Biodiversity comparison of endophytic fungi from wild and artificially cultivated Dendrobium officinale and screening of fungal strains with anti-anthracnose activities
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摘要:目的
系统分析和比较野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生真菌的多样性，并从中筛选抗炭疽病活性的菌株。
方法利用组织块分离法分离铁皮石斛内生真菌，采用载玻片培养法和基于rRNA内转录间隔区基因(rDNA-ITS)的分子鉴定法对它们进行鉴定，采用平板对峙法筛选抗炭疽病内生真菌。
结果从铁皮石斛中分离到236株内生真菌，其中132株分离自野生植株,104株分离自人工栽培植株，野生植株内生真菌的总定殖率(50.46%)、总分离率(61.11%)及多样性指数(2.95)均明显高于人工栽培植株(其相应数值分别为39.35%、48.14%和2.49)；筛选到34株对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides具抑制活性的内生真菌菌株，其中菌株F102(蜡孔菌Ceriporia sp.)、F27(硬孔菌Rigidoporus sp.)、F103(蚁巢伞菌Termitomyces sp.)和F122(伏革菌Peniophora sp.)的抑制效果较好，抑菌率分别为93.06%、88.20%、87.48%和84.57%。
结论野生与人工栽培铁皮石斛内生真菌的生物多样性和类群结构具有明显差异，并且其中蕴含着丰富的抗炭疽病活性菌株，这为人工栽培铁皮石斛药材品质的改良及其炭疽病的生物防治奠定了基础。
Abstract:ObjectiveTo systematically analyze and compare the diversity of endophytic fungi from wild and cultivated Dendrobium officinale, and screen fungal strains with anti-anthracnose activities.
MethodEndophytic fungi of D. officinale were isolated by tissue block separation method, and they were identified by slide culture method and molecular identification method based on internal transcribed spacer regions of ribosomal DNA (rDNA-ITS). Screening for endophytic fungi against anthracnose was carried out by plate method.
ResultTotally 236 endophytic fungal strains were isolated from D. officinale(132 from wild plants and 104 from artificially cultivated plants). Total colonization rate (50.46%), total isolation rate (61.11%) and diversity index (2.95%) of endophytic fungi in wild plants were significantly higher than those in artificially cultivated plants (the corresponding values were 39.35%, 48.14% and 2.49, respectively). We screened out 34 strains of endophytic fungi with inhibitory activities against Colletotrichum gloeosporioides. Amomg them, the strains Ceriporia sp. F102, Rigidoporus sp. F27, Termitomyces sp. F103 and Peniophora sp. F122 showed higher inhibitory effects, and their inhibition rates were 93.06%, 88.20%, 87.48% and 84.57%, respectively.
ConclusionThe biodiversity and community structure of endophytic fungi of wild D. officinale and artificially cultivated D. officinal had significant differences, and abundant strains with anti-anthracnose activities were obtained from them, which lays the foundation for improving the quality of medicinal materials of artificially cultivated D. officinal and the biocontrol of D. officinale anthracnose.
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氮(N)和磷(P)是影响植物生命活动的必要元素，对调节植物生长发育有重要意义[1]。热带和亚热带地区的土壤风化程度较高导致了土壤磷的缺乏，引起该地区的陆地生态系统受到磷的限制[2]。我国华南地区位于亚热带，近年来的社会发展和人类活动导致了氮沉降的持续发生[3]，可能会进一步加剧磷的限制作用。华南地区林业生产上，经常通过施加磷肥缓解森林土壤的磷缺乏，因此氮、磷添加对于林木生长发育的影响受到广泛关注。
