Analyses of differentially expressed genes of Eucalyptus urophylla in response to single and dual factor stresses of water and nutrient
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摘要:目的
比较尾叶桉Eucalyptus urophylla对水肥单、双因素胁迫的分子响应机制，为桉树抗逆育种提供思路和分子基础。
方法以无性系ZQUA44为试验材料，设3个水肥胁迫处理和1个对照（CK）。水肥双因素胁迫：20%~40%田间持水量，基肥[钙镁磷肥(CMPF) 250 g]；水分单因素胁迫：20%~40%田间持水量，基肥(CMPF 250 g+复合肥150 g)；养分单因素胁迫：60%~80%田间持水量，基肥(CMPF 250 g)；CK：60%~80%田间持水量，基肥(CMPF 250 g+复合肥150 g)。水分单因素胁迫和对照在种植2个月后施尿素100 g，8月份施复合肥150 g，第2年春天施复合肥100 g。对受胁迫处理的尾叶桉进行生长指标测定，并取叶片进行转录组测序，对测序结果进行拼接，利用生物信息学手段获得差异表达基因，对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。最后随机选择4个具有不同表达模式的差异表达基因进行qRT-PCR，验证转录组测序数据的可信度。
结果3种胁迫处理均在一定程度上抑制尾叶桉的生长发育，胁迫处理下尾叶桉各项生长指标多显著低于对照。水肥双因素胁迫、水分单因素胁迫和养分单因素胁迫处理共得到5 547个差异表达基因，分别有2 585、1 472和1 490个差异表达基因，各有1 195、222和665个基因表达上调和1 390、1 250和825个基因表达下调；3种胁迫处理分别获得155、75和108个基因编码转录因子。水肥单、双因素处理的差异表达基因均显著富集在苯丙烷的生物合成路径中。qRT-PCR结果与转录组测序结果基本一致，说明测序结果可信。
结论尾叶桉在3种胁迫处理下的转录变化具有明显的普遍性和特异性，综合胁迫对植物生长的影响比单独胁迫的影响更大，不同胁迫条件下植物可能具有不同的响应方式。
Abstract:ObjectiveTo compare the molecular response mechanisms of Eucalyptus urophylla under single and dual factor stresses of water and nutrient, and provide insight and molecular basis for resistance breeding of Eucalyptus.
MethodThe experiment selected E. urophylla clone ZQUA44 as matetial, and set three stress treatments and one control (CK). Water and nutrient deficiency stress: 20%−40% field moisture capacity, applying 250 g calcium magnesium phosphate fertilizer (CMPF) as base fertilizer; Water deficiency stress: 20%−40% field moisture capacity, applying 250 g CMPF and 150 g compound fertilizer as base fertilizer; Nutrient deficiency stress: 60%−80% field moisture capacity, applying 250 g CMPF as base fertilizer; CK: 60%−80% field moisture capacity, applying 250 g CMPF and 150 g compound fertilizer as base fertilizer. The urea of 100 g was applied at two months after planting, 150 g compound fertilizer in August, and 100 g compound fertilizer in the next spring in water deficiency stress and control treatments. High-throughput transcriptome sequencing was performed to E. urophylla leaves in different stress treatments, and the growth indexes of plant were determined. After assembling, differentially expressed genes were obtained using bioinformatics methods, and GO functional annotations and KEGG pathway analyses were performed. Finally, four differentially expressed genes with different expression patterns were randomly selected for qRT-PCR to validate the reliability of transcripcome sequencing data.
ResultAll three stress treatments partly suppressed the growth and development ofE. urophylla. Most of the growth indexes of E. urophylla in three stress treatments were significantly lower than those in control. A total of 5 547 differentially expressed genes were obtained in water and nutrient deficiency treatment, water deficiency treatment and nutrient deficiency treatment. The 2 585, 1 472 and 1 490 differentially expressed genes were obtained, including 1 195, 222 and 665 up-regulated genes and 1 390, 1 250 and 825 down-regulated genes, respectively. The 155, 75, 108 gene encoding transcription factors were respectively obtained in three stress treatments. The differentially expressed genes in three stress treatments were all significantly enriched in phenylpropane biosynthetic pathway. The qRT-PCR results were basically consistent with transcriptome sequencing results, indicating that the sequencing results were credible.
