Effect of astaxanthin on inflammatory response of RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide and its mechanism
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摘要:目的
研究虾青素(AST)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及作用机制，为将虾青素应用于炎症治疗奠定理论基础。
方法采用不同浓度梯度的脂多糖及虾青素对RAW264.7细胞进行不同时间段的处理，通过MTT法确定最佳处理浓度和时间，对细胞进行最佳处理后，用ELISA法、荧光定量PCR技术和Western blot法分别检测细胞炎症因子的分泌量、mRNA相对表达量和蛋白相对表达量。
结果100 μmol/L虾青素和2 μg/mL脂多糖处理3 h的RAW264.7细胞活力处于峰值。与对照组相比，脂多糖组RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6和Caspase-1的分泌量分别降低了12.83%、9.66%和20.80%(P<0.05)，脂多糖对于TLR4/MyD88/NF-кB通路相关蛋白表达有促进作用，其中，TLR4和NF-кB p65蛋白相对表达量分别提高了195.40%和226.95%(P<0.05)；与LPS组相比，AST+LPS组中虾青素对炎性因子的分泌及mRNA表达有抑制作用，TLR4、MyD88和NF-кB p65蛋白相对表达量降低了54.99%、45.70%和28.20%(P<0.05)。
结论虾青素预保护能抑制TLR4/MyD88/NF-кB通路相关蛋白的表达，进而缓解脂多糖刺激RAW264.7细胞产生的炎症反应。
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关键词:
- 炎症反应 /
- 虾青素 /
- 脂多糖 /
- TLR4/MyD88/NF-кB信号通路
Abstract:ObjectiveTo study the effect of astaxanthin (AST) on the inflammatory response of RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS) and the mechanism, and provide a theoretical basis for using AST in inflammation therapy.
MethodDifferent concentrations of LPS and AST were used to treat RAW264.7 cells for different time. The optimal treatment concentration and time were determined by MTT method. After applying the optimal treatment, the secretion, mRNA relative expression and protein relative expression of inflammatory factors were detected by ELISA, fluorescence quantitative PCR and Western blot method respectively.
ResultWhen treated with 100 μmol/L AST and 2 μg/mL LPS for 3 h, the viability of RAW264.7 cells was at the peak. Compared with the control group, the secretion of TNF-α, IL-6 and Caspase-1 in RAW264.7 cells of LPS group reduced by 12.83%, 9.66% and 20.80% respectively(P<0.05). LPS promoted the expression of TLR4/MyD88/NF-κB pathway-related proteins with relative expression of TLR4 and NF-кB p65 proteins enhanced by 195.40% and 226.95% respectively(P<0.05). Compared with LPS group, AST had inhibitory effects on the secretion and mRNA expression of inflammatory factors in AST+LPS group, and the relative expression of TLR4, MyD88 and NF-кB p65 proteins reduced by 54.99%, 45.70% and 28.20% respectively (P<0.05).
ConclusionAST pre-protection can inhibit the expression of TLR4/MyD88/NF-κB pathway-related proteins, thereby alleviate the inflammatory response in RAW264.7 cells induced by LPS.
