Mechanism of histidine kinase gene envZ regulating biofilm of avian pathogenic Escherichia coli
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摘要:目的
研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)生物被膜形成能力的影响，了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制，为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌耐药性的途径提供参考。
方法采用Red同源重组的方法构建envZ基因缺失株，比较野生株和envZ基因缺失株生长特性、生物被膜形成能力的差异。利用转录组学方法分析envZ在转录调控网络中对其生物被膜形成相关基因的调控机制。
结果成功构建envZ基因缺失株AE17ΔenvZ；envZ基因缺失对APEC的生长速度无明显影响，但使APEC生物被膜的成膜能力减弱。与野生株AE17相比，envZ基因缺失株有711个基因发生差异表达，与生物被膜形成相关的基因显著下调。
结论envZ基因除了响应环境渗透压，还参与调控APEC生物被膜的形成。
Abstract:ObjectiveTo study the effect of histidine kinase gene envZ in two-component system ompR/envZ on biofilm formation ability of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), understand the regulation mechanism of the two-component system on biofilm of APEC, and provide a reference for investigating the ways of biofilms affecting APEC antibiotic resistance.
MethodThe red homologous recombination method was used to construct the envZ-gene-deleted strain, and the differences in growth characteristics and biofilm formation abilities between wild strain and the envZ-gene-deleted strain were compared. The mechanism of envZ regulating biofilm formation related genes in transcriptional regulatory network was analyzed by transcriptomics.
ResultThe envZ-gene-deleted strain AE17ΔenvZ was successfully constructed. The envZ gene deletion had no significant effect on growth rate of APEC, but weakened the APEC biofilm formation ability. Compared with wild strain AE17, AE17ΔenvZ had 711 differentially expressed genes, and the genes related to biofilm formation were significant down regulation.
ConclusionIn addition to responding to environmental osmotic pressure, envZ gene is also involved in regulating the formation of APEC biofilm.
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Keywords:
- avian pathogenic Escherichia coli /
- envZ gene /
- biofilm /
- transcriptome analysis