ConclusionThe transcriptional changes of E. urophylla in three stress treatments have obvious universality and specificity, and the effects of dual factor stress on plant growth are more than that of single factor stress. Plant may have different responce modes in different stress conditions.
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中药穿心莲为爵床科Acanthaceae植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血、消肿的功效，用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、蛇虫咬伤等[1]，素有“中药抗生素”之称。现代药理研究证明，穿心莲具有抗菌、抗氧化、抗疟、抗血管生成、抗炎、抗糖尿病等多种药理作用，由于其显著的临床疗效而被广泛应用，需求量大幅度增加，但连作障碍问题使其质量和产量不稳定[2]。很多栽培药用植物都存在不同程度的连作障碍, 如人参[3]、西洋参[4]、三七[5]等，药用植物产生连作障碍的原因有很多，主要包括：化感自毒作用、土壤物理性质恶化和养分失衡、土传病害增加、根际土壤微生物群落变化[6-7]等。目前关于穿心莲连作障碍成因的研究主要集中在化感自毒作用[8-12]，也有关于利用平板计数法、BIOLOG微平板法和T-RFLP技术研究连作穿心莲根际土壤微生物的数量、结构和功能多样性的报道[13]。高通量测序技术具有免培养、高通量的优点，是获取大量土壤微生物信息的良好工具[14]，本研究采用16S rRNA 基因高通量测序研究穿心莲连作对土壤细菌多样性及群落结构的影响，为揭示穿心莲连作障碍的成因及作用机制提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集与处理
土样采集地点位于广东省清远市英德市大湾镇，采集时间为2018年10月。五点取样法采样，利用抖根法收集穿心莲根际土壤，所采土壤样品分为2个处理组：连作组(连作5年穿心莲的根际土壤)和对照组(连作5年穿心莲周边相同母质的未耕作自然土壤)，每组5次重复，所采土样去除植物残体和石砾等杂物后放入灭菌样品袋，置冰盒中运回，在实验室−80 ℃条件下保存，待用。
1.2 仪器与试剂
Daek reader (Clare Chemical Research)；Qubit™ fluorometer (Invitrogen)；微型离心机(Baygene)；涡旋混合器(其林贝尔)；NanoDrop™ One (Thermo Fisher Scientific)；电泳仪(北京六一)；凝胶成像仪(Tanon)；PCR 仪(BioRad)；冷冻离心机(Eppendorf)。
MOBIO PowerSoil® DNA Isolation Kit (MOBIO)；Premix Taq (Ex Taq Version 2.0 plus dye)、DL15000 DNA Marker、100bp DNA Ladder和DL2000 DNA Marker (TaKaRa)；琼脂糖(浩玛生物)；Primer和Quant-iT™ Broad-Range DNA Assay Kit (Invitrogen)；E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit (Omega)；NEBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs)。
1.3 细菌多样性测定
DNA提取与PCR扩增：按照DNA 提取试剂盒说明书进行基因组DNA抽提后，利用NanoDrop One 检测 DNA 的浓度和纯度。PCR扩增采用的引物为细菌16S rRNA基因中的V4~V5区引物515 F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R (5′- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR反应体系为：Premix Taq 25 μL，10 mmol/L的上、下游引物各1 μL，DNA (20 ng/μl) 3 μL，Nuclease-free water 20 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s进行30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。PCR反应结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的片段长度和浓度。利用GeneTools Analysis Software (Version4.03.05.0, SynGene)对 PCR 产物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各 PCR 产物进行混合。使用E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit 凝胶回收试剂盒回收 PCR 混合产物，TE 缓冲液洗脱回收目标 DNA 片段。
建库与测序：按照NEBNext®Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina®标准流程进行建库操作。使用 Illumina Hiseq 2500 平台对构建的扩增子文库进行 PE250 测序。(以上试验均由广东美格基因科技有限公司完成)。
1.4 数据处理与分析