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植物病原菌与特定植物通过长期协同进化产生可亲和性，形成特有的寄主范围，即植物病原菌寄生专化性[1]。由于非寄主植物的免疫抗性作用，植物病原菌较少跨越宿主侵染非寄主[2]，但特定条件下，病原菌也会出现宿主跳跃侵染非自然宿主的现象[3]，此为病原菌进化的策略之一。但近年研究发现，镰刀菌、炭疽菌等多种重要的植物病原真菌，出现跨界侵染人体的现象[4-5]。
尖孢镰刀菌Fusarium oxvsporum属于半知菌类Xmperfeetifungi镰刀菌属Fusarium[6]，可引起瓜类、香蕉、棉花以及花卉等农作物、经济作物的枯萎病和腐烂病，给农业生产带来巨大威胁，造成严重经济损失。目前，防治枯萎病的方法主要是使用化学药剂以及利用农业措施等[7]，但由于该病为土传病害，防治效果均不太理想，因而，通过深入探究病原与宿主间相互作用的分子机制，筛选抗病基因、培育抗病品种是防治该病害的重要思路。
天然免疫是动、植物识别和响应外来病原物攻击的重要防御措施，其进化地位古老且保守。动、植物的天然免疫在异物识别与抗微生物的分子组成等方面呈现高度相似性[8-9]。植物借助细胞膜表面的模式分子识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)、胞质内R蛋白识别病原相关分子模式(Pathogenassociated molecular patterns ，PAMPs )和病原效应因子启动天然免疫程序，植物的PRRs与动物Toll-like 受体相似，R蛋白的结构和功能均与动物CLR(Nod)蛋白相似[10]。动、植物免疫程序的启动均表现为丝裂原活化蛋白激酶级联(MAPK)信号的激活，转录因子的激活，一氧化氮、活性氧以及抗菌物质的表达等一系列响应过程[8]。这充分体现了天然免疫在动、植物进化起源中的一致性。由于缺乏特定的免疫组织、细胞、外周循环系统，相对于高等动物，秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的免疫组成和响应方式与植物的更为接近。因而，利用秀丽隐杆线虫深入探索植物病原菌与宿主间相互作用的分子机制，筛选针对病原菌的抗性基因，是研究植物抗病性、寻找植物抗病基因的另一视角。
本文利用秀丽隐杆线虫与尖孢镰刀菌共培养的方式，探索尖孢镰刀菌对线虫基本生物学特性的影响，并就其影响机理进行分析，以期为深入研究尖孢镰刀菌与宿主间相互作用的分子机制以及植物对其抗病性及抗病基因奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 菌株培养及孢子悬浮液的制备
方法参照文献[11]。尖孢镰刀菌菌株从患根腐病的天麻上分离纯化获得，于PDA固体培养基28 ℃恒温培养4 d，再取新鲜菌饼接种于150 mL PDA液体培养基中，25 ℃、 180 r/min培养10 d[12]，以无菌纱布过滤除去菌丝获得孢子菌悬液，M9缓冲液将孢子含量稀释至106 mL−1备用。
1.2 线虫的培养和同步化
试验选用野生型N2线虫株，以NGM固体培养基进行培养，以大肠埃希菌Escherichia coli OP50菌株作为线虫食物，25 ℃条件下恒温培养，待线虫长至产卵期时进行同步化，方法参照文献[13]，获得L1期幼虫备用。
1.3 试验平板制备
6 cm NGM平板表面均匀涂布200 μL相应含量的尖孢镰刀菌孢子菌悬液，待吹干后，平板中央滴加50 μL离心浓缩的OP50菌液。分别以尖孢镰刀菌灭活孢子和无孢子作为2个对照组，灭活孢子组在NGM平板表面均匀涂布经高温灭活的尖孢镰刀菌孢子液200 μL，待风干后滴加50 μL浓缩OP50菌液；无孢子组则在NGM板上均匀涂布200 μL液体PDA，风干后平板中央加入50 μL浓缩OP50菌液，以上各培养板于28 ℃恒温箱培养24 h，备用。
粗毒素板及其对照组：参考台莲梅等[14]的方法获得尖孢镰刀菌粗毒素。尖孢镰刀菌于PDA液体培养基中，25 ℃、180 r/min培养10 d，无菌纱布过滤除去菌丝收集菌液，菌液再通过0.45 μm过滤器除去分生孢子，获得含毒素菌液。试验组为NGM板上涂布200 μL含毒素菌液，对照组加同等体积液体PDA培养基，风干后加50 μL浓缩的OP50菌液，备用。
1.4 尖孢镰刀菌对线虫寿命、体长、繁殖力、咽运动速率及运动能力的影响
将同步化后L1期幼虫分别接种至活性孢子(Active spores，AS)、灭活孢子(Inactive spores，IS)及无孢子(No spore，NS)对照，的NGM培养板上，每板约50~70条虫，25 ℃条件下培养，每24 h统计线虫存活率，线虫长至成虫产卵时，须将原成虫转移至新的相应培养板上继续统计，每组至少3个重复。
将L1期幼虫接种于试验板和对照板，培养至12、24、36、48以及60 h时，各组随机挑取15条线虫，福尔马林固定，测量虫体大小，方法参照文献[15]。
将L1期幼虫分别接种于试验板和对照板，25 ℃培养至L4期，从各板中分别随机挑取一条线虫置于新培养板上，25 ℃条件下培养48 h后，统计该板内幼虫数量，每组至少3个重复。
L1期线虫接种至试验板和对照板，分别在接种后48、60 h测定线虫的咽泵运动速率，每组随机选取15条虫进行测量，方法参照文献[16]。
L1期线虫接于各平板上，25 ℃条件下培养48 h之后，测定1 min内线虫头部摆动和身体弯曲频次，即线虫运动能力，参考Yang等[17]的方法，每组测定15条。