碳(C)是组成植物体的重要结构性物质[4]，在调节林木生长发育和维持生态系统平衡方面发挥着关键作用[5-6]。研究表明，氮和磷等营养元素的输入能够影响植物的碳累积[7]，适度的氮沉降通常有利于植物的生长发育，而长期过量的氮沉降则抑制植物生长，引起土壤酸化并减弱生态系统的固碳能力[8]。磷添加可以缓解生态系统的磷限制，并提高生态系统的生产力。当前，磷沉降的研究主要集中在水生态系统[9]，鲜有森林生态系统磷沉降的报道。近年来，国内对森林生态系统碳储量的研究主要集中在不同林龄[10]、林分类型[11]和土壤[12]等方面，氮沉降对于森林碳储量的影响仍存在争议[13-14]，鲜有磷添加影响森林碳储量的报道。
密度是自然界中重要的选择压力，林分密度影响了植物对光照和养分的吸收利用，并引起相邻植物间对资源的激烈竞争，从而改变森林生物量的积累与分配[15]。当前，关于密度对植物幼苗的影响已有少量研究[16-17]，但鲜见氮、磷添加与密度的交互作用对幼苗碳储量影响的报道。樟树Cinnamomum camphora是我国特有的珍贵用材和经济树种[18]，前人主要研究了樟树的光合作用[19]、生理[20]、土壤碳氮储量[21]、施氮对土壤氮矿化的影响[22]和凋落物量及养分动态特征等[23]。本研究以1年生樟树幼苗为试验材料，通过分析氮、磷添加和不同种植密度对樟树幼苗各器官碳储量和分配格局的影响，以期了解氮磷沉降和密度影响樟树碳分配的机制，为氮磷沉降环境下亚热带地区樟树林的可持续经营提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于广东省广州市华南农业大学试验林(113°21′E，23°09′N)，该地年平均气温21.9 ℃，平均相对湿度77%，年降雨量约为1 736 mm，全年水热同期，雨量充沛，属亚热带季风气候。试验地光照充足，适合幼苗的生长，土壤类型为砂页岩发育的酸性红壤，土壤磷含量较低。处理前土壤的pH为4.02，有机质、全氮和全磷的质量分数分别为14.27、0.62和0.17 g·kg−1，碱解氮和有效磷的质量分数分别为57.40和0.10 mg·kg−1。
1.2 试验设计
以广东国森林业有限公司所提供的樟树1年生实生苗为试验材料，幼苗平均株高0.47 m，平均地径0.36 cm，平均冠幅11.10 cm。采用直径35 cm，深30 cm的无纺布美植袋种植，基质为该试验地0~20 cm土层的土壤。本试验选择氯化铵(NH4Cl)模拟大气氮沉降，以二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)进行磷添加。根据样地的氮沉降水平背景值以及参考同类研究方法[24-25]，并考虑到未来的氮沉降持续增加，确定N和P的添加量。
试验时间为2017年6—9月。试验采用4×4双因素析因设计。N、P添加处理设置4个水平：不加N和P(对照，CK)，加N，加P，加N+P。N、P及N+P每年的添加量分别为NH4Cl 40 g·m−2，NaH2PO4·2H2O 20 g·m−2，NH4Cl 40 g·m−2+ NaH2PO4·2H2O 20 g·m−2。种植密度设置4个水平：10、20、40和80株·m−2。试验采用完全随机区组设计，共16个处理，每处理3次重复，共48个小区，每个小区16株幼苗。根据处理水平的要求，N、P添加时，将各处理每次所需质量的肥料溶于12 L水中，向每袋的幼苗浇灌200 mL溶液，保证不会引起烧苗的现象，不施肥处理的只浇灌相同量的水。自6月起的每月月初和月中分2次向幼苗施肥直至收获，共施肥8次。幼苗处理前的平均苗高和平均地径分别为(0.47±0.03)和(0.36±0.07) cm。处理前的幼苗各器官生物量和碳含量见表1。
表 1 幼苗处理前各器官单株生物量和碳含量(平均值±标准误差)Table 1. Biomass and carbon content per seedling before treatment (mean ± SE)器官
Organ单株生物量/g
Biomass per seedlingw(C)/(g·kg−1) 根 Root 2.18±1.12 469.57±0.34 茎 Stem 1.11±0.25 487.02±1.92 枝 Branch 0.11±0.08 460.53±1.49 叶 Leaf 0.88±0.31 515.13±2.56 1.3 研究方法
2017年9月底，取16种处理的幼苗各15株，将植株分解为根、茎、枝和叶4部分，称量各器官鲜质量，再将其分别装入信封中编号，置烘箱中105 ℃条件下杀青2 h，转至80 ℃烘24 h至恒质量，称量各器官干质量，求出单株幼苗各器官的生物量，再根据种植密度估算出单位面积各器官的生物量。将不同处理幼苗的根、茎、枝和叶样品充分粉碎后，过60目筛，单株各器官分别取10 g样品，用重铬酸钾外加热法测定碳含量[26-27]，计算幼苗各器官碳储量(碳储量=生物量×碳含量)。土壤pH用电位法测定，用重铬酸钾氧化−外加热法测定土壤有机质含量，土壤全N和全P分别用半微量凯氏法和钼蓝比色法测定，土壤碱解N和有效P含量分别采用碱解−扩散法和0.5 mol·L−1碳酸氢钠法测定[26]。
1.4 数据处理
用Microsoft Excel 2003对数据进行平均值、标准误差分析和作图。用SAS 9.3统计分析软件对植物各器官碳含量和碳储量进行方差分析，而后对有显著差异的数据进行Duncan’ s多重检验，P<0.05为差异显著。
2. 结果与分析
2.1 氮、磷添加对不同种植密度樟树幼苗各器官碳含量的影响
试验结束时，各添加处理下的幼苗茎、枝、根的C含量差异不大。在各种植密度条件下，N和N+P添加处理下的幼苗叶片C含量均高于不加N和P处理(CK)。此外，随着种植密度的增大，叶片C含量表现出下降的趋势(表2)。
表 2 不同种植密度及氮、磷添加处理幼苗各器官的碳含量1)(平均值±标准误差)Table 2. Carbon contents of organs per seedling under different planting densities and nitrogen and phosphorus additions (mean±SE)种植密度/(株·m−2)
Planting densityN、P添加
