Identification of 29 strains of entomogenous fungi and their toxicity to Bemisia tabaci
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摘要:目的
对29株虫生真菌菌株进行分类学鉴定并筛选出对烟粉虱Bemisia tabaci具有高毒力的菌株。
方法采用形态学及ITS区、TEF区、Bloc区基因序列相似性分析鉴定菌株，并采用浸渍法测定真菌对烟粉虱的毒力。
结果29株虫生真菌有26株符合白僵菌Beauveria的特征，菌株SB003、SP665和SP670被鉴定属于棒束孢属Isaria；利用TEF区序列、Bloc区序列、TEF-Bloc联合序列构建的系统发育树，结果显示29株菌株共包括24株球孢白僵菌B. bassiana、2株假性球孢白僵菌B. pseudobassiana和3株环链棒束孢I. cateinannulata。烟粉虱2龄若虫的死亡率随孢子浓度的增加而增加，不同菌株致病力不同；用1×108 mL−1的孢子悬浮液处理烟粉虱2龄若虫7 d，致死率最高的菌株为SP433，其次为SB009，分别为87.37%和82.93%。
结论本研究可为虫生真菌的分类提供理论基础，筛选出的高致病力菌株SP433和SB009可为烟粉虱的生物防治提供参考。
Abstract:ObjectiveTo identify 29 strains of entomogenous fungi and select high virulent strains against Bemisia tabaci.
MethodIdentification of fungi were based on morphological analysis and genetic homology analysis of sequences in ITS, TEF and Bloc regions. The fungal toxicity to B. tabaci was evaluated by the immersion method.
ResultTwenty-six of 29 entomogenous fungal strains had the characteristics of Beauveria and the other three strains of SB003, SP665 and SP670 were identified as Isaria. Phylogenetic tree was constructed using TEF region sequence, Bloc region sequence and TEF-Bloc combined sequence, which showed that 29 strains included 24 strains of Beauveria bassiana, 2 strains of B. pseudobassiana, and 3 strains of Isaria cateinannulata. The mortality of the 2nd instar nymph of B. tabaci increased with the increase of spore concentration, and the pathogenicity of different strain was different. The 2nd instar nymphs of B. tabaci were treated with 1×108 mL−1 spore suspension for 7 days, and the SP433 strain had the highest lethality rate of 87.37%, followed by SB009 with a lethality rate of 82.93%.
ConclusionThis study can provide a theoretical basis for the classification of entomophytic fungi. The highly pathogenic strains of SP433 and SB009 were screened out, which can provide a reference for the biological control of B. tabaci.
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兰花是兰科Orchidaceae植物的总称，但在中国，兰花是指兰科兰属Cymbidium植物，特别是其中的地生种类，也就是今天的国兰[1]。兰科是开花植物中最大的科之一，已鉴定的兰科植物有899属29 199种，约占开花植物的8%~10%，除极地和极端干旱的沙漠外，世界各地均有兰花分布[2-3]。兰花具有很高的观赏价值、药用价值、食用价值、生态价值和文化价值，是世界著名的观赏花卉，也是中国传统十大名花之一[3]。作为观赏花卉，兰花既可以做切花、也可以做盆花，既可以观花、也可以赏叶，同时也是园林造景优良植材，深受世界各国人民的喜爱。作为进化程度最高、种类最丰富的植物，兰花也是当今生物学领域研究生命和进化的理想模式植物。新品种选育是兰花产业自主和高质量发展的基础，而育种方法是快速高效选育兰花优良品种的关键。目前，兰花育种的主要方法有引种驯化、选择育种、杂交育种、诱变育种和多倍体育种等[4-5]。这些育种方法虽然有效，但可利用资源范围窄、育种周期长，不能定向培育市场所需品种。分子育种是采用转基因或基因编辑技术创造变异、或通过分子标记辅助选择技术培育新品种的方法，主要包括转基因育种、基因编辑育种和分子标记辅助选择育种。近年来，随着兰花组学技术的发展，兰花主要育种目标性状的分子遗传基础、基因鉴定和克隆、高密度分子图谱构建等取得巨大进步，兰花转基因技术和分子标记辅助选择技术也取得明显进展，本文对此进行综述并对未来兰花分子育种技术研究的重点和品种创新进行了展望，为进一步推动兰花分子育种技术研究和新品种选育提供参考。
1. 兰花基因组测序和功能基因鉴定
1.1 基因组测序
自2015年Cai等[6]完成小兰屿蝴蝶兰Phalaenopsis equestris 基因组测序以来，迄今有来自4亚科8属18种共27份兰花完成了基因组测序，包括附生、地生和腐生3类(表1)[6-31]。其中，广东舌唇兰Platanthera guangdongensis基因组最大(4.27 Gb)[20]，深圳拟兰Apostasia shenzhenica基因组最小(348.73 Mb)[30]，天麻Gastrodia elata预测基因数最少(17 895个)[25]，染色体数最少的香荚兰Vanilla fragrans预测基因数最多(59 128个)[29]。基于基因组测序结果，对兰花叶艺、花型、花色、花期、适应性等性状的分子遗传基础分析结果表明，CH1基因家族显著缩减可能是导致墨兰Cymbidium sinense叶艺形成的重要原因[7]；光合天线和代谢途径相关基因表达水平降低引起建兰C. ensifolium叶艺的形成，叶片中与花发育相关的MADS-box基因表达水平显著提高导致花被状叶的形成[8]。