对Illumina Hiseq 2500测序得到的双端序列数据过滤，进行前期的质量控制，然后根据双端序列之间的重叠关系进行拼接，同时对拼接序列进行质量过滤，得到有效的拼接序列，将具有97%一致性的序列聚类成为可操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)。将每个OTU的代表序列与Silva数据库比对，获得代表性序列物种在各分类水平的注释信息。基于 OTU丰度表，使用 QIIME 软件包中的make_rarefaction_plots.py 等脚本进行Observed species指数的稀释曲线数据计算，并使用 R 软件绘制稀释曲线。基于均一化的 OTU 丰度表，使用 QIIME 软件包(V1.9.1)中的alpha_diversity.py脚本进行4种多样性指数(Observed species、Chao1、Shannon、Simpson)的计算。基于Unweighted Unifrac距离矩阵，使用qiime2 和 ggplot2 软件包进行主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)并绘图, 采用PCoA及分子方差分析(Analysis of molecular variance，Amova)进行组间群落结构差异显著性分析。使用R软件绘制柱状图、热图等。使用Excel 2016和SPSS 24.0 软件对试验数据进行统计分析，对处理组间的差异采用独立样本t检验进行分析。
2. 结果与分析
2.1 穿心莲连作处理对土壤细菌α多样性的影响
α多样性分析结果(表1)显示，连作组土壤中的丰富度指数包括Chao1指数和Observed species指数均显著低于对照组(P<0.05)，表明穿心莲连作使土壤细菌群落丰富度显著降低；连作组土壤中的多样性指数包括Shannon指数和Simpson指数均低于对照组，但差异并不显著。整体结果表明穿心莲连作使根际土壤细菌群落多样性减少。
表 1 穿心莲连作土壤与对照土壤细菌的α多样性1)Table 1. α diversity of bacteria in soil with continuous cropping of Andrographis paniculata and control soil组别
GroupChao1指数
Chao1 indexObserved species指数
Observed species indexShannon指数
Shannon indexSimpson指数
Simpson index对照组 Control group 2798.60±72.31 1994.60±83.74 9.05±0.40 0.992±0.0064 连作组 Continuous cropping group 2546.67±67.61 1782.40±45.94 8.92±0.12 0.991±0.0022 P 0.000*** 0.001** 0.517 0.877 1)表中数据为平均值 ± 标准差；“**”和“***”分别表示差异达到0.01和0.001的显著水平(t检验)
1) Data in the table are means ± standard deviations; “**”and“***” indicate differences at 0.01 and 0.001 significance levels respectively (t test)2.2 穿心莲连作处理对土壤细菌β多样性的影响
β多样性是对不同样品间的微生物群落构成进行比较。PCoA分析中，样品的空间距离越接近，表示样品的物种组成结构越相似。对连作组与对照组土壤样品进行PCoA分析(图1)，PC1的贡献率为33.63%，PC2的贡献率为13.47%，2个主成分的累计贡献率为47.10%，可以表征所有的变量特征。结果显示，对照组的5个样本能够与连作组5个样本明显分开，说明2个处理组样品的物种组成结构产生了明显差异。Amova分析可用于组间群落结构差异显著性分析，P 值小于0.05 说明组间差异显著。对连作组与对照组土壤样品进行Amova分析，结果显示Amova分析中P=0.011<0.05，说明两者组间群落结构差异显著。综上所述，穿心莲5年连作显著改变了土壤细菌群落结构。
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图 1 穿心莲连作土壤与对照土壤的PCoA (Unweighted Unifrac)分析Figure 1. PCoA (Unweighted Unifrac) analysis of soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control2.3 穿心莲连作处理对土壤细菌群落组成及丰度的影响
基于Unweighted Unifrac距离矩阵，通过非加权组平均聚类分析(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)法对连作组与对照组土壤样品进行门水平上的聚类与柱状图组合分析 (图2)。结果显示，连作组5个样本与对照组土壤5个样本在门水平上各自聚为一类，说明穿心莲5年连作明显改变了土壤细菌在门水平上的结构分布。从2个处理共检测到2769个OTU，分属于47个门，其中变形菌门Proteobacteria (相对丰度为22.53%~27.48%)、酸杆菌门Acidobacteria (相对丰度为19.62%~28.71%)、拟杆菌门Bacteroidetes (相对丰度为12.14%~17.75%)、绿弯菌门Chloroflexi (相对丰度为10.96%~11.62%)、浮霉菌门Planctomycetes (相对丰度为5.43%~6.26%)、疣微菌门Verrucomicrobia (相对丰度为4.24%~4.50%)、放线菌门Actinobacteria (相对丰度为2.86%~3.18%)、芽单胞菌门Gemmatimonadetes (相对丰度为2.48%~3.53%)、蓝藻细菌门Cyanobacteria (相对丰度为0.10%~4.81%)、Patescibacteria (相对丰度为0.49%~1.58%)和硝化螺旋菌门Nitrospirae (相对丰度为0.89%~1.09%) 这11个细菌门是2个处理组的主要细菌类群，上述门类相对丰度累计在连作组和对照组土壤中分别占细菌总数的96.44%和95.81%。