N and P additionsw(C)/(g·kg−1) 根 Root 茎 Stem 枝 Branch 叶 Leaf 10 CK 452.75±10.52Aa 492.11±21.67Aa 478.82±7.42Aa 477.81±3.18Bc N 447.34±4.82Ba 494.13±2.16Aa 477.82±3.31Ba 499.36±4.91Ab P 446.27±3.87Aa 500.56±1.57Aa 481.53±4.88ABa 501.17±1.56Ab N+P 462.95±2.60Aa 489.97±1.04Ba 481.98±5.13Aa 512.34±3.61Aa 20 CK 460.81±5.39Aa 500.11±1.83Aa 481.11±3.66Aa 494.30±2.87Aab N 457.91±8.47ABa 503.78±7.88Aa 480.64±3.53ABa 502.38±4.51Aa P 466.52±3.48Aa 496.91±2.59Aa 474.63±4.16Ba 484.32±4.44ABb N+P 460.04±4.44Aa 500.79±1.46Aa 482.60±5.00Aa 503.61±4.71Aa 40 CK 459.78±1.86Aab 497.80±2.11Aa 474.88±5.83Aab 474.64±5.10Bab N 469.60±5.10Aab 499.21±8.71Aa 488.58±3.32Aa 480.58±6.92Bab P 447.74±12.65Ab 485.44±5.03Bab 471.16±4.35Bb 465.51±4.06BCb N+P 471.79±4.12Aa 472.21±1.47Cb 475.74±4.70Aab 484.62±4.63Ba 80 CK 457.01±5.11Aa 490.15±7.01Aa 492.16±6.15Aa 480.11±2.77Ba N 457.79±6.02ABa 492.82±2.25Aa 482.77±2.22ABab 483.05±1.17Ba P 449.37±3.65Aa 499.93±3.63Aa 490.58±3.17Aa 448.61±14.61Cb N+P 452.35±14.07Aa 496.53±3.24Aa 475.81±5.28Ab 486.18±4.52Ba 1) 同列数据后，不同大写字母表示相同N、P添加处理下不同种植密度间差异显著，不同小写字母表示相同种植密度下不同N、P添加处理间差异显著(P<0.05，Duncan’ s法)
1)Different capital letters in the same column indicate significant differences among different planting densities under the same N/P addition treatment, and different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different N/P addition treatments under the same planting density (P<0.05, Duncan’ s test)2.2 氮、磷添加对不同种植密度樟树幼苗各器官碳储量的影响
与对照相比，N、P添加处理对单株幼苗C总储量整体表现为促进作用，但N、P添加各处理间差异不显著。随着种植密度的增大，相同N、P添加处理的单株幼苗C总储量呈现下降的趋势(表3)。
表 3 不同种植密度及氮、磷添加处理下单株幼苗各器官的碳储量和分配比例1)Table 3. Carbon storage of organs and its allocation per seedling under different planting densities and nitrogen and phosphorus additions种植密度/
(株·m−2)
Planting densityN、P添加
N and P additions根 Root 茎 Stem 枝 Branch 叶 Leaf 全株 Total C储量/g
C storage分配比例/%
RatioC储量/g
C storage分配比例/%
RatioC储量/g
C storage分配比例/%
RatioC储量/g
C storage分配比例/%
RatioC储量/g
C storage分配比例/%
Ratio10 CK 1.19Aa 41.66 0.97Aa 33.95 0.16Bb 5.47 0.54Ac 18.92 2.86Ab 100 N 2.04Aa 35.06 1.30Aa 22.32 0.78Aa 13.37 1.70Ab 29.25 5.82Aa 100 P 1.90Aa 32.78 1.04ABa 17.94 0.93Aa 16.00 1.93Ab 33.28 5.79Aa 100 N+P 2.13Aa 29.27 1.30Aa 17.86 1.05Aa 14.50 2.79Aa 38.37 7.27Aa 100 20 CK 1.00Aa 39.16 0.91ABa 35.33 0.15Bb 5.78 0.51Ac 19.73 2.57ABb 100 N 1.37Ba 32.94 1.07Aa 25.74 0.52Ba 12.38 1.21Ab 28.93 4.17Ba 100 P 1.42Ba 39.72 1.16Aa 32.53 0.26Bb 7.20 0.73Bc 20.55 3.58Ba 100 N+P 1.19Ba 28.11 0.98Aa 23.18 0.51Ba 11.94 1.56Ba 36.76 4.24Ba 100 40 CK 0.79Ab 37.97 0.75Ba 35.96 0.14Bb 6.83 0.40Ab 19.23 2.09BCb 100 N 1.36Ba 46.43 0.96Aa 32.86 0.23Cab 7.74 0.38Bb 12.97 2.93Ca 100 P 1.34Ba 47.16 0.80Ca 28.24 0.27Ba 9.34 0.43BCb 15.26 2.84BCa 100 N+P 1.27Ba 39.60 1.00Aa 31.36 0.31BCa 9.72 0.62Ca 19.33 3.20BCa 100 80 CK 0.79Aa 42.11 0.75Ba 39.84 0.22Aa 11.85 0.12Ba 6.20 1.88Ca 100 N 1.00Ba 43.05 0.90Aa 38.54 0.23Ca 9.74 0.20Ba 8.66 2.33Ca 100 P 0.71Ca 36.03 0.85BCa 42.94 0.21Ba 10.71 0.20Ca 10.33 1.98Ca 100 N+P 1.07Ba 42.72 0.99Aa 39.66 0.18Ca 7.01 0.27Ca 10.61 2.50Ca 100 1) 同列数据后，不同大写字母表示相同N、P添加处理下不同种植密度间差异显著，不同小写字母表示相同种植密度下不同N、P添加处理间差异显著(P<0.05，Duncan’ s法)
