Genetic variation analysis on oleoresin yield and growth traits of Pinus elliottii open-pollinated families
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摘要:目的
生长性状、木材性状和产脂性状是广东湿地松新一轮遗传改良的目标性状。分析湿地松树高、胸径、材积、松脂质量等的表型统计量、遗传力与性状相关性，为制定多性状遗传改良策略提供理论依据。
方法以广东省台山市18年生的32个湿地松自由授粉家系为材料，收集24 h内胸高处的松脂样品，称质量并调查生长量。利用Asreml统计软件估算性状的遗传力和性状间的相关系数。
结果松脂质量(m)呈正偏态分布，其变异系数高于生长性状的变异系数，达到75.04%。转换后的松脂质量(mt)单株狭义遗传力与家系平均遗传力分别为0.216 1和0.600 5。生长性状单株狭义遗传力为0.252 7~0.415 1，家系平均遗传力为0.648 3~0.751 2。树高、胸径和单株材积之间呈极显著遗传正相关(相关系数为0.813~0.983, P＜0.001)，三者与木材密度呈显著的正相关(P＜0.05)，但标准误较大；上述性状与松脂质量的遗传相关均不显著。
结论在广东选择脂、材性状优良的个体，应采用家系选择与家系内单株选择的合并选择方法；在广东现有的湿地松遗传材料中，对生长量、木材密度和松脂质量做同步改良是可行的。
Abstract:ObjectiveGrowth property, wood property and oleoresin trait are target traits in the new round of slash pine (Pinus elliottii ) genetic improvement. The goal was to analyze phenotypic performance, heritabilities and trait correlations of tree height, diameter at breast height (DBH), individual volume and resin mass, and provide a theoretical basis for developing breeding strategies for multiple traits.
MethodThirty-two open-pollinated families of 18-year-old P.elliottii in Taishan City of Guangdong Province were tested. Resin samples at breast height were collected for 24 hours, the mass was determined and the amount of growth was measured. The trait heritabilities and correlations between traits were estimated using Asreml.
ResultThe resin mass (m) presented positively skewed distribution, and its coefficient of variation was higher than those of the growth traits, reaching 75.04%. The individual narrow-sense heritability and family average heritability for transformed resin mass (mt) were 0.216 1 and 0.600 5. The narrow-sense heritabilities for growth traits ranged from 0.252 7 to 0.415 1, and the family average heritabilities ranged from 0.648 3 to 0.751 2. The genetic correlations among tree height, DBH and individual tree volume were strong with the correlation coefficients from 0.813 to 0.983(P＜0.001), and their genetic correlations with wood density were medium and significantly positive(P＜0.05), while the standard errors were large. No significant correlation was found between resin mass and the above traits.
ConclusionTo select individual performing well in oleoresin and wood properties, it is reliable to combine family selection and within-family selection. It’s possible to simultaneously improve growth, wood density and resin mass using current genetic materials of P. elliottii.