表 1 兰花基因组测序Table 1. Genome sequencing of orchid物种
Species染色体数
No. of
chromosomes基因组
大小/Gb
Genome size预测基因数
No. of
predicted genes重复序列/%
Repetitive
sequence测序技术及文献
Sequencing technique
and reference墨兰 Cymbidium sinense 20 3.52 29 638 77.78 Illumina HiSeq 2000[7] 建兰 C. ensifolium 20 3.62 29 073 80.58 Illumina HiSeq 2500 PacBio[8] 春兰 C. goeringii 20 3.99 29 556 88.87 Illumina Hiseq 2500[9] 春兰 C. goeringii 20 4.10 29 272 77.65 Illumina HiSeq 2500 PacBio[10] 硬叶兰 C. mannii 20 2.88 27 192 82.80 MGISEQ-2000[11] 铁皮石斛
Dendrobium officinale19 1.35 35 567 63.33 Illumina HiSeq 2000 PacBio[12] 铁皮石斛 D. catenatum 19 1.12 29 257 78.10 Illumina Hiseq2000[13] 鼓槌石斛 D. chrysotoxum 19 1.37 30 044 62.81 MGISEQ-2000 NovaSeqPacBio[14] 铁皮石斛 D. officinale 19 1.23 25 894 76.77 Illumina Hiseq 4000 PacBio[15] 霍山石斛 D. huoshanense 19 1.285 21 070 74.92 Illumina HiSeq 2000 PacBio[16] 金钗石斛 D.nobile 19 1.16 29 476 61.07 Illumina Novaseq6000[17] 小兰屿蝴蝶兰
Phalaenopsis equestris19 1.13 29 545 61.53 Illumina HiSeq 2000[6] 蝴蝶兰‘KHM190’
P. ‘KHM190’19 3.10 41 153 59.74 Illumina HiSeq 2000[18] 台湾蝴蝶兰 P. aphrodite 19 1.03 28 902 60.30 Illumina Hiseq 2000[19] 紫金舌唇兰
Platanthera zijinensis21 4.15 24 513 77.38 Illumina Hiseq 4000 PacBio[20] 广东舌唇兰
Platanthera guangdongensis21 4.27 22 559 82.18 Illumina Hiseq 4000 PacBio[20] 天麻 Gastrodia elata 18 1.06 18 969 66.18 Illumina HiSeq 2500[21] 天麻 G. elata 18 1.12 24 484 68.34 Illumina HiSeq 2000[22] 天麻 G. elata 18 1.04 21 115 66.36 PacBio Sequel II[23] 天麻 G. elata 18 1.05 18 844 74.92 Illumina NovaSeq 6000 PacBio[24] 天麻 G. elata 18 1.09 17 895 63.89 Illumina HiSeq 4000[25] 勐海天麻 G. menghaiensis 18 0.99 17 948 65.08 Illumina HiSeq 2500[26] 白及 Bletilla striata 18 2.37/2.43 26 673 PacBio[27] 香荚兰 Vanilla planifolia 14 1.5 29 167 44.30 Illumina HiSeq 2000[28] 香荚兰 V. planifolia 14 3.4 59 128 72.00 Illumina HiSeq 2000[29] 深圳拟兰
Apostasia shenzhenica34 0.35 21 841 42.05 Illumina HiSeq 2000 PacBio[30] 多枝拟兰 A. ramifera 34 0.37 22 841 44.99 Illumina Hiseq 2000[31] MADS-box基因影响花发育和形态。通过测序分析，在多枝拟兰A. ramifera、深圳拟兰、天麻、紫金舌唇兰Platanthera japonica、广东舌唇兰、香荚兰、小兰屿蝴蝶兰、台湾蝴蝶兰P. aphrodite、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum、铁皮石斛D. catenatum、春兰C. goeringii 、建兰和墨兰中分别鉴定出30、36、40、43、43、55、51、56、58、63、69、71和94个MADS-box基因[2, 7, 9, 19]，且多数兰花中没有FLC、AGL12和AGL15基因。在小兰屿蝴蝶兰中有20个基因优先在花组织中表达，MIKC等5个基因只在花中表达，C/D类和B类基因AP3、AGL6基因家族的扩张和分化可能是兰花高度特化花型形成的原因[6]。CsSEP4基因正调控墨兰合蕊柱发育 [7]。C类基因CeAG-1和 CeAG-2在建兰花瓣中的高表达形成鼻状花瓣，在花芽中低表达时，则花中没有鼻，取而代之的是几轮花被片，形成具有多花被片分枝花序的花；CeSEP-2基因表达上调对兰花形成特化的唇瓣十分重要，下调则形成菊瓣花；唇瓣结构由CeAP3-1、CeAP3-2、CeAP3-3、CeAP3-4和CeAGL6-2基因控制，CeAP3-3、CeAP3-4和CeAGL6-2在萼片和花瓣中高表达则分别形成唇瓣状萼片和花瓣突变体[8]。
萜类化合物在兰花香气和抗逆性中起关键作用。在深圳拟兰、小兰屿蝴蝶兰、鼓槌石斛、金钗石斛D. nobile和墨兰中鉴定出TPS基因数分别为14、21、48、51和59个[6,7,14,17,30]。墨兰的花香与TPS基因家族扩张有关，与无香的墨兰相比，有香的墨兰TPS家族基因表达量更高[7]。单萜和倍半萜主要在花发育晚期和开花期形成，与其生物合成的相关基因GDPS、FDPS和LIS高表达有关，FDPS和GDPS主要在萼片、花瓣和唇瓣中表达，说明萜类化合物主要在花被中合成[8]。