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温室控制系统通过多个传感器模块对环境因素进行数据采集，并对采集到的数据进行处理与分析。控制系统利用这些数据对温室中的各个因素进行调节与控制。由于传感器自身存在误差，并受到光照升温和长时间高湿状态等因素的影响，导致传感器采集到的温、湿度数据不准确[1]。目前对温室传感器的研究主要集中在硬件的优化、传感器的配置优化、温室数据融合等方向，对采集后的数据进行优化处理的应用较少。张敏等[2]采用MEMS集成的温湿度模块对端子箱中温、湿度同时进行测量，并使用温湿度自动补偿功能使测量更准确。该方法仅使用传感模块自带的温湿度自动补偿功能进行校准处理，无法完全消除由外在干扰引起的噪声，测试结果仍存在误差。尤其当环境湿度波动较大时，测量的湿度值误差也较大。于玉婷等[3]依据实测数据选用高斯函数对温室温度的日变化曲线进行最小二乘多峰拟合，将离散的数据点转化为连续的高斯函数。但在长时间高湿状态和持续存在噪声的环境下，拟合效果欠佳。Manoharan[4]利用监督学习算法对温室内环境参数进行分析并对后续采集的数据进行了自校正处理。监督学习的结果更好地展现了作物的生长环境，提高了温室环境中作物生产最优控制策略的效率。但该研究仅对短期温室环境数据进行了分析，缺少对持续高湿状态等恶劣环境的研究。
为提高温、湿度数据的精度与可信度，有必要对采集到的温、湿度数据进行降噪处理。由于传感器获取的环境温、湿度数据表现出非线性以及不稳定的特征。针对此类信号的分析，应采用时频分析方法。常采用的时频分析方法有短时傅里叶变换(Shorttime fourier transform, STFT)、小波变换(Wavelet transform,WT)、小波包变换(Wavelet packet transform)、经验模态分解(Empirical mode decomposition, EMD)、集合经验模态分解(Ensemble empirical mode decomposition, EEMD)和自适应噪音的完全集合经验模态分解(Complementary ensemble empirical mode decomposition with adaptive noise, CEEMDAN)。Liu等[5]使用EEMD方法对航空电磁数据进行去噪处理，结果显示，EEMD方法能够更准确地拟合运动噪声，提高信噪比，并在校正后的数据中几乎不会出现伪异常，从而更清晰地呈现地质构造。Thuc等[6]采用改进的自适应噪音EEMD算法结合显著性检验对局部放电信号进行降噪处理，提高了降噪效率。Vanus等[7]提出了一种基于人工蜂群算法对小波响应进行分类，以推荐的最合适小波对
$ {\mathrm{C}\mathrm{O}}_{2} $ 体积分数数据进行平滑处理，然后使用支持向量机预测$ {\mathrm{C}\mathrm{O}}_{2}\mathrm{体}\mathrm{积}\mathrm{分}\mathrm{数} $ 波形。结果显示，使用WT平滑处理后的数据预测结果精度更高。熊春宝等[8]提出了EEMD−小波阈值联合滤波方法来提高大跨径桥梁结构在环境激励下的振动响应信号的精度。该方法利用平均周期法和相关系数法去除分量中的噪音，在提高信号精度方面比单一方法更有效。由于温室系统不同位置采集到的数据可能存在差异，仅采集单一位置的环境温、湿度数据具有局限性。因此，可以采用多个传感器对相同数据进行采集，并使用数据融合技术对多个传感器数据进行融合，从而提高数据准确性和可信度。常用的空间融合方法包括加权平均法、目标跟踪、卡尔曼滤波、功能模型。Xia等[9]采用改进的无迹卡尔曼滤波器对传感器采集自温室的温度数据进行预处理。自适应加权数据融合算法能够自适应地调节数据来源的权重，而且可以处理非线性环境，并具有较小的响应延时。Wang等[10]提出了一种基于支持度和自适应加权的加权系数构造方法，研究结果表明，采用该方法的融合结果优于传统的平均估计融合和基于支持度的数据融合。
为解决传感器数据非线性和不稳定的问题，本研究采用EEMD联合小波包自适应阈值 (Wavelet packet adaptive threshold，WPT)的方法对融合后数据进行降噪处理，通过归一化自相关函数和互相关函数进行线性相关性分析，再结合均方根误差(RMSE)、信噪比(SNR)和相关性系数(R)等对降噪效果进行量化评估。最后，本研究采用卡尔曼滤波联合自适应加权平均算法，对降噪后的数据进行融合。
1. 材料处理与方法
1.1 温室数据采集
温室控制系统硬件组成如图1所示，主要由控制箱、工业空调、加湿设备、温湿度传感器等组成。温室数据采集模块利用传感器技术对温室环境数据进行采集。由于温室系统的多个传感器需要进行数据管理和执行器设备控制，通过CAN总线发送特定的控制命令，可以实现对温室传感器和节点的远程控制，从而提高温室数据采集和处理效率，因此使用CAN总线可以实现高效的数据收集和控制。CAN总线可以实现实时通信，但其抗干扰能力有限，缺乏可靠的时钟同步机制，可能导致数据丢失或错误等问题，从而影响通信数据的可靠性和稳定性。温室系统中各参数的精准控制依赖于准确可靠地采集数据，因此，对CAN总线传输后的数据进行有效的降噪处理，即降低干扰信号在原始信号中的比例，提高信噪比，将有助于提高数据的可信度和准确性。
本研究选取经CAN总线传输后的温、湿度数据作为研究对象。采集温、湿度数据的同时，本研究对空调、喷雾机、补光灯等设备进行了调节控制，以测得不同温湿度、温湿度持续变化和长时间高湿状态下的温、湿度数据。图1展示了使用传感器采集到的原始温、湿度数据。从图1中可以看出，在多种干扰的影响下，原始温、湿度数据出现连续波动和不稳定的情况。
