宁夏地区荷斯坦牛乳成分及相关指标的非遗传因素、体细胞评分变化规律

    母童, 虎红红, 冯小芳, 顾亚玲, 田佳, 温万, 张娟, 王影

    母童, 虎红红, 冯小芳, 等. 宁夏地区荷斯坦牛乳成分及相关指标的非遗传因素、体细胞评分变化规律[J]. 华南农业大学学报, 2021, 42(2): 34-43. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202005023
    引用本文: 母童, 虎红红, 冯小芳, 等. 宁夏地区荷斯坦牛乳成分及相关指标的非遗传因素、体细胞评分变化规律[J]. 华南农业大学学报, 2021, 42(2): 34-43. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202005023
    MU Tong, HU Honghong, FENG Xiaofang, et al. Variation characteristics of non-genetic factors and somatic cell score for raw milk composition and related traits of Holstein in Ningxia region[J]. Journal of South China Agricultural University, 2021, 42(2): 34-43. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202005023
    Citation: MU Tong, HU Honghong, FENG Xiaofang, et al. Variation characteristics of non-genetic factors and somatic cell score for raw milk composition and related traits of Holstein in Ningxia region[J]. Journal of South China Agricultural University, 2021, 42(2): 34-43. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202005023

    宁夏地区荷斯坦牛乳成分及相关指标的非遗传因素、体细胞评分变化规律

    基金项目: 宁夏自治区农业育种专项(2019NYYZ05)
    详细信息
      作者简介:

      母童(1995—),男,博士研究生,E-mail: mtlv3h@163.com

      通讯作者:

      顾亚玲(1963—),女,教授,E-mail: guyl@nxu.edu.cn

    • 中图分类号: S823

    Variation characteristics of non-genetic factors and somatic cell score for raw milk composition and related traits of Holstein in Ningxia region

    • 摘要:
      目的 

      阐明非遗传因素对宁夏地区荷斯坦牛乳成分及相关指标的影响。

      方法 

      基于宁夏地区荷斯坦奶牛DHI测定数据,利用SAS 9.2软件GLM过程分析胎次、泌乳时期和产犊季节对9项泌乳性状的影响,并探究泌乳性状在不同体细胞评分中的变化规律。

      结果 

      胎次、泌乳时期、产犊季节、泌乳时期×产犊季节对9项泌乳性状的影响均达到显著水平(P<0.05)。对不同胎次进行比较,乳脂率和乳固形物含量在第2胎后显著下降(P<0.05),乳蛋白率和高峰奶量在第3胎后显著下降(P<0.05);日产奶量第4胎后稍有降低;乳糖率则呈现先下降后上升的趋势,在第3胎达到最低(P<0.05),为4.84%。体细胞评分随着胎次的增加逐渐上升,泌乳高峰日在第1胎次最晚出现(94.07 d),第4胎次最早(67.33 d)。对不同泌乳时期进行比较,日产奶量和乳糖率在第2、3胎随着泌乳时期的延长逐步下降(P<0.05),而乳蛋白率、乳固形物含量、体细胞评分和乳脂率呈上升趋势(P<0.05)。对不同产犊季节进行比较,1~3胎乳脂率和第1胎乳固形物含量春季至冬季均逐步下降;第1胎日产奶量和乳糖率呈上升趋势,到第2、3胎时在夏季分别处于最低水平;1~3胎乳蛋白率、体细胞评分、泌乳高峰日和高峰奶量春季至冬季均呈先升高后降低的趋势,且各性状不同胎次均在夏季达到最高水平。随着体细胞评分增高,乳糖率、日产奶量及高峰奶量整体上逐渐下降,乳脂率和乳蛋白率呈缓慢上升趋势,乳固形物含量和泌乳高峰日在体细胞评分分别为4和5时达到最高水平。

      结论 

      本研究结果为提高宁夏地区荷斯坦奶牛泌乳性能及生鲜乳质量提供了理论依据。

      Abstract:
      Objective 

      To clarify the effects of non-genetic factors on the raw milk composition and related traits of Holstein in Ningxia region.

      Method 

      Based on the DHI data of Holstein in Ningxia region, the effects of parity, lactation stage and calving season on nine lactation traits were analyzed by GLM process of SAS 9.2 software, and the variation characteristics of lactation traits in different somatic cell scores were explored.