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图 2 穿心莲连作土壤与对照土壤细菌在门水平上的UPGMA聚类与柱状图组合分析S1~S5为对照组，C1~C5为连作组；图中左侧是UPGMA 聚类树结构，右侧是各样品在门水平上的物种相对丰度分布图Figure 2. UPGMA clustering and histogram combination analysis of bacteria in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control at the phylum levelS1−S5 belong to the control group, C1−C5 belong to the continuous cropping group; The left side of the figure is the UPGMA cluster tree structure, and the right side is the relative abundance distribution map of each sample at the phylum level对连作组与对照组土壤细菌主要细菌门的相对丰度采用独立样本t检验进行差异显著性分析(表2)。结果显示，拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门、绿弯菌门、蓝藻细菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、疣微菌门的相对丰度在2种处理土壤中差异不显著，而变形菌门、酸杆菌门、Patescibacteria的相对丰度在不同处理土壤中差异显著(P<0.05)，其中连作组土壤中变形菌门、酸杆菌门的相对丰度较对照组分别增加了21.97%、46.33% (P<0.05)，而Patescibacteria较对照组减少了68.99% (P<0.05)。
表 2 穿心莲连作土壤与对照土壤主要细菌门的相对丰度比较1)Table 2. Comparison of relative abundance of major bacterial phylums in soil of Andrographispaniculata continuous cropping and control门
Phylum相对丰度/%
Relative abundanceP 对照组
Control group连作组
Continuous cropping group变形菌门 Proteobacteria 22.53±3.40 27.48±2.42 0.029* 酸杆菌门 Acidobacteria 19.62±5.60 28.71±3.56 0.015* 拟杆菌门 Bacteroidetes 17.75±4.57 12.14±1.05 0.050 绿弯菌门 Chloroflexi 10.96±1.81 11.62±3.33 0.705 浮霉菌门 Planctomycetes 6.26±0.91 5.43±0.60 0.129 疣微菌门 Verrucomicrobia 4.50±2.52 4.24±0.74 0.834 放线菌门 Actinobacteria 3.18±0.65 2.86±0.23 0.325 芽单胞菌门 Gemmatimonadetes 3.53±0.93 2.48±0.17 0.064 蓝藻细菌门 Cyanobacteria 4.81±8.69 0.10±0.04 0.293 Patescibacteria 1.58±0.27 0.49±0.15 0.000*** 硝化螺旋菌门 Nitrospirae 1.09±0.26 0.89±0.17 0.184 1) 表中数据为平均值 ± 标准差；“*”和“***”分别表示差异达到0.05和0.001的显著水平(t检验)
1) Data in the table are means ± standard deviations; “*”and“***” indicate differences at 0.05 and 0.001 significance levels respectively (t test)在属分类水平上，根据所有样品在属分类水平的物种注释及丰度信息，选取穿心莲连作土壤与对照土壤细菌丰度排名前30个物种及其在每个样品中的丰度信息绘制热图，并从分类信息和样品间差异2个层面进行聚类(图3)。结果显示，穿心莲连作土壤5个样本与对照土壤5个样本丰度排名前30个属的相对丰度各自聚为一类，说明穿心莲5年连作明显改变了土壤细菌在属水平上的结构分布。2个处理组的主要细菌属为黄杆菌属Flavobacterium(相对丰度为1.84%~8.52%)、Bryobacter (相对丰度为1.57%~2.15%)、伯克氏菌属Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia (相对丰度为0.24%~2.17%)、HSB_OF53-F07 (相对丰度为1.81%~1.94%)、Candidatus_Solibacter (相对丰度为1.03%~1.76%)、ADurb.Bin063-1 (相对丰度为1.16%~1.65%)、MND1 (相对丰度为0.37%~1.46%)、Acidibacter (相对丰度为0.28%~1.43%)、Mucilaginibacter (相对丰度为0.38~1.37%)、Ellin6067 (相对丰度为0.41%~1.19%)、芽单胞菌属Gemmatimonas (相对丰度为0.57%~1.18%)、Haliangium (相对丰度为0.50%~1.10%)、硝化螺旋菌属Nitrospira (相对丰度为0.88%~1.08%)、Candidatus_Udaeobacter (相对丰度为0.68%~1.07%)和1921-2 (相对丰度为0.87%~1.00%)。
