Effect of oregano oil addition in the diet on abdominal fat deposition in Tianlu yellow-feathered chicken
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摘要:目的
探讨饲粮中添加牛至油对天露黄鸡腹脂沉积及脂肪代谢的影响，并通过模拟生产试验对牛至油降低肉鸡腹脂率效果进行验证。
方法实验室试验：选取24只65日龄雌性天露黄鸡，逐只称质量编号后，根据体质量相近的原则，随机分为3组，每组8只，单笼饲养；对照组饲喂基础饲粮(不含牛至油)，处理组分别饲喂含100和200 mg/kg牛至油的饲粮；试验开始前预饲喂3 d，正式试验时间为30 d，自由采食及饮水。模拟生产试验：选取270只65日龄雌性天露黄鸡，逐只称质量编号后，按照体质量相近的原则，随机分为3组，每组6次重复，每次重复15只，试验处理和饲养管理方法与实验室试验相同。实验室试验结束后称体质量计算生产性能指标，并屠宰，采集血液、肝脏、腹脂、胸肌、腿肌等样品，测定屠宰性能、血清生化指标和脂肪代谢相关基因的mRNA表达量。模拟生产试验结束后称体质量，并取样测定生产性能和屠宰性能，验证实验室试验结果。
结果实验室试验中，与对照组相比，饲粮添加200 mg/kg牛至油可显著提高天露黄鸡的平均日增体质量和胸肌率，显著降低天露黄鸡的耗料增重化和脂肪沉积，腹脂减少率达到23.51%；显著降低天露黄鸡肝脏中与脂肪合成相关基因的mRNA表达量，对肝脏中脂肪分解相关基因无明显影响。模拟生产试验结果与实验室试验相符，验证了牛至油具有降低天露黄鸡腹脂沉积的作用，与对照组相比，200 mg/kg牛至油添加组的腹脂减少率达到20.00%。
结论饲粮中添加200 mg/kg牛至油可显著降低天露黄鸡的腹脂沉积，其作用可能与降低肝脏脂肪酸的合成有关。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of oregano oil addition in the diet on abdominal fat deposition and fat metabolism of Tianlu yellow-feathered chicken, and verify the effect of oregano oil reducing abdominal fat rate of broiler through production simulation experiment.
MethodIn laboratory experiment, twenty-four 65-day-old female Tianlu yellow-feathered chickens were selected. Each chicken was weighed and numbered, then randomly divided into three groups with eight chickens of each group according to the principle of weight similarity. Each chicken was fed in single cage. The control group was fed with basal diets (without oregano oil), while the other two groups were fed with diets containing 100 and 200 mg/kg oregano oil respectively for 30 days after 3 days’ pre-feeding. The chickens were fed by free eating and free drinking. In production simulation experiment, total 270 65-day-old female Tianlu yellow-feathered chickens were randomly divided into three groups according to the principle of weight similarity after weighing and numbering, with six replicates in each group and 15 chickens per replicate. All experiment protocols were the same as laboratory experiment. The chickens were weighed after the laboratory experiment to calculate production performance. Then the chickens were slaughtered to collect blood, liver, abdominal fat, breast muscle and leg muscle samples and determine slaughter performance, serum biochemical indicators and mRNA expression levels of fat metabolism related genes. After the production simulation experiment, the chickens were weighed and sampled to determine production and slaughter performances, and verify the results of the laboratory experiment.
ResultIn laboratory experiment, compared with the control, 200 mg/kg oregano oil addition significantly increased Tianlu yellow-feathered chicken average daily weight gain and breast muscle rate, significantly reduced feed to gain ratio and abdominal fat deposition, with abdominal fat reduction rate of 23.51%. Adding 200 mg/kg oregano oil to the diets significantly reduced mRNA expression levels of fat synthesis related genes in liver of Tianlu yellow-feathered chicken, but had no obvious effect on fat decomposition related genes. The results of production simulation experiment conformed to those of laboratory experiment, and validated the effect of oregano oil reducing abdminal fat deposition. Compared with the control group, the abdominal fat reduction rate reached 20% in 200 mg/kg oregano oil addition group.
ConclusionThe 200 mg/kg oregano oil addition can significantly reduce abdominal fat deposition of Tianlu yellow-feathered chicken by reducing the synthesis of fatty acids in liver.
