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鸡源复合益生菌对肉仔鸡免疫球蛋白及Toll样受体通路的影响

贺濛初, 李思婷, 王志, 舒迎霜, 桂雪儿, 朱杰, 李锦春, 吴金节

贺濛初, 李思婷, 王志, 等. 鸡源复合益生菌对肉仔鸡免疫球蛋白及Toll样受体通路的影响[J]. 华南农业大学学报, 2021, 42(2): 26-33. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202003020
引用本文: 贺濛初, 李思婷, 王志, 等. 鸡源复合益生菌对肉仔鸡免疫球蛋白及Toll样受体通路的影响[J]. 华南农业大学学报, 2021, 42(2): 26-33. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202003020
HE Mengchu, LI Siting, WANG Zhi, et al. Effects of chicken-derived compound probiotics on immunoglobulin and Toll-like receptor pathway of broilers[J]. Journal of South China Agricultural University, 2021, 42(2): 26-33. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202003020
Citation: HE Mengchu, LI Siting, WANG Zhi, et al. Effects of chicken-derived compound probiotics on immunoglobulin and Toll-like receptor pathway of broilers[J]. Journal of South China Agricultural University, 2021, 42(2): 26-33. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202003020

鸡源复合益生菌对肉仔鸡免疫球蛋白及Toll样受体通路的影响

基金项目: 安徽省重点研究与开发计划(1804a07020135)
详细信息
    作者简介:

    贺濛初(1994—),男,硕士研究生,E-mail:553073964@qq.com

    李思婷(1997—),女,硕士研究生,E-mail:li15816657198@qq.com;†表示同等贡献

    通讯作者:

    吴金节(1962—),男,教授,E-mail: wjj@ahau.edu.cn

  • 中图分类号: S831.5

Effects of chicken-derived compound probiotics on immunoglobulin and Toll-like receptor pathway of broilers

  • 摘要:
    目的 

    探究益生菌对肉仔鸡血清免疫球蛋白与肠道Toll样受体通路的影响。

    方法 

    选择90只1日龄白羽肉杂鸡,随机分为3组,即对照组、益生菌低剂量组和益生菌高剂量组。其中对照组饲喂基础日粮,益生菌低剂量组在每千克基础日粮中添加复合益生菌109 cfu,益生菌高剂量组在每千克基础日粮中添加复合益生菌2×109 cfu。第21天,每组随机选取10只鸡放血致死,并立即采集样本,进行ELISA、免疫组化、qPCR及Western blot检测。

    结果 

    在第21天,益生菌低剂量组和益生菌高剂量组鸡的料肉比分别比对照组降低9%和12% (P<0.05),血清IgG含量分别升高28%和40% (P<0.01),血清IgM含量分别升高44%和58% (P<0.01)。益生菌低剂量组TLR4蛋白表达和mRNA相对表达量比对照组分别升高33%和28%,AP-1蛋白表达和mRNA相对表达量分别比对照组升高106%和67% (P<0.01);益生菌高剂量组TLR4蛋白表达及mRNA相对表达量比对照组分别升高106%和69%,AP-1蛋白表达及mRNA相对表达量比对照组分别升高163%和98% (P<0.01)。

    结论 

    饲喂益生菌可降低肉仔鸡料肉比,提高血清中IgG、IgM的含量,并且通过调节Toll样受体通路蛋白表达可以提高机体免疫力。

    Abstract:
    Objective 

    To investigate the effects of probiotics on serum immunoglobulin and intestinal Toll-like receptor pathway in broilers.

    Method 

    Ninety one-day-old white feather chicks were randomly divided into three groups including control group, low-dose probiotic group and high-dose probiotic group. The chicks in control group were fed basal diet, 109 cfu probiotics per kg basal diet were added in the low-dose probiotic group, and 2×109 cfu probiotics per kg basal diet were added in the high-dose probiotic group. On the 21st day, ten chicks in each group were sacrificed by bloodletting, and the samples were collected immediately for ELISA, immunohistochemistry, qPCR and Western blot.

