Preparation and in vitro release characteristics of florfenicol sustained-release granules
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摘要:目的
延长药物有效血药浓度的维持时间，产生持续稳定的抑菌作用，避免多剂量连续使用氟苯尼考产生胚胎毒性和免疫抑制。
方法以硬化油、聚乙二醇、甘油酯为辅料，采用离心喷雾干燥制粒技术法制备氟苯尼考缓释颗粒，高效液相色谱法(HPLC)测定氟苯尼考含量。以药物在不同释放介质(pH 1.2盐酸缓冲液、pH 4.3醋酸缓冲液和pH 6.8磷酸缓冲液)中的释放特性为指标，对氟苯尼考粉和自制的氟苯尼考缓释颗粒进行溶出试验，考察体外释放特性。
结果4个批次制备的氟苯尼考缓释颗粒中氟苯尼考实际含量在标示含量中的占比分别为99.19%、100.01%、97.45%和100.72%，相对标准偏差（RSD）分别为0.82%、0.86%、0.77%和0.24%。氟苯尼考粉在0.25 h内完全释放，自制的氟苯尼考缓释颗粒在模拟胃液环境(pH 1.2盐酸缓冲液)基本不释放，在模拟肠液环境(pH 4.3醋酸缓冲液和pH 6.8磷酸缓冲液)缓慢释放，5 h内释放量达95%以上。
结论自制的氟苯尼考缓释颗粒中药物分布较均匀，符合中国兽药典要求。相比于氟苯尼考粉，氟苯尼考缓释颗粒表现出良好的耐酸性体外缓释性，可为后续的临床试验研究和临床使用药物提供参考依据。
Abstract:ObjectiveTo prolong the maintenance time of the effective blood concentration of the drug, generate a sustainable and stable bacteriostatic action, and avoid embryotoxicity and immunosuppression in multi-dose continuous use of florfenicol.
MethodThe test used hardened oil, polyethylene glycol and glyceride as auxiliary materials. The florfenicol sustained-release granules were prepared by centrifugal spray drying granulation method, and the content of florfenicol was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Using release characteristics of the drug in different media (pH 1.2 hydrochloric acid buffer, pH 4.3 acetate buffer and pH 6.8 phosphate buffer) as indicators, the dissolution tests of florfenicol powder and self-made florfenicol sustained-release granules were carried out to investigate their in vitro release performances.
ResultThe percentages of florfenicol actual contents in indicated contents of florfenicol sustained-release granules prepared in four batches were 99.19%, 100.01%, 97.45% and 100.72%, and the relative standard deviations (RSD) were 0.82%, 0.86%, 0.77% and 0.24% respectively. The florfenicol powder was completely released within 0.25 h. The self-made florfenicol sustained-release granules were substantially not released in simulated gastric fluid environment (pH 1.2 hydrochloric acid buffer), and released slowly under simulated intestinal fluid environment (pH 4.3 acetate buffer and pH 6.8 phosphate buffer) with the release amount of over 95% within 5 h.
ConclusionThe drug in self-made florfenicol sustained-release granules is homogeneous distributed, and the granules conform to China veterinary pharmacopoeia. Compared with florfenicol powder, florfenicol sustained-release granules show good acid resistance and in vitro sustained-release performance, which provides a reference for subsequent clinical trial research and clinical use of drugs.