花色是兰花主要育种目标性状。通过基因组测序和表达分析，在墨兰中鉴定出56个花青素合成代谢相关基因和125个MYBs，花青素合成代谢相关基因在绿色、黄色、粉色和紫黑色花中差异表达，其中，4个F3′H基因在红色和紫色花中高表达。调控花青素合成途径上游的MYBs一般在开紫黑色花的墨兰中表达上调，而调控下游的平行基因表达谱存在显著差异，此外，MYBs通过调控F3′5′H的表达影响墨兰的花色[7]。在白色和粉色台湾蝴蝶兰中，F3H的表达模式明显不同，R2R3-MYB在不同颜色蝴蝶兰中表达模式也不同[19]。
次生代谢物是药用兰花的主要育种目标性状。测序分析结果表明，铁皮石斛中SPS和SuSy基因扩张与石斛多糖形成有关[12]；甲基赤藓糖醇磷酸途径中DXS、LUT1、LUT2、LCY1、LUT5等相关基因的丢失，导致天麻中叶黄素、胡萝卜素和脱落酸等物质的缺乏[23]；OMT基因在秋水仙素生物合成中起重要作用[24]。
其他性状研究结果表明，墨兰CsSVP基因与其互作蛋白CsAP1和CsSOC1共同调控低温诱导开花[7]。附生兰耐热性与SDD1、PPP7和3MAT基因家族扩张有关[12]。鼓槌石斛花期短是由于在开花至凋谢过程中类胡萝卜素含量逐渐增加、叶黄素含量逐渐减少，导致ABA含量减少、乙烯含量增加所致[14]。
1.2 功能基因鉴定
功能基因鉴定是兰花分子育种的基础。迄今采用转基因、RNAi和VIGS等技术已从兰属、石斛属、蝴蝶兰属和文心兰属Oncidium兰花中鉴定出功能基因91个[32-103]。其中，通过将基因转入兰花中并验证功能的有24个，占比24.7%。已鉴定出功能的基因包括植株生长发育、叶色、花发育、花色、开花时间、多糖合成、抗病、抗逆和组培快繁特性等基因(表2)，其中，花色、花发育、花期、抗逆和多糖合成的基因数分别为20、19、 15、13和 5个，占比分别为22.0%、20.9%、16.5%、14.3%和5.5%。
表 2 兰花功能基因鉴定Table 2. Identifications of functional genes in orchid性状
Trait基因
Gene来源
Source载体类型
Carrier type受体、结果及文献
Receptor, result and reference花色
Flower
colorDFR 大花蕙兰
‘Rosannagirl Mild’过表达 矮牵牛，转基因植株花色由白色变为粉红色[32] F3′5′H 蝴蝶兰‘TS444’ 瞬时表达和过表达 蝴蝶兰‘TS444’，花色由粉红色变为品红色[33] PeUFGT3 小兰屿蝴蝶兰 RNAi 小兰屿蝴蝶兰，花色出现不同程度褪色[34] PeMYB2/11/12 小兰屿蝴蝶兰 VIGS 小兰屿蝴蝶兰，红色色素、斑点和网纹丧失[35] DseCHS-B 石斛兰‘睡公主’ RNAi 石斛兰‘睡公主’，花青素积累受损[36] CHS 蝴蝶兰‘大辣椒’ RNAi 蝴蝶兰‘大辣椒’，花瓣颜色变淡、色素含量降低[37] MYBx1 蝴蝶兰‘大辣椒’ 过表达 矮牵牛，转基因植株花色素沉积降低[38] OgPSY 文心兰‘柠檬绿’ RNAi 文心兰‘柠檬绿’，叶黄素含量降低，花朵白色[39] DoFLS1 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因植株花色苷含量降低、黄酮醇含量增
加[40]PeMYB4L 小兰屿蝴蝶兰 VIGS 小兰屿蝴蝶兰，红色素沉积降低[41] DoMYB5，DobHLH24 铁皮石斛 瞬时表达和过表达 烟草和铁皮石斛，花色苷积累增加[42] 开花时间
Flowering
timeOnFT，OnTFL1 文心兰‘南茜’ 过表达 拟南芥，过表达OnFT植株克服晚花缺陷、过表达OnTFL1抑制成花转变[43] PhalCOL 台湾蝴蝶兰 过表达 烟草，转基因植株花期提早[44] CgFT 春兰 过表达 烟草，转基因植株花期提早[45] CsFT 墨兰 过表达 拟南芥，转基因植株花期提前[46] OMADS1 文心兰 过表达 拟南芥和烟草，转基因植株花期提前[47] DoSOC1 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因植株花期提前[48] PhFT 蝴蝶兰 Fortune Saltzman 过表达 拟南芥，转基因植株克服晚花缺陷[49] PaFT1，PaFD 台湾蝴蝶兰 过表达 拟南芥和水稻，转基因植株开花(抽穗)变早，叶片少 [50] CsFT 墨兰 过表达 拟南芥，转基因植株提前开花[51] DoAP1 石斛兰 Chao Praya Smile 过表达 拟南芥，过表达促进开花 [52] PhPEBPs 蝴蝶兰 Little Gem Stripes 过表达 拟南芥，PhFT1、 PhFT3、 PhFT5和 PhMFT 促进
开花，PhFT6抑制开花[53]花发育
Floral
developmentPeMADS6 小兰屿蝴蝶兰 过表达 拟南芥，转基因植株出现花瓣状萼片，花寿命增加
3~4倍[54]ORAP11/13 蝴蝶兰 Formosa Rose 过表达 烟草，开花提前，叶片和花器官结构改变[55] PeMADS1/7 小兰屿蝴蝶兰 过表达 拟南芥，PeMADS1挽救ag-4突变体花缺陷表型，PeMADS7抑制花被脱落，种子不育增加[56] PhapLFY 台湾蝴蝶兰 过表达 拟南芥，挽救lfy突变体的异常花不育表型[57] CsAG1 墨兰 过表达 拟南芥，转基因植株花瓣同一性被破坏[58] PaSPK1 台湾蝴蝶兰 VIGS 蝴蝶兰，双花序植株比例减少[59] DoAG1/2 石斛兰 Chao Praya Smile 过表达 拟南芥，挽救ag-4突变体花朵缺陷表型[60] PaFYF1/2 台湾蝴蝶兰 过表达和 VIGS 拟南芥和蝴蝶兰，基因过表达延迟拟南芥花衰老和脱落，且对乙烯处理不敏感；基因沉默蝴蝶兰花衰老和脱落提前[61] PeDL1/2 小兰屿蝴蝶兰 VIGS和
瞬时过表达小兰屿蝴蝶兰，基因沉默影响胚珠初始数量；瞬时过表达导致雌蕊胚珠和柱头腔发育异常[62] MIR390a/b/c 春兰 过表达 拟南芥，转基因植株花药长径比增大、柱头分离、花粉量减少、种子败育率增加[63] CemiR396 建兰 过表达 烟草，转基因植株矮小、叶片变窄、花被严重弯曲、花药发育异常、部分不育[64] 续表 2 Continued table 2 性状
Trait基因
Gene来源
Source载体类型
Carrier type受体、结果及文献
Receptor, result and reference多糖合成
Polysaccharide