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Keywords:
- Pinus elliottii /
- open-pollinated family /
- resin mass /
- genetic correlation
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是单股正链RNA病毒，有囊膜，直径在50~70 nm，全基因组1.5 kb左右[1-3]。PRRSV是猪繁殖与呼吸道综合征(PRRS)的主要病原，PRRS是一种在世界范围内广泛存在的烈性传染病，对全球养猪业造成了重大危害。1987年首次在美国被发现，之后在加拿大及其他北美地区出现。2006年夏季由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)引起的“无名高热”综合征，相较2006年之前的毒株可引起仔猪的高发病率与高死亡率，给我国养猪业带来了沉重的经济损失[4-6]。 感染猪通常会产生免疫抑制，从而继发感染其他细菌和病毒。临床表现主要有两方面：一是母猪严重的繁殖障碍，包括流产死胎、木乃伊胎及弱仔；二是各年龄段猪感染后均出现呼吸系统症状，常伴随非特异性的间质性肺炎[7]。
福建地处沿海，生猪产业发展迅速。在全国生猪优势区域布局规划中，福建确定为我国生猪产业的优势区域布局和发展重点区域，在生猪产业中具有生产基础、市场竞争、产品加工等优势，与此同时福建也是我国的生猪主销区之一，养猪业的健康发展对福建省的经济发展起着重要的作用[8]。PRRSV新现毒株与国内经典毒株的重组导致出现新的高致病性PRRSV，这让我国PRRS的防治工作更是雪上加霜[9]。在福建地区陆续有PRRSV新毒株的出现，如NADC30-like和欧洲I型毒株[10-11]，尤其NADC30-like毒株，已有研究证明现有商业化蓝耳病疫苗不能对其提供完全保护[12]。近年来福建省陆续出台相关政策，对畜禽养殖要求提高门槛，同时将大力支持可养区生猪养殖场实施标准化改造[13-14]。这种趋势有助于提升猪场生物安全防控能力，对于猪场疫病防控起到一定的促进作用。
中小型养猪场与大型规模化、标准化养猪场相比，因其规模小、设施和管理相对比较落后、生物安全措施较薄弱，往往是疫病高发区。通过有针对性地对福建地区各中小型养猪场进行PRRSV流行病学调查，有助于了解PRRSV在该地区的流行情况，为PRRSV的防控提供借鉴。因PRRSV的GP5蛋白是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，编码GP5蛋白的ORF5基因在一定程度上能反映PRRSV的遗传变异情况，所以本试验主要是以GP5蛋白的流行程度来反映PRRSV的流行情况。
1. 材料与方法
1.1 样品收集
2017年83份疑似感染PRRSV的病料收集于福建龙岩、南平、漳州、福州、宁德等县市各中小型猪场。样品类型包括猪肺脏、淋巴结等，其中龙岩地区收集了12份，南平21份，漳州17份，福州9份，泉州5份，三明15份，宁德4份。将采集的组织样品研磨并于–70 ℃条件下保存，由国家生猪种业工程技术研究中心实验室留存。
1.2 主要试剂
RNA抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司，RNA酶抑制剂、dNTP混合物(2.5 mmol/L)、TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000和克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；感受态细胞大肠埃希菌DH5α购自北京天根生化科技有限公司。
1.3 引物设计与合成
根据 GenBank中收录的JXA1的基因序列(EF112445.1)与国内外流行的PRRSV毒株基因序列的比对结果，设计2套扩增PRRSVORF5基因的引物，引物序列见表 1。
表 1 引物和扩增片段长度Table 1. Primer and amplified fragment length引物名称
Primer name引物序列(5'→3')
Primer sequence长度/bp
LengthORF5-1-F TGAGACCATGAGGTGGGC 726 ORF5-1-R GAAAACGCCAAAAGCACC ORF5-2-F TGCTCCATTTCATGACAC 974 ORF5-2-R GCATCTGGAGGTGATGAAT 1.4 病毒总 RNA 的提取
取–70 ℃保存备用的病料处理上清液，按上海飞捷生物技术有限公司的RNA抽提试剂盒操作说明书提取病毒RNA，用适量RNase free水溶解，–20 ℃条件下保存备用。
1.5 RT-PCR 扩增