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金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus是一种革兰阳性球菌，可引起肺和皮肤组织感染，甚至危及生命。作为一种机会致病菌，金葡菌已成为外科手术感染及医疗器械污染中最常见的病原体[1-3]。近年来，随着抗生素的大量使用，金葡菌耐药性逐渐增强，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的出现引起了全球的广泛关注。有研究表明，金葡菌可通过噬菌体、质粒、转座子及葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)等方式进行耐药基因的水平转移[4-6]。mecA作为MRSA菌株携带的耐药基因，已有研究表明mecA主要通过SCCmec元件进行水平转移[7-8]。
SCCmec是一种具有高度多样性的移动遗传因子。1999年首次测定了1982年分离的日本金葡菌N315菌株的mec整体结构及DNA序列。1年后，mecDNA被发现是由2个位点特异性重组酶基因ccrA和ccrB驱动的新基因元件，命名为SCCmec[9]。SCCmec (SCC家族的主要成员)是一种携带mec基因(mecA、mecB和mecC)以及控制其表达的基因mecR1(编码信号转导蛋白mecR1)和mecI(编码抑制蛋白mecI)的移动遗传元件，并作为葡萄球菌菌株间基因信息交换的载体。SCCmec位于葡萄球菌染色体复制起点附近，插入在插入位点attB (orfX的3'端)。SCCmec有3个基本的遗传因素：ccr基因复合体(由ccrAB或ccrC及其周围的ORFs组成)、mec基因复合体(由mec基因、插入序列和周围的ORFs组成)和连接区(J区)。在ccr基因复合体中，通过ccrAB或ccrC位点特异性重组，可以将多个耐药和耐重金属基因插入SCCmec中，SCCmec可通过ccrAB或ccrC的精确切除和整合，整合到葡萄球菌菌株的染色体上；因此，不同的葡萄球菌菌株交换遗传信息，以适应不同的环境和抗生素选择的压力[10]。SCCmec编码一种新的特异性青霉素结合蛋白(PBP2a)，与金葡菌内源性青霉素结合蛋白相比，PBP2a与β–内酰胺的结合亲和力降低，导致抗生素失活。与其他对β–内酰胺类抗生素的抑制机制不同，MRSA还能够通过PBP2a持续合成独特的细胞壁成分。由于获得了SCCmec元件，甲氧西林敏感金葡菌(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)进化为MRSA[11]。根据各类型SCCmec在J区域的差异，将SCCmec分为不同的型和亚型。III型SCCmec在巴西、波兰、伊朗、土耳其、马来西亚、泰国、中国和中国台湾等国家或地区为主要检出类型[12]。本研究通过对实验室60株二代测序金葡菌基因组序列SCCmec元件进行比对分析，发现CRISPR阳性(CRISPR+)和CRISPR阴性(CRISPR−)不同菌株中都携带SCCmec元件，SCCmec元件的主要类型为III型，另外有1株为VIII型，1株为XII型，与报道结果一致。
成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是存在于原核生物中的一种适应性免疫系统。有研究表明，约50%的细菌携带CRISPR/Cas系统[13]。它能够靶向切割核酸序列，从而抵御噬菌体、质粒等外源基因的入侵，保持细菌自身遗传结构的稳定[14]。CRISPR/Cas系统能否限制细菌耐药基因和毒力基因的水平转移，目前还没有明确的结论。Marraffini等[15]发现表皮葡萄球菌RP62a菌株的CRISPR/Cas系统可以阻止质粒的结合转移。张蒙蒙等[16]发现葡萄球菌中CRISPR/Cas系统可以限制mecA等耐药基因的转移。目前，金葡菌中CRISPR/Cas系统对细菌耐药基因和毒力基因的影响还不清楚。本研究以NCBI数据库575株金葡菌的基因组序列为研究对象，探讨CRISPR结构对其耐药基因和毒力基因的影响，并通过对实验室分离菌株二代测序基因组序列进行分析，做进一步验证。
1. 材料与方法
1.1 材料
575株金葡菌基因组序列下载自NCBI数据库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/154)，60株金葡菌基因组为本研究前期临床分离菌株的二代测序数据。
1.2 方法
1.2.1 CRISPR位点的识别与提取
通过CRISPRs finder ( https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)在线进行，统计具有CRISPR位点的金葡菌，将金葡菌基因组分为CRISPR+和CRISPR− 2大类。
1.2.2 金葡菌多位点序列分型及系统发育树的构建
对575株金葡菌通过Center for Genomic Epidemiology在线网站( http://www.genomicepidemiology.org/)进行多位点序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)，构建系统发育树。对CRISPR+和CRISPR−菌株ST型别进行韦恩图的绘制，分析二者的相关性。
1.2.3 耐药基因、毒力基因的统计
通过Center for Genomic Epidemiology网站下载整理耐药基因和毒力基因数据库，预测金葡菌基因组的ORF，利用blastn软件进行耐药基因和毒力基因的比对(序列一致率>80%，覆盖率>70%)。
1.2.4 原噬菌体和接合质粒的比对分析
实验室60株金葡菌基因组通过PHASTER在线网站( http://phaster.ca/)比对原噬菌体的携带情况，统计结果为完整噬菌体序列。通过Center for Genomic Epidemiology在线网站比对接合质粒存在情况(序列一致率>95%)。
