Preparation of a thermo-sensitive gel uterine perfusate and drug concentration monitoring
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摘要:目的
研制一种多西环素温敏型原位凝胶子宫灌注液，并对其进行质量评价及子宫内药物浓度的监测。
方法以泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)为主要温敏材料，采用“冷法”工艺制备原位凝胶。采用单因素分析和正交试验对处方进行筛选与优化，通过无膜溶出模型考察制剂体外溶蚀和释药情况，并在高温、高湿、强光等条件下对研制的温敏凝胶稳定性进行考察。选用5头二元杂交母猪对制剂进行子宫内药物浓度的监测。
结果最终优化处方为50 g制剂含多西环素1 g、P407 10 g、P188 2.5 g、氯化镁2.3 g和亚硫酸氢钠0.1 g，用乙醇胺调pH至4.0±0.2，余量为超纯水。制剂体外溶蚀及释药时间长达48 h，累积溶蚀率和释药率均达100%。制剂稳定性符合兽用化学药物稳定性研究技术指导原则的要求，在第2次给药96 h后母猪子宫内药物浓度仍能保持在68.54 μg/mL。
结论多西环素温敏型原位凝胶子宫灌注液制备方法简单，性质稳定，猪子宫灌注给药后局部药物浓度长时间维持在较高水平，具有缓释效果，有望为临床治疗母猪子宫内膜炎开创新途径。
Abstract:ObjectiveTo prepare a doxycycline thermo-sensitive in situ gel uterine perfusate, evaluate its quality, and monitor drug concentration in sow uterus.
MethodPoloxamer 407 (P407) and poloxamer 188 (P188) were used as the main thermo-sensitive materials. The in situ gel was prepared by “cold” process. The prescription was screened and optimized by single factor analysis and orthogonal experiment. The in vitro dissolution and drug release of the preparation were measured by membrane free dissolution model. The stability of the developed thermo-sensitive gel was investigated under the conditions of high temperature, high humidity and strong light. Five binary hybrid sows were selected to monitor drug concentration in sow uterus.
ResultThe final optimized prescription was doxycycline 1 g, P407 10 g, P188 2.5 g, magnesium chloride 2.3 g and sodium bisulfite 0.1 g in per 50 g preparation, pH was adjusted to 4.0±0.2 with ethanolamine, and the residue was ultrapure water. The in vitro dissolution and drug release time of the preparation lasted for 48 h, the cumulative dissolution rate and drug release rate were up to 100%. The preparation stability was complied with technical guidelines for the stability of veterinary chemical drugs. The drug concentration remained at 68.54 μg/mL after 96 h of the second administration.
ConclusionThe doxycycline thermo-sensitive in situ gel uterine perfusate is a simple preparation method and shows good stability. The local concentration of the drug in sow uterus maintains at a high level for a long time. The preparation has a sustained release effect and is expected to be an innovative way to treat sow endometritis.
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Keywords:
- doxycycline /
- thermo-sensitive in situ gel /
- poloxamer solution /
- sow endometritis /
- slow release