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图 3 穿心莲连作土壤与对照土壤中相对丰度前30的细菌群落在属水平的热图S1~S5为对照组，C1~C5为连作组；热图中着色方格对应的值为样品在属分类上的Z值，即为样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值；方格颜色越红，说明该样品相对丰度越高Figure 3. Heat map of bacterial communities with top 30 relative abundances in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control at the genus levelS1−S5 belong to the control group, C1−C5 belong to the continuous cropping group; The value corresponding to the colored square in the heatmap is the Z score of a sample in the genus classification, which is the difference between the relative abundance of the sample in the category and the average relative abundance of all samples in the category divided by the standard deviation of all samples in the category; The redder the color of the box, the higher the relative abundance of the sample对穿心莲连作土壤与对照土壤细菌主要细菌属的相对丰度采用独立样本t检验进行差异显著性分析(表3)。结果显示，HSB_OF53-F07、ADurb.Bin063-1、硝化螺旋菌属、1921-2 、Candidatus_Udaeobacter的相对丰度在2种处理土壤中差异不显著(P>0.05)，而黄杆菌属、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、伯克氏菌属、MND1、芽单胞菌属、Mucilaginibacter、Acidibacter、Ellin6067、Haliangium的相对丰度在不同处理土壤中差异显著(P<0.05)，其中连作组土壤中Bryobacter、Candidatus_Solibacter、Mucilaginibacter、Acidibacter、伯克氏菌属的相对丰度较对照组分别增加了36.94%、70.87%、260.53%、410.71%和804.17% (P<0.05)，而黄杆菌属、MND1、芽单胞菌属、Ellin6067、Haliangium的相对丰度较对照组分别减少了78.40%、74.66%、51.69%、65.55%和54.55% (P<0.05)。
表 3 穿心莲连作土壤与对照土壤细菌主要细菌属相对丰度比较1)Table 3. Comparison of relative abundance of major bacterial genera in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control属
Genus相对丰度/%
Relative abundanceP 对照组
Control group连作组
Continuous cropping groupFlavobacterium 8.52±4.19 1.84±0.41 0.023* HSB_OF53-F07 1.94±0.50 1.81±0.49 0.672 Bryobacter 1.57±0.35 2.15±0.23 0.014* ADurb.Bin063-1 1.16±0.66 1.65±0.38 0.182 Candidatus_Solibacter 1.03±0.33 1.76±0.17 0.005** Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia 0.24±0.05 2.17±0.13 0.000*** Nitrospira 1.08±0.26 0.88±0.17 0.172 1921-2 0.87±0.20 1.00±0.18 0.319 MND1 1.46±0.28 0.37±0.16 0.000*** Candidatus_Udaeobacter 1.07±0.63 0.68±0.11 0.216 Gemmatimonas 1.18±0.31 0.57±0.09 0.010* Mucilaginibacter 0.38±0.15 1.37±0.18 0.000*** Acidibacter 0.28±0.09 1.43±0.23 0.000*** Ellin6067 1.19±0.52 0.41±0.14 0.026* Haliangium 1.10±0.18 0.50±0.08 0.000*** 1) 表中数据为平均值±标准差；“*”、“**”和“***”分别表示差异达到0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验)
1) Data in the table are means±standard deviations; “*”，“**”and“***”indicate differences at 0.05, 0.01 and 0.001 significance levels respectively (t test)3. 讨论与结论