1.2.5 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，CRISPR+和CRISPR−与耐药基因和毒力基因之间的关系采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 金葡菌基因组中CRISPR结构分布概况
公共数据库575株金葡菌中有62株(11%)含有确证的CRISPR位点(CRISPR+)，513株(89%)无或仅含有可疑的CRISPR结构(CRISPR−)。实验室60株金葡菌中有14株(23%)含有确证的CRISPR位点(CRISPR+)，46株(77%)无或仅含有可疑的CRISPR结构(CRISPR−)。
2.2 金葡菌MLST型别及相关性分析
对575株金葡菌基因组进行MLST分型，536株可以进行ST分型，共得到81个ST型别。对基因组进行系统发育树的构建，如图1A所示。我们将ST型别数量≥10的菌株标注不同的颜色，其他型别菌株以白色显示，同时将新ST型菌株以黑色标注。系统发育树显示，ST8型别的菌株所占的比例最高，为19%(111/575)；其次是ST5，占比达到13%(77/575)。在CRISPR+菌株中，最具有代表性的型别是ST398；CRISPR−菌株中，最具有代表性的型别是ST8。通过绘制韦恩图来分析CRISPR+与CRISPR−菌株的关系，如图1B所示，CRISPR+与CRISPR−之间有11个共同的ST型，菌株之间具有相关性。
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图 1 公共数据库基因组CRISPR+和CRISPR−金葡菌MLST型别系统发育树(A)和ST型别交叉情况(B)Figure 1. Phylogenetic tree (A) and ST type crossover (B) of CRISPR+ and CRISPR−Staphylococcus aureus MLST types in public database genome2.3 金葡菌耐药基因的分析
2.3.1 金葡菌耐药基因分布
公共数据库基因组中，62株CRISPR+金葡菌中阳性率最高的耐药基因是tet(38)，占比高达90%(56/62)；其次是blaZ，占比60%(37/62)。与CRISPR+菌株相比，513株CRISPR−菌株中ant(4')-Ib、aph(3')-Ⅲa、aad(6)和msr(A)的阳性率高(P<0.05)。CRISPR−菌株耐药基因的种类多于CRISPR+菌株(表1)。
表 1 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1)Table 1. Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome耐药基因 Drug resistance gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion ant(4')-Ⅰb 2 3 72 14 0.014 ant(9)-Ⅰa 9 15 126 25 0.078 aac(6')-le-aph(2")-Ⅰa 5 8 82 16 0.100 aph(3')-Ⅲa — — 102 20 0.000 aad(6) 1 2 58 11 0.013 ant(6)-Ⅰa 2 3 3 1 0.164 mecA 33 53 285 56 0.727 mecR1 4 6 99 19 0.013 mecⅠ 2 3 74 14 0.009 blaZ 37 60 292 57 0.679 mecC 3 5 4 1 0.032 cfr(A) — — 2 0 1.000 erm(A) 10 16 135 26 0.081 erm(B) 1 2 12 2 1.000 erm(C) 4 6 29 6 0.772 erm(T) 1 2 — — 0.206 Isa(E) 2 3 4 1 0.259 Isa(B) — — 1 0 1.000 msr(A) — — 60 12 0.009 msr(F) — — 1 0 1.000 optr(A) — — 1 0 1.000 vga(A)LC 3 5 3 1 0.014 vga(E) 3 5 4 1 0.032 vga(A)v 1 2 — — 0.206 tet(38) 56 90 491 96 0.063 tet(K) 16 26 50 10 0.000 tet(L) 3 5 6 1 0.063 tet(M) 19 31 71 14 0.001 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 实验室菌株基因组中，14株CRISPR+金葡菌中阳性率最高的耐药基因是blaZ，占比57%(8/14)。与CRISPR+菌株相比，46株CRISPR−菌株中ant(6)-Ia、cfr、mecA的阳性率高(P<0.05)。CRISPR+菌株的耐药基因种类少于CRISPR−菌株(表2)。
表 2 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1)Table 2. Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome耐药基因 Drug resistance gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion lnu(A) 2 14 5 11 0.660 lnu(B) — — 9 20 0.100 lsa(E) — — 9 20 0.100 erm(A) 1 7 1 2 0.955 erm(B) 4 29 20 43 0.368 erm(C) 6 43 28 61 0.234 erm(T) 1 7 4 9 1.000 fexA 2 14 35 76 0.000 fexB 1 7 1 2 0.955 aac(6')-aph(2'') — — 16 35 0.013 aph(2'')-Ia 4 29 18 39 0.542 aadD 2 14 32 70 0.000 ant(6)-Ia 3 21 25 54 0.004 ant(9)-Ia 1 7 1 