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水稻是中国主要的粮食作物，而杂草又是水稻生产的主要制约因素。我国稻田化学除草面积约占种植面积的90%以上，长期、大量、高频施药会产生杂草抗药性、作物药害、环境污染等诸多负面问题[1-9]。机械除草作为一种环境友好型的绿色除草方式，可以有效缓解当前化学除草带来的危害[10]，符合国家提出的质量兴农、绿色兴农的农业产业发展方向。中国的水田机械特别是水田除草机械研究尚处在理论和试验研究阶段[11-21]，未能在生产中广泛应用；日本的研究机构和农机生产企业已经开发了一系列的水田除草机[22]，但价格昂贵，长期依赖日本的水稻生产机械将影响我国农业生产的战略安全，因此，迫切需要提高我国水稻机械除草关键技术和装备的自主研发水平。由于水田环境的复杂性和水稻种植的农艺特点，水稻生产中采用机械除草方式存在着伤苗率高、除草率低、适应性差等问题；而水稻种植的株距较小(机械化移栽株距10~17 cm)，株间机械除草技术更是水田机械除草的“瓶颈”问题。综上所述，鉴于水稻机械除草的重要性，针对水稻机械除草技术中的难点，本文对现有水稻机械除草技术研究现状进行了综述，以期发现尚待解决的关键技术问题，为水稻机械除草作业技术的研究提供参考和借鉴。
1. 水稻株间机械除草技术研究现状
有机农业的发展有力地带动了机械除草新技术的发展[23-49]。但是与行株间同步高效防除的化学除草技术相比，株间机械除草相对较低的除草率和工作效率仍然是制约机械除草大面积应用的“瓶颈”问题。当前以日本为代表的移栽水稻田常采用基于苗草根系差异特点的株间机械除草技术，该技术主要是根据作物与杂草根系深浅差异，控制除草部件工作深度，除去杂草但不损伤作物的除草技术。该技术无需对作物或杂草定位，工作效率高，但是除草率相对较低，除草作业时需要作物扎好根、作物苗龄一般“四叶期”以上。其关键部件主要可分为对转式、固定弹齿式和弹齿耙式等。
1)对转式株间除草部件：由1对相对转动的橡胶指盘、毛刷或者弹齿盘组成，主要对杂草进行拉拔和埋压，除草深度一般控制在10~30 mm。日本水稻生产机械化水平较高，一些农机企业已经开发出系列水田除草装备。日本美善株式会社研发的水田除草机乘坐式机型有4、5、8行3种机型，可同时完成行−株间除草作业，株间除草部件为1对地面驱动的伞状除草盘(图1)[50]。
图2为日本和同产业研发的步进式水稻中耕除草机，其行间除草部件为随动的除草辊，株间除草部件为1对驱动转动的弹齿盘，作业效率为0.4~0.6 hm2/h[51]。国内东北农业大学研究人员在此基础上设计了一种株间除草装置，通过钢丝软轴驱动弹齿盘转动，将土壤搅动、翻转连同杂草翻出地表并将其覆盖，完成除草作业[11,52-55]。
2)固定弹齿式株间除草部件：扭簧式株间除草部件是固定弹齿式除草部件中结构最简单的一种，由1对连接在固定机架上的扭转弹簧齿组成。弹簧齿由2个部分组成：垂直部分以一定角度指向土壤表面；水平部分指向作物。机具工作时，株间除草部件横跨在作物两侧，随着机具前进拖、拔或埋没株间杂草。日本三菱农机公司生产的水田除草机株间除草部件为固定在机架上的2组除草弹丝，工作原理与扭簧式株间除草部件相似，可通过调节倾斜角度和高度改变作业深度，通过调节内侧除草钢丝的上下位置调节除草弹丝组的作业强度[56]。日本Q-HOE公司是一家专门从事机械除草的生产和销售企业，其研发的同类型株间除草部件在水田和旱地都得到了较好的应用(图3)[57]。
齐龙等[58]发明了一种株间机械弹性触觉除草器，根据稻株与杂草的生物力学差异，利用板簧激振、扭簧摆动实现株间除草。由于固定弹齿式株间除草部件横跨在作物两侧工作，与作物非常接近，准确对行是减少伤苗率的关键。
3)弹齿耙式株间除草部件：主要由安装在固定机架上的弹簧耙齿组成，工作深度和强度的变化通过调节弹簧齿的工作角度和张紧力完成，可同时完成行−株间除草作业。研究表明弹齿耙可用于玉米、向日葵、菜豆、胡萝卜、洋葱、豌豆、扁豆、冬季谷类作物等大田杂草防控[59-62]，对阔叶型杂草的除草效果更好。为了减少对作物的损伤，应在作物苗期“四叶期”后进行机械除草。日本农研机构联合井关农机公司合作开发了弹性耙齿式水田除草机，株间除草率为40%~50%(图4)[63]。
2007年，日本农研机构联合井关、久保田等公司共同开发了高精度乘坐式水田除草机，行间除草部件为旋转耙齿，株间除草部件为摆动弹性耙齿(图5)[64]。该机具作业速度为0.4~0.6 m/s、行间作业深度40~60 mm、株间作业深度20~40 mm、作业时水深要求30~60 mm，机具工作时，驱动耙齿高速转动(100~200 r/min)除去行间杂草，利用左右摆动(频率3.7~7.3 Hz)的梳齿除去株间杂草，行间除草率大于85%，株间除草率为50%左右[65-66]。吴崇友等[13]研制的2BYS-6 型水田中耕除草机，其行间采用旋转部件，株间使用摆动部件除草，经鉴定相对除净率为78.1%。
2. 新型水稻机械除草装备研究现状
2014年，日本OREC公司发明了“Weedman”水田除草机(图6)[67]，并于2017年上市销售。该机具通过对转弹齿舀取深度约1 cm的株间土壤并将刮除的杂草混合到行间土壤中，再通过旋转铲刀式行间除草部件切割、掩埋杂草。这种除草机有3个优点：不仅可以在作物行间除草，在株间的除草效果也很好；通过将工作机放置在车身前，操作者可以直观地观测是否对行准确以减少伤苗率；通过4轮转向和4轮驱动，最大限度地减少田间稻苗损失。
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图 6 OREC公司研制的“Weedman”水田除草机Figure 6. “Weedman” weeding machine for paddy field developed by OREC company2015年，日本农研机构开发了一种三轮乘坐式高精度水田除草机(图7)[68]。在三轮式管理机中部搭载除草装置，除草装置可升降，行间采用旋转指齿除草，除草深度可调整为6级(1、2、3、4、5和6 cm)；株间采用摆动梳齿除草，除草深度可调整为3级(1、2和3 cm)，摆动继电器可根据杂草发生情况调节摆动频率。操作人员可以根据稻株和田间状况进行精准作业，工作速度是1.2 m/s，约为步行除草机(0.3 m/s)的4倍。二次作业的除草率达到80%以上，伤苗率小于3%，尾部结合链式除草部件，除草效果更好。与此机结构相似的还有实产业公司2016年研制的三轮水田除草机(图8)[69]，可同时作业8行，工作效率高；运输时除草部分可折叠，方便运输。
