这也可能导致KASP和SSR标记的检测结果不一致。另一方面，利用KASP标记进行基因分型可以减少电泳点样的步骤，从而降低试验误差。此外， KASP标记的应用避免了使用有毒化学物质如核酸染料，减少了对人体和环境的潜在危害。KASP的结果更加直观，可以通过颜色区分不同基因型，直接定位到相应的材料。
3.3 结论
本研究针对稻瘟病抗性基因Pi2的核心区域，开发了基于KASP基因分型技术的特异性分子标记Pi2-C3，并建立了一套水稻Pi2基因的KASP基因分型体系。该标记能够准确检测水稻材料中Pi2基因，将不同水稻材料的Pi2位点分为T/T、T/A和A/A基因型，其中T/T为抗病基因型。相较于其他分子标记，操作流程更加简便，检测结果更加高效。KASP基因分型检测技术为水稻抗稻瘟病种质资源的鉴定和抗性群体的高通量筛选提供了技术支持，为水稻新时代抗性育种奠定了基础。
-
表 1 啤酒发酵条件正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for beer fermentation conditions
水平 Level 因素 Factor 紫色马铃薯酶解汁液添加体积分数/%
Addition of purple potato enzymolysis juice (A)pH(B) θ/℃ (C) 1 75 5.0 12 2 50 5.5 15 3 25 6.5 18 
下载: 导出CSV
表 2 紫色马铃薯酶解汁液添加体积分数对浓色啤酒感官评分及理化指标的影响1)
Table 2 Effects of potato enzymolysis juice addition on sensory score and physicochemical properties of dark beer
φ(紫色马铃薯
酶解汁液)/%
Addition of purple potato enzymolysis juice感官评分
Sensory
score酒精度(φ)/%
Alcohol contentρ(还原糖)/
(mg·mL−1)
Reducing sugar content色度/EBC
Chromaφ(总酸)/
(mL·L−1)
Total acidspH 发酵度/%
Fermentative degree发酵力/
(g·L−1·d−1)
Fermentation capacity0(CK) 85.8 4.48±0.03a 32.53±4.89a 34.83±0.25ab 12.8±0.3a 4.17 60.87 6.85 25 88.0 4.28±0.02b 9.96±0.02f 34.35±0.26b 7.9±0.1c 4.81 56.47 6.09 33 84.8 4.23±0.04b 10.10±0.03e 35.04±0.20a 8.1±0.1c 4.74 53.85 5.41 50 80.5 4.11±0.05c 11.16±0.03c 30.84±0.15d 9.1±0.3b 4.54 52.43 4.26 67 76.6 3.14±0.03d 10.37±0.02d 27.23±0.20e 9.3±0.4b 4.33 50.32 3.21 75 72.2 3.08±0.05d 12.59±0.03b 20.19±0.20c 9.4±0.4b 4.25 48.89 3.21 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
表 3 不同初始pH对浓色啤酒感官评分及理化指标的影响1)
Table 3 Effects of initial pH on sensory score and physicochemical properties of dark beer
初始 pH
Initial pH感官评分
Sensory score酒精度(φ)/%
Alcohol contentρ(还原糖)/
(mg·mL−1)
Reducing sugar content色度/EBC
Chromaφ(总酸)/
(mL·L−1)
Total acidspH 发酵度/%
Fermentative degree发酵力/
(g·L−1·d−1)
Fermentation capacity5.0 82.6 4.49±0.04b 18.92±0.15a 39.50±0.20a 9.7±0.1a 4.67 66.15 4.67 5.5 83.2 4.26±0.04d 18.64±0.20a 38.88±0.10ac 9.7±0.1a 4.69 63.08 4.76 6.0 85.4 4.53±0.03c 13.96±0.20b 38.29±0.20bc 9.4±0.1b 4.68 64.62 4.85 6.5 82.3 4.66±0.02a 8.61±0.21c 34.88±0.15e 8.2±0.1c 4.73 65.38 5.18 7.0 80.2 4.63±0.05a 5.75±0.31d 36.52±0.20d 8.0±0.1d 4.66 61.52 5.22 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
表 4 不同酵母菌种对浓色啤酒感官评分及理化指标的影响1)
Table 4 Effects of yeast strains on sensory score and physicochemical properties of dark beer
酵母菌株
Yeast starter感官评分
Sensory score酒精度(φ)/%
Alcohol contentρ(还原糖)/
(mg·mL−1)
Reducing sugar content色度/EBC
Chromaφ(总酸)/
(mL·L−1)
Total acidspH 发酵度/%
Fermentative degree发酵力/
(g·L−1·d−1)
Fermentation capacityM20 84.3 4.49±0.00a 15.18±0.05b 36.06±0.06b 9.5±0.3a 4.56 51.54 5.84 M21 86.3 4.25±0.00b 13.47±0.03c 35.66±0.11c 9.5±0.2a 4.53 53.08 5.54 M36 80.8 4.26±0.00b 8.70±0.02e 37.21±0.35a 9.1±0.3a 4.61 60.38 5.83 M44 84.1 4.24±0.00b 15.72±0.03a 34.94±0.26d 10.5±2.1a 4.34 47.31 4.66 M47 81.6 4.17±0.00c 12.92±0.04d 33.17±0.10e 9.1±1.0a 4.62 53.08 5.74 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