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中药大黄来源于蓼科植物大黄的根茎，最早记载于《神农百草经》，有药中“将军”之美称，被列为中药“四大金刚”之一，已经有
2000 多年的中医临床用药史[1]。中药大黄主要由大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素等游离蒽醌，番泻苷A/B等二蒽酮苷类结合型蒽醌，二苯乙烯，多糖，单宁等成分组成，具有泻下攻积、抗菌、抗感染、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、保肝利胆等多种药理作用[2]。其中，蒽醌是大黄的主要活性成分，含量(w)约占其成分的3%~5%[3]。大黄酸(Rhein，RH)是大黄蒽醌的主要成分之一，结构式如图1所示，具有抗感染[4]、抗肿瘤[5]、抗糖尿病[6]、降脂[7]、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肾毒性等[8]多种药理作用。然而，大黄酸溶解度低、脂溶性差、毒性强、生物利用度差、易引起胃肠道不适，这些特性限制了其临床应用[9]。近年来，畜禽病原菌的抗生素耐药性逐渐变得严重，导致抗生素敏感性下降，研发抗生素增效剂、复方制剂等的防控策略逐渐成为应对畜禽耐药病原菌的研究热点。大黄酸对幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌等多种厌氧菌有强大的抑菌作用。对大黄酸进行结构改造，通过羟基、羧基取代成酯或酰胺等修饰，改善大黄酸理化性质，降低毒性，提高抗感染、抗癌、抗菌等活性，具有重要意义，可为畜禽病原菌耐药防控提供新思路，也为大黄酸类衍生物的进一步研究提供参考依据。目前，大黄酸衍生物双醋瑞因是大黄酸最具代表性的衍生物之一，可阻滞白细胞介素−1β(Interleukin-1β，IL-1β)的作用，减少破骨细胞的形成和抑制吸收因子的合成在临床上广泛应用于治疗骨关节炎[10]。双醋瑞因的上市为后续大黄酸衍生物的研究和开发提供了理论依据；但是，双醋瑞因存在严重的毒副作用，为了控制其重度腹泻及影响肝脏的风险，对其临床使用设置了限制性条件。双醋瑞因又名1, 8−二乙酰基−3−羧基蒽醌，用乙酰氯对大黄酸第1、8位羟基进行保护。有研究表明，第1、8位羟基对大黄酸毒性的影响较小[11]，因此，双醋瑞因对大黄酸毒性的改善并不明显。研究表明，大黄酸第3位羧基是大黄酸毒性的关键影响因素[11]，对第3位羧基进行修饰能提高大黄酸的跨膜能力，从而可能提高大黄酸的抗感染效果[12]。据报道，游离的脂肪酸在肠道炎症反应中具有潜在的应用价值，它可以与肠道细胞膜的特异性受体结合从而发挥免疫保护作用，降低肠道促炎因子水平，以治疗肠道炎症[13]。一方面，脂肪酸作为能量物质，提供了成年人每日所需能量的30%[14]；另一方面，脂肪酸参与生物膜的构成、受体激活、信号转导、神经系统发育和各种基因的调节[15]。脂肪酸衍生化可以使大黄酸具有更好的应用价值，保护大黄酸，避免其在体内快速代谢或降解，提高大黄酸稳定性[16]；还可以增强大黄酸分子的亲脂性和跨膜转运能力[17]；由于肿瘤组织对脂肪酸的吸收能力较强，也可以促进大黄酸分子对癌细胞的靶向积累。总之，通过脂肪酸对大黄酸进行衍生化具有广阔的应用前景。
本研究前期工作发现，大黄酸与脂肪酸具有协同抗感染作用，并且脂肪酸能在一定程度上降低大黄酸的毒性；但是，大黄酸和脂肪酸在体内代谢速率、生物利用度等因素影响下很难发挥协同作用。因此，本研究通过对大黄酸第3位羧基与羟基癸酸和癸醇进行酯化衍生化，制备出4种大黄酸衍生物，通过核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)和傅里叶变换红外光谱(Fourier transforme infrared spectroscopy，FTIR)表征其结构，进一步探究其毒性、抗感染和抗氧化活性变化，筛选出具有应用前景的大黄酸衍生物，以期为大黄酸衍生物的结构设计及其生物活性等研究提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 仪器与材料
核磁共振波谱(德国Bruker公司)；磁力搅拌器(上海龙跃仪器设备有限公司)；流式细胞计数仪(美国贝克曼库尔特)；傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher Nicolet公司)；酶标定量测定仪(美国Beckman公司)；CO2细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)；RT-qPCR仪(美国Bio-Rad生命医学产品有限公司)；旋转蒸发仪N-1200B(日本EYELA东京理化)；小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(武汉普诺赛生命科技有限公司)；一氧化氮(NO)检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司)；DMEM、特级胎牛血清、青链霉素(赛默飞生命科学产品与服务旗舰店)；总RNA极速提取试剂盒(广州晖鼎生物科技有限公司)；4−(二甲氨基)吡啶(4-Dimethylaminopyridine，DMAP)、N,N′−二环己基碳二亚胺(N, N′-Dicyclohexylcarbodiimide，DCC)(上海麦克林生化科技有限公司)；氘代二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海源叶生物科技有限公司)；大黄酸(上海麦克林生化科技有限公司)；1−癸醇(1-Decanol，DA)、10−羟基癸酸(10-Hydroxydecanoic acid，10-HA)、10−羟基−2−癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA)、5−羟基癸酸钠(5-Hydroxydecanoate sodium，5-HD)(上海毕得医药科技股份有限公司)结构式如图2所示；双氯荧光黄乙酸乙酯(2, 7-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)(广州市齐云生物技术有限公司)。