1.5 生物信息学分析
为了进一步探讨尖孢镰刀菌对秀丽隐杆线虫生物学特性影响的分子机制，收集与活性孢子、灭活孢子共培养60 h的线虫并提取mRNA，以无孢子为空白对照组，进行转录组学测序，并对差异表达基因进行GO和KEGG分析。每个处理重复3次。
1.6 数据处理
运用GraphPad Prism 5进行数据处理，结果用平均值 ± 标准差表示；t检验分析2组数据的差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 镰刀菌孢子在NGM板上的生长情况
分别在NGM板上铺满活性孢子、灭活孢子及液体PDA，吹干后加入浓缩的OP50菌液。如图1所示，培养24 h后铺有活性孢子的NGM板上有菌丝产生，说明该菌分生孢子可在NGM板上萌发并生长产生菌丝体。
2.2 尖孢镰刀菌对秀丽隐杆线虫寿命的影响
秀丽隐杆线虫与尖孢镰刀菌孢子共培养结果(图2)显示，共培养的前5 d中，活性孢子组(AS)、灭活孢子组(IS)以及无孢子对照组(NS)的线虫存活率无显著差异(图2a)；从第6天开始，3组线虫的存活率表现出差异，导致线虫最终寿命呈现显著性差异(P<0.05)(图2a)；AS组线虫的平均寿命为16 d，IS组线虫平均寿命为19 d；而NS组线虫平均寿命为18 d。此外，与有活性孢子共培养的死亡线虫可在显微镜下观察到虫体周围布满菌丝的现象(图2b、2c)，而活虫虫体上则无该现象。
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图 2 尖孢镰刀菌对线虫存活率的影响“*”“**”“***”分别表示相同时间处理与对照(NS)在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)Figure 2. Effect of Fusarium oxysporum on Caenorhabditis elegans survival rate“*” “**” and “***” indicate that there are significant differences between treatment groups and the control group (NS) at 0.05, 0.01 and 0.001 levels at the same time, respectively (t test)2.3 尖孢镰刀菌孢子对线虫体长的影响
线虫与尖孢镰刀菌孢子共培养自36 h开始，试验组与对照组线虫体长呈现显著差异，AS组的线虫体长显著小于IS组和NS组的(P<0.05)，而IS组和NS组的线虫，体长无明显差异(图3、4)。AS组线虫在36 h时体长为712.79 μm，IS组线虫体长为786.53 μm，而NS组体长为816.43 μm；在共培养60 h后，AS组线虫体长为1257.84 μm，IS组线虫1547.65 μm，NS组线虫为1495.10 μm。这些结果表明尖孢镰刀菌影响秀丽隐杆线虫的发育，且只有在尖孢镰刀菌孢子具有活性时才会产生影响效应。
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图 3 尖孢镰刀菌对线虫体长的影响“**”和“***”分别表示相同时间内不同处理组间在0.01和0.001水平差异显著(t检验)Figure 3. Effect of Fusarium oxysporum on nematode body length“**” and “***” indicate that there are significant differences among different treatment groups at 0.01 and 0.001 levels at the same time, respectively (t test)![]()
图 4 线虫分别在无孢子(NS)、灭活孢子(IS)及活性孢子(AS)组共培养不同时间的体长Figure 4. Body length of nematodes in NS, IS and AS groups at different time of cocultrue2.4 尖孢镰刀菌对线虫繁殖力、咽泵运动速率及运动能力的影响
如图5所示，尖孢镰刀菌具有活性的分生孢子加入培养体系后，在相同观测时间下，1条成虫所繁殖的幼虫数量为99条，与IS组(128条)和无孢子对照组(132条)相比，AS组的线虫繁殖能力显著下降(P<0.05)，而IS组与NS组间则无明显差异，表明尖孢镰刀菌对线虫的繁殖能力具有明显的抑制作用，而孢子被灭活后，该抑制作用即被消除。
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图 5 尖孢镰刀菌对线虫繁殖的影响“*”和“**”分别表示相同时间内不同处理组间在0.05和0.01水平差异显著(t检验)Figure 5. Effects of Fusarium oxysporum on fecundity in Caenorhabditis elegans“*” and “**” indicate that there are significant differences among different treatment groups at 0.05 and 0.01 levels at the same time, respectively (t test)线虫咽泵运动速率可反映其进食情况，将同步化后的L1期线虫分别于AS板、IS板及NS板上培养48和72 h后，随机挑取各板线虫15条，并统计其咽泵运动速率。如图6所示，线虫在AS板、IS板及NS板内培养后，其咽泵运动速率无显著性差异。