1) Different capital letters in the same column indicate significant differences among different planting densities under the same N/P addition, and different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different N/P addition under the same planting density (P<0.05, Duncan’ s test)各处理的单株幼苗各器官的C储量分配表现各异。CK处理各密度单株幼苗的C储量的分配比例呈现为根>茎>叶>枝；对于N添加处理，在种植密度10和20株·m−2条件下，单株幼苗C储量分配比例呈现为根>叶>茎>枝，种植密度40株·m−2条件下其呈现为根>茎>叶>枝，种植密度80株·m−2条件下其呈现为根>茎>枝>叶；对于P添加处理，在种植密度10株·m−2条件下，单株幼苗C储量分配比例呈现为叶>根>茎>枝，种植密度20和40株·m−2条件下其呈现为根>茎>叶>枝，种植密度80株·m−2条件下其呈现为茎>根>枝>叶；对于N+P添加处理，在种植密度10和20株·m−2条件下，单株幼苗C储量的分配比例呈现为叶>根>茎>枝，种植密度40和80株·m−2条件下的单株幼苗C储量分配比例呈现为根>茎>叶>枝。可见，P和N+P添加处理在低种植密度条件下，单株幼苗叶的C储量分配比例相对较高，高密度种植则促进了C储量向茎进行分配。
由表4的方差分析可知，单株幼苗各器官C储量和总C储量在各种植密度间和不同N、P添加处理间均存在显著性差异，种植密度对单株幼苗及各器官C储量的影响均大于各N、P添加处理。种植密度和N、P添加处理的交互作用对单株幼苗的枝、叶和总C储量有显著影响。
表 4 不同种植密度和氮、磷添加对单株幼苗各器官碳储量交互作用的方差分析Table 4. Variance analyses of interaction effects of planting density and nitrogen and phosphorus additions on carbon storage of organs per seedling器官碳储量
Carbon storage of organs种植密度
Planting densityN、P添加
N and P additions种植密度与N、P添加交互作用
Interaction effect of planting density and N and P additionsF P F P F P 根 Root 17.219 0.000 6.261 0.001 1.003 0.441 茎 Stem 6.800 0.000 4.157 0.007 0.745 0.667 枝 Branch 33.459 0.000 13.035 0.000 5.281 0.000 叶 Leaf 93.367 0.000 28.212 0.000 8.978 0.000 全株 Total 54.661 0.000 18.687 0.000 3.565 0.001 2.3 氮、磷添加和不同种植密度处理下樟树幼苗各器官的单位面积碳储量
如表5所示，各N、P添加处理下幼苗各器官的单位面积C储量有所差异。总体而言，N、P添加处理能够促进幼苗的单位面积C储量增加，但是随着种植密度的增大，其促进效果逐渐减弱。
表 5 不同种植密度及氮、磷添加处理下幼苗各器官的单位面积碳储量和分配比例1)Table 5. Carbon storage of organs and its allocation in unit area under different planting densities and nitrogen and phosphorus additions种植密度/
(株·m−2)
Planting densityN、P添加
N and P additions根 Root 茎 Stem 枝 Branch 叶 Leaf 全株 Total C储量/
(g·m−2)
C storage分配比
例/%
RatioC储量/
(g·m−2)
C storage分配比
例/%
RatioC储量/
(g·m−2)
C storage分配比
例 /%
RatioC储量/
(g·m−2)
C storage分配比
例/%
RatioC储量/
(g·m−2)
C storage分配比
例/%
Ratio10 CK 11.89Ca 41.66 9.70Da 33.95 1.56Cb 5.47 5.40Cc 18.92 28.55Db 100 N 20.40Ca 35.00 12.98Ca 22.32 7.78Ba 13.37 17.02Bb 29.55 58.18Ca 100 P 18.99Ba 32.78 10.39Ca 17.94 9.27Ca 16.00 19.28Ab 33.28 57.93Ca 100 N+P 21.28Ca 29.27 12.99Ca 17.86 10.54Aa 14.50 27.90Aa 38.37 72.71Ca 100 20 CK 20.07BCa 39.16 18.11Ca 35.33 2.96Cb 5.78 10.11Bc 19.73 51.25Cb 100 N 27.47Ca 32.94 21.46BCa 25.74 10.33Ba 12.38 24.13Bb 28.93 83.39BCa 100 P 28.41Ba 39.72 23.27Ba 32.53 5.15BCb 7.20 14.70Ac 20.55 71.53Ba 100 N+P 23.84Ca 28.11 19.66Ca 23.18 10.13Aa 11.94 31.18Aa 36.76 84.80BCa 100 40 CK 31.80Bb 37.97 30.11Ba 35.96 5.72Bb 6.83 16.11Ab 19.23 83.74Bb 100 N 54.37Ba 46.43 38.47Ba 32.86 9.07Bb 7.74 15.18Bb 12.97 117.10Ba 100 P 53.62Aa 47.16 32.10Ba 28.24 10.62Ba 9.34 17.34Ab 15.26 113.68Ba 100 N+P 50.62Ba 39.60 40.08Ba 31.36 12.42Aa 9.72 24.70Aa 19.33 127.82Ba 100 80 CK 63.24Aa 42.11 59.83Aa 39.84 17.80Aa 11.85 9.31Ba 6.20 150.19Aa 100 N 80.25Aa 43.05 71.86Aa 38.54 18.17Aa 9.74 16.15Aa 8.66 186.43Aa 100 P 57.14Aa 36.02 68.12Aa 42.94 16.99Aa 10.71 16.39Aa 10.33 158.64Aa 100 N+P 85.55Aa 42.72 79.42Aa 39.66 14.03Aa 7.01 21.25Aa 10.61 200.24Aa 100 1) 同列数据后，不同大写字母表示相同N、P添加处理下不同种植密度间差异显著，不同小写字母表示相同种植密度下不同N、P添加处理间差异显著(P<0.05，Duncan’ s法)