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图 2 癸醇(A)和羟基癸酸(B、C、D)的结构式Figure 2. Structural formulas of decanol (A) and hydroxydecanoic acid (B, C, D)1.2 试验与方法
1.2.1 大黄酸衍生物的制备与纯化
精密称取0.5 g(1.70 mmol)大黄酸，置于20 mL DMSO溶液中，于50 ℃、200 r/min搅拌1 h，完全溶解后，加入DA/10-HA/10-HDA/5-HD、DCC 3.40 mmol和DMAP 0.85 mmol，反应摩尔比按照大黄酸∶DA/10-HA/10-HDA/5-HD∶DCC∶DMAP=1.0∶1.0∶2.0∶0.5。在50 ℃条件下反应，每间隔1 h，用薄层层析法监测反应情况，确认产物生成，直至产物不再增加(展开剂为乙酸乙酯和石油醚，体积比为2∶3)，停止反应。大黄酸与羟基脂肪酸的反应结构式如图3所示。反应结束后待温度降至室温，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液透析1 d (透析袋截留相对分子质量为500)，去离子水透析2 d，每隔12 h更换透析液，除去未反应的物质。随后，在−75 ℃、0.001 MPa条件下冷冻干燥48 h，得到冻干粗产物。将上述得到的粗产品用38~48 μm孔径的硅胶柱层析进行干法上样，使样品层与硅胶层之间的高度比为1∶20。洗脱液乙酸乙酯∶石油醚=2∶3(V/V)，直至监测到产物完全洗脱，获得最终产物。用旋转蒸发器除去溶剂，于50 ℃真空烘箱干燥24 h，得到黄色粉末固体产物。
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图 3 大黄酸与羟基脂肪酸的反应结构式F-A为接枝脂肪酸或癸醇，R为F-A反应掉羟基的部分结构，R-FA为接枝后的大黄酸衍生物。Figure 3. Structural formula for the reaction of rhein with hydroxy fatty acidsF-A is grafted fatty acid or decanol, R is the part of the structure where F-A reacts to drop the hydroxyl group, R-FA is the grafted rhein acid derivative.1.2.2 大黄酸衍生物的抗感染活性测定
为验证大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率的影响，选用CCK-8试剂盒对RAW 264.7细胞存活率进行检测。分别用10~160 μmol/L的大黄酸及其衍生物处理RAW 264.7细胞24 h，10%(
$\varphi $ ) CCK-8试剂孵育0.5~4.0 h，酶标仪设定波长为450 nm，测定每孔光密度。为验证大黄酸衍生物的抗感染效果，构建脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的RAW 264.7细胞模型，测定大黄酸及其衍生物处理后RAW 264.7中NO释放量以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达量变化。用20 μmol/L的大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA在37 ℃、5%(
$\varphi $ ) CO2条件下预孵育8 h，加入LPS，终质量浓度为 1 μg/mL，在37 ℃、5%($\varphi $ ) CO2条件下孵育16 h(另外设置LPS阳性对照组，不加药物处理)。用细胞培养液上清液[DMEM+10% (φ) FBS溶液+1% (φ) 青链霉素溶液]稀释NaNO2标准品至0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL每孔，在96孔板中加入标准品及样品(每组设置3个复孔)，用酶标仪于540 nm波长处测定光密度，计算NO含量。提取RAW 264.7的RNA，反转录，利用RT-qPCR测定肿瘤坏死因子−α (Tumour necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、白细胞介素−6 (Interleukin-6，IL-6)的表达量变化，具体步骤如下。首先，投入总量为1 μg的RNA，2 μL 4× gDNA wiper Mix，用RNase-free ddH2O定容至10 μL，充分混匀，于42 ℃离心2 min后，得到去DNA的反应液。然后，在上述反应液中加入4 μL 5× Hiscript Ⅲ qRT SuperMix，用RNase-free ddH2O定容至20 μL，得到反转录体系，充分混匀，短暂离心，经37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的PCR反应后，得到cDNA。最后，按照下述反应程序进行RT-qPCR：95 ℃ 30 s，循环1次；95 ℃ 10 s，循环40次；60 ℃ 30 s，循环40次；72 ℃ 30 s，循环40次。RT-qPCR反应体系中所需的引物序列见表1。表 1 RT-qPCR引物Table 1. RT-qPCR primer引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)
Primer sequence扩增序列
Amplified sequenceGAPDH-F ACCCAGAAGACTGTGGATGG GAPDH mRNA GAPDH-R CACATTGGGGGTAGGAACAC GAPDH mRNA TNF-ɑ-F CTCTTCAAGGGACAAGGCTG TNF-ɑ mRNA TNF-ɑ-R CGGACTCCGCAAAGTCTAAG TNF-ɑ mRNA IL-6-F CCGGAGAGGAGACTTCACAG IL-6 mRNA IL-6-R TCCACGATTTCCCAGAGAAC IL-6 mRNA IL-1β-F GACCTTCCAGGATGAGGACA IL-1β mRNA IL-1β-R AGGCCACAGGTATTTTGTCG IL-1β mRNA 1.2.3 大黄酸衍生物的抗氧化活性测定