土壤中的微生物群落对植物的生长发育具有重要作用[15]，其中细菌具有维持土壤肥力的作用[16]，连作通常会使土壤细菌数量降低，导致土壤肥力类型由高肥力的“细菌型” 向低肥力的“真菌型”转化[17]。土壤细菌的丰富度和多样性对于维持土壤生态健康发挥着关键作用[18]。本研究发现，5年连作处理使穿心莲根际土壤细菌较对照丰富度显著降低，多样性减少，与谭勇等[19]对未种植三七土壤与3年生三七根际土壤细菌群落多样性水平研究的结果类似。穿心莲在其生长过程中会向土壤中释放阿魏酸、对羟基苯甲酸等酚酸类化感自毒物质[20]。有研究指出，一定浓度的阿魏酸、对羟基苯甲酸及其混合酚酸会抑制土壤氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌的生长[21]。据此可以推测，在本研究中，经过5年连作处理后，穿心莲根际土壤中可能积累了一定量的化感自毒物质而抑制了部分土壤细菌的生长，从而降低了细菌种群多样性和丰富度水平。
本研究结果显示，穿心莲5年连作显著改变了土壤细菌群落结构。从2个处理组土壤样品中共检测到2769个OTU，分属于47门885属，穿心莲5年连作明显改变了土壤细菌在门和属水平上的结构分布。在门水平上，连作穿心莲根际土壤中优势细菌类群为变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、疣微菌门、放线菌门和芽单胞菌门，与前人研究连作穿心莲的优势细菌类群结果大致相同[13]。在2个处理组中丰度最高的是变形菌门和酸杆菌门，这2种菌门在2个处理组中合计占比均超过40%。变形菌门在土壤中的C、N和S循环中起着关键作用[22]，但同时也含有一些致病菌[23]，因此连作组土壤中变形菌门的相对丰度较对照组显著增加，可能会增加一些不利于穿心莲生长发育的致病菌。酸杆菌门是寡营养细菌[24]，可以作为较贫瘠土壤环境的指示[25]，而连作组土壤中酸杆菌门的相对丰度较对照组显著增加，说明连作土壤的营养状况出现恶化。门水平上变化显著的还有Patescibacteria，但Patescibacteria没有可培养细菌代表，目前对其功能还不了解[26]。在属水平上，有10个优势菌属的相对丰度变化显著(P<0.05)，其中拟杆菌门下的黄杆菌属、变形菌门下的伯克氏菌属、Haliangium尤其值得关注。有报道指出黄杆菌属具有植物促生作用[27]，部分菌群可产生较高活性的几丁质酶抑制植物病原真菌的生长[28]。已有研究从Haliangium中分离出抗植物病原真菌物质，说明Haliangium具有潜在的生防作用[29]。连作组中黄杆菌属和Haliangium相对丰度较对照组显著减少，这2种有益生防细菌的相对丰度显著下降可能导致土壤中植物病原真菌数量增加。伯克氏菌属是一类重要的植物病原细菌，会引起植物腐烂、枯萎和严重坏死等病害症状[30]，因此连作组土壤中伯克氏菌属相对丰度的显著增加可能会对穿心莲的生长发育产生负面影响。
综上所述，穿心莲5年连作降低了土壤细菌丰富度和多样性水平，使土壤微生态系统稳定性降低，同时有益菌相对丰度显著降低，而病原菌相对丰度显著增加造成细菌群落结构改变。土壤细菌丰富度和多样性水平降低，细菌群落结构改变，打破了原有的土壤微生态平衡，可能是穿心莲连作障碍的重要原因之一。合理轮作、间作及施加合适的土壤改良剂等措施可以增加土壤微生物多样性和改善土壤微生物群落结构，对土壤微生态环境产生积极影响，是缓解连作障碍的有效措施[31-34]，目前有关穿心莲连作障碍缓解措施的研究正在进行中。
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图 1 4种不同水肥处理中尾叶桉无性系生长指标的变化
T1：水肥双因素胁迫，T2：水分单因素胁迫，T3：养分单因素胁迫；各小图相同指标柱子上不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05，Duncan’s法)
Figure 1. Growth index changes of Eucalyptus urophylla clones in four different water and fertilizer treatments
T1: Water and nutrient deficiency stress, T2: Water deficiency stress, T3: Nutrient deficiency stress; Different lowercase letters on columns of the same index in each figure indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, Duncan’s method)
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图 2 3种胁迫处理中尾叶桉差异表达基因分布情况
T1：水肥双因素胁迫，T2：水分单因素胁迫，T3：养分单因素胁迫
Figure 2. Distribution of differentially expressed genes of Eucalyptus urophylla in three stress treatments
T1: Water and nutrient deficiency stress, T2: Water deficiency stress, T3: Nutrient deficiency stress
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图 3 3种胁迫处理中尾叶桉差异表达基因韦恩图
T1：水肥双因素胁迫，T2：水分单因素胁迫，T3：养分单因素胁迫；括号中的百分数表示该基因在所有上调或下调基因中占的比例
Figure 3. Venn diagram of differentially expressed genes of Eucalyptus urophylla in three stress treatments
T1: water and nutrient deficiency stress, T2: water deficiency stress, T3: Nutrient deficiency stress; The percentage in parenthesis indicates the proportion of the gene in all up-regulated or down-regulated genes