1)Different capital letters in the same column indicate significant differences among different planting densities under the same N/P addition, and different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different N/P additions under the same planting density (P<0.05, Duncan’ s test)CK处理情况下，种植密度10、20和40株·m−2时幼苗各器官的单位面积C储量呈现为根>茎>叶>枝，种植密度80株·m−2时其呈现为根>茎>枝>叶；N添加处理情况下，种植密度10和20株·m−2时幼苗各器官单位面积C储量为根>叶>茎>枝，种植密度40株·m−2时其呈现为根>茎>叶>枝，种植密度80株·m−2时其呈现为根>茎>枝>叶；P添加处理情况下，种植密度10株·m−2时幼苗各器官单位面积C储量呈现为叶>根>茎>枝，种植密度20和40株·m−2时其呈现为根>茎>叶>枝，种植密度80株·m−2时其呈现为茎>根>枝>叶；N+P添加处理下，种植密度10、20株·m−2时幼苗各器官单位面积C储量为叶>根>茎>枝，种植密度40和80株·m−2时其呈现为根>茎>叶>枝。总体而言，在各种植密度条件下，氮、磷添加处理的幼苗各器官的单位面积C储量基本上均有所增加。氮、磷添加对低种植密度下幼苗叶的单位面积C储量分配比例有促进效果，在高种植密度条件下，幼苗叶的单位面积C储量分配比例降低。
由表6可知，单株幼苗及根、茎和枝的单位面积C储量在各种植密度间和不同N、P添加处理间均有显著性差异，幼苗叶的单位面积C储量只在各氮、磷添加处理间有显著性差异，其中种植密度对单株幼苗及根茎和枝的单位面积C储量的作用较强，N、P添加处理对幼苗叶有较大影响。种植密度和N、P添加处理的交互作用对幼苗枝和叶的单位面积C储量有显著影响。
表 6 不同种植密度及氮、磷添加对幼苗各器官的单位面积碳储量交互作用的方差分析Table 6. Variance analyses of interaction effects of planting density and nitrogen and phosphorus additions on carbon storage of organs in unit area器官单位面积碳储量
Carbon storage of organs in
unit area种植密度
Planting densityN、P添加
N and P additions种植密度与N、P添加交互作用
Interaction effect of planting density and N and P additionsF P F P F P 根 Root 51.780 0.000 3.743 0.013 1.003 0.313 茎 Stem 127.420 0.000 2.741 0.047 0.676 0.730 枝 Branch 29.407 0.000 6.744 0.000 2.670 0.007 叶 Leaf 1.959 0.123 26.787 0.000 2.340 0.017 全株 Total 201.698 0.000 3.062 0.030 0.874 0.550 3. 讨论与结论
3.1 氮、磷添加对于不同种植密度樟树幼苗碳含量与分配的影响
本研究结果显示，N、P添加处理对幼苗根、茎和枝的C含量影响不显著，这与Currey等[28]的研究结果相类似。原因可能是植物体内的功能性物质含量受环境影响较大，而结构性物质受影响较小的缘故。C是组成植物体的结构性物质，故其含量较为稳定。此外，C通常不是植物生长受限的主要元素，所以其在大部分植物体内的含量较高且变化较小[29]。翁俊等[30]的研究结果表明，N沉降能促进毛竹Phyllostachys edulis叶的C含量增加，本研究也发现N和N+P添加处理在低密度种植时能够促使樟树幼苗叶的C含量上升。因为叶片是光合固碳的重要器官，N添加对植物叶片N素、叶绿素和光合色素含量[31]以及Rubisco酶浓度[32]有促进作用，从而提高植物的光合速率，最终引起叶C含量的升高。另外，N和P的输入可以缓解土壤的养分限制，从而增强植物根系对营养元素的吸收能力[33]，间接促进植物叶片光合作用的固C能力。
密度影响着植物个体生长过程中可获取的资源环境空间[34]。通常情况下，种植密度越大，资源对植物的限制作用越大[15]。本研究发现随着种植密度的增大，樟树幼苗叶片C含量表现出下降的趋势。这是因为高种植密度下个体间对养分的争夺较为激烈，并且植株间距小导致叶片较多地重叠和相互遮蔽，从而引起植物光合速率下降，造成植物叶片光合固碳能力的降低[35]。
3.2 氮、磷添加对不同种植密度樟树幼苗碳储量与分配的影响
本研究表明，相比于对照，N、P添加处理能够促进幼苗平均单株和单位面积C总储量增加，这与Yan等[7]的研究结果相类似，原因可能是N的输入提升了植物的净初级生产力[36]，从而提高幼苗的固C量。植物体内蛋白质的合成需要光合作用同化的C作为主要组分，而适当的P输入有助于蛋白质的积累，从而间接影响植物C累积[37]。N和P共同参与了植物体内光合代谢和矿质代谢过程，N+P添加处理同时为植物提供了大量的必需元素，有利于植物在生长代谢过程中吸收更多的养分，导致C储量增加。
Elser等[38]曾报道，N和P同时添加在各种类型生态系统中都有较强的正协同效应，本研究也发现，在低、中种植密度情况下，N+P添加处理对幼苗单株及叶片C储量的促进效果大于单一N或P添加处理。原因可能是仅添加N会提高土壤的N︰P质量比，加剧了生态系统的P匮乏，从而限制树木生物量的增加[39]。一方面，N添加使土壤酸性增强，促进土壤中的固相磷酸盐分解，并使其被土壤中的金属阳离子固定而沉淀，降低了P的有效性[40]。N添加还会引起土壤中铝离子的溶出增加，抑制了植物对P的吸收[41]；另一方面，本试验地为南方红壤区，土壤缺P较严重[42]，因此土壤中供应的P不足以平衡N，单一N添加处理会进一步增加P的匮乏程度，从而使P成为树木生长发育的限制因子[43]。P添加有利于提高生态系统中N的利用效率，N+P添加处理对净初级生产力的促进效果更为显著[44]。本研究中的N+P添加处理，为樟树幼苗提供了生长所需的N素，同时缓解了P限制，因此对幼苗碳储量的促进作用更强。