本研究使用了一种分布式传感器节点的传感器网络，该网络由4个传感器节点1～4组成。所有的试验均在200 cm×200 cm×250 cm的温室中进行。将温室的长和宽边分别设为X和Y轴，高线设为Z轴。传感器节点的位置信息如图2所示。
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图 2 传感器节点在温室中的位置红色数字表示节点编号，括号中为节点位置Figure 2. Positions of sensor nodes in the greenhouseThe red number represents the node number, and the node position is indicated in parentheses1.2 温室数据预处理
当使用多个传感器采集温室系统数据时，通常存在绝对误差，例如每个传感器的测量偏差以及系统干扰。这些误差可能会导致数据不准确，甚至影响系统性能和决策结果。为解决该问题，本研究利用神经网络进行误差补偿。具体而言，首先，使用传感器在不同温度、湿度下测量数据，同时使用高精度温湿度传感器获取参考温、湿度值。其次，对采集到的数据进行归一化处理。再次，将测量的温、湿度值作为全连接神经网络的输入变量，将参考温、湿度值作为模型的输出变量进行训练。然后，使用K-fold交叉验证的准确率、精确率、召回率和F1-score作为方法性能评价指标。最后，将训练好的模型应用在温、湿度误差补偿中。模型和训练的超参数设置如表1所示。
表 1 模型和训练的超参数设置Table 1. Hyperparameter settings for models and training参数类型
Parameter type参数
Parameter参数值
Parameter value模型参数
Model parameter全连接神经网络的层数
The number of layers of a fully connected neural network3 输入维度 Input dimension 2 隐藏层维度
Hidden layer dimension10 输出维度 Output dimension 2 训练参数
Training parameter学习率 Learning rate 0.001 训练轮次 Training round 100 批量训练的批大小
Batch size for batch training32 交叉验证的 K-fold
Cross-validated K-fold5 优化器 Optimizer Adam 1.3 EEMD分解
EEMD是一种改进的EMD方法，其在每次经验模态分解的过程中叠加高斯白噪声，利用白噪声的统计特性，通过改变信号振幅的极值点特性来避免模态混叠的问题[11]。最终，EEMD对多次EMD分解得到的本征模态函数(Intrinsic mode function, IMF)进行平均处理，消除白噪声的影响，从而更加准确地分析信号的特性和特征。具体实现步骤如下：
1)设定总体平均次数M，确定分解的IMF数量J。
2)在原始信号
$ y(t) $ 上加上1个满足标准正态分布的白噪声序列$ n(t) $ ，得到含噪声的信号$ x(t) $ ：$$ x(t) = y(t) + n(t) 。 $$ (1) 3)对含噪声的信号
$ x(t) $ 进行EMD，得到分解出的IMF和残差项：$$ x(t) = \displaystyle\sum\limits_{{{j}} = 1}^J {{c_{i,j}}\left( t \right)} + {r_{i,j}}\left( t \right) \text{，} $$ (2) 式中，
${{{c}}_{i,j}}(t)$ 为第i次加入白噪声后分解得到的第j个IMF，${{{r}}_{i,j}}(t)$ 是残余函数，代表信号的平均趋势，J是IMF的数量。4)重复步骤2)和步骤3)M次，每次生成1个幅值不同的白噪声序列并加入到原始信号中进行分解，得到M组IMF：
${{{c}}_{1,j}}(t),$ ${{{c}}_{2,j}}(t),$ …,${{{c}}_{M,j}}(t)$ , j=1, 2, …, J。5)按照IMF的顺序，将每一组IMF按照序号求出其统计平均值，得到J个平均IMF。将M组IMF对应位置的平均值取平均，得到最终的IMF[12]，即：
$$ {c_j}\left( t \right) = \dfrac{{\text{1}}}{M}\displaystyle\sum\limits_{{{i}} = 1}^M {{c_{i,j}}\left( t \right)} , $$ (3) 式中，
$ {{{c}}_j}(t) $ 是EEMD分解的第j个IMF，i=1, 2, …, M, j=1, 2, …, J。1.4 WPT降噪
WPT降噪是一种基于小波包变换的信号降噪方法。该方法将小波系数分为噪声和信号两部分，从而实现信号的去噪。通过选择合适的阈值，可有效保留信号的瞬态和细节部分，并消除随机噪声的影响，提高信号的精确度和可靠性。