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图 6 尖孢镰刀菌对线虫咽泵运动速率的影响Figure 6. Effect of Fusarium oxysporum on pharyngeal pumping rate of nematodes如图7所示，在与尖孢镰刀菌孢子共培养后，活性孢子组(AS)线虫的身体弯曲和头部摆动频率分别为94和97次/min，这与灭活孢子组(IS)和无孢子组(NS)线虫的身体弯曲及头部摆动频率无显著差异，表明该菌分生孢子并未对线虫的运动能力产生显著影响。
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图 7 尖孢镰刀菌对线虫运动能力的影响Figure 7. Effects of Fusarium oxysporum on locomotor ability of nematodes2.5 尖孢镰刀菌次生代谢物对秀丽隐杆线虫表型特征的影响
如图8所示，在NGM板中加入200 μL尖孢镰刀菌次生代谢物，试验组线虫的平均寿命为20 d，对照组的线虫平均寿命为19 d(图8a)；试验组在60 h时的体长为1071.80 μm，对照组线虫的体长为1078.63 μm(图8c)；与无毒素对照组相比(132条)，试验组的线虫(125条)繁殖能力并未呈现显著差异(图8b)；此外，尖孢镰刀菌次生代谢物的添加也并未改变线虫运动能力（图8d）和咽泵运动速率(图8e)。
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图 8 尖孢镰刀菌毒素对秀丽隐杆线虫生理特征的影响Figure 8. Effects of Fusarium oxysporum toxin on the physiological characteristics of Caenorhabditis elegans2.6 转录组质量控制分析
每个样本的原始检测数据为47185902~48933528条，过滤后序列为44038824~45110062条。Q20(Phred值大于20的碱基占总碱基的百分比)均大于97%，Q30(Phred值大于30的碱基占总碱基的百分比)均大于91%，说明测序质量较高，能满足后续的生物信息学分析要求。
2.7 线虫转录组测序分析
经表达差异分析，以P<0.05和log2(Foldchange)>0作为筛选条件，结果(图9)显示，相比于NS组，AS组线虫出现差异表达的基因共有1119个，其中表达上调的基因有703个，表达下调的基因为416个(图9a)；IS组与NS组相比，表达差异基因共有663个，其中357个基因表达上调，306个基因表达下调(图9b)。AS组与IS组共同差异表达的基因有173个(图9c)。结果表明尖孢镰刀菌可从基因表达水平对秀丽隐杆线虫的生命活动造成显著影响。
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图 9 差异基因散点图(a、b)和韦恩图(c)Figure 9. Differential gene scatter plot (a, b) and Venn diagram (c)对差异表达基因进行GO分析，使用R软件中的phyper函数进行富集分析，计算P 值，然后对P值进行FDR校正得到Q，通常Q≤ 0.05的功能视为显著富集。分别从分子功能(Molecular function，MF)、生物学途径(Biological process，BP)和细胞组成(Cellular component，CC)3个部分AS组和IS组线虫的差异表达基因进行GO注释。在AS组线虫的差异基因一共注释到1120条GO术语，有显著性差异的有33条，主要富集的生物过程共注释到13条(图10a)，其中先天免疫反应(Innate immune response)富集到的基因最多；分子功能注释到14条(图10b)，氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)富集到的基因最多；细胞组成注释到6条(图10c)，细胞外区域(Extracellular region)富集到的基因最多。而IS组线虫，差异表达基因一共注释到1245条GO术语，具有显著性差异的为78条，其中生物过程注释到33条(图11a)，先天免疫反应(Innate immune response)富集到的基因最多；分子功能注释到36条(图11b)，氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)富集到的基因最多；细胞组成注释到9条(图11c)，线粒体(Mitochondrion)富集到的基因最多。表明秀丽隐杆线虫通过调控相关免疫基因响应尖孢镰刀菌对其产生的影响。
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图 10 活性孢子 (Active spores, AS)组和无孢子 (No spore, NS)组差异基因的GO功能注释Figure 10. GO function annotation of differential genes in AS and NS groups![]()