表 5 不同酵母接种体积分数对浓色啤酒感官评分及理化指标的影响1)
Table 5 Effects of yeast inoculation doses on sensory score and physicochemical properties of dark beer
φ(酵母接种)/%
Yeast inoculation
dosage感官评分
Sensory score酒精度(φ)/%
Alcohol contentρ(还原糖)/
(mg·mL−1)
Reducing
sugar content色度/EBC
Chromaφ(总酸)/
(mL·L−1)
Total acidspH 发酵度/%
Fermentative degree发酵力/
(g·L−1·d−1)
Fermentation capacity2 82.1 5.84±0.00a 9.39±0.04c 33.24±0.15c 10.1±0.2a 4.57 61.54 6.06 4 85.1 5.09±0.00c 9.25±0.03d 32.18±0.10d 9.7±0.1a 4.64 61.15 6.20 6 87.2 5.01±0.00d 9.41±0.04c 33.01±0.20c 9.6±0.2a 4.64 60.38 6.19 8 81.2 4.83±0.00e 11.01±0.12a 34.02±0.15a 9.1±0.9a 4.61 60.38 6.53 10 78.5 5.33±0.00b 10.14±0.03b 33.60±0.15b 9.6±1.4a 4.51 59.62 7.80 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
表 6 不同发酵温度对浓色啤酒感官评分及理化指标的影响1)
Table 6 Effects of fermentation temperatures on sensory score and physicochemical properties of dark beer
发酵温度/℃
Fermentation temperature感官评分
Sensory score酒精度(φ)/%
Alcohol contentρ(还原糖)/
(mg·mL−1)
Reducing
sugar content色度/EBC
Chromaφ(总酸)/
(mL·L−1)
Total acidspH 发酵度/%
Fermentative degree发酵力/
(g·L−1·d−1)
Fermentation capacity10 85.1 4.62±0.00d 11.65±0.02a 39.80±0.20a 10.4±0.5a 4.71 55.38 5.52 12 84.8 4.59±0.00e 8.83±0.04b 38.42±0.15b 9.7±0.1ab 4.70 60.38 5.67 15 86.3 4.85±0.00a 8.59±0.02c 37.96±0.15b 9.1±0.2b 4.85 60.77 8.87 18 84.1 4.79±0.00b 8.77±0.02b 36.45±0.20c 9.3±1.0ab 4.46 60.77 6.53 22 76.2 4.65±0.00c 8.59±0.03c 34.97±0.20d 8.9±0.9b 4.71 60.38 5.50 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
表 7 添加紫色马铃薯酶解汁液的浓色啤酒发酵正交试验结果
Table 7 Results of orthogonal experiment for dark beer fermentation with addition of purple potato enzymolysis juice
试验号
Experiment No.A B C 误差
Error感官评分
Sensory score1 1 1 1 1 73.2 2 1 2 2 2 78.8 3 1 3 3 3 79.6 4 2 1 2 3 78.7 5 2 2 3 1 68.8 6 2 3 1 2 83.7 7 3 1 3 2 75.0 8 3 2 1 3 81.5 9 3 3 2 1 86.9 k1 72.150 70.603 74.450 71.250 k2 72.050 71.333 76.433 74.137 k3 76.103 78.367 69.420 74.917 极差 Range 4.053 7.764 7.013 3.667
下载: 导出CSV
表 8 添加紫色马铃薯酶解汁液的浓色啤酒与市售浓色啤酒抗氧化成分含量比较1)
Table 8 Contents of antioxidants in commercial dark beer and dark beer with addition of purple potato enzymolysis juice
样品
Sampleρ/(mg·L−1) 总酚 Total phenol 绿原酸 Chlorogenic acid 花青素 Anthocyanin 添加紫色马铃薯酶解汁液的浓色啤酒
Dark beer with addition of purple potato enzymolysis juice360.2±3.9a 685.7±11.6c 208.4±6.0b 未发酵混合汁液 Mixture juice before fermentation 352.7±1.8b 1104.9±7.9a 691.3±23.1a 纯麦芽浓色啤酒 Dark beer prepared with pure wort 186.0±1.5c 1020.0±41.9b 0 某市售浓色啤酒 A commercial dark beer 124.2±2.8d 602.1±24.4d 0 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
表 9 添加紫色马铃薯酶解汁液的浓色啤酒与市售浓色啤酒体外抗氧化能力比较1)
Table 9 Comparison of antioxidant capacities in vitro between commercial dark beer and dark beer with addition of purple potato enzymolysis juice
样品
Sample总还原力
Total reduction capacityDPPH自由基清除能力
DPPH radical scavenging capacityABTS自由基
清除率/%
ABTS radical scavenging rate还原值
Reduction
valueρ(维生素C)/
(mg·mL−1)
Vitamin C content清除率/%
Scavenging
rateρ(维生素C)/
(mg·mL−1)
Vitamin C