      Result 

      Parity, lactation stage, calving season, lactation stage × calving season had significant effects (P<0.05) on nine lactation traits. Comparison of different parities showed that milk fat percentage and milk solid content decreased significantly after the second parity (P<0.05), milk protein percentage and peak milk yield decreased significantly after the third parity (P<0.05), daily milk yield decreased slightly after the fourth parity, milk lactose percentage decreased first and then increased, reaching the lowest level of 4.84% in the third parity (P<0.05), somatic cell score increased gradually with the increase of parity, and the day of peak milk yield was the latest in the first parity(94.07 d) and the earliest in the fourth parity (67.33 d). Comparison of different lactation stages showed that daily milk yield and milk lactose percentage gradually decreased with the prolongation of lactation in the second and third parities (P<0.05), while milk protein percentage, milk solid content, somatic cell score and milk fat percentage showed an increasing trend (P<0.05). Comparison of different calving seasons showed that from spring to winter, milk fat percentage of the first parity to third parity and milk solid content of the first parity gradually decreased, while daily milk yield and milk lactose percentage showed an increasing trend for the first parity and were at the lowest level in summer for the second parity and third parity. Milk protein percentage, somatic cell score, the day of peak milk yield and peak milk yield showed a trend of increasing first and then decreasing from the first parity to third parity, and the highest levels of all these traits for different parities were found in summer. With the increase of somatic cell score, milk lactose percentage, daily milk yield and peak milk yield decreased gradually, while milk fat percentage and milk protein percentage increased slowly. Milk solid content and the day of peak milk yield reached the highest level when somatic cell score was 4 and 5, respectively.

      Conclusion 

      The results of this study provide a theoretical basis for improving the lactation performance and fresh milk quality of Holstein in Ningxia.

    • 植物内生真菌(Endophytic fungus)是指那些生活史的部分阶段或全部生活于健康植物组织或器官内部,且在长期的协同进化过程中与宿主植物形成互惠共生关系的一类真菌[1-2]。内生真菌与宿主植物形成的这种互惠共生关系为研究者从植物内生真菌次生代谢产物中寻找新型的天然活性先导物提供了新的方向[3]。近年来,内生真菌次生代谢产物的研究越来越受到人们的重视,尤其是从短叶红豆杉Taxus brevifolia韧皮部分离到产紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae后,掀起了人们对内生真菌次生代谢产物研究的热潮[4-5]。内生真菌作为一种新型的天然活性物质资源宝库,能够产生多种结构新颖的次生代谢产物,其具有抗菌、杀虫、抗氧化、抗肿瘤以及促进植物生长和提高植物抗病性等多种生物活性,从植物内生真菌中寻找具有开发潜能的生物活性物质引起了人们极大的兴趣[6-9]

      目前对于桉树内生真菌及其次生代谢产物的研究多集中在内生真菌的生理学和生态学作用方面。谢安强等[10-12]研究发现桉树内生真菌能够显著提高桉树的抗逆能力,如促进植株对磷的吸收能力,提高桉树的抗寒能力,促进植株的光合作用效能等。Kharwar等[13]从柠檬桉Eucalyptus citriodora中分离得到的曲霉属Aspergillussp.和毛壳菌属Chaetomiumsp.内生真菌表现出较强的抗真菌和抗细菌活性。格希格图等[14]从不同桉树根部分离到的内生真菌对桉树青枯病菌Ralstonia solanacearum有不同程度的拮抗作用,其中以大叶桉Eucalyptus robusta内生真菌的抗菌活性最为明显。Mohali等[15]从桉树和金合欢Acacia farnesiana中分离到2株新的内生真菌Fusicoccum sp.,但并未对其次生代谢产物的生物活性进行研究。华南农业大学林学与风景园林学院森林保护教研室的前期研究表明,窿缘桉Eucalyptus exserta果实内生真菌Eef-10表现出较好的抗桉树青枯病菌活性[16],本文在前期研究的基础上,以内生真菌Eef-10为研究对象,通过形态学和分子生物学相结合的方法确定其分类地位,同时分离和鉴定内生真菌Eef-10中的活性成分,并测定其抗细菌和抗肿瘤细胞活性,以期为内生真菌资源的开发和利用提供理论依据。

      内生真菌Eef-10分离自健康的窿缘桉果实,目前保藏于华南农业大学林学与风景园林学院植物和微生物健康实验室。

      供试细菌包括大肠埃希菌Escherichia coli(G-)、根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens(G-)、黄瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans(G-)、桉树青枯病菌Ralstonia solanacearum(G-)和番茄疮痂病菌Xanthomonas vesicatoria(G-),以上菌株均保藏于华南农业大学林学与风景园林学院植物和微生物健康实验室。

      供试细胞株系为肝癌细胞(Hep-G2)和宫颈癌细胞(HeLa),供试肿瘤细胞由中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所提供。

      核磁共振波谱仪(Bruker Avance-600,美国Bruker公司),半制备型液相色谱仪(泵:UC-3281,紫外检测器:UC-3292S,上海Welch公司),分析型液相色谱仪(LC-10F,天津博纳艾杰尔科技有限公司),三用紫外仪(ZQ-1,上海安亭科学仪器厂),超净工作台(SW-CJ-2G,苏州净化设备有限公司),生化培养箱(LRH-250,上海一恒科技有限公司)。

      Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞士GE Heaithcare公司),GF254薄层层析硅胶和正相柱层析硅胶(青岛化工有限公司),硫酸链霉素(w=98%,上海麦克林生化科技有限公司),噻唑蓝(MTT)生物显色剂(w=98%,美国Amresco公司),喜树碱(w≥99%,上海麦克林生化科技有限公司),真菌基因组DNA抽提试剂盒 [生工生物工程(上海)股份有限公司],甲醇、二甲基亚砜、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和石油醚(分析纯,天津富宇精细化工厂),甲醇(色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司),氘代氯仿、氘代丙酮(巴斯夫化学有限公司)。