synthesisDoUGE 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因植株多糖积累提高、盐胁迫和渗透胁迫耐受性提高[65] DoGMP1 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因植株甘露糖含量增加、盐胁迫下萌发率提高[66] DoMYB75 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因种子水溶性多糖含量增加14%[67] DoRWA3 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因种子、叶片和茎中多糖的乙酰化水平显著提高[68] 抗逆性
Abiotic
stress tolerancePaCDPK1::GUS 蝴蝶兰 ‘TS97K’ 启动子融合GUS 拟南芥，转基因植株PaCDPK1基因表达受寒冷、伤害和病原体攻击诱导[69] CfJMT 蕙兰 过表达 番茄，转基因植株MeJA 生物合成基因转录水平升高[70] DcCIPk24 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因植株对干旱和盐胁迫耐受性增强[71] DnMSI1 金钗石斛 过表达 拟南芥，转基因植株NaCl 胁迫耐受性降低[72] CgWRKY18 墨兰 过表达 拟南芥，转基因植株根变长，对盐和渗透胁迫耐受性增强[73] PaCBF1 台湾蝴蝶兰 过表达 拟南芥，转基因植株低温胁迫下细胞膜完整性好[74] 抗病性
Disease resistancePaAGO5a/b 台湾蝴蝶兰 VIGS 蝴蝶兰，过表达PaAGO5a/b植株叶片中CymMV和ORSV积累显著降低[75] DcMYC2b 铁皮石斛 过表达 拟南芥，过表达DcMYC2b感染飞燕草菌核病后损伤小[76] 生长发育
Growth and developmentDsCKX1 石斛兰 ‘Sonia’ 过表达 拟南芥，转基因植株生物量降低，根系生长迅速，离体形成根系能力下降[77] cfJMT 蕙兰 过表达 矮牵牛，转基因植株叶片变小，花粉发育异常[78] CgWRKY57 春兰 过表达 拟南芥，转基因植株根长和萌发率降低[79] CgARF1 春兰 过表达 拟南芥和烟草，转基因植株叶片老化，叶绿素含量降低[80] DcWOX4/9/11 铁皮石斛 过表达 拟南芥，DcWOX4过表达导致植株显著矮小，叶缘羽状深裂，花期推迟2周；DcWOX9过表达导致植株矮化，叶缘锯齿状，开花推迟1周，强表型植株雌雄蕊均不育；DcWOX11过表达导致叶缘向下卷曲[81] 叶发育
Leaf developmentDoeREB5 铁皮石斛 过表达 拟南芥，转基因植株叶片形状和叶柄大小改变[82] 叶色
Leaf colorCsERF2 墨兰 过表达 烟草，转基因植株叶绿素含量下降，叶绿体异常[83] 叶片数量
No. of leavesCcMYB24 兰 ‘TRIR’ 过表达 拟南芥，转基植株叶片数量增加[84] 2. 转基因和基因编辑
转基因技术是兰花分子育种核心技术之一。自Kuehnlehe等[104]利用基因枪法将PRV CP基因转入石斛兰原球茎以来，兰花转基因技术研究取得巨大进展(表3)。迄今已建立蝴蝶兰、石斛兰、文心兰、大花蕙兰C. hybrida、春兰、墨兰、寒兰C. kanran、万代兰Vanda和小扇叶兰Erycina pusilla等兰花转基因技术体系，主要转基因方法为农杆菌介导法和基因枪法，涉及的性状包括花型、花色、花期、花寿命、次生代谢物、抗病、抗逆和组培快繁特性等[85-131]。通过过表达外源基因或自身基因、基因沉默、RNAi和激活标签系统等手段已获得花色变深的蝴蝶兰‘TS444’[33]和‘V3’[94]，花期提前的石斛兰[102]，抗除草剂小扇叶兰[89]，多糖和甘露糖含量高、抗逆性强的铁皮石斛[96]，PLB 形成能力增强的蝴蝶兰[97]，顶端分生组织形成多芽和花期提前的石斛兰[98]，花瓣中出现红色斑点的南茜文心兰Oncidium Gower Ramsey[101]和寒兰[103]，鲜切花寿命增加、花蕾脱落延迟的石斛兰[119]，抗病毒的蝴蝶兰[122,124]、石斛兰[104, 123]和抗低温的蝴蝶兰[131]等转基因兰花。
表 3 兰花转基因技术研究状况Table 3. Research status on transgenic technology of orchid方法
Method目标基因
Target gene受体
Receptor载体类型
Carrier type结果及文献
Result and reference农杆菌介导法Agrobacterium-
mediated methodDOH1 石斛 Madame Thong-In自交 F1 过表达 获得154个多芽转化体[85] hptII，gusA 文心兰 Sherry Baby‘OM8’ 过表达 获得28株转基因植株[105] hpt，gfp 蝴蝶兰‘White Hikaru’ 过表达 gfp检出率73.30% [106] GUS 蝴蝶兰 S122-2×S153 和 S153×S119-4的 F1 过表达 获得88株转基因植株[107] ORSV CP 玉花兰 过表达 遗传转化率64.00% [108] nptII，hpt，GUS 兰 ‘RY’、 ‘L4’和‘L23’ 过表达 获得抗潮霉素转基因植株[109] hpt，GUS 石斛兰 Ekapol‘Panda 1’ 过表达 遗传转化率44.40% [110] etr1-1 齿舌兰 Stirling Tiger和
Sweet Sugar过表达 获得转基因植株[86] hpt 大花蕙兰 过表达 遗传转化率62.50% [111] GUS 朵丽蝶兰 Sogo Beach 过表达 获得转基因植株[112] ACS 石斛兰 过表达 遗传转化率12.15% [87] PhaNPR1 台湾蝴蝶兰 基因沉默 获得转基因植株 [88] wheatwin1，wheatwin2，nptII 万代兰 Kasem’s Delight
Tom Boykin过表达 获得转基因植株[113] GUS 墨兰‘企剑白墨’ 过表达 遗传转化率0.75% [114] MSRB7 小扇叶兰 过表达 获得抗除草剂转基因植株，遗传转化率0.60% [89] GUS 石斛兰 Formidible ‘Ugusu’ 过表达 遗传转化率18.50% [115] GUS 金钗石斛 过表达 遗传转化率27.30% [116] eGFP，HptII 台湾蝴蝶兰‘M1663’(4n)、
朵丽蝶兰 Join Angel ‘TH274-1’