WPT降噪基本流程如下：1)使用小波包分解对信号进行处理，获得一组小波包系数。2)对于每个小波包系数，采用不同的阈值处理方法。固定阈值处理方法将每个小波包系数与预设的阈值比较，小于阈值的系数被置零，大于阈值的系数被保留；软阈值处理方法根据小波包系数的统计特性对小于阈值的系数进行缩小到零，对大于阈值的系数进行缩小到阈值以下；硬阈值处理方法类似于软阈值，但是小于阈值的系数会被直接置零；自适应阈值方法则根据小波包系数的统计特性动态地确定阈值。3)重构处理过的小波包系数，以获得降噪后的信号。
1.5 EEMD联合WPT降噪
EEMD算法能够更好地处理瞬态和非周期信号，而小波包分解则更适用于周期性信号的处理。联合使用这2种方法可以去除多种噪音，具有更好的去噪效果。具体步骤如图3所示。
EEMD可以生成多个IMF分量，每个IMF分量都有明显的局部特征，而小波包分解可以将IMF分量进一步分解成多个子带，提供更精细的频率信息。联合使用这2种方法可以更好地提取信号的局部和频率特征，保留信号的细节和特征信息。
2. 仿真分析
为了验证本研究算法对含噪温、湿度数据的降噪效果，采用MATLAB模拟包含噪声的温、湿度数据，并进行降噪试验。以温度数据为例(图4)，具体而言，首先生成一组范围为[20, 30]、样点数为6000的纯净温度数据，然后根据现场采集到的温度数据特征，在纯净数据上加上一组范围为[−1, 1]、样点数为6000的高斯白噪音，得到含噪温度数据(图4)。
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图 4 纯净温度数据(A)与含噪温度数据(B)Figure 4. Pure temperature data (A) and temperature data with noise (B)目前常用的降噪方法包括以下9种：最小均方算法(Least mean square, LMS)自适应滤波[13]、有限脉冲响应(Finite impulse response, FIR)低通滤波[14]、无限脉冲响应(Infinite impulse response, IIR)滤波[15]、变分模态分解(Variational mode decomposition, VMD)-WT降噪[16]、VMD降噪[17]、WPT降噪[18]、EMD-WPT降噪[19]、EEMD-WPT降噪[20]、CEEMDAN-WPT降噪[21]。本研究使用上述9种算法对含噪温、湿度数据进行仿真降噪试验，并比较它们的降噪效果。
以温度数据进行降噪的结果(图5)为例，经EMD-WPT、EEMD-WPT和CEEMDAN-WPT降噪算法处理，含噪温、湿度数据的噪声被有效去除，降噪效果明显。降噪后的含噪温、湿度数据得到明显的优化，输出信号与原始信号之间差别相对较小。
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图 5 不同算法对温度数据降噪处理的仿真结果Figure 5. Simulation results of different algorithms for noise reduction processing of temperature data本研究选取RMSE、SNR和R等指标作为评价温、湿度数据降噪效果的标准。其中，RMSE是衡量实测信号与降噪处理后的信号之间的偏差，SNR是信号与噪音的比例，SNR越高说明降噪效果越好。而R则是衡量实测信号与降噪处理的信号之间的相关程度。
降噪前含噪数据的信噪比为32.88 dB。经过EEMD-WPT降噪算法处理后的数据SNR为56.91 dB，SNR提升了24.03 dB。如表2所示，EEMD-WPT算法相比于WPT算法处理后的数据SNR提高了40.31%，RMSE降低了84.75%。同时，与EMD-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了23.40%。而与CEEMDAN-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了35.71%。经EEMD-WPT算法降噪后的数据比其他算法具有更高的SNR、更小的RMSE和更大的R，从而得到了最佳的降噪效果。
表 2 不同算法温度数据输出结果的RMSE、SNR和RTable 2. The RMSE, SNR and R of the temperature data output result of each algorithm算法 Algorithm RMSE SNR/dB R LMS 0.219 41.20 0.999 FIR 0.112 47.05 0.999 IIR 0.189 42.52 0.998 VMD-WT 0.136 45.33 0.999 VMD 0.155 44.23 0.999 WPT 0.236 40.56 0.997 EMD-WPT 0.047 54.61 1.000 EEMD-WPT 0.036 56.91 1.000 CEEMDAN-WPT 0.056 53.10 1.000 3. 试验验证
3.1 数据预处理
试验使用全连接神经网络建立了温、湿度误差补偿模型，如图6所示。从图6中可以看出预测值与参考值2个变量之间呈现出高度线性的关系，且该模型在测试数据集上的RMSE仅为0.0395。