      采用形态学和分子生物学相结合的方法对内生真菌Eef-10进行鉴定。

      用灭菌牙签挑取PDA培养基上菌落边缘生长旺盛的菌丝,接种于新的PDA培养基中,置于生化培养箱中培养7~10 d,然后用生物显微镜观察菌丝、有性孢子和产孢结构等特征,参照Sekhar等[17]对内生真菌Eef-10进行形态学鉴定。

      参照单体江等[18]的方法对内生真菌Eef-10进行分子生物学鉴定。将纯化后的内生真菌Eef-10(在PDA培养基上生长5 d)接种到PDB培养基中,28 ℃、150 r/min条件下振荡培养5 d,分液漏斗过滤后收集菌丝,用液氮进行充分研磨至粉末状,采用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取其总DNA,使用真菌的通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增其ITS序列。PCR反应体系(50 μL):去离子水21 μL,2×Taq PCR MasterMix(含染料)25 μL,ITS4(10 μmol/L)1 μL,ITS5(10 μmol/L)1 μL,模板DNA(10 ng/ μL)2 μL;PCR扩增程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min 20 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序成功的ITS序列提交至GenBank数据库,获得登录号。通过在NCBI网站上进行BLAST,下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列,使用MAFTT version 7处理后,用MEGA6软件采用最大似然法构建系统发育树。

      采用大米固体培养基对内生真菌Eef-10进行大规模发酵。首先从4 ℃冻存管中挑取少许Eef-10菌丝接种到PDA平板上活化培养5~7 d,再将其菌丝接种在500 mL装有200 mL PDB培养基的三角瓶中,置于28 ℃、150 r/min条件下振荡培养3~5 d。将获得的液体种子接入已灭菌的大米培养基中,共发酵6 kg,28 ℃条件下暗培养60 d,以确保菌丝将大米培养基营养消耗完毕。而后将发酵好的固体发酵物用甲醇冷浸提取3次,每次7 d,减压浓缩后水混悬,依次用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取,分别得到石油醚层和乙酸乙酯层粗提物。

      乙酸乙酯层提取物(51.40 g)经减压硅胶柱层析,先用石油醚洗脱,再用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,通过薄层层析合并成A~D 4个部分。其中B部分(25.19 g)再经减压硅胶柱层析,采用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,通过薄层层析合并成11个馏分,分别编号为B1~B11。B4馏分(2.9 g)经Sephadex LH-20柱层析(三氯甲烷︰甲醇体积比为1︰1),通过薄层层析检测后合并为7个组分,分别编号为B4-1~B4-7。B4-7(30 mg)经semi-HPLC(甲醇︰水体积比为 65︰35,流速5 mL/min,λ = 210 nm,进样体积为0.1 mL)制备,得到化合物Ⅰ(4.5 mg)和化合物Ⅱ(5.5 mg)。B6馏分(9.5 g),经Sephadex LH-20(三氯甲烷︰甲醇体积比为1︰1)柱层析,通过薄层层析检测后合并成6个组分,编号为B6-1~B6-6。其中B6-3(95 mg)经semi-HPLC(甲醇︰水体积比为50︰50,流速5 mL/min,λ = 210 nm,进样体积为0.1 mL)制备,得到化合物Ⅲ(30 mg)。

      单体化合物的结构主要通过1H NMR、13C NMR等波谱学数据进行鉴定,并与文献比对后确定。

      抗细菌活性的测定参照刘志强等[19]的方法,精密称取单体化合物Ⅰ~Ⅲ各2.0 mg分别溶于0.3 mL丙酮中,再加入0.7 mL蒸馏水,配成质量浓度为2 000 μg/mL的母液,然后用φ为30%的丙酮溶液依次稀释成质量浓度为2 000.000、1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg/mL的样品溶液。阳性对照为硫酸链霉素,采用相同的方法配成质量浓度为500.000 00、250.000 00、125.000 00、62.500 00、31.250 00、15.625 00、7.812 50、3.906 25 μg/mL的溶液,备用。在无菌的96微孔板中加入106 CFU/mL的供试菌液90 μL,然后加入不同浓度的测试样品溶液10 μL。同时设空白对照(H2O)和溶剂对照(φ为30%的丙酮溶液),每处理6个重复。用封口膜将96微孔板四周封口,于28 ℃、黑暗条件下振荡(15 r/min)培养24 h,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),继续培养4 h后,以3 000 r/min 离心20 min,去上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL,振荡(15 r/min)30 min,为了测定半抑制浓度(IC50),多孔板离心后,每孔取100 μL,于510 nm 下测定吸光度(D510 nm)。按下面公式计算待测样品对供试细菌的抑制率:

      $${\text{抑制率}} = \frac{{{\text{溶剂对照孔}}{D_{510\;{\rm{nm}}}} - {\text{药液孔}}{D_{510\;{\rm{nm}}}}}}{{{\text{溶剂对照孔}}{D_{510\;{\rm{nm}}}}}} \times 100\% {\text{。}}$$