(4n)和台湾蝴蝶兰(2n)过表达 遗传转化率1.20%~5.20% [117] C3H，C4H，4CL，CCR，IRX 铁皮石斛 CRISPR/Cas9 遗传转化率93.60% [90] AcF3H 石斛兰‘5N’ 过表达 遗传转化率10.13% [91] KNAT1 毛药石斛 过表达 遗传转化率70.00% [92] DcObgC-GUS/GFP 铁皮石斛 过表达 遗传转化率56.50[93] PeMYB11 蝴蝶兰 Sogo Yukidian‘V3’ 过表达 转基因植株花色素苷积累升高[94] GUS 金钗石斛 过表达 遗传转化率34.44%~82.44% [118] MADS 小兰屿蝴蝶兰 CRISPR/Cas9 获得转基因植株[95] DoUGP 铁皮石斛 过表达 转基因植株总多糖和甘露糖含量升高，抗逆性增强[96] AntiCpACO 石斛兰 Sonia ‘睡公主’ 过表达 转基因植株花蕾脱落延迟，切花寿命增加[119] PaSTM 台湾蝴蝶兰 过表达 转基因植株 PLB再生能力增强[97] 续表 3 Continued table 3 方法
Method目标基因
Target gene受体
Receptor载体类型
Carrier type结果及文献
Result and reference基因枪法
Particle
bombardmentPRV CP 石斛兰‘K1346’、‘K1347’、
‘K1348’和‘K1349’过表达 获得抗病毒植株[104] DOH1 石斛兰 Madame Thong-In 过表达，
反义表达过表达转基因植株芽形成和发育受抑制，反义转基因植株顶端分生组织形成多芽、开花早，遗传转化率60.00%[98] DOMADS1::GUS 石斛兰 Madame Thong-In 基因表达 获得转基因植株[99] GUS 金钗石斛 过表达 愈伤组织和类原球茎转化率分别为12%和2%[120] GFP 石斛兰 Sonia 17 过表达 获得转基因植株[121] CymMV CP 蝴蝶兰 ‘TS340’ 过表达 转基因植株抗Cym MV能力增强[122] CymMV-CS CP 石斛兰 Hickam Deb 过表达 转基因植株抗Cym MV能力增强[123] CymMV CP，Pflp 蝴蝶兰 ‘TS97K’ 过表达 获得双抗转基因植株[124] GUS 石斛兰Jaquelyn Thomas 过表达 遗传转化率19.87% [125] DcOSEP1 石斛兰 Madame Thong-In和
Chao Praya Smile过表达 获得转基因植株[100] GFP 石斛兰 Sonia 17 过表达 遗传转化率1.70% [126] EgTCTP 蝴蝶兰 过表达 转基因植株类原球茎芽分化更慢[127] OgCHS 文心兰‘南茜’ 过表达 转基因植株花瓣出现红色斑点[101] DOFT 石斛兰 Chao Praya Smile 过表达，RNAi 过表达转基因植株开花提早，RNAi植株开花延迟[102] CkCHS-1，CkDFR，CkANS 寒兰 过表达 转基因植株花瓣和唇瓣中出现红色斑点[103] 子房注射法
Ovary
injectionhpt，GUS 金钗石斛 过表达 获得转基因植株[128] GUS, Kan 紫宝石蝴蝶兰 过表达 遗传转化率3.10% [129] 花粉管通道法
Pollen tube
pathwayhptII 蝴蝶兰和朵丽蝶兰 过表达 获得52个转化体[130] AtCBF1 蝴蝶兰 过表达 获得抗低温转基因植株[131] 基因编辑技术是一种有效定向育种技术。Kui等[90]以原球茎为受体，通过农杆菌介导法建立了铁皮石斛CRISPR/Cas9基因编辑技术体系，C3H、C4H、4CL、CCR和IRX基因编辑效率为10%~100%。Tong等[95]以培养30 d的原球茎为受体，对小兰屿蝴蝶兰MADS基因进行编辑，从20个外植体中共获得47个突变体，其中，46个突变体在3个位点均发生突变，总突变率为97.90%。
3. 分子标记辅助选择
高密度遗传连锁图谱构建对QTL定位、基因克隆和分子标记辅助选择等具有重要作用。在石斛兰、蝴蝶兰和兜兰Paphiopedilum等兰花上已构建出了高密度分子遗传图谱(表4)[19, 132-139]。Lu等[135]以细茎石斛D. moniliforme×铁皮石斛杂交后代为作图群体，构建了含 8573个SLAF标记、19个连锁群的石斛兰分子遗传图谱，标记间平均距离为 0.32 cM，鉴定出5个与茎多糖含量相关的QTLs。 Li等[136]以100个金钗石斛和大苞鞘石斛D. wardianum F1杂交后代为作图群体，构建出含9564 个SNP标记、19个连锁群的石斛兰分子遗传图谱，标记间平均距离为 0.41 cM，鉴定出2个与茎长和1个与茎粗相关的QTLs。Hsu等[138]通过测序基因分型(Genotyping-by-sequencing，GBS)鉴定出1191个SNPs，基于1191个SNPs和22个SSRs构建出含19个连锁群的蝴蝶兰高密度分子遗传图谱，通过基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)，鉴定出7个与1个花部颜色相关联的SNPs。Li等[139]以同色兜兰Paph. concolor和带叶兜兰Paph. hirsutissimum的95个杂种后代为作图群体，构建出具有13个连锁群、8410个SNP标记的遗传图谱，标记间平均距离为0.19 cM，筛选出与叶长、叶宽、叶厚和叶数连锁的SNP标记共12个。
表 4 兰花分子遗传图谱构建Table 4. Construction of genetic map in orchid by molecular marker作图群体(F1)
Mapping
population植株数
No. of
plants标记类型
Type of
marker图谱长度/cM
Length of
genetic map连锁群数
No. of
linkage groups标记间距离/cM
Marker
interval参考文献
Reference铁皮石斛×重唇石斛 Dendrobium
officinale×D. hercoglossum90 RAPD, SRAP ♀629.40,
♂1 304.60♀14,
♂19♀11.20,
♂11.60[132] 铁皮石斛×钩状石斛
D. officinale×D. aduncum140 SRAP, SSR 1 580.40 27 11.89 [133] 金钗石斛×细茎石斛
D. nobile×D. moniliforme90 RAPD, ISSR ♀1 474.00,
♂1 326.50♀15,
♂16♀14.75,
♂14.88[134] 细茎石斛×铁皮石斛
D. moniliforme×D. officinal111 SNP 2 737.49 19 0.32 [135] 金钗石斛×大苞鞘石斛
D. nobile×D. wardianum100 SNP 3612.12 19 0.41 [136] 蝴蝶兰‘462’×蝴蝶兰‘20’
Phalaenopsis ‘462’×P. ‘20’88 AFLP ♀878.30,