植物C的分配转移模式是植物种群提高竞争能力、克服逆境的重要策略[45]。研究表明，高密度的种植条件会抑制林冠的生长发育，在竞争压力较大的环境下，植物会优先将C分配给茎。本研究中随着种植密度增大，幼苗对叶的C分配比例减弱，而增加了对茎的分配比例。可能是种植密度的增大加剧了植物之间的竞争，茎对促进植物生长发育的作用增加，而叶片的作用相对减弱。另外，植物通过激素抑制侧芽的生长，将C从叶向茎转移，从而引起植物不同器官C储量的分配比例发生改变[46]。同时，由于高密度种植条件下植物的生长空间拥挤狭小，且林冠郁闭早，限制了树冠的生长发育，这也可能导致幼苗叶的C储量分配比例降低[47]。
本研究表明，种植密度和N、P添加处理的交互作用对幼苗枝和叶的单位面积C储量，以及幼苗单株及枝和叶的C储量有显著影响。按照最优化分配理论，当光资源受限时，植物增大枝叶的分配；而土壤养分受限时，植物增大根的分配[48]。N、P添加处理增加了土壤养分，能够在一定程度上缓解高密度条件下的养分限制，在养分已经满足了樟树幼苗需求的情况下，光合作用成为幼苗生物量积累的限制因素，因而幼苗将更多的生物量向叶片分配，而叶片生物量需要更大的枝条来支撑[49]，从而有利于幼苗枝和叶C储量及单株幼苗总C储量的增加。随着种植密度的增大，植物个体对N、P等土壤营养元素的竞争加剧，同时林冠层郁闭较早，从而阻碍了林冠的生长，幼苗生长空间受到限制，树木的侧枝数量和长度均下降，这也会导致枝、叶和单株幼苗总C储量的减少[46, 50]。
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图 1 铁皮石斛内生真菌对胶孢炭疽菌生长的影响
A为胶孢炭疽菌株生长7 d后的菌落形态；B、C、D、E、F分别为胶孢炭疽菌株与F84、F123、F31、F100、F05菌株共培养7 d后的菌落形态
Figure 1. The effects of fungal endophytes from Dendrobium officinale on the growth of Colletotrichum gloeosporioides
A shows the colony morphology of C. gloeosporioides strains growing for 7 days; B, C, D, E and F are the colony morphologies of C. gloeosporioides growing with strains F84, F123, F31, F100 and F05, respectively, for 7 days
表 1 铁皮石斛内生真菌的定殖率和分离率1)
Table 1 The colonization rate and isolation rate of endophytic fungi in Dendrobium officinale
生境
Habitat器官
Organ组织块数目
No. of tissue segments长菌组织块数目
No. of tissue segments with fungi内生真菌数
No. of endophytic fungal strains定殖率/%
Colonization rate分离率/%
Isolation rate野生
Wild根 Root 72 41 49 56.94Ab 68.06Ab 茎 Stem 72 52 62 72.22Aa 86.11Aa 叶 Leaf 72 16 21 22.22Bc 29.17Bc 整株 Whole plant 216 109 132 50.46 61.11 人工栽培
Artificial cultivation根 Root 72 18 24 25.00Bc 33.33Bb 茎 Stem 72 31 40 43.06Bb 55.56Ba 叶 Leaf 72 36 40 50.00Aa 55.56Aa 整株 Whole plant 216 85 104 39.35 48.15 1)相同生境同列数据后的不同小写字母表示不同器官间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)；相同器官同列数据后的不同大写字母表示不同生境间差异显著(P<0.05，t检验)
1) Different lowercase letters in the same column of the same habitat indicate significant differences among different organs (P<0.05, Duncan’s test); Different capital letters in the same column of the same organ indicate significant differences between different habitats (P<0.05,t test)
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表 2 代表性铁皮石斛内生真菌的分子鉴定
Table 2 Molecular identification of representative endophytic fungi from Dendrobium officinale
菌株编号
Strain number器官
OrganGenbank中最相似菌株
The most similar strain in Genbank相似度/%
Similarity鉴定属名
Identified genusF07 叶 Leaf Fusarium proliferatum LrSF11(MG543691.1) 99 镰刀菌属 Fusarium F201 叶 Leaf Fusarium oxysporum Z9(EF611088.1) 99 镰刀菌属 Fusarium F209 叶 Leaf Fusarium proliferatum LrBF48 (MG543766.1) 99 镰刀菌属 Fusarium F231 叶 Leaf Talaromyces verruculosus A1S1-6(KJ767062.1) 99 踝节菌属 Talaromyces F412 叶 Leaf Grammothele fuligo MEL:2382748(KP012931.1) 99 Grammothele F26 叶 Leaf Rigidoporus vinctus NZD-mf190(KM277965.1) 99 硬孔菌属 Rigidoporus F45 叶 Leaf Phanerochaete sp. (MK791719.1) 99 显革菌属 Phanerochaete F04 叶 Leaf Schizophyllum commune HE2742 (KC505580.1) 99 裂褶菌属 Schizophyllum F96 叶 Leaf Ascomycota sp. 3454 (FJ544248.1) 99 子囊菌属 Ascomycota F84 叶 Leaf