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图 6 温度(A)和相对湿度(B)误差补偿模型Figure 6. Temperature (A) and relative humidity (B) error compensation models从图7可以看出，温、湿度误差分布直方图的峰值均位于误差为0左右，且温度的误差范围集中在[−0.04, 0.04]，湿度的误差范围集中在[−0.05, 0.05]，均在误差允许范围内。因此利用神经网络补偿多个传感器间存在的绝对误差具有可行性。
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图 7 温度(A)和相对湿度(B)误差分布直方图Figure 7. Temperature (A) and relative humidity (B) error distribution histogram3.2 EEMD分解
将原始温、湿度数据经过EEMD分解得到多个IMF分量和残余分量，而后使用WPT对IMF分量和残余分量进行降噪处理，能够得到更加精细和含噪信号更少的信号。原始信号经EEMD分解可以得到IMF分量，如图8、9所示。在选择IMF分量进行WPT降噪时，本算法将保留R较高的IMF分量，而对R较低的IMF分量进行降噪处理。最终，使用降噪后的IMF分量以及保留的IMF分量重构数据，从而得到降噪后的结果。
3.3 WPT降噪
WPT降噪方法的实现首先需要选择合适的小波基和分解尺度。通常在工程中，使用 db、sym、coif 等小波系作为小波基。为更好地选择小波基来拟合信号并提高小波变换的精度，需要分析不同小波基函数在WPT降噪中能够达到的最优降噪效果。在试验中，使用SNR作为评价指标，并对温度数据和湿度数据使用 db、sym、coif这3种小波系进行WPT降噪处理。经试验验证后，对于温度数据的WPT降噪选择使用 db3 作为小波基的分解形式，将分解尺度设为 5 层。对于湿度数据的WPT降噪，选择使用 db2 作为小波基的分解形式，将分解尺度设为 3 层。
小波包经分解后，需要对各个尺度上的小波包系数进行阈值量化处理，所以阈值函数的选择对降噪效果具有较大的影响。使用固定阈值法时，由于不同尺度的小波包系数适用的阈值不同，因此缺乏灵活性；软阈值法获得的重构信号具有更好的光滑性，但误差相对较大；硬阈值法获得的重构信号具有更好的逼近性，但存在周围振荡；自适应阈值法能够为各尺度上的小波包系数选择最佳的阈值，适应性更好。
试验分别采用固定阈值、软阈值、硬阈值和自适应阈值法对原始温度数据进行降噪处理。结果如图10所示。本研究对不同阈值的去噪方法进行了RMSE、SNR和R等指标的评估，如表3所示。试验结果显示，自适应阈值去噪处理比其他阈值方法具有更高的SNR，更小的RMSE和更强的相关性。因此，本研究选择自适应阈值作为小波包降噪的阈值函数，对温度数据进行降噪处理。
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图 10 温度数据不同阈值降噪效果对比Figure 10. Comparison of noise reduction effects of different thresholds for temperature data表 3 不同阈值去噪方法温度数据输出结果的RMSE、SNR和RTable 3. RMSE, SNR and R of temperature data output results of different threshold denoising methods去噪方法 Denoising method RMSE SNR/dB R 硬阈值去噪 Hard threshold denoising 0.224 40.69 0.996 软阈值去噪 Soft threshold denoising 0.224 40.70 0.995 固定阈值去噪 Fixed threshold denoising 0.224 40.70 0.996 自适应阈值去噪 Adaptive threshold denoising 0.169 43.13 0.998 试验对湿度原始数据进行了相同的降噪处理，结果如图11所示。评估了不同阈值去噪处理后的RMSE、SNR和R，如表4所示。试验结果显示自适应阈值降噪处理方法的SNR更高、RMSE更小、相关性更强，因此本研究选择将湿度数据的自适应阈值作为小波包的去噪阈值函数。