♂820.30♀14,
♂15♀5.00,
♂6.70[137] 台湾蝴蝶兰×羞花蝴蝶兰
P. aphrodite×P. modesta184 RAD 3 075.80 22 1.00 [19] 台湾蝴蝶兰×小兰屿蝴蝶兰
P. aphrodite×P. equestris117 SNP l5 192.05 27 0.13 [138] 同色兜兰×带叶兜兰 Paphiopedilum
concolor×Paph. hirsutissimum95 SNP 1 616.18 13 0.19 [139] 王健等[140]利用RAPD分子标记对16种有香和无香春兰进行分析，筛选到引物BA0088，该引物在有香春兰中扩增出一条特异性370 bp条带，带型清晰，重复性好。刘泽强[141]利用大花蕙兰和墨兰杂交后代F1群体筛选到2个与兰花香气性状紧密连锁的ISSR标记b19和b21，b19对兰花有香后代的预测准确率为84%、b21的预测准确率为88%，双标记预测准确率为98%。李晓红[142]筛选到8个与兰花纯黄绿色花连锁的SSR标记，这些标记辅助纯黄绿色花选择的准确率为52%~100%。肖文芳等[143]以黄金豹蝴蝶兰P. Frigdaas Oxford和白天使蝴蝶兰P. Join Angel及其杂交后代为材料，筛选到2个与蝴蝶兰花底色关联的SNP标记，Marker35886和Marker70907的2个SNP位点对花底色的鉴定准确率分别为66.67%和73.33%，双标记鉴定准确率达93.33%。
4. 展望
兰花种类繁多、用途广泛、市场前景广阔。随着经济发展和人们个性化需求的增加，市场对兰花新品种的需求逐渐提高，如何快速高效选育兰花新品种，满足市场需求已成为育种家急需解决的问题。分子育种能够最大限度利用种质资源，快速定向培育兰花新品种，目前已成为兰花育种方法研究的热点[2,5]。随着组学技术的发展，分子育种技术将成为影响兰花新品种选育、决定产业竞争力和高质量发展的关键核心技术。
21世纪以来，兰花分子育种技术研究取得了巨大进步，但鲜见利用分子育种方法培育出兰花新品种的报道，原因是兰花转基因、基因编辑和分子标记辅助选择等技术还处于技术研发阶段，且目前的研究主要是从技术创新而非品种创新的角度进行的。为了将分子育种技术更好地应用于品种创新，今后应加强以下几个方面的研究工作。
1)加强优良商业化品种转基因技术研究，建立稳定高效兰花转基因技术体系。转基因技术不仅是转基因和基因编辑育种的技术基础，也是挖掘兰花主要育种目标性状基因的关键技术。目前兰花转基因技术只在蝴蝶兰、石斛等少数兰花的个别材料中取得成功，而且转基因效率不高，今后应研究其他主要商业化兰花和优良品种的高效转基因技术，为选育具有商业化应用前景的兰花新品种奠定基础。
2)加强遗传图谱构建和标记辅助选择技术研究，构建以SSR、Indel等分子标记为主的高密度分子遗传图谱，建立分子标记辅助主要育种目标性状选择技术体系。虽然目前已构建出几种兰花高密度分子遗传图谱，但这些图谱主要是SNP标记图谱，育种应用价值不高，已建立分子标记辅助选择技术的只有花香和黄绿色花等少数性状，今后应加强筛选与育种早期无法选择或选择难度大、成本高和准确率低的性状紧密连锁分子标记，建立其辅助目标性状选择技术，实现育种早期高效定向选择的目的，以进一步提高育种效率和效益。
3)加强控制主要育种目标性状的主效基因挖掘。不管是转基因还是基因编辑育种，获得功能基因是前提，目前虽然鉴定出许多育种目标性状基因，但这些基因都是通过反向遗传学方法获得的，多数基因的功能未经验证，其效应和遗传规律不清楚，今后应加强采用正向遗传学方法或结合传统遗传学研究结果挖掘关键基因。
4)加强兰花基因编辑技术研究。利用CRISPR/Cas9 编辑兰花基因效率高[90,95]，显示出其在兰花育种上的巨大应用潜力。因此，大力加强兰属兰花、卡特兰、文心兰等兰花基因编辑技术研究、建立基因编辑技术体系，对进一步推动兰花育种和产业高质量发展具有重要意义。
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图 1 菌株的菌落形态(奇数为正面，偶数为反面)
1、2：SB003；3、4：SB004；5、6：SB006；7、8: SB009；；9、10：SB010；11、12：SB015；13、14: SB026；15、16：SB032；17、18：SB035；19、20：SB036；21、22：SB037；23、24：SB038；25、26：SB039；27、28：SB041；29、30：SB043；31、32：SB050；33、34：SB051；35、36：SB057；37、38：SB062；39、40：SB063；41、42：SB671；43、44：SB672；45、46：SB673；47、48：SB674；49、50：SP016；51、52：SP031；53、54：SP433；55、56：SP665；57、58：SP670
Figure 1. Colony morphology of strain(the odd number showed the front and the even number showed the back )
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图 4 基于不同序列以最大似然法构建的真菌系统发育树
▲为供试菌株
Figure 4. Phylogenetic tree of fungi constructed using the maximum likelihood method and based on different sequences
▲ indicates test strains
表 1 供试菌株信息
Table 1 Information of test strains
菌株
Strain采样地
Sampling place采样时间
Sampling timeSB003 湖北省神农架林区 Shennongjia forest area, Hubei Province 2007−07 SB004 甘肃省天水市麦草沟自然保护区
Maicaogou nature reserve, Tianshui, Gansu Province2007−08 SB006 甘肃省临夏回族自治州莲花山自然保护区
Lianhuashan nature reserve, Linxia Hui Autonomous Region, Gansu Province2007−08 SB009 四川省成都市青羊区文殊院 Wenshuyuan, Qingyang district, Chengdu, Sichuan Province 2007−10 SB010 云南省昆明市 Kunming, Yunnan Province 2007−09 SB015 河南省鹤壁市 Hebi, Henan Province 2007−10 SB026 四川省雅安市宝兴县蜂桶寨