2 0.955 tet(K) 3 21 14 30 0.737 tet(L) 3 21 25 54 0.004 tet(M) 1 7 7 15 0.667 tet(S) 2 14 14 30 0.314 tet(T) — — 1 2 1.000 blaZ 8 57 17 37 0.180 str — — 3 7 0.779 cfr 2 14 23 50 0.028 mecA1 2 14 17 37 0.189 sal(A) 2 14 17 37 0.189 optrA 2 14 17 37 0.189 mecA 3 21 25 54 0.004 msr(A) — — 1 2 1.000 dfrG 1 7 15 33 0.086 qacG 2 14 — — 0.079 fosD 1 7 13 28 0.154 fosB5 — — 2 4 1.000 fosB4 1 7 0 0 0.525 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 2.3.2 金葡菌耐药基因数目
在菌株携带耐药基因的数量方面，CRISPR+菌株携带的耐药基因数量更少。公共数据库基因组CRISPR+菌株中，有58%(36/62) 的菌株携带耐药基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(77%，395/513)；实验室菌株基因组CRISPR+菌株中，有29%(4/14) 的菌株携带耐药基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(74%，34/46)(表3)。
表 3 公共数据库与实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因数目比较Table 3. Comparison of the number of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database and the laboratory genomes基因组 Genome 耐药基因数目 Number of drug resistance gene 占比/% Proportion CRISPR+ CRISPR− 公共数据库 Public database ≥5 95 100 ≥10 58 77 ≥15 11 38 ≥20 0 6 实验室 Laboratory ≥5 36 76 ≥10 29 74 ≥15 7 50 ≥20 0 17 同时，我们分别对2组数据中CRISPR+和CRISPR−菌株携带耐药基因数目进行箱线图绘制。公共数据库基因组中，CRISPR+菌株整体携带耐药基因数量的平均值低于CRISPR−菌株，差异极显著(P<0.01)(图2A)。实验室基因组中，CRISPR+菌株整体携带耐药基因数量的平均值低于CRISPR−菌株，差异显著(P<0.05)(图2B)。
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图 2 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+与CRISPR−菌株整体携带耐药基因数目平均值比较“*”和“**”分别表示在P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验)Figure 2. Comparison of the average number of drug resistance genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database (A) and the laboratory(B) genomes“*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test)2.4 金葡菌毒力基因的分析
2.4.1 金葡菌毒力基因分布
由表4可知，公共数据库基因组中，CRISPR+金葡菌阳性率最高的毒力基因是hlgB、hlgC，占比高达100%(62/62)；其次是aur，占比98%(61/62)。与CRISPR+菌株相比，CRISPR−菌株中splA、splB的阳性率高(P<0.05)。CRISPR−菌株毒力基因的种类多于CRISPR+菌株。
表 4 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较1)Table 4. Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome毒力基因 Virulence gene CRISPR+ CRISPR− P 数量 Quantity 占比/% Proportion 数量 Quantity 占比/% Proportion aur 61 98 503 98 0.855 splA 18 29 368 72 0.000 splB 21 34 381 74 0.000 splE 19 31 66 13 0.000 sak 4 6 — — 0.000 scn 4 6 — — 0.000 sea 4 6 103 20 0.009 seb 1 2 44 9 0.074 sec 10 16 58 11 0.267 sed — — 28 5 0.061 seg 15 24 221 43 0.004 seh — — 23 4 0.159 sei 15 24 227 44 0.003 sej — — 39 8 0.015 sek 4 6 137 27 0.000 sel 10 16 54 11 0.185 sem 15 24 229 45 0.002 sen 14 23 225 44 0.001 seo 15 24 229 45 0.002 sep 2 3 62 12 0.033 seq 5 8 131 26 0.002 ser — — 38 7 0.025 seu 15 24 115 22 0.752 tst 4 6 67 13 0.135 hlgA 60 97 507 99 0.192 hlgB 62 100 512 100 0.728 hlgC 62 100 512 100 0.728 lukD 24 39 386 75 0.000 lukE 25 40 378 74 0.000 lukF 7 11 124 24 0.022 lukS — — 28 5 0.061 lukF-PV 7 11 124 24 0.022 lukS-PV — — 28 5 0.061 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 实验室菌株基因组中，CRISPR+金葡菌阳性率最高的毒力基因是aur、hlgA、hlgB和hlgC，占比71%(10/14)。与CRISPR+菌株相比，CRISPR−菌株中sei、sem、sen、seo和seu的阳性率高。CRISPR+菌株的毒力基因种类少于CRISPR−菌株(表5)。