      所得数据采用 Microsoft excel 软件进行分析,供试样品浓度取对数(X),抑制率换算成概率值(Y),求得抑制活性回归方程(Y = aX+b)和半抑制浓度(IC50)。

      抗肿瘤细胞活性的测定参照Ouyang等[20]的方法,阳性对照为喜树碱。将对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板(Nest)中,待6~8 h后细胞贴壁。用含有5%(w)FBS(Gibco)的DMEM(Hyclone)细胞培养基将化合物以2倍梯度稀释,共制备8个梯度(质量浓度分别为80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 μg/mL)备用。小心吸弃各孔内原生长培养基后,将制备好的各浓度化合物分别加入对应孔中,每孔200 μL,每个化合物每个浓度设置4组重复孔。对照孔加入相应浓度的DMSO。在37 ℃,φ(CO2)为5%条件下,化合物与细胞继续共培养48 h。每孔加入CCK8试剂15 μL,在37 ℃、φ(CO2)为5%条件下继续培养4 h后,采用多功能微孔板检测仪在450 nm下检测各孔的吸光度(D450 nm),记录并保存数据。采用GraphPad Prism 5拟合各化合物在各细胞株的生长抑制曲线并计算其IC50值。

      内生真菌Eef-10的菌落和显微形态如图1所示。在PDA培养基上,菌落呈规则圆形(图1a),气生菌丝发达,绒毛状,初始时菌落白色,后期菌落颜色逐渐变灰,且随时间延长而逐渐加深,培养7 d后可布满整个培养皿(d = 7.5 cm)。在显微镜下观察发现,菌丝有隔(图1b),内含多个油滴,菌丝后期颜色较深且粗细不均,隔间距缩短;子囊果近球形(图1d),有孔口;附属丝较长,呈菌丝状,有隔,周生于子囊果且大部分集中生长于子囊果顶部;子囊孢子灰褐色(图1c),单孢,卵圆形,光滑,长×宽平均为7.0 μm×5.5 μm,有顶生萌发孔;与毛壳菌属Chaetomium的特征相一致[17, 21]

      图  1  内生真菌Eef-10的菌落(a)、菌丝(b)、子囊孢子(c)和子囊果(d)
      Figure  1.  Colony (a), mycelium (b), ascospore (c) and ascoma (d) of endophytic fungus Eef-10

      进一步通过真菌通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,获得大小为592 bp的目的序列,将该目的序列提交至GenBank,获得登录号MK120863。在GenBank数据库中进行同源性比对,采用最大似然法通过MEGA 6构建系统发育树(图2)。从图2可以看出,内生真菌Eef-10与Chaetomium sp.(登录号:KU504294.1)聚在同一支上,其最大相似度为99.82%,结合形态学特征最终将内生真菌Eef-10确定为子囊菌门Ascomycota核菌纲Pyrenomycetes粪壳目Sordariales毛壳菌科Chaetomiaceae毛壳菌属Chaetomium sp.真菌。

      图  2  依据内生真菌Eef-10的rDNA-ITS 序列构建的系统发育树
      Figure  2.  Phylogenetic tree of endophytic fungus Eef-10 based on rDNA-ITS sequence

      通过1H NMR、13C NMR等波谱学数据以及与文献比对,确定了3种化合物的结构(图3)。

      图  3  化合物Ⅰ~Ⅲ的结构
      Figure  3.  The structures of compounds Ⅰ-Ⅲ

      化合物Ⅰ,淡黄色固体,1H NMR谱在δH6.20 (1H, s)处有1个苯基质子信号,在δH2.09 (3H, s)和2.46 (3H, s)处有2个苯甲基质子信号,在δH3.91 (3H, s)处有1个甲氧基质子信号,δH 12.06 (1H, s)和 5.14 (1H, s)表明其结构中含有2个羟基信号,而且13C NMR谱中的2个芳香族碳信号δC163.37和158.20进一步支持了苯环在C-2和C-4处的氧化;通过1H NMR谱的相关信息及13C NMR谱δC163.37,158.20,140.39,110.75,108.70,105.46可以推导其结构中含有1个五取代苯环;13C NMR谱在δ 172.83处表明其结构中含有1个羰基。化合物Ⅰ的1H NMR (600 MHz,CDCl3)δH:12.06 (1H,s,2-OH),6.20 (1H,s,H-5),5.14 (1H,s,5-OH),3.91 (3H,s,H-1'),2.45 (3H,s,H-6),2.10 (3H,s,H-3);13C NMR (151 MHz,CDCl3) δC:172.83 (C-7),163.37 (C-2),158.20 (C-4),140.39 (C-6),110.75 (C-5),108.70 (C-3),105.46 (C-1),52.08 (C-1'),24.36 (C-6),7.89 (C-3)。上述数据与文献[22]数据一致,故将化合物Ⅰ鉴定为2, 4−二羟基−3, 6−二甲基苯甲酸甲酯(Methyl 2, 4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate,即Atraric acid)(图3a)。