    Result 

    Compared with the control group on the 21st day, the feed conversion ratios of low- and high-dose probiotic groups decreased by 9% and 12% (P<0.05), the IgG levels in serum increased by 28% and 40% (P<0.01), and the IgM levels in serum increased by 44% and 58% (P<0.01) respectively. The protein and mRNA expression of TLR4 increased by 33% and 28% respectively in low-dose probiotic group (P<0.01), and the protein and mRNA expression of AP-1 increased by 106% and 67% respectively in low-dose probiotic group (P<0.01). The protein and mRNA expression of TLR4 increased by 106% and 69% respectively in high-dose probiotic group (P<0.01), and the protein and mRNA expression of AP-1 increased by 163% and 98% respectively in high-dose probiotic group (P<0.01).

    Conclusion 

    Feeding probiotics can reduce the feed conversion ratio in broilers, increase the levels of IgG and IgM in serum, and enhance the immunity by regulating the expression of Toll-like receptor pathway proteins.

  • 普通大蓟马Megalurothrips usitatus又名豆大蓟马、豆花蓟马,隶属于缨翅目蓟马科大蓟马属,主要分布于澳大利亚、马来西亚、斯里兰卡、菲律宾、斐济、印度、日本等[1-3],在我国海南、台湾、广东、广西、湖北、贵州、陕西等地也均有发生为害[4-5]。据报道,该虫有28种寄主,其中16种为豆科植物,目前它已成为危害华南地区豆科作物的主要害虫[6-9],田间调查和室内试验均表明豇豆为其嗜好寄主[10-11]。普通大蓟马主要以锉吸式口器取食豇豆幼嫩组织的汁液,可造成叶片皱缩、生长点萎缩、豆荚痂疤等,严重影响豇豆品质[12-13]。此外,该虫体积小、发生量大、隐秘性强,大部分时间都躲在花中取食,从豇豆苗期至采收期均可为害[14-15],以上特点均增加了农户的防治难度。当其为害严重时,农户只能增加施药频率和施药量,这也导致该虫对多种常用化学农药产生了严重的抗药性[16-17]

    目前关于普通大蓟马的研究主要集中在生物学特性[18]及综合防治技术[19-20]等层面,随着抗药性的不断发展与研究的不断深入,从分子层面解析普通大蓟马的抗药性机制和寄主选择机制等以寻求新型绿色防控方法势在必行,室内种群的大规模饲养是展开这些研究的基础。化蛹基质作为影响昆虫种群规模的关键因子,韩云等[21]曾指出普通大蓟马在含水量(w)为15%的砂壤土中羽化率显著高于砂土、壤土和黏土,但不适用于室内大规模饲养,因为实际应用中,存在土壤类型无法明确区分、配制砂壤土会增加人工饲养的工作量等问题。土壤以外的其他基质对普通大蓟马化蛹的适合度鲜见研究报道。

    本研究以普通大蓟马为试验对象,室内观测其在沙子、蛭石和厨房用纸3种基质及无基质条件下的羽化规律,分析该虫对不同化蛹基质的适合度,以期为普通大蓟马的室内大规模饲养提供基础资料,为该虫的综合治理提供理论依据。

    普通大蓟马于2017年采自广东省广州市增城区朱村豇豆田,采回后在RXZ-500C型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)内用豇豆豆荚饲养,饲养条件为温度(26±6) ℃,光照周期12 h光∶12 h暗,相对湿度(70±5)%。室内饲养多代后,选取发育一致的老熟2龄若虫(以体色变为橙红色为标准)进行室内试验。

    供试基质包括沙子、蛭石、锯末和厨房用纸,并以无基质作为空白对照。试验前将沙子、蛭石和锯末置于DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)中105 ℃恒温烘烤6 h备用。