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图 11 相对湿度(RH)数据不同阈值降噪效果对比Figure 11. Comparison of noise reduction effect of different thresholds for realative humidity (RH) data表 4 不同阈值去噪方法相对湿度数据输出结果的RMSE、SNR和RTable 4. RMSE, SNR and R of relative humidity data output results of different threshold denoising methods去噪方法 Denoising method RMSE SNR/dB R 硬阈值去噪 Hard threshold denoising 0.335 46.45 0.951 软阈值去噪 Soft threshold denoising 0.336 46.45 0.950 固定阈值去噪 Fixed threshold denoising 0.162 52.76 0.989 自适应阈值去噪 Adaptive threshold denoising 0.120 55.40 0.994 通过观察图10、11可以发现，相比于硬阈值、软阈值和固定阈值，自适应阈值的降噪效果显著提高。虽然采用WPT降噪处理后的信号的降噪效果有所改善，但仍存在一些噪音毛刺，这可能是由于噪音信号的复杂性所致。
采用仿真试验所用的9种算法对实际采集的温、湿度数据进行降噪处理，试验结果如图12、13所示。通过观察图12、13可知，EEMD-WPT算法对噪声具有较好的抑制作用。该算法在去除噪声干扰的同时，保留了大量的原始信号波形特征。同时该算法数据图形变化较为平缓，可以较好地估计原始数据的特征。
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图 12 不同算法对温度数据降噪处理结果Figure 12. Results of noise reduction processing of temperature data by different algorithms![]()
图 13 不同算法对相对湿度(RH)数据降噪处理结果Figure 13. Results of noise reduction processing of relative humidity (RH) data by different algorithms4. 温室数据融合
对降噪后的数据采用卡尔曼滤波与自适应加权平均算法相结合的方法，将温室内多组传感器数据进行空间数据融合，从而使来自不同位置的传感器或设备数据融合在一起，以获得更为全面、准确的信息。
卡尔曼滤波结合自适应加权融合算法进行数据融合具体步骤如下：
1)对不同来源的数据，通过自适应加权平均算法进行加权融合。首先对不同来源的数据分配相同的初始权重。然后根据每个数据点的误差大小动态调整权重。最后根据新的权值重新计算加权平均值。
2)将得到的加权平均值作为卡尔曼滤波算法的观察值，进行卡尔曼滤波计算，得到优化后的融合结果。
3)根据融合结果的准确性、可靠性等指标，适时调整自适应加权平均算法的权重系数，以进一步优化融合效果。
温、湿度数据融合结果如图14、15所示，对降噪后的多源数据进行空间数据融合处理，能够有效减少数据中的噪声和不确定性，从而提高数据的质量和可靠性，进一步提升数据处理和分析的效果和准确率。
5. 结论
本研究以温室系统中的采集数据为研究对象，提出了EEMD联合WPT算法对数据进行降噪处理。在数据降噪后计算评价指标并进行对比，得出以下结论：
1)使用EEMD将CAN传输后的温、湿度数据分解，并对分解出的IMF分量进行小波包分解，然后应用自适应阈值降噪技术对小波包系数进行去噪处理，最终将数据进行重构。降噪后的温、湿度数据的SNR、RMSE和R均优于其他算法。通过EEMD-WPT算法，降噪后的数据SNR相较于降噪前提升了73.08%。该算法相对于WPT算法处理后的数据SNR提高了40.31%，RMSE降低了84.75%。同时，与EMD-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了23.40%。而与CEEMDAN-WPT算法相比，EEMD-WPT算法处理后的数据RMSE降低了35.71%。因此，EEMD-WPT算法降噪后的数据拥有更高的SNR、更小的RMSE和更大的R，表现出较优的降噪效果。
2)对温室系统中不同位置的传感器所采集到的数据进行降噪处理后，本研究采用卡尔曼滤波和自适应加权平均算法相结合的方法进行数据融合。该方法充分考虑每个传感器可能受到的不同干扰和误差，以及检测数据的可用范围的限制。通过数据融合技术，可以纠正或筛选掉低质量的数据，从而提高数据质量的可靠性。同时，该技术还可以整合多个传感器的数据，进一步扩大监测范围，从而获取更全面、更准确、更详细的信息。
3)本研究创新地将时频分析方法引入温室传感器数据的研究中，在温、湿度持续变化，长时间高湿状态等恶劣环境下，能消除温、湿度数据中的绝大部分的噪声，从而显著提高了SNR和数据的准确性。这为温室内温、湿度数据的处理提供了新的方法。
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图 1 envZ基因缺失株AE17ΔenvZ的鉴定
M：DL2000 DNA marker，1：空白对照(envZ-in-F/R)，2：AE17ΔenvZ内侧(envZ-in-F/R)，3：AE17内侧(envZ-in-F/R)，4：空白对照(envZ-out-F/R)，5：AE17ΔenvZ外侧(envZ-out-F/R)，6：AE17外侧(envZ-out-F/R)
Figure 1. Identification of envZ deletion strain AE17ΔenvZ