      化合物Ⅱ,白色固体,化合物Ⅱ的1H NMR谱和13C NMR谱与化合物Ⅰ数据非常接近,基本骨架一致,1H NMR谱中δH1.40 (t,J = 7.1 Hz,3H),4.38 (q,J = 7.1 Hz,2H)信号,表明其结构中含有1个R—CH2—CH3信号。化合物Ⅱ的1H NMR (600 MHz,CDCl3)δH:12.14 (1H,s,2-OH),6.19 (1H,s,H-5),5.18 (1H,s,5-OH),4.38 (2H,q,J= 7.1 Hz,H-1′),2.46 (3H,s,H-6),2.09 (3H,s,H-3),1.40 (3H,t,J= 7.1 Hz,H-2′);13C NMR (151 MHz,CDCl3) δC:172.17 (C-7),163.18(C-2),158.01 (C-4),140.18 (C-6),110.53 (C-5),108.55 (C-3),105.28(C-1),61.22(C-1′),24.23(C-6),14.26(C-2′),7.67(C-3)。上述数据与文献[23]数据一致,最终化合物Ⅱ鉴定为2, 4−二羟基−3, 6−二甲基苯甲酸乙酯(Ethyl 2, 4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate)(图3b)。

      化合物Ⅲ,无色油状液体,化合物Ⅲ的1H NMR (600 MHz,Acetone-d6) δH:5.71(1H, s,H-3),4.32 (2H,t,J = 6.2 Hz,H-6),2.42 (2H,t,J = 6.2 Hz,H-5),2.01(3H,s,H-7);13C NMR (151 MHz,Acetone-d6)δC:164.55 (C-2),159.51 (C-4),116.95 (C-3),66.64 (C-6),29.75 (C-5),22.87(C-7)。上述数据与参考文献[24]数据基本一致,所以化合物Ⅲ鉴定为4−甲苯−5, 6−二氢−2H−吡喃−2−酮(4-methyl-5, 6-dihydro-2H-pyran-2-one)(图3c)。

      内生真菌Eef-10次生代谢产物对5种供试细菌的抑制活性如表1所示。其中化合物Ⅲ在供试浓度下对5种供试细菌的IC50均大于200 μg/mL;化合物Ⅱ对所有供试细菌的抑制活性均强于化合物Ⅰ,其中对桉树青枯病菌的抑制活性最强,其IC50为35.87 μg/mL,与阳性对照硫酸链霉素非常接近,其次是对黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌的抑制活性,其IC50分别为38.91和 40.80 μg/mL,对大肠埃希菌和根癌土壤杆菌的抑制活性较弱;化合物Ⅰ对黄瓜角斑病菌的抑制活性最强,其IC50为67.25 μg/mL,其次是对番茄疮痂病菌的抑制活性,其IC50为93.59 μg/mL,而对其他供试细菌的IC50均大于100 μg/mL。

      表  1  内生真菌Eef-10次生代谢产物的抗细菌活性
      Table  1.  Antibacterial activities of the secondary metabolites isolated from endophytic fungus Eef-10
      供试样品
      Tested sample
      IC50/(μg·mL−1)
      大肠埃希菌
      Escherichia
      coli
      根癌土壤杆菌
      Agrobacterium
      tumefaciens
      黄瓜角斑病菌
      Pseudomonas
      lachrymans
      桉树青枯病菌
      Ralstonia
      solanacearum
      番茄疮痂病菌
      Xanthomonas
      vesicatoria
      化合物Ⅰ Compound Ⅰ 130.55 ± 3.57 105.39 ± 4.52 67.25 ± 1.23 113.11 ± 3.58 93.59 ± 0.43
      化合物Ⅱ Compound Ⅱ 48.52 ± 0.33 55.50 ± 1.61 38.91 ± 0.54 35.87 ± 0.18 40.80 ± 0.70
      化合物Ⅲ Compound Ⅲ > 200 > 200 > 200 > 200 > 200
      硫酸链霉素 Streptomycin sulfate 18.51 ± 0.46 5.10 ± 0.03 30.54 ± 0.89 33.07 ± 2.46 13.81 ± 1.62
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      抗肿瘤细胞活性的测定结果如表2所示,通过GraphPad Prism 5拟合各化合物在各细胞株的生长抑制曲线计算其IC50,除化合物Ⅱ之外,其他化合物对2种肿瘤细胞的IC50均大于50 μg/mL;化合物Ⅱ对HeLa细胞的IC50大于50 μg/mL,但对Hep-G2的IC50仅为1.50 μg/mL,明显强于阳性对照喜树碱的3.6 μg/mL,表明化合物Ⅱ对Hep-G2肿瘤细胞具有较好的生长抑制作用。