    首先称取过筛烘干后的沙子50 g 3组,分别加入2.5、3.5和4.5 mL蒸馏水,充分混匀,配制成含水量(w)分别为5%、7%和9%的沙子化蛹基质;称取过筛烘干后的蛭石10 g 3组,分别加入10.0、12.5和15.0 mL蒸馏水,充分混匀,配制成含水量(w)分别为20%、25%和30%的蛭石化蛹基质;称取过筛烘干后的蛭石10 g 3组,分别加入12.5、15.0和17.5 mL蒸馏水,充分混匀,配制成含水量(w)分别为25%、30%和35%的锯末化蛹基质。将以上基质分别转移至350 mL玻璃组培瓶内,基质深度均为5 cm,将厨房用纸对折成合适大小后平铺在组培瓶底部作为基质。在所有基质上放置纱网,再加入1根新鲜的豇豆豆荚(长度约4~5 cm),分别接入50头普通大蓟马老熟2龄若虫,用250目纱布封口后置于人工气候箱中饲养,每日观察并记录成虫羽化数量。每个处理设6次重复。设置不加入任何化蛹基质的空白对照。

    含水量的测定方法按以下公式[22]进行:

    含水量=实际含水质量/烘干后基质质量×100%。

    运用SPSS 24.0软件进行试验数据处理分析,不同基质及含水量对普通大蓟马羽化率、蛹历期和性比(雄性∶雌性)的影响采用单因素方差分析,并运用Duncan’s法检验差异显著性。

    普通大蓟马在不同基质中的羽化率、蛹历期和性比具有显著差异(图1)。由图1A可知,普通大蓟马在厨房用纸中的羽化率显著高于其他基质,为54.33%,其次为含水量5%(w)的沙子,羽化率为44.67%;锯末最不适宜于普通大蓟马羽化,在含水量(w)为25%、30%、35%的锯末中普通大蓟马的羽化率分别为10.33%、5.33%、16.67%,显著低于空白对照与其他基质。

    图  1  不同基质对普通大蓟马羽化率、发育历期和性比(雄性∶雌性)的影响
    1~3分别为含水量(w)为5%、7%和1%的沙子,4~6分别为含水量(w)为20%、25%和30%的蛭石,7~9分别为含水量(w)为25%、30%和35%锯末,10:厨房用纸,11:无基质;各图中的不同小写字母表示差异显著(P<0.05,Duncan’s法)
    Figure  1.  Effects of different substrates on eclosion rate, pupa developmental period and male-female ratio of Megalurothrips usitatus
    1: Sand with 5% moisture, 2: Sand with 7% moisture, 3: Sand with 10% moisture, 4: Vermiculite with 20% moisture, 5: Vermiculite with 25% moisture, 6: Vermiculite with 30% moisture, 7: Sawdust with 25% moisture, 8: Sawdust with 30% moisture, 9: Sawdust with 35% moisture, 10: Kitchen paper, 11: No substrate; Different lowercase leters in the same figure indicated significant difference among different substrate (P<0.05, Duncan’s method)

    图1B可知,普通大蓟马在含水量5%(w)的沙子中蛹的发育历期最短,为5.29 d,其次为含水量7%(w)的沙子,为6.01 d,在其他基质中的蛹期则无显著差异,在6.14~7.16 d。

    图1C可知,普通大蓟马在含水量30%(w)的蛭石中性比最高,为0.60,含水量10%(w)的沙子和30%(w)的蛭石性比相对较低,分别为0.12和0.06,在其他基质中性比无显著差异。

    表1数据可知,沙子含水量(w)为5%时普通大蓟马羽化最早,始于第2天;其次为蛭石,羽化始于第4天,其他条件下羽化均始于第3天;以锯末为基质时羽化最晚,始于第5天。沙子含水量(w)为5%和厨房用纸条件下,羽化高峰出现在第5天,羽化率分别为21%和22.67%;次高峰在第6天,羽化率分别为14.33%和21%。沙子含水量(w)为9%、锯末以及空白对照下羽化高峰出现在第7天,其他条件下羽化高峰均出现在第6天。不同基质类型及含水量条件下,普通大蓟马的羽化均结束于第8天或第9天,与不同基质培养条件下普通大蓟马蛹期之间的差异相对应。