content添加紫色马铃薯酶解汁液的浓色啤酒
Dark beer with addition of purple potato enzymolysis juice0.9509±0.022 4a 0.150±0.016a 49.9±0.6b 0.043±0.003b 83.9±2.3a 未发酵混合汁液
Mixture juice before fermentation0.9138±0.006 5b 0.143±0.019a 55.3±0.8a 0.048±0.004a 37.0±3.3c 纯麦芽浓色啤酒
Dark beer prepared with pure wort0.5259±0.006 8c 0.074±0.019b 46.8±0.5c 0.040±0.003c 74.0±3.4b 某市售浓色啤酒 A commercial dark beer 0.3460±0.001 8d 0.042±0.020c 34.6±0.5d 0.028±0.003d 69.9±1.3b 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s test)
下载: 导出CSV
-
[1] 王兰, 邓放明, 赵玲艳, 等. 紫色马铃薯保健功效及其利用研究进展[J]. 中国酿造, 2015, 34(7): 117-120. doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2015.07.028 [2] SHEN G, ZHANG L, HU T, et al. Preparation of potato flour by freeze-thaw pretreatment: Effect of different thawing methods on hot-air drying process and physicochemical properties[J]. LWT-Food Science and Technology, 2020, 133: 110157. doi: 10.1016/j.lwt.2020.110157
[3] 罗尚兵, 罗兴友. 节能环保型马铃薯全粉加工方法: CN106072183A[P]. 2016-11-09. [4] 木泰华, 李鹏高. 马铃薯中生物活性成分及其功能[J]. 食品科学, 2016, 37(19): 269-276. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201619045 [5] SUN Y, JIANG L Z, WEI D X. Partial characterization, in vitro antioxidant and antiproliferative activities of patatin purified from potato fruit juice[J]. Food and Function, 2013, 4(10): 1502-1511. doi: 10.1039/c3fo60248f
[6] MAKINEN S, KELLONIEMI J, PIHLANTO A, et al. Inhibition of angiotensin converting enzyme I caused by autolysis of potato proteins by enzymatic activities confined to different parts of the potato tuber[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(21): 9875-9883. doi: 10.1021/jf8016817
[7] KIM T H, PARK J S, AN S S, et al. Inhibition of thrombina ctivated fibrinolysis inhibitor decreases postoperative adhesion[J]. Journal of Surgical Research, 2015, 193(2): 560-566. doi: 10.1016/j.jss.2014.07.056
[8] LANGNER E, NUNES F M, POZAROWSKI P, et al. Antiproliferative activity of melanoidins isolated from heated potato fiber (potex) in glioma cell culture model[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(6): 2708-2716. doi: 10.1021/jf1047223
[9] ANDRE C M, OUFIR M, GUIGNARD C, et al. Antioxidant profiling of native Andean potato tubers (Solanum tuberosum L.) reveals cultivars with high levels of beta-carotene, alpha-tocopherol, chlorogenic acid, and petanin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(26): 10839-10849. doi: 10.1021/jf0726583
[10] 杨婧娀, 王佐民, 于宏伟, 等. 精酿啤酒的发展前景[J]. 酿酒, 2018, 45(4): 35-37. [11] 刘金鹏, 秦艳霞, 俞志敏, 等. 响应面法优化蓝莓啤酒酿制工艺[J]. 大连工业大学学报, 2016, 35(6): 36-39. [12] 孙科. 保健型红枣啤酒发酵工艺研究[J]. 山东食品发酵, 2014, 33(1): 105-108. [13] CARVALHO G B M, SILVA D P, BENTO C V, et al. Banana as adjunct in beer production: Applicability and performance of fermentative parameters[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 155(1/2/3): 53-62.
[14] BONCIU C, STOICESCU A. Obtaining and characterization of beers with cherries[J]. Innovative Romanian Food Biotechnology, 2008, 3: 23-27.