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图 4 3种胁迫处理中尾叶桉差异表达基因的GO分类
Figure 4. GO categories of differentially expressed genes of Eucalyptus urophylla in three stress treatments
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图 5 3种胁迫处理中尾叶桉差异表达基因的KEGG分析
T1：水肥双因素胁迫，T2：水分单因素胁迫，T3：养分单因素胁迫
Figure 5. KEGG analyses of differentially expressed genes of Eucalyptus urophylla in three stress treatments
T1: Water and nutrient deficiency stress, T2: Water deficiency stress, T3: Nutrient deficiency stress
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图 6 4个基因的转录组测序结果与qRT-PCR验证结果的相关性分析
Figure 6. Correlation analyses between transcriptome profiling and qRT-PCR verification results of four genes
表 1 qRT-PCR验证的引物信息
Table 1 Primers for qRT-PCR validation
基因
Gene引物序列(5′→3′)
Primer sequenceEucgr.F02337.1 F: 5′-CTGTTCGGTGAATTGCCACG-3′ R: 5′-AGGGATCTGCTGCGAGAATG-3′ Eucgr.F00180.1 F: 5′-CTCGTCGCTCGAATGGAAGA-3′ R: 5′-CTTCTTGGAGTGAGGCTCCG-3′ Eucgr.K02129.1 F: 5′-GGGAACGACTGACAGCTGAA-3′ R: 5′-CCGGATGTATGCTCGGAGAC-3′ Eucgr.B03214.1 F: 5′-CCAACACCACTTCGACCTCTC-3′ R: 5′-TGACCTTGAAGGAGAGGGACT-3′ 
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表 2 3种胁迫处理中尾叶桉叶片转录组测序质量1)
Table 2 Transcriptome sequencing quality of Eucalyptus urophylla leaves in three stress treatments
处理
Treatment重复
Replicate原始序列数
No. of raw reads去杂序列数
No. of clean reads去杂碱基数/(×109)
No. of clean bases错误率/%
Error rateQ20/% Q30/% GC含量/%
GC contentCK 1 102 875 922 98 982 508 14.85 0.01 97.84 94.29 47.41 2 91 836 470 88 460 334 13.07 0.02 96.61 91.37 47.30 3 88 160 956 85 873 298 12.82 0.02 95.22 88.34 45.19 T1 1 118 961 564 112 278 350 16.84 0.02 95.26 88.29 47.78 2 99 694 016 96 296 560 14.44 0.01 98.23 95.22 47.15 3 96 089 830 93 089 066 13.96 0.02 97.23 92.76 50.93 T2 1 93 283 460 90 948 242 13.64 0.01 98.39 95.68 45.45 2 91 547 658 88 602 608 13.27 0.02 95.06 87.93 45.32 3 92 936 506 90 084 620 13.51 0.01 98.15 95.05 46.51 T3 1 94 953 336 91 803 584 13.55 0.02 96.68 91.55 47.04 2 90 612 280 87 845 130 13.11 0.02 95.14 88.20 48.26 3 97 341 022 94 914 876 14.24 0.01 97.47 93.33 44.54 1) T1：水肥双因素胁迫，T2：水分单因素胁迫，T3：养分单因素胁迫；Q20：Phred数值大于20的碱基占总碱基的百分比，Q30：Phred数值大于30的碱基占总碱基的百分比；GC含量：去杂序列中G与C在4种碱基中占的百分比
1) T1: Water and nutrient deficiency stress, T2: Water deficiency stress, T3: Nutrient deficiency stress; Q20: Percentage of bases with phred greater than 20 in total bases; Q30: Percentage of bases with phred greater than 30 in total bases; GC content: Percentage of G and C in four bases in clean reads
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