    表  1  不同基质对普通大蓟马逐日羽化率的影响1)
    Table  1.  Effects of differents substrates on daily eclosion rate of Megalurothrips usitatus %
    t/d 沙子含水量(w) Water content in sand 蛭石含水量(w) Water content in vermiculite
    5% 7% 9% 20% 25% 30%
    1 0 0 0 0 0 0
    2 1.67±0.42c 0 0 0 0 0
    3 1.00±1.68c 0 0 0 0 0
    4 1.33±0.67c 5.33±0.33c 0.33±0.33b 0 0 0
    5 21.00±3.82a 5.33±2.17b 2.67±1.91b 3.00±2.30bc 10.33±3.48ab 0.33±0.33b
    6 14.33±4.66b 17.33±1.76a 2.67±1.91b 11.67±2.09a 14.67±3.33a 7.67±2.22a
    7 2.33±0.80c 5.00±0.85b 8.67±1.84a 6.33±2.28b 7.67±1.74bc 6.67±1.52a
    8 0.67±0.42c 0.67±0.67c 0.67±0.42b 4.00±1.35bc 4.00±1.37cd 1.67±0.94b
    9 0 0 0.33±0.33b 0.67±0.42b 0 0.67±0.42b
    10 0 0 0 0 0 0
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    化蛹基质的类型对普通大蓟马化蛹具有一定影响,本研究发现锯末和蛭石不适宜于普通大蓟马化蛹,锯末和蛭石不同含水量条件下大蓟马的羽化率都显著低于空白对照。有研究指出土壤中砂土含量低于30%时,蓟马若虫不能化蛹[23],蓟马在砂壤土中的羽化率也显著高于砂土、黏土、壤土等单一土壤[21]

    化蛹基质的含水量对普通大蓟马化蛹具有显著影响,本研究发现当沙子含水量(w)为5%时,羽化率仅次于厨房用纸,高达44.67%,与孟国玲等[23]关于豆带蓟马Taenithripsglycines在含水量(w)为5.7%时羽化率最高(43.63%)的报道相对一致。韩云等[21]研究发现普通大蓟马在含水量(w)为15%的砂壤土中羽化率最高,为52.08%,而土壤含水量(w)5%时羽化率仅为6.67%。这与本研究结果不符,究其原因可能是不同类型的基质吸水力与保水力不同,导致在相同的绝对含水量下湿度有差异。此外,有研究曾指出高含水量不利于蓟马化蛹[24],这与本研究结果相一致,沙子含水量(w)5%时的羽化率显著高于含水量(w)7%和10%。

    在本研究中,成虫性比普遍低于1∶1,含水量(w)30%的蛭石羽化性比最高,为0.6,含水量(w)30%锯末最低,为0.06,其他处理的性比无显著差异,为0.12~0.48。张念台[8]和谭柯[24]在田间调查的结果也显示其成虫性比低于1∶1,后代总是偏于雌性,谭柯[24]则表示后代偏雌性可能是蓟马暴发的原因之一。这与本研究结果相一致,后代偏于雌性。

    本研究发现普通大蓟马在厨房用纸中的羽化率最高,蛹发育历期与其他基质相比无明显差异,且以厨房用纸为化蛹基质时,可以清楚地观察到普通大蓟马蛹期的形态特征变化,可以随时根据试验需求收集不同时期的若虫或成虫。虽然沙子含水量(w)5%时蛹发育历期最短且羽化率也较高,但蓟马一旦入土化蛹便无法继续观察形态或收集虫体。因此,本试验条件下,厨房用纸是最适合室内普通大蓟马大量饲养的化蛹基质。

  • 图  1   鸡十二指肠Toll样受体通路蛋白的免疫组化图

    Y:阴性对照;A:对照组;B:益生菌低剂量组;C:益生菌高剂量组;1:TLR2;2:TLR4;3:Myd88;4:TRAF-6;5:AP-1;图中蛋白阳性表达产物呈棕黄色,细胞核呈蓝色, 细胞膜不着色

    Figure  1.   Immunohistochemical photographs of Toll-like receptor pathway proteins in duodenum of chicks