表 5 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较Table 5. Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome毒力基因 Virulence gene CRISPR+1) CRISPR− P 数量 Quantity 占比% Proportion 数量 Quantity 占比% Proportion aur 10 71 22 48 0.121 splA 1 7 12 26 0.264 splB 2 14 10 22 0.713 splE 2 14 9 20 1.000 sak 6 43 9 20 0.078 scn 7 50 14 30 0.179 hlgA 10 71 22 48 0.121 hlgB 10 71 22 48 0.121 hlgC 10 71 22 48 0.121 lukD 1 7 12 26 0.264 lukE 1 7 12 26 0.264 sea — — 1 2 1.000 seg — — 9 20 0.100 seh — — 2 4 1.000 sei — — 10 22 0.098 sem — — 10 22 0.098 sen — — 10 22 0.098 seo — — 10 22 0.098 seu — — 10 22 0.098 edinA — — 1 2 1.000 1) “—”表示未检测到 1) “—” is not detected 2.4.2 金葡菌毒力基因数目
在菌株携带毒力基因的数量方面，CRISPR+菌株携带的毒力基因更少。公共数据库基因组CRISPR+菌株中，有35%(22/62) 的菌株携带毒力基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(73%，374/513)；实验室菌株基因组CRISPR+菌株中，有7%(1/14)的菌株携带毒力基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(41%，19/46)(表6)。
表 6 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因数目比较Table 6. Comparison of the number of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome基因组 Genome 毒力基因数目 Number of virulence gene 占比/% Proportion CRISPR+ CRISPR− 公共数据库 Public database ≥5 68 96 ≥10 35 73 ≥15 6 15 ≥20 3 0 实验室 Laboratory ≥5 50 48 ≥10 7 41 ≥15 0 13 ≥20 0 7 同时，我们分别对2组数据中CRISPR+和CRISPR−菌株携带毒力基因数目进行箱线图绘制。公共数据库基因组中，CRISPR+菌株整体携带毒力基因数目的平均值低于CRISPR−菌株，差异极显著(P<0.01)(图3A)。实验室基因组中，CRISPR+菌株整体携带毒力基因数目的平均值低于CRISPR−菌株，差异显著(P<0.05)(图3B)。
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图 3 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+和CRISPR−菌株整体携带毒力基因数目平均值比较“*”和“**”分别表示在 P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验)Figure 3. Comparison of the average number of virulence genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome (A) and the laboratory genome (B)“*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test)2.5 原噬菌体和接合质粒的比对分析
实验室60株金葡菌基因组原噬菌体比对结果显示，CRISPR+金葡菌中原噬菌体的携带率为29%(4/14)，CRISPR−金葡菌中原噬菌体的携带率为67%(31/46)。CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05)。接合质粒的分析结果显示，CRISPR+金葡菌中接合质粒的携带率为86%(12/14)，CRISPR−金葡菌中接合质粒的携带率为80%(37/46)。CRISPR−和CRISPR+菌株基本一致，无显著差异(P>0.05)。
3. 讨论与结论
3.1 讨论
CRISPR/Cas系统作为原核生物的一种适应性免疫系统，能抵御外来基因元件如噬菌体、质粒的入侵，保持细菌自身遗传结构的稳定。日本学者于1987年首次在大肠埃希菌中发现该结构[17]，Barrangou等[13]首次用试验证明CRISPR/Cas系统具有抵御外来噬菌体干扰的功能。本研究结果显示，CRISPR+金葡菌菌株大多含有较少的耐药基因和毒力基因，CRISPR结构能够限制耐药基因、毒力基因的水平转移，使细菌的遗传结构保持稳定[18]。