Fusarium oxysporum SXLWF11(MG461555.1) 100 镰刀菌属 Fusarium F70 叶 Leaf Aspergillus flavus C7-7(MG818938.1) 99 曲霉属 Aspergillus F75 叶 Leaf Diaporthe goulteri P8(MN823638.1) 99 间座壳属 Diaporthe F303 茎 Stem Neofusicoccum parvum WH-15710(KY111851.1) 99 新梭孢属 Neofusicoccum F301 茎 Stem Trichoderma sp. SDAS203714(MK871051.1) 99 木霉属 Trichoderma F212 茎 Stem Gibberella sp. SCSGAF0028(JN850990.1) 99 赤霉菌属 Gibberella F441 茎 Stem Pilatoporus ibericus LE-BIN 3922(MG722742.1) 99 Pilatoporus F10 茎 Stem Rigidoporus vinctus SCAU046(KY827376.1) 99 硬孔菌属 Rigidoporus F18 茎 Stem Aureobasidium melanogenum 7-1(MF939079.1) 99 短梗霉属 Aureobasidium F38 茎 Stem Phanerochaete sp. T(MK791719.1) 99 显革菌属 Phanerochaete F62 茎 Stem Leiotrametes lactinea Cui 7084(JN048769.1) 99 栓菌属 Leiotrametes F03 茎 Stem Schizophyllum commune SCAU12(MF061788.1) 99 裂褶菌属 Schizophyllum F87 茎 Stem Penicillium sclerotiorum SCAU155(MF135518.1) 99 青霉属 Penicillium F23 茎 Stem Irpex lacteus BYSTW1(MG820083.1) 99 耙齿菌属 Irpex F73 茎 Stem Colletotrichum gloeosporioides (KJ563297.1) 99 炭疽菌属 Colletotrichum F08 茎 Stem Phomopsis sp. Cef-S1(KX960809.1) 96 拟茎点霉属 Phomopsis F20 茎 Stem Perenniporia sp. TD95(KY849400.1) 99 卧孔菌属 Perenniporia
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表 3 铁皮石斛根、茎、叶中内生真菌不同属的占比
Table 3 Genus proportions of endophytic fungi in roots, stems and leaves of Dendrobium officinale
% 生境
Habitat属名
Genus根
Root茎
Stem叶
Leaf整株
Whole plant野生
Wild硬孔菌属 Rigidoporus 14.29 12.90 9.52 12.88 短梗霉属 Aureobasidium 10.20 8.07 14.29 9.85 显革菌属 Phanerochaete 6.13 12.90 14.29 10.61 栓菌属 Trametes 10.20 6.45 14.29 9.09 裂褶菌属 Schizophyllum 16.33 3.23 4.76 8.33 青霉属 Penicillium 2.04 4.84 9.52 4.54 蜡孔菌属 Ceriporia 8.16 3.23 0.00 4.54 蚁巢伞属 Termitomyces 4.08 1.61 0.00 2.27 耙齿菌属 Irpex 4.08 3.23 4.76 3.79 炭疽菌属 Colletotrichum 0.00 12.90 4.76 6.82 拟茎点霉属 Phomopsis 2.04 6.45 4.76 4.54 卧孔菌属 Perenniporia 2.04 1.61 0.00 1.52 隔孢伏革属 Peniophora 6.13 0.00 0.00 2.27 子囊菌属 Ascomycota 2.04 3.23 14.29 4.54 伏革菌属 Phlebiopsis 0.00 4.84 0.00 2.27 射脉菌属 Phlebia 2.04 4.84 0.00 3.03 镰刀菌属 Fusarium 2.04 1.61 0.00 1.52 拟层孔菌属 Fomitopsis 4.08 0.00 0.00 1.52 曲霉属 Aspergillus 0.00 4.84 0.00 2.27 酵母属 Meyerozyma 2.04 0.00 0.00 0.76 间座壳属 Diaporthe 0.00 0.00 4.76 0.76 茎点霉属 Phoma 0.00 1.61 0.00 0.76 Subulicystidium 2.04 0.00 0.00 0.76 浅黄囊孔属 Flavodon 0.00 1.61 0.00 0.76 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 人工栽培
Artificial cultivation镰刀菌属 Fusarium 0.00 45.00 10.00 21.14 曲霉属 aspergillus 16.67 5.00 10.00 9.62 青霉属 Penicillium 16.67 5.00 15.00 11.54 新梭孢属 Neofusicoccum 0.00 5.00 0.00 1.92 木霉属 Trichoderma 25.01 5.00 10.00 11.54 耙齿菌属 Irpex 0.00 15.00 10.00 9.62 栓菌属 Trametes 8.33 0.00 5.00 3.85 硬孔菌属 Rigidoporus 8.33 0.00 0.00 1.92 裂褶菌属 Schizophyllum 8.33 0.00 5.00 3.85 显革菌属 Phanerochaete 0.00 5.00 10.00 5.77 踝节菌属 Talaromyces 8.33 5.00 5.00 5.77 Grammothele 0.00 0.00 10.00 3.85 赤霉菌属 Gibberella 0.00 5.00 0.00 1.92 Pilatoporus 0.00 5.00 0.00 1.92 炭疽菌 Colletotrichum 0.00 0.00 5.00 1.92 隔孢伏革属 Peniophora 8.33 0.00 5.00 3.85 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00