    Y: Negative control; A: Control group;B: Low-dose probiotic group;C: High-dose probiotic group;1: TLR2;2: TLR4;3: Myd88;4: TRAF-6;5: AP-1;In the figure protein positive expression products were stained brown-yellow, the nuclei were stained blue,and the cell membranes were not stained

    图  2   益生菌对Toll样受体通路蛋白光密度的影响

    Ⅰ:对照组,Ⅱ:益生菌低剂量组,Ⅲ:益生菌高剂量组;各图中,柱子上方的不同小、大写字母分别表示差异达到0.05和0.01的显著水平(Duncan’s法)

    Figure  2.   Effect of probiotics on optical density of Toll-like receptor pathway protein

    Ⅰ: Control group, Ⅱ: Low-dose probiotic group, Ⅲ: High-dose probiotic group; In each figure, different lowercase and capital letters on bars indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels respectively (Duncan’s method)

    图  3   益生菌对Toll样受体通路蛋白mRNA相对表达量的影响

    Ⅰ:对照组,Ⅱ:益生菌低剂量组,Ⅲ:益生菌高剂量组;各图中,柱子上方的不同小、大写字母分别表示差异达到0.05和0.01的显著水平(Duncan’s法)

    Figure  3.   Effect of probiotics on the mRNA relative expression of Toll-like receptor pathway protein

    Ⅰ: Control group, Ⅱ: Low-dose probiotic group, Ⅲ: High-dose probiotic group; In each figure, different lowercase and capital letters on bars indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels respectively (Duncan’s method)

    图  4   Toll样受体通路蛋白的电泳图

    Ⅰ:对照组,Ⅱ:益生菌低剂量组,Ⅲ:益生菌高剂量组

    Figure  4.   Electrophoretic pattern of Toll-like receptor pathway protein

    Ⅰ: Control group, Ⅱ: Low-dose probiotic group, Ⅲ: High-dose probiotic group

    图  5   益生菌对Toll样受体通路蛋白表达量的影响

    Ⅰ:对照组,Ⅱ:益生菌低剂量组,Ⅲ:益生菌高剂量组;各图中,柱子上方的不同小、大写字母分别表示差异达到0.05和0.01的显著水平(Duncan’s法)

    Figure  5.   Effect of probiotics on the expression level of Toll-like receptor pathway protein

    Ⅰ: Control group, Ⅱ: Low-dose probiotic group, Ⅲ: High-dose probiotic group; In each figure, different lowercase and capital letters on bars indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels respectively (Duncan’s method)

    表  1   基础日粮组成及营养水平(风干基础)

    Table  1   Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

    基础日粮 Basic diet w/% 营养组分 Nutrient component w/%
    玉米 Corn 55.71 粗蛋白质 Crude protein 21.00
    豆粕 Soybean meal 32.57 钙 Ca 1.00
    玉米蛋白粉 Corn protein meal 5.00 有效磷 Available P 0.41
    大豆油 Soybean oil 2.50 赖氨酸 Lys 1.25
    石粉 Limestone 1.34 蛋氨酸 Met 0.55
    预混料1) Premix 2.88 蛋氨酸+胱氨酸 Met+Cys 0.90
    代谢能2)/(MJ·kg−1) Metabolic energy 12.34 苏氨酸 Thr 0.88
     1)预混料为每千克饲粮提供:维生素A 10000 IU,维生素D3 2500 IU,维生素E 25 mg,维生素K3 5 mg,维生素B1 2.5 mg,维生素B2 7.5 mg,维生素B6 5 mg,维生素B12 0.025 mg,烟酸50 mg,D−泛酸15 mg,叶酸1.5 mg,生物素0.1375 mg,Cu2+ 6.4 mg,Fe2+ 90 mg,Mn2+ 106 mg,Zn2+ 70 mg,I+ 0.80 mg,Se2+ 0.30 mg;2)代谢能为计算值,其余为实测值
     1)The premix provided the following per kg of diets:Vitamin A 10000 IU,vitamin D3 2500 IU,vitamin E 25 mg,vitamin K3 5 mg,vitamin B1 2.5 mg,vitamin B2 7.5 mg,vitamin B6 5 mg,vitamin B12 0.025 mg,nicotinic acid 50 mg,D-pantothenic acid 15 mg,folic acid 1.5 mg,biotin 0.1375 mg,Cu2+ 6.4 mg,Fe2+ 90 mg,Mn2+ 106 mg,Zn2+ 70 mg,I+ 0.80 mg, Se2+ 0.30 mg; 2) Metabolic energy is a calculated value and others are measured values
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    表  2   qPCR引物参数