      表  2  内生真菌Eef-10次生代谢产物的抗肿瘤细胞活性
      Table  2.  Antitumor activities of the secondary metabolites isolated from endophytic fungus Eef-10
      供试细胞Tested cell IC50/(μg·mL−1)
      化合物Ⅰ
      Compound Ⅰ
      化合物Ⅱ
      Compound Ⅱ
      化合物Ⅲ
      Compound Ⅲ
      喜树碱
      Camptothecin
      Hep-G2 > 50 1.50 > 50 3.6
      HeLa > 50 > 50 > 50 6.3
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      本研究以分离和鉴定抗细菌和抗肿瘤的活性化合物为导向,从窿缘桉内生真菌Chaetomium sp. Eef-10中共分离出3个化合物,包括2个苯酚类和1个戊烯酸内酯类化合物。前人的研究表明,化合物Ⅰ(Atraric acid)是一种天然的雄激素受体拮抗剂,主要应用于前列腺癌的治疗[25-26],该化合物曾在地衣植物Parmotrema cooperi[27]Lecidella carpathica[28]Pseudevernia furfuracea[22]以及地钱植物Frullania brasiliensis[29]、非洲臀果木Pygeum africanum[23]和紫葳科植物Newbouldia laevis[30]中被发现和报道,而有关化合物Ⅱ的研究却很少,一般是作为Atraric acid衍生物的形式被报道,但化合物Ⅱ对雄激素受体的拮抗作用甚至略高于Atraric acid,亦可作为抗前列腺癌优先级的候选药物[31]。本研究中活性测定的结果显示,化合物Ⅱ表现出较好的抗细菌活性,其中对桉树青枯病菌的抑制活性最强,IC50为35.87 μg/mL,与阳性对照结果相当,且化合物Ⅱ对Hep-G2肿瘤细胞也具有较好的抑制作用,研究结果为寻找抗桉树青枯病菌天然微生物源活性药物提供了新的思路。

      致谢:感谢华南农业大学农学院谢辉和徐春玲老师在内生真菌形态学鉴定方面提供的帮助!

    • 图  1   乳脂率、乳蛋白率、乳糖率及乳固形物含量在不同体细胞评分中的变化规律

      Figure  1.   Changes of milk fat percentage, milk protein percentage, milk lactose percentage and milk solid content along with the variation of somatic cell score

      图  2   日产奶量和高峰奶量在不同体细胞评分中的变化规律

      Figure  2.   Changes of daily milk yield and peak milk yield along with the variation of somatic cell score

      图  3   泌乳高峰日和脂蛋比在不同体细胞评分中的变化规律

      Figure  3.   Changes of the day of peak milk yield and fat to protein ratio along with the variation of somatic cell score

      表  1   宁夏地区荷斯坦牛泌乳性状表型参数描述性统计

      Table  1   Descriptive statistics of phenotypic parameters of Holstein cow’s lactation in Ningxia region

      性状 Trait 数据量 Data amount 平均值 ${\bar x}$ 标准误 σ 最大值 Max. 最小值 Min.
      日产奶量/kg Daily milk yield 17796 32.18 0.082 70.60 5.00
      乳脂率/% Milk fat percentage 17796 3.73 0.007 7.94 1.02
      乳蛋白率/% Milk protein percentage 17796 3.32 0.003 4.69 2.03
      脂蛋比 Fat to protein ratio 17796 1.12 0.002 3.09 0.28
      体细胞评分 Somatic cell score 17796 2.71 0.013 9.00 0.00
      乳糖率/% Milk lactose percentage 17796 4.89 0.002 5.46 2.44
      乳固形物含量/% Milk solid content 17796 12.42 0.009 18.76 8.74
      高峰奶量/kg Peak milk yield 17388 42.97 0.082 80.00 18.60
      泌乳高峰日/d The day of peak milk yield 17388 80.84 0.446 305.00 1.00
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      表  2   胎次、泌乳时期和产犊季节与观察的9项性状之间的方差分析(P值)

      Table  2   The variance analysis between parity, lactation stage, calving season and observed nine traits (P value)

      性状
      Trait
      胎次
      Parity
      泌乳时期
      Lactation
      stage
      产犊季节
      Calving
      season
      胎次×泌乳时期
      Parity×
      Lactation stage
      胎次×产犊季节
      Parity×
      Calving season
      泌乳时期×产犊季节
      Lactation stage ×
      Calving season
      日产奶量 Daily milk yield <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0101 <0.0001
      乳脂率 Milk fat percentage <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.1760 0.0425 <0.0001
      乳蛋白率 Milk protein percentage <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0667 0.1044 <0.0001
      脂蛋比 Fat to protein ratio <0.0001 <0.0001 0.0099 0.0446 0.2821 <0.0001
      体细胞评分 Somatic cell score <0.0001 <0.0001 0.0416 <0.0001 0.1861 <0.0001
      乳糖率 Milk lactose percentage <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.2664 <0.0001
      乳固形物含量 Milk solidcontent <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0081 0.0019 <0.0001
      高峰奶量 Peak milk yield <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.1177 <0.0001
      泌乳高峰日 The day of peak milk yield <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
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      表  3   不同胎次泌乳性状的最小二乘均值1)