M: DL2000 DNA marker, 1: Blank control (envZ-in-F/R), 2: AE17ΔenvZ inside (envZ-in-F/R), 3: AE17 inside (envZ-in-F/R), 4: Blank control (envZ-out-F/R), 5: AE17ΔenvZ outside (envZ-out-F/R), 6: AE17 outside (envZ-out-F/R)
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图 3 酶标仪测定AE17和AE17ΔenvZ生物被膜形成能力
“*”代表不同菌株间差异显著(P<0.05，t检验)
Figure 3. Biofilm formation abilities of AE17 and AE17ΔenvZ detected by microplate reader
“*” indicates significant difference between different strains (P<0.05, t test)
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图 4 培养48 h后结晶紫染色观察AE17和AE17ΔenvZ生物被膜生成量
Figure 4. Biofilm formation amounts of AE17和AE17ΔenvZobserved by crystal violet staining after 48 hours’ cultivation
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图 5 扫描电镜观察AE17和AE17ΔenvZ生物被膜
Figure 5. Biofilms of AE17 and AE17ΔenvZ observed by scanning electron microscope
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图 6 AE17ΔenvZ差异表达基因火山图
Figure 6. Volcano map of AE17ΔenvZdifferentially expressed genes
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图 7 差异表达基因的GO功能分类
Figure 7. GO functional classification of differentially expressed genes
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图 8 差异表达基因的KEGG功能分类
Figure 8. KEGG functional classification of differentially expressed genes
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图 9 差异表达基因的验证
“*”代表相同基因不同菌株间差异显著(P<0.05，t检验)
Figure 9. Verification of differentially expressed genes
“*” indicates significant difference between different strains of the same gene (P<0.05, t test)
表 1 envZ基因缺失和缺失鉴定引物
Table 1 Primers used for construction and identification of envZ gene deletion
引物 Primer 序列(5′→3′) Sequence 产物大小/bp Product size envZ-U-F GCGGGCCACGCAACGAAAGTTAT 810 envZ-U-R CCAGCCTACAACCATTAGCGGCACGGGATTAGGGC envZ-cm-F CGCTAATGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTT 1 013 envZ-cm-R TGAACTTCGCCATATGAATATCCTCCTTAG envZ-D-F TATTCATATGGCGAAGTTCAGCACCACCAGATA 736 envZ-D-R CGAAGCGTCGCTAATGCAGAACA envZ-out-F ATCAAACCCAGTACCACTTCCTCT 2 102 envZ-out-R GCTCTCCCGCGATAAGCT envZ-in-F TCCCGCTCATAGCCACTT 499 envZ-in-R TTCATCAGGGCGATTTCTC pKD46-F GATACCGTCCGTTCTTTCCTT 888 pKD46-R TGATGATACCGCTGCCTTACT pCP20-F TTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACC 409 pCP20-R GTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCC 