但是，从进化的角度看，基因的水平转移可以使细菌获取新的遗传物质，有利于细菌在复杂的环境中生存[19-20]。本研究在对毒力基因进行分析的过程中发现，极少数CRISPR+金葡菌携带的毒力基因数目高于CRISPR−菌株，这与Palmer等[21]的研究一致，说明在外源基因获取压力下，CRISPR/Cas系统往往处于失活状态。
细菌耐药性的产生主要依赖于耐药基因的水平转移，CRISPR/Cas系统是否能够限制耐药、毒力基因的水平转移，不同研究有不同的报道。有研究表明，一些种类的细菌几乎不携带CRISPR/Cas系统[22]；同时，也有相关研究表明，宿主菌可以通过丢失CRISPR结构来获得高度有益的外源DNA[23]。Touchon等[24]分析了263株大肠埃希菌的CRISPR/Cas系统，对CRISPR结构与耐药性的关系进行了分析，结果表明，CRISPR结构的存在并不能阻止耐药基因和质粒的水平转移。洪丽娟等[25]发现志贺菌中CRISPR结构对菌株耐药基因和耐药表型均无影响。然而，张蒙蒙等[16]发现葡萄球菌基因组中CRISPR/Cas系统携带率低，且基因座、Cas基因的结构和功能均不完善，仅较少的菌株中含有完整的CRISPR/Cas系统，完整的葡萄球菌CRISPR/Cas系统可能限制mecA基因的水平转移。Palmer等[21]发现CRISPR/Cas系统的存在限制了粪肠球菌中来自可移动元件的耐药基因间的水平传播。Marraffini等[15]通过试验证明葡萄球菌RP62a的CRISPR/Cas系统能够抵御噬菌体的入侵。同时，Watson等[26]研究表明CRISPR/Cas系统可以通过转导增强基因的水平转移。对于CRISPR结构与毒力基因的关系，Wiedenheft等[27]研究表明铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统的存在与小鼠中某些毒力基因的表达密切相关。
3.2 结论
本研究通过对公共数据库金葡菌基因组中CRISPR/Cas系统、耐药基因和毒力基因进行比对分析，并利用实验室金葡菌基因组进行验证，发现金葡菌中CRISPR结构的存在可能影响金葡菌耐药、毒力基因的水平转移。CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，表明CRISPR−菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究结果对进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播有参考意义。
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图 1 50 μg/mL氟苯尼考溶液在不同释放介质溶液中的高效液相色谱图
Figure 1. High performance liquid chromatograms of 50 μg/ mL florfenicol solution in different release medium solutions
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图 2 氟苯尼考缓释颗粒和氟苯尼考粉在不同释放介质溶液中的累计释放量曲线
Figure 2. Cumulative release curves of florfenicol sustained-release granules and florfenicol powder in different release medium solutions
表 1 添加制备氟苯尼考缓释颗粒空白辅料的药物回收率
Table 1 Recovery rates of blank excipients for preparation of florfenicol sustained-release granules
n=3 ρ/(μg/mL)
释放介质
Release medium回收率/% Recovery rate RSD 1 2 3 ${\bar{\textit{X} } } \pm {\rm{SD} }$ 40 pH 1.2 盐酸缓冲液
pH 1.2 Hydrochloric acid buffer98.33 98.50 98.63 98.49±0.12 0.13 pH 4.3 醋酸缓冲液
pH 4.3 Acetate buffer98.47 100.07 100.47 99.67±0.86 0.86 pH 6.8 磷酸缓冲液
pH 6.8 Phosphate buffer100.00 100.91 99.28 100.06±0.67 0.67 50 pH 1.2 盐酸缓冲液
pH 1.2 Hydrochloric acid buffer100.74 99.46 100.98 100.39±0.67 0.67 pH 4.3 醋酸缓冲液
pH 4.3 Acetate buffer100.33 101.13 100.28 100.58±0.39 0.39 pH 6.8 磷酸缓冲液
pH 6.8 Phosphate buffer99.35 100.03 100.22 99.87±0.37 0.37 60 pH 1.2 盐酸缓冲液
pH 1.2 Hydrochloric acid buffer98.93 98.29 98.70 98.64±0.26 0.27 pH 4.3 醋酸缓冲液
pH 4.3 Acetate buffer100.84 100.13 100.93 100.63±0.36 0.35 pH 6.8 磷酸缓冲液
pH 6.8 Phosphate buffer98.82 100.40 101.03 100.08±0.93 0.93 
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表 2 添加制备氟苯尼考缓释颗粒空白辅料的药物精密度