      Table  3   Least square means of lactation traits in different parities

      性状
      Trait
      1胎次 1st parity 2胎次 2nd parity 3胎次 3rd parity 4胎次 4th parity 5胎次 5th parity
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      日产奶量/kg Daily milk yield 30.37±0.129a 7061 33.83±0.140b 5610 32.00±0.181c 3585 35.06±0.301d 1292 34.54±0.688bd 3585
      乳脂率/% Milk fat percentage 3.67±0.011a 7061 3.79±0.012b 5610 3.77±0.016bc 3585 3.72±0.026ac 1292 3.62±0.059a 248
      乳蛋白率/% Milk protein percentage 3.30±0.005a 7061 3.35±0.005b 5610 3.35±0.006b 3585 3.30±0.011a 1292 3.25±0.025c 248
      脂蛋比 Fat to protein ratio 1.12±0.003a 7061 1.13±0.004b 5610 1.13±0.005ab 3585 1.13±0.008ab 1292 1.12±0.017ab 248
      体细胞评分 Somatic cell score 2.57±0.021a 7061 2.70±0.023b 5610 2.92±0.029c 3585 2.83±0.048c 1292 3.26±0.110d 248
      乳糖率/% Milk lactose percentage 4.96±0.003a 7061 4.86±0.003b 5610 4.84±0.004c 3585 4.86±0.007b 1292 4.86±0.016bc 248
      乳固形物含量/% Milk solid content 12.39±0.014a 7061 12.51±0.016b 5610 12.43±0.020a 3585 12.37±0.033a 1292 12.13±0.075c 248
      高峰奶量/kg Peak milk yield 37.03±0.111a 6842 46.66±0.124b 5497 47.20±0.154c 3533 46.96±0.257bc 1274 44.39±0.589d 242
      泌乳高峰日/d The day of
      peak milk yield
      94.07±0.699a 6842 72.87±0.780b 5497 73.32±0.973b 3533 67.33±1.620c 1274 68.55±3.716bc 242
       1) 同行数据后的不同小写字母表示不同胎次间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
       1) Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among different parities (P<0.05, Duncan’s method)
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      表  4   泌乳性状在不同泌乳时期的最小二乘均值1)

      Table  4   Least square means of lactation traits in different lactation stages

      性状
      Trait
      胎次
      Parity
      泌乳前期 Early lactation 泌乳中期 Mid lactation 泌乳后期 Late lactation
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data amount
      日产奶量/kg Daily milk yield 1 31.73±0.179a 3585 31.67±0.202a 3585 28.27±0.167b 3585
      2 41.54±0.248a 1662 35.81±0.239b 1791 26.24±0.218c 2157
      3 39.50±0.362a 854 33.87±0.298b 1257 26.07±0.275c 1474
      乳脂率/% Milk fat percentage 1 3.59±0.018a 2407 3.53±0.021b 1888 3.85±0.017c 2766
      2 3.64±0.023a 1662 3.73±0.022b 1791 3.94±0.020c 2157
      3 3.64±0.033a 854 3.70±0.027a 1257 3.91±0.025b 1474
      乳蛋白率/% Milk protein percentage 1 3.11±0.007a 2407 3.30±0.008b 1888 3.46±0.007c 2766
      2 3.11±0.008a 1662 3.34±0.008b 1791 3.54±0.007c 2157
      3 3.09±0.012a 854 3.34±0.010b 1257 3.52±0.009c 1474
      脂蛋比 Fat to protein ratio 1 1.16±0.005a 2407 1.07±0.006b 1888 1.11±0.005c 2766
      2 1.18±0.007a 1662 1.12±0.006b 1791 1.11±0.006b 2157
      3 1.19±0.009a 854 1.11±0.008b 1257 1.11±0.007b 1474
      体细胞评分 Somatic cell score 1 2.49±0.034a 2407 2.35±0.038b 1888 2.80±0.032c 2766
      2 2.11±0.041a 1662 2.52±0.039b 1791 3.30±0.036c 2157
      3 2.37±0.059a 854 2.85±0.048b 1257 3.30±0.045c 1474
      乳糖率/% Milk lactose percentage 1 4.98±0.005a 2407 4.99±0.005a 1888 4.91±0.004b 2766
      2 4.94±0.006a 1662 4.88±0.006b 1791 4.79±0.005c 2157
      3 4.93±0.009a 854 4.87±0.007b 1257 4.76±0.007c 1474
      乳固形物含量/% Milk solid content 1 12.15±0.023a 2407 12.25±0.026b 1888 12.69±0.021c 2766
      2 12.22±0.029a 1662 12.48±0.028b 1791 12.75±0.025c 2157
      3 12.06±0.041a 854 12.37±0.034b 1257 12.70±0.032c 1474
       1) 同行数据后的不同小写字母表示不同泌乳时期间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
       1) Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among different lactation stages (P<0.05, Duncan’s method)
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      表  5   泌乳性状在不同产犊季节的最小二乘均值1)