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表 2 实时荧光定量PCR引物
Table 2 Primers used in real time fluorogenic quantitative PCR
引物 Primer 序列(5′→3′) Sequence dnaERT-F GATTGAGCGTTATGTCGGAGGC dnaERT-R GCCCCGCAGCCGTGAT fhlART-F GAAGTGGTGGTCGTTGCCGATAAA fhlART-R GCTGGAGTTGAAGATAATGGGGG flhDRT-F AGAGTAATCGTCTGGTGGCTGTC flhDRT-R CGACAACATTAGCGGCACTG flhCRT-F GGCTGGTGAGCGTGGGTAATA flhCRT-R AGTGCCCGCAAGCAGAAGAAG fimDRT-F CACCTTTGTCATCTGCCGAACTCTA fimDRT-R GTCCCTGGCGGTAATTCTTGC fimHRT-F GCTATCCATTTCCGACCACCA fimHRT-R GCACTGCTCACAGGCGTCAAA mlrART-F TTAGTTCACCGTTACGAATCGC mlrART-R AAACAACAGCCTCCACCAGC mcbRRT-F CTGTTGAAAACCTCACCCCG mcbRRT-R TTAATGATTTGTTCCATGTCGCC
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表 3 生物被膜相关的差异表达基因
Table 3 Differentially expressed genes associated with biofilm
基因
Gene基因描述
Gene descriptionlog2F tabA 编码含DUF386结构域的毒素−抗毒素生物被膜蛋白 Encoding toxin-antitox biofilm protein that contains DUF386 domain −7.086 6 lsrR 大肠埃希菌群体感应的主要调节器 Main regulator ofEscherichia coliquorum sensing −5.905 8 mcbR 编码GntR家族转录调节剂 Encoding GntR family transcription regulator −4.944 8 bdcA 编码c-di-GMP结合生物被膜弥散介质 Encoding c-di-GMP binding biofilm dispersion medium −4.598 6 mlrA 编码MerR家族转录调节剂，csg基因激活剂，调控csgD基因表达，是生物被膜形成的关键调节因子
Encoding MerR family transcription regulator, csg gene activator, regulating csgD gene expression,
a key regulator of biofilm formation−3.587 1 flhD 编码1类启动子，与flhC形成转录激活物复合物FlhD4C2，决定细菌是运动还是非运动
Encoding a type of promoter, forming transcriptional activator complex FlhD4C2 with flhC,
determining bacterium moving or not−1.900 9 flhC 编码1类启动子，与flhD形成转录激活物复合物FlhD4C2，决定细菌是运动还是非运动
Encoding a type of promoter, forming transcriptional activator complex FlhD4C2 with flhD,
determining bacterium moving or not−1.313 0 fliA 鞭毛特异性转录σ因子(σ28)，负责所有3类启动子的激活，3类启动子控制形成细丝、运动蛋白以及
趋化蛋白的蛋白表达
A flagella-specific transcription σ factor (σ28), responsible for the activation of all three types of promoters
which control the protein expression of filaments, motor proteins and chemotactic proteins−1.197 1 fliZ 所有鞭毛基因有效表达所必需 Necessary for effective expression of all flagellar genes −1.274 4
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