图 11 灭活孢子(Inactive spores, IS)组和无孢子(No spore, NS)组差异基因的GO功能注释Figure 11. GO function annotation of differential genes in IS and NS groups对差异基因进行KEGG分析，与NS组相比，AS组线虫的差异表达基因主要富集在以下几个调节通路(图12a)：药物代谢−细胞色素P450通路(Drug metabolism - cytochrome P450)、代谢外源性物质的细胞色素P450通路(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)、脂肪酸代谢通路(Fatty acid metabolism)、类固醇激素合成通路(Steroid hormone biosynthesis)；IA与NS组间(图12b)的差异表达基因主要富集在脂肪酸代谢通路(Fatty acid metabolism)、过氧化物酶体通路(Peroxisome)、脂肪酸降解通路(Fatty acid degradation)、不饱和脂肪酸通路的合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)。
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图 12 活性孢子(Active spores, AS)组、无孢子(No spore, NS)组和灭活孢子(Inactive spores, IS)组差异基因KEGG通路富集柱状图Figure 12. KEGG pathway enrichment histogram of differential genes of AS, NS and IS groups3. 结论与讨论
研究结果表明，尖孢镰刀菌具有活性的分生孢子加入线虫培养基后，显著影响了秀丽隐杆线虫的寿命、体长和繁殖能力，这与白色念珠菌Monilia albican[18]、胶孢炭疽菌Colletotrichum[19]侵染线虫的趋势一致；且尖孢镰刀菌的孢子被灭活后，其影响效应也随之消失；但对线虫的运动能力以及咽泵运动速率无明显影响。由此可见，尖孢镰刀菌对线虫的损伤主要集中在线虫的生长发育和繁殖两方面，且活菌是产生该损伤的必要条件。在共培养的前5 d，线虫的存活率并未受到孢子的影响，而在共培养第6天开始，活性孢子组线虫的死亡率相较于灭活孢子组及无孢子组明显升高，这可能与线虫的防御机制相关，线虫的衰老导致其抵抗力下降，更易于被尖孢镰刀菌损伤。对活性孢子组中死亡线虫的显微观察发现，该虫体周围布满菌丝，这与圆锥掘氏梅里霉[20] Drechmeria coniospora、马尔尼菲青霉菌[21]Penicillium marneffei和烟曲霉[22]Aspergillus fumigatus感染线虫的现象一致。因而，尖孢镰刀菌菌丝是否能够穿透虫体体壁组织从而对虫体造成机械伤害还有待后续试验验证。作为最常见的植物病原真菌，尖孢镰刀菌常存在于谷物中，其代谢产生的毒素对人及牲畜造成严重威胁，如导致人体急性淋巴细胞性白血病[23]。黑曲霉及链格孢菌的发酵液对线虫的寿命、头部摆动以及体长均具有显著的影响作用[24]，而本试验中，尖孢镰刀菌的代谢粗提物并未对线虫产生明显损伤，这可能是因为试验中尖孢镰刀菌代谢物由于菌丝体的去除而不能长时间积累，浓度过低。因而，本试验体系中，尖孢镰刀菌对线虫的损伤究竟是因为菌丝的机械伤害，亦或是菌丝在生长过程中产生的次生代谢物所致，还有待更深入地探讨和研究。
本研究转录组测序结果发现AS vs NS组差异表达基因的数量显著高于IS vs NS组，说明试验中AS组通过调节线虫更多的基因来响应有活性尖孢镰刀菌对其造成的伤害；GO分析结果表明共培养体系中尖孢镰刀菌的加入主要影响了线虫体内的先天免疫反应和氧化酶活性的生物功能，而KEGG富集对差异表达基因代谢通路分析显示，药物代谢−细胞色素P450通路、代谢外源性物质的细胞色素P450通路和脂肪酸代谢通路是线虫响应尖孢镰刀菌的主要信号通路。
作为重要的植物病原真菌，尖孢镰刀菌可对线虫的寿命、繁殖能力、体长等生物学特征产生显著影响，且转录组数据分析表明线虫通过调节免疫相关基因以及细胞色素P450信号等信号通路响应尖孢镰刀菌对其产生的影响。由此可见，该菌−虫共培养模型可能成为探索动、植物间天然免疫相似性以及进化关系的重要工具，进而为寻找存在于植物中的广谱抗病基因奠定基础。
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图 1 不同浓度虾青素对RAW264.7细胞活力的影响
相同处理时间柱子上的不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 1. Effect of astaxanthin on the viability of RAW264.7 cells at different concentration
Different lowercase letters on bars of the same treatment time indicate significant difference among treatment groups (P<0.05, Duncan’s method)
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图 2 不同质量浓度脂多糖对RAW264.7细胞活力的影响