为验证大黄酸及其衍生物对LPS诱导的RAW 264.7细胞中活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生的影响，用20 μmol/L的大黄酸以及大黄酸衍生物处理RAW 264.7细胞。ROS荧光探针DCFH-DA可穿透活细胞膜进入细胞内，并可被细胞内的ROS氧化，生成氧化乙啶；氧化乙啶可嵌入染色体DNA中，产生红色荧光。根据此原理可以评估细胞内ROS含量及其变化情况。用DCFH-DA染色，通过流式细胞计数仪检测大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞中ROS产生的影响，评估大黄酸及其衍生物抗氧化水平。
1.2.4 统计学分析
采用Orgin Pro 9.0和Graph Pad 8进行统计分析，试验分组均至少有3次重复，采用t检验比较组别之间的差异性。若P>0.05，则无统计学意义；若P<0.05、P<0.01或P<0.001，则其有显著差异；若P<0.000 1，则其有极显著差异。
2. 结果与分析
2.1 大黄酸衍生物结构表征
为了表征大黄酸衍生物是否成功合成，用FTIR和1H NMR表征其结构。R-5HD的FTIR表征结果如图4A所示。大黄酸的羟基(—OH)峰位于3 420.40 cm−1，羰基(—C=O)峰位于1 648.98 cm−1；5-HD的羟基峰位于3 410.34 cm−1，羰基峰位于1 703.44 cm−1；R-5HD的羟基峰位于3 447.58 cm−1，羰基峰位于1 740.69 cm−1，新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6)，酚羟基氢对应h1/f1(11.87×10−6)，第3位羧基(—COOH)氢对应g1(13.79×10−6)；5-HD碳链上的氢对应b2(2.33×10−6)、c2(1.54×10−6)、d2(1.38×10−6)、e2(3.10×10−6)、g2(1.38×10−6)、h2/i2(1.25×10−6)、j2(1.28×10−6)、k2(0.88×10−6)，羟基氢对应f2(3.41×10−6)，羧基氢对应a2(11.87×10−6)。由大黄酸衍生物R-5HD的1H NMR表征(图4B)可以看出，大黄酸第3位羧基峰和5-HD碳链上的羟基峰消失，与5-HD对比，R-5HD中峰h3(4.02×10−6)发生明显的偏移。以上结果均表明R-5HD成功合成。
R-DA的FTIR表征结果如图4C所示，大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1，羰基峰位于1 648.98 cm−1；R-DA的羟基峰位于3 447.58 cm−1，羰基峰位于1 740.69 cm−1，新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6)，酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6)，第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6)；DA碳链上的氢对应b2/d2/e2/f2(1.26×10−6)、g2(1.30×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.50×10−6)、j2(4.35×10−6)，羟基氢对应k2(3.23×10−6)。由R-DA的1H NMR表征(图4D)可以看出，大黄酸第3位羧基峰和DA碳链上的羟基峰消失，与DA对比，R-DA中羟基相邻烷烃链上氢对应的h3(4.33×10−6)发生明显偏移。以上结果均表明R-DA成功合成。
R-10HA FTIR结构表征如图4E所示。大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1，羰基峰位于1 648.98 cm−1；10−HA的羟基峰位于3 410.34 cm−1，羰基峰位于
1703.44 cm−1；R-10HA的羟基峰位于3 447.58 cm−1，羰基峰位于1 740.69 cm−1，新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6)，酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6)，第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6)；10-HA碳链上的氢对应c2(1.54×10−6)、d2(1.33×10−6)、e2/f2(1.26×10−6)、g2(1.30×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.58×10−6)、j2(3.62×10−6)，羟基的氢对应k2(4.7×10−6)，羧基的氢对应a2(11.87×10−6)。由R-10HA的1H NMR 表征(图4F)可以看出，大黄酸第3位羧基峰和10-HA碳链上的羟基峰消失，与10-HA对比，R-10HA中峰h3(4.02×10−6)发生明显的偏移。以上结果均表明R-10HA成功合成。R-10HDA FTIR表征结果如图4G所示，大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1，羰基峰位于1 648.98 cm−1；10-HDA的羟基峰位于3 410.34 cm−1，羰基峰位于1 703.44 cm−1；R-10HDA的羟基峰位于3 447.58 cm−1，羰基峰位于1 740.69 cm−1，新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6)，酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6)，第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6)；10-HDA碳链上的氢对应b2(6.02×10−6)、c2(7.11×10−6)、d2(2.16×10−6)、e2(1.29×10−6)、f2(1.33×10−6)、g2(1.26×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.58×10−6)，羟基的氢对应k2(4.70×10−6)，羧基的氢对应a2(12.05×10−6)。由R-10HDA的1H NMR表征(图4H)可以看出，大黄酸第3位羧基峰和10-HDA碳链上的羟基峰消失，与10-HDA对比，R-10HDA中峰h3(4.02×10−6)发生明显偏移。以上结果均表明R-10HDA成功合成。