      Table  5   Least square means of lactation traits in different calving seasons

      性状
      Trait
      胎次
      Parity
      春季 Spring 夏季 Summer 秋季 Autumn 冬季 Winter
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      ${\bar{\boldsymbol x}}$±σ 数据量
      Data
      amount
      日产奶量/kg
      Daily milk
      yield
      1 28.12±0.217a 1633 29.23±0.259b 1155 30.77±0.214c 1691 32.03±0.173d 2582
      2 31.46±0.349a 1022 27.13±0.361b 959 32.79±0.278c 1612 39.04±0.249d 2017
      3 30.93±0.460a 585 26.19±0.377b 871 32.21±0.323c 1186 37.79±0.362d 943
      乳脂率/%
      Milk fat
      percentage
      1 3.92±0.022a 1633 3.74±0.026b 1155 3.65±0.022c 1691 3.50±0.018d 2582
      2 3.95±0.029a 1022 3.89±0.030a 959 3.81±0.023b 1612 3.63±0.021c 2017
      3 3.97±0.040a 585 3.91±0.033a 871 3.76±0.028b 1186 3.54±0.031c 943
      乳蛋白率/%
      Milk protein
      percentage
      1 3.30±0.009a 1633 3.42±0.011b 1155 3.36±0.009c 1691 3.20±0.007d 2582
      2 3.38±0.011a 1022 3.53±0.012b 959 3.40±0.009a 1612 3.21±0.008c 2017
      3 3.36±0.015a 585 3.51±0.013b 871 3.39±0.011a 1186 3.16±0.012c 943
      脂蛋比
      Fat to
      protein ratio
      1 1.20±0.007a 1633 1.09±0.008b 1155 1.09±0.006b 1691 1.10±0.005b 2582
      2 1.18±0.008a 1022 1.10±0.009b 959 1.12±0.007bc 1612 1.13±0.006cd 2017
      3 1.19±0.011a 585 1.11±0.009b 871 1.11±0.008b 1186 1.12±0.009b 943
      体细胞评分
      Somatic
      cell score
      1 2.78±0.041a 1633 2.80±0.049a 1155 2.44±0.041b 1691 2.43±0.033b 2582
      2 2.84±0.054a 1022 3.21±0.056b 959 2.74±0.043a 1612 2.36±0.038c 2017
      3 2.85±0.072a 585 3.29±0.059b 871 2.97±0.050a 1186 2.56±0.056c 943
      乳糖率/%
      Milk lactose
      percentage
      1 4.91±0.006a 1633 4.95±0.007b 1155 4.97±0.006b 1691 4.98±0.005c 2582
      2 4.83±0.008a 1022 4.81±0.008b 959 4.85±0.006a 1612 4.91±0.006c 2017
      3 4.80±0.011a 585 4.77±0.009a 871 4.84±0.008b 1186 4.93±0.009c 943
      乳固形物含量/%
      Milk solid
      content
      1 12.64±0.028a 1633 12.51±0.033b 1155 12.44±0.028b 1691 12.13±0.022c 2582
      2 12.69±0.037a 1022 12.69±0.038a 959 12.61±0.029a 1612 12.25±0.026b 2017
      3 12.62±0.050a 585 12.69±0.041a 871 12.49±0.035b 1186 11.99±0.039c 943
      高峰奶量/kg
      Peak milk
      yield
      1 35.12±0.201a 1528 38.63±0.232b 1143 37.88±0.193c 1646 36.90±0.156d 2525
      2 44.55±0.306a 975 46.06±0.311b 945 48.09±0.239c 1600 46.83±0.215d 1 977
      3 44.88±0.426a 556 47.93±0.342b 861 48.85±0.292c 1182 45.82±0.329a 934
      泌乳高峰日/d
      The day of peak
      milk yield
      1 68.78±1.515a 1528 146.45±1.752b 1143 112.54±1.460c 1646 73.62±1.179d 2525
      2 62.56±1.656a 975 104.79±1.682b 945 75.99±1.293c 1600 60.18±1.163a 1 977
      3 57.19±2.039a 556 96.99±1.638b 861 75.00±1.398c 1182 58.96±1.573a 934
       1) 同行数据后的不同小写字母表示不同季节间差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
       1) Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among different seasons (P<0.05, Duncan’s method)
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      表  6   泌乳性状之间的Pearson相关系数1)

      Table  6   Pearson correlation coefficient between lactation traits

      性状 Trait DMY MFP MPP FPR SCS MLP MSC PMY DPMY
      日产奶量 Daily milk yield (DMY) 1.000
      乳脂率 Milk fat percentage (MFP) −0.158* 1.000
      乳蛋白率 Milk protein percentage (MPP) −0.362* 0.423* 1.000
      脂蛋比 Fat to protein ratio (FPR) 0.012* 0.881* −0.042* 1.000
      体细胞评分 Somatic cell score (SCS) −0.240* 0.076* 0.183* −0.006 1.000
      乳糖率 Milk lactose percentage (MLP) 0.261* −0.125* −0.176* −0.050* −0.394* 1.000
      乳固形物含量 Milk solid content (MSC) −0.198* 0.896* 0.625* 0.663* 0.020* −0.029* 1.000
      高峰奶量 Peak milk yield (PMY) 0.404* 0.069* −0.050* 0.099* −0.006 −0.138* 0.060* 1.000
      泌乳高峰日 The day of peak milk yield (DPMY) −0.045* 0.007 0.059* −0.022* 0.055* 0.029* 0.004 −0.204* 1.000
       1)“*”表示显著相关(P<0.05)
       1)“*”indicates significant correlation (P<0.05)
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    出版历程
    • 收稿日期:  2020-05-13
    • 网络出版日期:  2023-05-17
    • 刊出日期:  2021-03-09

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