相同处理时间柱子上的不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 2. Effect of different content of lipopolysaccharide on the viability of RAW264.7 cells
Different lowercase letters on bars of the same treatment time indicate significant difference among treatment groups (P<0.05, Duncan’s method)
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图 3 虾青素预保护对脂多糖刺激RAW264.7细胞炎症因子分泌量的影响
虾青素(AST)浓度为100 μmol/L，脂多糖(LPS)质量浓度为2 μg/mL；各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 3. Effects of astaxanthin pre-protection on inflammatory factor secretion from RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide
The astaxanthin(AST) concentration is 100 μmol/L, the lipopolysaccharide(LPS) content is 2 μg/mL; In each figure, different lowercase letters on bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s method)
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图 4 虾青素预保护对脂多糖刺激的RAW264.7细胞中炎症因子mRNA相对表达量的影响
虾青素(AST)浓度为100 μmol/L，脂多糖(LPS)质量浓度为2 μg/mL；各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 4. Effects of astaxanthin pre-protection on mRNA expression of inflammatory factor in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide
The astaxanthin(AST) concentration is 100 μmol/L, the lipopolysaccharide (LPS) content is 2 μg/mL；In each figure, different lowercase letters on bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s method)
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图 5 虾青素预保护下脂多糖刺激的RAW264.7细胞中炎症因子蛋白的电泳图
Figure 5. Electrophoresis of inflammatory factor in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide under astaxanthin pre-protection
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图 6 虾青素预保护对脂多糖刺激的RAW264.7细胞中炎症因子蛋白相对表达量的影响
各图中，柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 6. Effects of astaxanthin pre-protection on relative protein expression of inflammatory factor in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide
In each figure, different lowercase letters on bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s method)
表 1 qPCR的引物序列
Table 1 qPCR primer sequence
基因 Gene 正向引物(5′→3′) Forward primer 反向引物(5′→3′) Reverse primer 18s RNA CTCAACACGGGAAACCTCAC CGCTCCACCAACTAAGAACG IL-1β GGCTACTGCCTTCCCTACC CCTGATTGAACCCAGATTGG TNF-α ACCTGCCTGTGCTGAGTT ATGAAGTGCTGGGACACC IL-18 GGCCGACTTCACTGTACAACCG GGTCACAGCCAGTCCTCTTACTTC 
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