2.2 大黄酸衍生物的抗感染活性评估
2.2.1 大黄酸衍生物对RAW 264.7细胞的毒性
结果如图5所示，大黄酸浓度高于40 μmol/L时具有明显的毒性，RAW 264.7细胞存活率降低至60%；DA浓度为160 μmol/L时，RAW 264.7细胞存活率降低至60%。而R-DA、R-10HA、R-10HDA、R-5HD浓度为160 μmol/L时，RAW 264.7细胞存活率仍接近100%。由此可见，大黄酸衍生物显著降低大黄酸的细胞毒性。
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图 5 不同浓度大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率的影响“*”“**”“***”分别表示相同处理浓度大黄酸衍生物组与大黄酸组在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。Figure 5. Effect of different concentrations of rhein and its derivatives on survival rates of RAW 264.7 cells“*” “**” “***” indicate significant differences between rhein derivative group and rhein group at 0.05, 0.01 and 0.001 levels respectively in the same treatment concentration (t test).2.2.2 大黄酸衍生物的抗感染活性
大黄酸及其衍生物对NO释放量的影响如图6A所示。与空白对照组(CK)相比，阳性对照组(LPS模型组)NO释放量极显著增加(P<
0.0001 )。与LPS模型组相比，大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均能够极显著抑制LPS诱导的RAW 264.7中NO的释放量，说明4种大黄酸衍生物均具有较强的抗感染活性，对第3位羧基进行结构修饰不会丧失大黄酸的抗感染活性。![]()
图 6 大黄酸及其衍生物的抗感染作用“*”“**”“***”“****”分别表示与LPS组(阳性对照组)在0.05、0.01、0.001和0.000 1水平差异显著(t检验)。Figure 6. Anti-inflammatory effects of rhein and its derivatives“*” “**” “***” “****” indicate significant differences differed from LPS group (positive control group) at 0.05, 0.01, 0.001 and 0.000 1 levels respectively (t test).大黄酸及其衍生物均能显著降低LPS诱导的RAW 264.7中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量，结果如图6B~6D所示。与空白对照组(CK)相比，阳性对照组(LPS组)的TNF-α mRNA表达水平增加了47倍；与LPS组相比，大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了TNF-α mRNA表达水平(P<0.05)。LPS组的IL-1β mRNA表达水平比CK增加了8 813倍；与LPS组相比，大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了IL-1β mRNA表达水平。LPS组的IL-6表达水平比CK增加了4 885倍；与LPS组相比，大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了IL-6 mRNA表达水平。以上结果表明，大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA和R-10HDA均能显著抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平，对大黄酸进行结构修饰使其抗感染效果更强，且R-DA的抗感染效果最强。
2.2.3 大黄酸衍生物的抗氧化活性
如图7所示，DCFH-DA探针孵育后，空白对照组(CK)的荧光强度为1 319.66；经过LPS刺激后细胞内ROS水平显著升高，荧光强度为60 968.00，比空白对照组增加了46倍(P<
0.0001 )。药物处理后大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA以及R-10HDA组的荧光强度均显著下降，且R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA的抑制效果均优于大黄酸。以上结果表明，修饰后的R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA显著增强了大黄酸的抗氧化活性。![]()
图 7 大黄酸及其衍生物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放ROS的影响“**”“***”“****”分别表示与LPS组(阳性对照组)在0.01、0.001和0.000 1水平差异显著(t检验)。Figure 7. Effect of rhein and its derivatives on LPS-induced ROS release from RAW 264.7 cells“**” “***” “****” indicate significant differences differed from LPS group (positive control group) at 0.01, 0.001 and 0.000 1 levels respectively (t test).3. 结论与讨论