Table 2 Accuracy of blank excipients for preparation of florfenicol sustained-release granules
n=6 释放介质
Release medium氟苯尼考含量/% Florfenicol content RSD/% 1 2 3 4 5 6 ${\bar{\textit{X} } } \pm {\rm{SD} }$ pH 1.2 盐酸缓冲液
pH 1.2 Hydrochloric acid buffer100.60 101.02 100.95 99.32 98.87 99.51 100.05±0.84 0.84 pH 4.3 醋酸缓冲液
pH 4.3 Acetate buffer99.52 100.20 100.53 99.82 100.05 100.73 100.14±0.41 0.41 pH 6.8 磷酸缓冲液
pH 6.8 Phosphate buffer100.94 101.02 100.30 99.49 101.18 101.14 100.68±0.61 0.60
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表 3 氟苯尼考在不同释放介质溶液中的稳定性试验结果
Table 3 Results of the stability test of florfenicol in different release medium solutions
释放介质
Release medium不同采样时间在标示含量中的占比/% Percentage in indicated content at different sampling time RSD/% 0 h 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h 8 h ${\bar{\textit{} X} } \pm {\rm{SD} }$ pH 1.2 盐酸缓冲液
pH 1.2 Hydrochloric acid buffer97.33 100.12 99.00 95.05 100.56 99.51 99.40 97.91 100.84 98.86±0.02 1.86 pH 4.3 醋酸缓冲液
pH 4.3 Acetate buffer99.10 101.85 100.60 101.09 101.25 100.40 97.93 98.85 102.19 100.36±0.01 1.44 pH 6.8 磷酸缓冲液
pH 6.8 Phosphate buffer97.43 101.33 100.03 100.78 102.61 101.36 102.70 98.57 102.21 100.78±0.02 1.80
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表 4 氟苯尼考缓释颗粒中药物含量的测定结果
Table 4 Determination of drug content in fluorfenicol sustained-release granules
% 批次
Batch实际含量( ${\bar{\textit{} X} } \pm {\rm{SD} }$)
Actual contentRSD 批次
Batch在标示含量中的占比( ${\bar{\textit{} X} } \pm {\rm{SD} }$)
Percentage in indicated contentRSD 1 9.89±0.09 0.93 1 99.19±0.008 0.82 2 9.95±0.08 0.85 2 100.01±0.009 0.86 3 9.72±0.08 0.87 3 97.45±0.008 0.77 4 10.02±0.04 0.42 4 100.72±0.002 0.24
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表 5 氟苯尼考缓释颗粒体外累积释放方程拟合
Table 5 Fitting of cumulative release equations of florfenicol sustained-release granules
释放介质 Releasse medium 方程模型 Equation model 回归方程1) Regression equation R2 pH 1.2 盐酸缓冲液
pH 1.2 Hydrochloric acid bufferZero-order M=0.006 79t+0.014 91 0.649 49 First-order ln(1−M)=−0.007 14t−0.014 62 0.655 46 Higuchi M=0.025 12t1/2−0.004 13 0.804 98 pH 4.3 醋酸缓冲液
pH 4.3 Acetate bufferZero-order M=0.090 19t+0.442 3 0.690 03 First-order ln(1−M)=−0.771 85t−0.046 22 0.998 96 Higuchi M=0.333 68t1/2+0.189 37 0.854 28 pH 6.8 磷酸缓冲液
pH 6.8 Phosphate bufferZero-order M=0.091 21t+0.431 13 0.690 13 First-order ln(1−M)=−0.763 80t−0.030 72 0.999 32 Higuchi M=0.337 40t1/2+0.175 45 0.854 01 1) M表示累计释放百分率，t表示取样时间
1) M indicates cumulative release ratio, t indicates sampling time
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1. 李轩宇，郑天尧，王越. 基于深度学习的视频信号降噪技术研究. 电视技术. 2025(01): 220-222 . 
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