Fengtong village, Baoxing county, Ya’an, Sichuan Province2007−07 SB032 韩国济州岛天地渊瀑布 Tiandiyuan waterfall, Jeju Island, South Korea 2008−07 SB035 云南省红河州石屏县 Shiping county, Honghe Prefecture, Yunnan Province 2009−05 SB036 内蒙古自治区呼伦贝尔市新巴尔虎左旗
Xinbalhuzuoqi, Hulunbuir, Inner Mongolia Autonomous Region2009−08 SB037 内蒙古自治区兴安盟扎赉特旗
Zhalaitqi, Xing’an League, Inner Mongolia Autonomous Region2009−08 SB038 内蒙古自治区锡林郭勒盟正镶白旗
Zhengxiangbaiqi, Xilinguole League, Inner Mongolia Autonomous Region2009−08 SB039 内蒙古自治区阿拉善盟贺兰山国家级自然保护区
Helan Mountain National Nature Reserve, Alxa League, Inner Mongolia Autonomous Region2009−08 SB041 内蒙古自治区锡林郭勒盟正镶白旗
Zhengxiangbaiqi, Xilinguole League, Inner Mongolia Autonomous Region2009−08 SB043 西藏自治区林芝市波密县古乡
Gu village, Bomi county, Linzhi, Tibet Autonomous Region2009−09 SB050 广东省广州市白云山 Baiyun Mountain, Guangzhou, Guangdong Province 2009−10 SB051 广东省河源市龙川县 Longchuan county, Heyuan, Guangdong Province 2010−05 SB057 贵州省雷山县方祥乡 Fangxiang village, Leishan county, Guizhou Province 2010−07 SB062 内蒙古自治区阿拉善盟古拉本敖包镇
Gulaben Aobao Town, Alxa League, Inner Mongolia Autonomous Region2010−08 SB063 内蒙古自治区阿拉善盟贺兰山脉中部哈拉乌
Harau, central Helan Mountain, Inner Mongolia Autonomous Region2010−08 SB671 云南省镇沅彝族哈尼族拉祜族自治县
Zhenyuan Yi Hani Lahu Autonomous county, Yunnan Province2009−10 SB672 福建省厦门市鼓浪屿 Gulangyu, Xiamen, Fujian Province 2010−09 SB673 云南省迪庆州维西县保和镇 Baohe town, Weixi county, Diqing Prefecture, Yunnan Province 2010−09 SB674 广东省广州市华南农业大学林学与风景园林学院
College of forestry and landscape architecture, South China Agricultural University, Guangzhou,
Guangdong Province2010−10 SP016 湖北省神农架林区老君山 Laojun Mountain, Shennongjia forest area, Hubei Province 2007−08 SP031 甘肃省张掖市肃南县东柳沟 Dongliugou, Sunan county, Zhangye, Gansu Province 2007−08 SP433 内蒙古自治区呼伦贝尔市牙克石市
Yakeshi, Hulunbuir, Inner Mongolia Autonomous Region2009−08 SP665 云南省楚雄彝族自治州峨绿公园西灵宫
Xiling Palace, Erlu Park, Chuxiong Yi Autonomous Prefecture, Yunnan Province2009−09 SP670 湖北省宜昌市蛤蟆泉 Toad Spring, Yichang, Hubei Province 2009−10 
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表 2 虫生真菌DNA的PCR扩增引物
Table 2 PCR amplification primers for entomogenous fungal DNA
基因序列 Gene sequence 引物 Primer 引物序列(5′→3′) Primer sequence ITS ITS4F TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5R GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Bloc B5.1F CGACCCGGCCAACTACTTTGA B3.1R GTCTTCCAGTACCACTACGCC TEF 983F GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT 2218R ATGACACCRACRGCRACRGTYTG
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表 3 虫生真菌的产孢量1)
Table 3 Spore productions of entomogenous fungi
菌株
Strain产孢量/(×107 mL−1)
Spore production菌株
Strain产孢量/(×107 mL−1)
Spore production菌株
Strain产孢量/(×107 mL−1)