本研究以大黄酸为原料，以羟基癸酸和癸醇为修饰物，经一步酯化反应合成了4种大黄酸衍生物(R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA)，通过FTIR以及1H NMR对合成的化合物进行结构鉴定，证实4种衍生物合成成功，经对大黄酸及其衍生物进行毒性研究以及抗感染、抗氧化活性研究，主要结论及其分析如下。
通过大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率影响的分析，经过羟基癸酸和癸醇修饰之后的大黄酸衍生物对RAW 264.7细胞的毒性降低，安全性增加。羟基癸酸和癸醇与药物分子的化学偶联可能会引起它们在体内的药效学/药代动力学变化，从而降低它们的毒性。经羟基癸酸和癸醇修饰之后的大黄酸衍生物具有更强的抗感染效果，能显著降低LPS诱导的NO释放水平和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的转录水平。综合来讲，在体外炎症模型下，R-DA的抗感染效果最为突出。
ROS作为LPS诱导炎症的重要中介，可引起DNA、蛋白质和脂质的损伤[18]。此外，过量的ROS产生和积累可诱导细胞损伤和氧化应激[19]。本研究中，LPS刺激后，ROS水平显著升高，经大黄酸以及4种衍生物孵育后，LPS诱导的RAW 264.7细胞中ROS水平显著降低，R-DA抑制ROS效果与大黄酸有显著差异，相比其他3种衍生物有更好的ROS抑制效果。有研究发现，大黄酸可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶的表达起到抗感染作用，经修饰后的大黄酸衍生物作用后，细胞NO释放水平显著降低[20]，这与Ge等[21]研究结果一致。
在大黄酸构效关系研究中，大黄酸分子上第3位碳上的取代基是羧基，增大了大黄酸的极性，是溶解性的关键基团，因此，本研究采用酯化反应的方法，将第3位碳上的羧基转化为酯键，以制备具有良好脂溶性和抗感染活性的大黄酸衍生物。据调查，对蒽醌类药物的修饰改性主要是通过在羟基和羧基引入侧链基团增加药物的吸收，引入脂肪酸可以克服母体药物的脂溶性、吸收率、生物利用度等限制。此外，多数脂肪酸具有抗菌、抗感染、抗氧化活性，例如Omega-3和Omega-6等，在人体内发挥至关重要的作用。通过引入脂肪酸可以增强大黄酸的抗感染活性，降低毒性，同时也为机体的正常运转和代谢提供必需的化学物质。前期工作中经对大黄酸衍生物的抗菌活性进行初步验证，发现其能显著增强大黄酸对金黄色葡萄球菌和肠球菌的抗菌活性，相关研究后续将继续展开，为畜禽耐药性防控提供思路，也为大黄酸进一步的研究提供基础数据。
在体外抗感染过程中，R-DA可能通过抑制NF-κB途径减少LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子的产生，也可能是由于R-DA中羟基癸醇的脂溶性作用，与细胞膜上的蛋白受体靶向结合，增加细胞膜的通透性，使药物进入细胞内发挥作用，从而起到抗感染、抗氧化的作用。
本研究中，虽然制备的大黄酸衍生物具有更低的毒性以及更优的抗感染效果，但大黄酸衍生物的纯化方法、合成产率需要进一步优化和提高。因此，在本文的基础上，仍有许多工作值得深入探究，并且要对衍生物的抗感染机制做深入性研究，如衍生物的抗感染机制是否与大黄酸的作用机制一致，以及通过结构修饰后衍生物的生物利用度是否有所增加，以期为新药的开发利用提供参考价值。
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图 1 牛至油对天露黄鸡血清生化指标的影响
TG：甘油三酯，TC：总胆固醇，HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇，LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇，NEFA：游离脂肪酸；相同指标柱子上不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，单因素方差分析)
Figure 1. Effects of oregano oil on serum biochemical parameters of Tianlu yellow-feathered chickens
TG: Triglyceride, TC: Total cholesterol, HDL-C: High density lipoprotein cholesterol, LDL-C: Low density lipoprotein cholesterol, NEFA: Non-esterified fatty acid; Different lowercase letters on the same index columns indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, One way ANOVA)
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图 2 牛至油对天露黄鸡肝脏脂肪代谢相关基因mRNA表达量的影响
FAS：脂肪酸合成酶基因，ACC：乙酰辅酶A羧化酶基因，SREBP-1C：固醇调节元件结合蛋白基因，ApoB：载脂蛋白B基因，MTP：微粒体甘油三酯转移蛋白基因，LPL：脂蛋白酯酶基因，ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶基因，CPT-1：肉碱棕榈酰转移酶−1基因；各小图相同基因柱子上不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，单因素方差分析)
Figure 2. Effects of oregano oil on mRNA expression levels of liver lipid metabolism genes in Tianlu yellow-feathered chickens