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表 4 铁皮石斛根、茎、叶中内生真菌的多样性1)
Table 4 The diversity of endophytic fungi in roots, stems and leaves of Dendrobium officinale
生境
Habitat器官
Organ真菌物种数
Number of fungal species (S)多样性指数
Shannon-Wiener diversity index (H′)均匀度指数
Evenness index (E)相似性指数 Similarity index(C) 根
Root茎
Stem叶
Leaf野生
Wild根 Root 18 2.70a 0.92a 0.72 0.60 茎 Stem 19 2.82a 0.94a 0.72 0.65 叶 Leaf 11 2.28b 0.95a 0.60 0.65 整株 Whole plant 24 2.95 人工栽培
Artificial cultivation根 Root 8 1.98b 0.95a 0.44 0.70 茎 Stem 10 1.84b 0.80b 0.44 0.64 叶 Leaf 12 2.42a 0.97a 0.70 0.64 整株 Whole plant 16 2.49 1)相同生境同列数据后的不同小写字母表示不同器官间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Different lowercase letters in the same column of the same habitat indicate significant differences among different organs (P<0.05, Duncan’s test)
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表 5 野生铁皮石斛内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用1)
Table 5 Inhibitory effects of endophytic fungi of wild Dendrobium officinale on Colletotrichum gloeosporioides
菌株编号
Strain number属名
Genus菌株半径/cm
Colony radius抑菌率/%
Inhibition rate对照 Control 炭疽菌属 Colletotrichum 5.80±0.12 F102 蜡孔菌属 Ceriporia 0.52±0.04 93.06±0.94* F27 硬孔菌属 Rigidoporus 0.68±0.04 88.20±0.88* F103 蚁巢伞属 Termitomyces 0.73±0.03 87.48±0.27* F122 隔孢伏革属 Peniophora 0.89±0.05 84.57±1.09* F100 显革菌属 Phanerochaete 1.03±0.03 82.19±0.32* F24 硬孔菌属 Rigidoporus 1.15±0.08 80.15±1.47* F97 茎点霉属 Phoma 1.24±0.03 78.54±0.74* F92 子囊菌属 Ascomycota 1.33±0.03 77.11±0.71* F75 间座壳属 Diaporthe 1.35±0.07 76.70±1.50* F134 炭疽菌属 Colletotrichum 1.36±0.30 76.34±5.11* F67 拟层孔菌属 Fomitopsis 1.45±0.03 74.97±0.85* F135 炭疽菌属 Colletotrichum 1.46±0.26 74.65±5.01* F06 蚁巢伞属 Termitomyces 1.53±0.03 73.56±0.29* F115 显革菌属 Phanerochaete 1.53±0.02 73.54±0.70* F74 拟茎点霉属 Phomopsis 1.59±0.09 72.55±1.20* F84 镰刀菌属 Fusarium 1.62±0.06 72.11±1.06* F42 显革菌属 Phanerochaete 1.67±0.03 71.26±0.29* F55 裂褶菌属 Schizophyllum 1.73±0.03 70.09±0.81* F80 青霉属 Penicillium 1.79±0.05 69.04±1.34* F31 栓菌属 Trametes 1.79±0.05 69.04±1.34* F112 酵母属 Meyerozyma 1.81±0.00 68.82±0.62* F125 显革菌属 Phanerochaete 1.83±0.04 68.50±0.23* F124 子囊菌属 Ascomycota 1.93±0.04 66.70±0.84* F131 拟茎点霉属 Phomopsis 1.93±0.43 66.50±8.07* F03 裂褶菌属 Schizophyllum 2.00±0.06 65.45±1.68* F132 射脉菌属 Phlebia 2.00±0.30 65.31±5.87* F101 裂褶菌属 Schizophyllum 2.01±0.07 65.30±1.67* F123 子囊菌属 Ascomycota 2.03±0.03 64.92±0.88* F02 卧孔菌属 Perenniporia 1.28±0.04 64.92±0.88* F66 拟层孔菌属 Fomitopsis 2.07±0.07 64.30±1.82* F54 耙齿菌属 Irpex 2.28±0.03 60.89±0.98* F36 射脉菌属 Phlebia 2.33±0.03 59.78±1.28* F05 拟茎点霉属 Phomopsis 2.67±0.09 53.92±2.41* F25 短梗霉属 Aureobasidium 2.88±0.06 50.24±1.56* 1)表中数据为平均值±标准误(n=3);“*”表示与对照相比差异显著(P<0.05，t检验)
1)The data in table are means±standard deviations (n = 3); “*”indicates significant difference from the control (P<0.05,t test)
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