Spore productionSB003 3.25±0.59f SB037 9.86±0.69abcdef SB671 4.64±0.71ef SB004 14.27±2.63abc SB038 14.78±2.06ab SB672 8.35±1.72abcdef SB006 13.65±1.59abcd SB039 16.38±2.83a SB673 5.15±1.10def SB009 9.42±1.19abcdef SB041 3.48±0.47f SB674 6.61±1.75bcdef SB010 6.72±1.92bcdef SB043 11.16±1.48abcdef SP016 4.04±0.49ef SB015 8.29±0.74abcdef SB050 12.64±3.07abcde SP031 9.32±1.73abcdef SB026 9.19±1.73abcdef SB051 6.54±0.47bcdef SP433 12.54±2.36abcde SB032 16.56±1.59a SB057 9.30±0.37abcdef SP665 5.57±0.89cdef SB035 3.84±0.56ef SB062 6.02±1.76bcdef SP670 7.26±0.49bcdef SB036 11.23±2.66abcdef SB063 7.88±1.59abcdef 1)数据后不同小写字母者表示不同菌株间菌落产孢量差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Different lowercase letters indicate significant differences in spore production among different strains (P<0.05, Duncan’s test)
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表 4 供试菌株ITS区、TEF区和Bloc区的序列比对结果
Table 4 Results of comparing the ITS regions, TEF regions and Bloc regions of test strains
真菌
Fungus菌株登录号 Accession number of strain ITS区
ITS regionTEF区
TEF regionBloc区
Bloc region球孢白僵菌 Beauveria bassiana KX901309 JQ867178 JQ867116 球孢白僵菌 B. bassiana AY531976 JQ867172 JQ867106 球孢白僵菌 B. bassiana KX901310 JQ867171 JQ867109 球孢白僵菌 B. bassiana GU233705 JQ867157 JQ867118 球孢白僵菌 B. bassiana GU233701 JQ867151 JQ867125 球孢白僵菌 B. bassiana AY883691 AY883788 球孢白僵菌 B. bassiana KU725693 KU725706 假球孢白僵菌 Beauveria pseudobassiana MH259852 HQ880999 HQ880727 假球孢白僵菌 B. pseudobassiana LC163567 LC163595 环链棒束孢 Isaria cateniannulata GU734760 GU734758
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表 5 不同浓度的孢子悬浮液处理烟粉虱2龄若虫7 d的死亡率1）
Table 5 Mortality of the 2nd instar nymphs of Bemisia tabaci infected with spore suspensions of different concentrations for 7 days
% 菌株 Strain 1×107 mL−1 1×108 mL−1 菌株 Strain 1×107 mL−1 1×108 mL−1 CK 9.43±0.58d 11.73±2.00d SB043 47.67±4.00abc 80.33±3.93ab SB003 56.43±3.45abc 60.06±2.68bc SB050 49.47±1.47abc 81.30±4.86ab SB004 55.23±5.85abc 75.23±5.49abc SB051 59.67±4.17abc 70.87±5.90abc SB006 51.03±0.54abc 72.33±6.90abc SB057 51.67±3.55abc 76.00±2.34abc SB009 67.93±1.68ab 82.93±2.88ab SB062 35.81±3.54c 63.34±3.93abc SB010 47.90±4.42abc 70.20±4.94abc SB063 68.03±5.46ab 71.40±2.03abc SB015 64.30±7.27ab 77.07±4.95abc SB671 59.80±1.12abc 59.50±9.22bc SB026 51.77±4.15abc 67.80±3.0abc SB672 44.67±6.17bc 62.43±7.28bc SB032 56.57±2.95abc 77.69±3.88ab SB673 53.23±5.62abc 70.53±2.57abc SB035 53.07±2.37abc 59.99±2.77bc SB674 67.20±7.04ab 77.20±2.70abc SB036 55.33±6.36abc 80.67±4.41ab SP016 54.47±8.25abc 72.07±4.82abc SB037 50.17±7.69abc 74.00±3.21abc SP031 49.43±2.13abc 52.85±1.00c SB038 48.03±6.08abc 70.87±5.90abc SP433 69.03±3.76ab 87.37±0.43a SB039 72.77±2.14a 73.13±5.20abc SP665 49.70±4.65abc 64.90±3.26abc SB041 50.33±4.36abc 70.33±5.42abc SP670 65.77±0.50ab 72.40±1.56abc 1)相同浓度数据后不同小写字母者表示不同菌株间致病力差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)Different lowercase letters after data at the same concentration indicate significant differences in pathogenicity among different strains (P<0.05, Duncan’s test)
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1. 张玲玲，房林，李琳，吴坤林，曾晶珏，张佳瑞，康明，曾宋君. 兜兰育种技术研究进展. 广西科学. 2023(06): 1052-1059 . 
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