FAS: Fatty acid synthase gene, ACC: Acetyl CoA carboxylase gene, SREBP-1C: Sterol-regulatory element binding protein gene, ApoB: Apolipoprotein B gene, MTP: Microsomal triglyceride transfer protein gene, LPL: Lipoprotein lipase gene, ATGL: Adipose triacyl glyceride lipase gene, CPT-1: Carnitine palmitoyl transferase gene; Different lowercase letters on the same gene columns in each figure indicate significant differences among different treatments (P < 0.05，One way ANOVA)
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图 3 牛至油对天露黄鸡腹脂脂肪代谢基因mRNA表达量的影响
FABP：脂肪酸结合蛋白基因，FAT/CD36：脂肪酸转位酶基因，ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶基因，LPL：脂蛋白酯酶基因，CPT-1：肉碱棕榈酰转移酶−1基因；各小图相同基因柱子上不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，单因素方差分析)
Figure 3. Effects of oregano oil on mRNA expression levels of abdominal fat lipid metabolism genes in Tianlu yellow-feathered chickens
FABP: Fatty acid-binding protein gene, FAT/CD36: Fatty acid translocase gene, ATGL: Adipose triacyl glyceride lipase gene, LPL: Lipoprotein lipase gene, CPT-1: Carnitine palmitoyl transferase gene; Different lowercase letters on the same gene columns in each figure indicate significant differences among different treatments (P < 0.05，One way ANOVA)
表 1 目的基因PCR引物
Table 1 Target gene PCR primers
基因
Gene序列号
Serial number引物序列/(5′→3′)
Primer sequence退火温度/℃
Annealing temperature片段大小/bp
Product lengthLPL XM_015280414.1 F: TTGGTGACCTGCTTATGCTA 57.2 185 R: TGCTGCCTCTTCTCCTTTAC FAS NM_205155 F: TGCTATGCTTGCCAACAGGA 58.0 137 R: ACTGTCCGTGACGAATTGCT APOB NM_001044633.1 F: GCCGTTTGACTGGGAGTACA 58.2 126 R: TCTTCCCATTTCCTGGTGCC ACC NM_205505 F: GCTGG GTTGA GCGAC TAATG A 57.3 171 R: GAAACTGGCAAAGGACTGACG FAT/CD36 NM_001030731.1 F: TGCAAAGCAGGAGGGTGAAA 60.6 94 R: GGTGCAAAGGCCACAAAGAG MTP NM_001109784.2 F: GTTCTGAAGGACATGCGTGC 60.6 287 R: CCAGCAAAGGAGTCCAGGTT A-FABP NM_204290.1 F: GCCTGACAAAATGTGCGACC 59.7 105 R: TTCCTGGTAGCAAACCCCAC SREBP-1 NM_204126 F: TACCG CTCAT CCATC AACGAC 58.1 92 R: TTCCTCAGGATCGCCGACTT CPT-1 NM_001012898.1 F: GGAGAACCCAAGTGAAAGTAATGAA 58.9 135 R: GAAACGACATAAAGGCAGAACAGA ATGL NM_001113291.1 F: CCTTTGGACTCCGCTTGGAA 58.9 242 R: GGACCCAGGAACCTCTTTCG 
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表 2 实验室试验中牛至油对天露黄鸡生产性能和屠宰性能的影响1)
Table 2 Effects of oregano oil on production and slaughter performances of Tianlu yellow-feathered chickens in laboratory experiment
w(牛至油)/(mg·kg−1)
Oregano oil content初始体质量/g
Initial weight末体质量/g
Final weightADWG/g ADFI/g 耗料增重比/%
Feed to gain ratio屠体质量/g
Dressed weight0 990.00±19.40a 1 379.29±29.37a 12.97±0.92a 84.31±2.71a 6.64±0.35a 1 225.00±26.79a 100 968.33±48.25a 1 438.33±57.66a 15.67±0.76ab 96.63±8.53a 6.13±0.33ab 1 279.17±62.09a 200 959.17±36.24a 1 510.83±58.01a 18.39±2.51b 92.87±5.82a 5.28±0.35b 1 335.83±55.12a w(牛至油)/(mg·kg−1)
Oregano oil content全净膛质量/g