[15] NUNES C D S O, SILVA G P D, MACHADO B A S, et al. Cocoa pulp in beer production: Applicability and fermentative process performance[J]. PLoS One, 2017, 12(4): e0175677. doi: 10.1371/journal.pone.0175677
[16] RAY R C, PANDA S K, SWAIN M R, et al. Proximate composition and sensory evaluation of anthocyanin-rich purple sweet potato (Ipomoea batatas L.) wine[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2012, 47(3): 452-458. doi: 10.1111/j.1365-2621.2011.02861.x
[17] PANDA S K, SWAIN M R, SINGH S, et al. Proximate compositions of a herbal purple sweet potato (Ipomoea batatas L.) wine[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2013, 37(5): 596-604. doi: 10.1111/j.1745-4549.2012.00681.x
[18] PANDA S K, PANDA S H, SWAIN M R, et al. Anthocyanin-rich sweet potato (Ipomoea batatas L.) beer: Technology, biochemical and sensory evaluation[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2015, 39(6): 3040-3049. doi: 10.1111/jfpp.12569
[19] 李志霞, 聂继云, 闫震, 等. 响应面法对3,5−二硝基水杨酸比色法测定水果中还原糖含量条件的优化[J]. 分析测试学报, 2016, 35(10): 1283-1288. doi: 10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.011 [20] 国家质量监督检验检疫总局. 啤酒分析方法: GB/T 4928—2008[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008. [21] 牛广财, 闫公昕, 朱丹, 等. Folin-Ciocalteu比色法测定沙棘酒中总多酚含量的工艺优化[J]. 食品与机械, 2016, 32(4): 80-83. [22] NIO-MEDINA G, ROMO-LONGORIA J D, RAMÍREZ-GONZÁLEZ I V, et al. Phenolic content and antioxidant capacity level in commercial Mexican lager beers[J]. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 2017, 75(2): 156-158. doi: 10.1094/ASBCJ-2017-2751-01
[23] 桑戈, 赵力, 谭婷婷, 等. pH示差法测定紫薯酒中花青素的含量[J]. 酿酒科技, 2015(6): 88-91. [24] SINGH S, SINGH R P. In vitro methods of assay of antioxidants: An overview[J]. Food Reviews International, 2008, 24(4): 392-415. doi: 10.1080/87559120802304269
[25] BENZIE I F, STRAIN J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: The FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1): 70-76. doi: 10.1006/abio.1996.0292
[26] 蔡柳, 董文, 胡新喜, 等. 马铃薯块茎中单糖组分及含量的测定[J]. 食品科技, 2018, 43(4): 327-331. [27] 尹乐斌, 周娟, 李立才, 等. 石榴五味子保健酒发酵工艺优化及抗氧化活性研究[J]. 食品与机械, 2019, 35(3): 208-214. [28] 国家质量监督检验检疫总局. 啤酒: GB/T 4927—2008[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008. [29] CHEN Y, MA Y, DONG L, et al. Extrusion and fungal fermentation change the profile and antioxidant activity of free and bound phenolics in rice bran together with the phenolic bioaccessibility[J]. LWT-Food Science and Technology, 2019, 115: 108461. doi: 10.1016/j.lwt.2019.108461
[30] ECHEVERRIGARAY S, SCARIOT F J, MENEGOTTO M, et al. Anthocyanin adsorption by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation is associated to the loss of yeast cell wall/membrane integrity[J]. International Journal of Food Microbiology, 2020, 314: 108383. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2019.108383
[31] 张赟彬, 何国庆. 添加马铃薯辅料酿制高氨基酸营养啤酒的研究[J]. 酿酒, 2004, 31(1): 83-84. doi: 10.3969/j.issn.1002-8110.2004.01.037 [32] 姚立华, 何国庆, 陈启和. 以马铃薯为辅料的黄酒发酵条件优化[J]. 农业工程学报, 2006, 22(12): 228-233. doi: 10.3321/j.issn:1002-6819.2006.12.048 -
期刊类型引用(4)
1. 张振超，陶美奇，潘永飞，孙国胜，王传友，安林海，戴忠良. 基于高通量测序的青花菜KASP标记开发与应用. 核农学报. 2025(03): 513-524 . 
百度学术
2. 陈静，饶刚顺，刘婉卿，李惠芬，杨义强，徐鹏，王重荣. 稻瘟病抗性基因Pi2、Pita的特异KASP标记开发与应用. 广东农业科学. 2024(05): 93-101 . 百度学术
3. 王攀. 植物分子标记高通量快速检测技术的研究进展. 中国种业. 2024(07): 17-22 . 百度学术
4. 肖玉珍，张瑞青，张跃星，代雪，张勇，王中元，于蓉，侯尹婕，张显，魏春华. 甜瓜KASP标记开发及指纹图谱构建. 中国瓜菜. 2024(09): 9-17 . 百度学术
其他类型引用(1)
计量
- 文章访问数: 1011
- HTML全文浏览量: 3
- PDF下载量: 1992
- 被引次数: 5