    Table  2   qPCR primer parameters

    基因
    Gene
    引物
    Primer
    序列
    Sequence
    θ熔断/℃
    Fusing-off temperature
    产物大小/bp
    Product size
    TLR2 Forward AACATTCTGAAAATAACGGCAT 55.9 72
    Reverse AAACTCCTGCATCTGTACCTGA 57.1
    TLR4 Forward CATTCAAGGCAATTCCTACAGC 57.0 138
    Reverse TTGAGAAACACAATGCCCTC 56.2
    Myd88 Forward TGCCTTCATCTGCTACTGTCA 56.4 79
    Reverse TTTGAACTCCGTTTGCTCC 56.0
    TRAf-6 Forward CTCAAACGTACTATCCGAGA 53.6 70
    Reverse AAATACCATTACATTGTTGTGC 53.6
    AP-1 Forward CCGCAGCATCACATAAACCC 59.3 145
    Reverse CTTTGATTCTCTCCTGCGACT 58.3
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    表  3   益生菌对鸡生长性能的影响1)

    Table  3   Effect of probiotics on growth performance of chicks

    组别
    Group
    7 d 14 d 21 d

    质量/g
    Weight
    日采
    食量/g
    Daily
    feed intake
    料肉比
    Feed
    conversion
    ratio

    质量/g
    Weight
    日采
    食量/g
    Daily
    feed intake
    料肉比
    Feed
    conversion
    ratio

    质量/g
    Weight
    日采
    食量/g
    Daily
    feed intake
    料肉比
    Feed
    conversion
    ratio
    对照组
    Control group
    103±18.2Aa 165.8±15.4Aa 1.61±0.28a 264±14.2Aa 427.7±19.6a 1.62±0.29Ab 426±38.7Aa 728.5±28.6a 1.71±0.46Bb
    益生菌低剂量组
    Low-dose probiotic group
    104±14.3Aa 165.4±13.2Aa 1.59±0.14a 285±16.9Ab 437.8±21.5a 1.52±0.45Aa 458±29.7Bb 709.9±38.9a 1.55±0.68Aa
    益生菌高剂量组
    High-dose probiotic group
    115±23.6Ab 181.7±29.2Ab 1.58±0.23a 292±23.3Ab 435.0±32.5a 1.49±0.51Aa 475±31.7Bc 712.5±26.5a 1.50±0.54Aa
     1) 表中数据为平均值±标准差;同列数据后的不同小、大写字母分别表示差异达到0.05和0.01的显著水平(Duncan’s法)
     1) Data in the table are means ± standard deviations; Different lowercase and capital letters in the same column indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels respectively (Duncan’s method)
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    表  4   益生菌对鸡血清IgG和IgM含量的影响1)

    Table  4   Effect of probiotics on IgG and IgM contents in chicken serum ρ/(μg·mL−1)

    组别
    Group
    IgG IgM
    7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d
    对照组 Control group 1265±134a 1312±87Aa 1341±177Aa 812±89a 851±186Aa 869±150Aa
    益生菌低剂量组 Low-dose probiotic group 1323±67a 1587±142Aa 1723±73Bb 834±145a 1043±179Ab 1252±198Bb
    益生菌高剂量组 High-dose probiotic group 1277±213a 1673±59Bb 1 880±214Bb 828±121a 1226±96Bc 1376±134Bb
     1)同列数据后的不同小、大写字母分别表示差异达到0.05和0.01的显著水平(Duncan’s法)
     1)Different lowercase and capital letters in the same column indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels respectively (Duncan’s method)
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-17
  • 网络出版日期:  2023-05-17
  • 刊出日期:  2021-03-09

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