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图 7 农研机构研制的三轮水田除草机Figure 7. Tricycle weeding machine for paddy field developed by agricultural research institute![]()
图 8 实产业公司研制的三轮水田除草机Figure 8. Tricycle weeding machine for paddy field developed by real estate company日本秋田县立大学研制了一种水田除草机器人，如图9所示[70]。运用气垫船的原理向下喷气使其浮于水田表面，安装天线后可根据GPS自动导航行驶，按照预定路线或人为遥控进行水田除草。这种自动行走机器人采用柔性辊刷进行除草，使得刚发芽的杂草浮在水面上枯萎，可大幅度减少除草剂的使用。由于旋转的柔性辊刷可以一边进行行间、株间除草，一边在水田里纵、横、斜地自由行走，不需要像轮式除草机要到田边掉头转弯，因此具有高效率、低伤苗率的优点。
3. 结论与展望
3.1 结论
本文基于苗草根系差异特点的株间机械除草技术综述了国内外相关领域的研究现状，并介绍了新型水稻机械除草装备。通过对国内外行株间机械除草新技术的综述，尤其是水稻株间机械除草现状的分析发现，现有水田除草机的株间除草装置均不具备稻株或杂草的识别和定位功能，仅根据机械化移栽田水稻与杂草根系差异特点对水稻和杂草统一处理，株间除草率仅为60%左右[71]，需多次作业才能完成除草要求。然而多次作业不仅降低了生产效率，而且增加了机具对秧苗的碾压概率。因此，水稻株间机械除草技术的研究可借鉴智能株间除草技术，通过智能除草的优势来提高除草精度和除草效果。
3.2 展望
水稻智能除草技术的研究主要集中在基于作物行的视觉导航方面[71-79]，鲜见根据稻株位置精确控制智能除草机械进行株间除草作业的研究。要实现水稻株间智能化机械除草，提高除草率、降低伤苗率，今后需在一些机理和关键技术上做进一步的研究，具体包括：
1)稻株精确识别和定位方法研究。稻株精确识别和定位是智能株间机械除草作业的前提，由于除草期内相邻稻穴(株)间顶部叶冠已有部分遮叠、禾本科杂草与水稻形态相似、稻穴内稻株丛生、移栽时取秧量不同、生长过程中分蘖数不一以及气流引起的自然形变等对稻株的视觉识别精度影响很大。因此，应该根据水稻生长和种植的农艺特点，研究适合的稻株识别和定位方法。
2)小株距作物株间除草−避苗状态高速切换技术研究。由于机械化种植水稻株距较小，这就要求株间除草装置应具有较高的状态切换速度和工作平稳性。因此，应加强对株间除草装置工作机理的研究，探明影响除草装置工作性能的主要原因，优化除草装置的结构参数。
3)机械除草(触土)部件与水田土壤相互作用机理研究。除草部件主要通过对杂草周围水田土壤的扰动以及对杂草的直接机械作用实现去除杂草的目的，除草效果可以通过土壤的形变体现出来。由于水田土壤复杂的流变特性，通过土槽或田间试验很难观测到土壤颗粒的扰动程度、位移以及力场，因此需要采用先进的土壤−机器系统仿真方法，研究除草刀齿与水田土壤颗粒的相互作用过程，为除草刀齿结构和工作参数的优化提供理论基础。
研制高精度、高效率的智能水稻除草机是当今水稻机械除草研究急需攻关的技术难点，未来水田机械除草技术随着图像处理技术的不断更新和应用，这些问题将会得到解决，研制出定位精度高、作业速度快的智能水田除草机也将是未来水田机械除草技术发展的必然趋势。
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表 1 正交试验设计和结果1）
Table 1 Design and result of orthogonal experiment
试验号
Test number因素 Factor 多西环素含量变化/%
Doxycycline content change泊洛沙姆溶液
Poloxamer solution络合物摩尔比
Mole ratio
of complexw(亚硫酸氢钠)/%
Sodium bisulfite
contentpH w(P407)/% w(P188)/% 1 18 3 5∶1 0.10 pH0 1.83 2 18 3 3∶1 0.15 3.0 2.86 3 18 3 1∶1 0.20 4.0 1.50 4 20 5 5∶1 0.15 4.0 1.88 5 20 5 3∶1 0.20 pH0 1.82 6 20 5 1∶1 0.10 3.0 3.13 7 20 6 5∶1 0.20 3.0 1.03 8 20 6 3∶1 0.10 4.0 1.63 9 20 6 1∶1 0.15 pH0 4.33 平均值1/% Mean 1 2.063 1.580 2.197 2.660 平均值2/% Mean 2 2.277 2.103 3.023 2.340 平均值3/% Mean 3 2.330 2.987 1.450 1.670 极差 Range 0.267 1.407 1.573 0.990 1) 络合物摩尔比表示金属络合剂氧化镁与多西环素的摩尔比例；pH0表示初始pH；多西环素含量变化指制备试剂后第0天和第7天多西环素含量的差值；平均值1、2、3分别代表了4个考察因素为1、2、3水平时多西环素含量变化的平均值
1) Mole ratio of complex indicates mole ratio of metal complexing agent magnesium chloride to doxycycline; pH0 indicates initial pH; Doxycycline content change means doxycycline content difference between zero and seven days after preparing reagent; Mean 1, 2, 3 respectively indicate means of doxycycline content change of 1, 2, 3 levels of four factors