Eviscerated weight上架质量/g
Shelf weight肝脏指数/%
Liver index胸肌率/%
Breast muscle rate腿肌率/%
Leg muscle rate腹脂率/%
Abdominal fat rate0 840.86±27.60a 949.35±26.31a 3.39±0.46a 12.62±0.41b 18.04±0.41a 10.55±0.56a 100 883.97±40.90a 999.47±42.62a 3.04±0.12a 13.18±0.50b 18.67±0.55a 9.84±1.01ab 200 932.30±36.99a 1 041.57±37.50a 3.31±0.25a 14.73±0.48a 18.85±0.35a 8.07±0.64b 1)ADWG表示平均日增体质量，ADFI表示日均采食量；同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，单因素方差分析)
1) ADWG indicates average daily weight gain, ADFI indicates average daily feed intake；Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, One way ANOVA)
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表 3 牛至油对天露黄鸡胸肌和腿肌中水分、粗蛋白和粗脂肪含量的影响1)
Table 3 Effects of oregano oil on water, crude protein and ether extract contents in breast and leg muscles of Tianlu yellow-feathered chickens
w/% 组织
Tissuew(牛至油)/(mg·kg−1)
Oregano oil content水分
Water粗蛋白
Crude protein粗脂肪
Ether extract胸肌 0 71.94±0.32a 25.30±0.24a 0.96±0.07a Breast muscle 100 71.85±0.21a 25.35±0.20a 0.93±0.13a 200 73.17±1.44a 24.53±1.31a 0.71±0.04a 腿肌 0 73.28±0.27a 22.07±0.10b 3.23±0.19ab Leg muscle 100 73.04±0.28a 22.04±0.21b 3.50±0.17a 200 72.81±0.67a 23.07±0.47a 2.50±0.42b 1)相同组织同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，单因素方差分析)
1) Different lowercase letters in the same tissue and column indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, One way ANOVA)
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表 4 模拟生产试验中牛至油对天露黄鸡生产性能和屠宰性能的影响
Table 4 Effects of oregano oil on production and slaughter performances of Tianlu yellow-feathered chickens in production simulation experiment
w(牛至油)/(mg·kg−1)
Oregano oil content初始体质量/g
Initial weight末体质量/g
Final weightADWG/g ADFI/g 宰前活体质量/g
Live weight before slaughtering屠体质量/g
Dressed weight0 1 037.95±2.13a 1 635.96±6.55a 19.93±0.21a 94.80±0.64a 1 655.00±6.03a 1 513.18±5.36a 100 1 036.25±0.42a 1 614.16±5.61a 19.26±0.19a 93.75±0.92a 1 630.00±8.27b 1 496.43±9.30ab 200 1 043.16±11.44a 1 626.75±12.32a 19.45±0.31a 95.36±1.35a 1 618.50±8.75b 1 478.00±7.68b w(牛至油)/(mg·kg−1)
Oregano oil content全净膛质量/g
Eviscerated weight上架质量/g
Shelf weight肝脏指数/%
Liver index胸肌率/%
Breast muscle rate腿肌率/%
Leg muscle rate腹脂率/%
Abdominal fat rate0 1 073.64±7.54a 1 169.09±7.09a 3.13±0.07a 16.00±0.52ab 19.04±0.44a 9.01±0.29a 100 1 046.78±12.11a 1 142.14±11.01a 3.24±0.12a 16.92±0.39a 18.98±0.32a 8.09±0.37ab 200 1 065.50±13.24a 1 163.50±15.36a 3.10±0.13a 15.49±0.54b 18.73±0.42a 7.21±0.48b 1)ADWG表示平均日增体质量，ADFI表示日均采食量；同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，单因素方差分析)
1) ADWG indicates average daily weight gain, ADFI indicates average daily feed intake；Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, One way ANOVA)
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