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表 2 多西环素温敏型原位凝胶子宫灌注液加速试验结果
Table 2 Results of acceleration test of doxycycline thermo-sensitive in situ gel uterine perfusate
批次
Batcht/d 性状
CharacterpH θ胶凝/℃
Gelling temperaturew(多西环素)/%
Doxycycline content1 0 淡黄色半固体凝胶
Pale yellow semi-solid gel4.04 29.9 99.91 30 4.05 30.3 98.90 60 4.02 30.0 99.14 90 4.02 30.1 99.86 180 4.03 30.2 99.74 2 0 淡黄色半固体凝胶
Pale yellow semi-solid gel4.05 30.1 99.84 30 4.01 30.2 98.83 60 4.03 30.0 99.12 90 4.02 29.8 99.83 180 4.02 30.2 98.67 3 0 淡黄色半固体凝胶
Pale yellow semi-solid gel4.02 30.4 99.10 30 4.03 30.1 98.63 60 4.01 30.3 98.39 90 4.01 30.3 99.27 180 4.02 30.1 98.58
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表 3 多西环素温敏型原位凝胶子宫灌注液长期稳定性试验结果
Table 3 Results of long-term stability test of doxycycline thermo-sensitive in situ gel uterine perfusate
批次
Batcht/d 性状
CharacterpH θ胶凝/℃
Gelling temperaturew(多西环素)/%
Doxycycline content1 0 淡黄色澄清溶液
Pale yellow clarifying solution4.05 30.0 100.68 90 4.06 30.3 101.12 180 4.08 30.1 101.79 2 0 淡黄色澄清溶液
Pale yellow clarifying solution4.03 30.2 101.80 90 4.00 29.9 99.26 180 4.05 30.3 99.59 3 0 淡黄色澄清溶液
Pale yellow clarifying solution4.04 30.4 101.87 90 4.02 30.1 100.76 180 4.06 30.2 100.46
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表 4 多西环素温敏型原位凝胶子宫灌注液在母猪子宫内的药物质量浓度
Table 4 Drug mass concentration of doxycycline thermo-sensitive in situ gel uterine perfusate in sow uterus
ρ/(μg·mL−1) 采样时间
Sampling time母猪编号1) Sow number ${\bar X }$±S 1 2 3 4 5 第1次给药12 h后 12 h after the first administration 85.76 0.53 102.21 269.32 48.71 101.31±101.73 第1次给药24 h后 24 h after the first administration — 191.27 18.76 258.31 115.77 116.82±110.48 第1次给药36 h后 36 h after the first administration 1.80 — 3.77 187.32 27.36 44.05±80.86 第2次给药前 Before the second administration 0.35 2.85 — 211.50 64.39 55.82±91.25 第2次给药8 h后 8 h after the second administration 477.33 8.07 167.14 163.36 104.64 184.11±176.07 第2次给药12 h后 12 h after the second administration 391.98 11.25 1870.95 86.11 4.28 472.91±797.41 第2次给药24 h后 24 h after the second administration 109.63 4.64 51.34 240.79 401.62 161.60±160.76 第2次给药36 h后 36 h after the second administration 161.18 3.91 33.14 120.06 159.39 95.54±72.93 第2次给药48 h后 48 h after the second administration 46.23 264.80 18.21 — 170.11 99.87±113.64 第2次给药72 h后 72 h after the second administration 229.61 185.04 26.94 — 202.99 128.92±107.00 第2次给药96 h后 96 h after the second administration 130.93 95.37 10.71 — 105.70 68.54±59.24 1)“—”表示未检出
1)“—” means no doxycycline detected
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