以20 μL为反转体系，分别加入制备好的RNA 9.5 μL，5×MLV Buffer 4.0 μL，MLV反转录酶 1.0 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4.0 μL，RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.5 μL，反转录随机引物1.0 μL，混匀后，置于恒温水浴锅中42 ℃反应1 h后获得 cDNA 模板。将cDNA用于 PCR 反应。采用50 μLPCR体系，分别加入TaKaRa Ex -Taq DNA聚合酶25 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各2 μL，加ddH2O至终体系50 μL。反应参数：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s (ORF5片段为1 min)，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。
1.6 ORF5基因的克隆和测序
参照DNA Purification Kit说明书回收扩增的目的片段后，于16 ℃将目的基因与pMD18-T载体过夜连接，连接产物转化到 DH5a感受态细胞，37 ℃条件下倒置培养10~16 h，挑菌，经PCR鉴定为阳性的菌液送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。
1.7 ORF5基因的进化树以及GP5蛋白的氨基酸序列分析
将各片段的测序结果，利用DNAStarLasergne软件进行人工拼接，得到PRRSV ORF5基因序列。从GenBank已上传毒株序列中选择具有代表性的26株PRRSV毒株，其中1株欧洲毒株，7株美国毒株和18株中国毒株。用MEGA6.0软件进行遗传进化树的绘制，用DNA Star 7.0软件进行氨基酸序列相似性的比较。
2. 结果与分析
2.1 2017年福建地区PRRSV样品检测结果
2017年在福建南平、宁德、三明、漳州、福州、泉州、龙岩等地区70个中小规模猪场采集83份疑似蓝耳阳性样品，阳性检出率为73%(置信度为95.0%，置信区间为62.1%~82.2%)，在NCBI上比对GP5遗传进化树显示分离毒株仍以JXA1亚群为主，占61%，GM2为代表毒株的分支检出率为17%，出现新的分支占15%，NADC30分支毒株占7%。南平、宁德、三明、福州、龙岩、泉州和漳州市的阳性率分别为26.50%、9.56%、15.47%、11.45%、12.58%、8.38%和17.76%。
2.2 PRRSV GP5氨基酸序列分析
比较不同PRRSV毒株的氨基酸序列，结果如图1所示。GP5各个区域的功能依次为信号肽区1~26 aa、诱导表位[27A(I/V)VLV29]、主要中和表位[37 H(F/L)QLIYNL45]、高变区、转膜区以及细胞表位，毒力相关位点为R13和 R151[15-16]。本试验NADC30为参考毒株亚群，以R13Q为主，其他分离株亚群以R13为主，仅有2株R13H突变，而R151氨基酸位点在各个分离株亚群中不变，以JXA1毒株为参考毒株的第I亚群和第II亚群出现了广泛的位点突变，包括信号肽区(L14S、F16S、 A26T)、诱导表位(L28P、 V29A)，高变区1 (S32N、 N33Q)和高变区2 (A28N/K)等突变位点，在细胞表位功能区的突变与其他亚群基本保持一致。GM2亚群大部分毒株与参考毒株相比在主要中和表位发生了H28Y和L29S突变，同时新出现的亚群与其他亚群相比在信号肽区(C10Y、L17S)、诱导表位区(A21V)、高变区1(N23T/A D24S)、主要中和表位(L41S)和高变区2(A57V)等具有特征性的位点，在其他位点仅少数存在氨基酸置换。通过糖基化分析预测，不同亚群糖基化位点也存在着一定的差异，JXA1亚群I有4个糖基化位点，亚群II只有3个，GM2和NADC30据推测也只有3个糖基化位点，新出现的亚群存在4个糖基化位点。
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图 1 PRRSV GP5氨基酸序列比对分析结果PS：信号肽；D：诱导表位；PNE:主要中和表位；HVR1、HVR2：高变区；T1、T2：T细胞表位；B：B细胞表位；TM1、TM2、TM3：跨膜区域；黄色高亮部分表示糖基化位点Figure 1. Comparison analysis of amino acid locus variation in PRRSV GP5PS: Peptide signal; D: Decoy epitope; PNE: Principal neutralizing epitope; HVR1, HVR2: Hypervariable region; T1, T2: T cell epitope; B: B cell epitope; TM1, TM2, TM3: Transmembrane regions; Yellow highlighted region refers to glycosylation site2.3 PRRSV ORF5遗传进化分析和基因的相似性
GeneBank上选取PRRSV的参考毒株与2017年测得的序列进行遗传进化分析，结果如图2所示，所有毒株均属于美洲型毒株，与参考毒株划分为不同的亚群，其中以JXA1毒株为代表的高致病性亚群仍为主要检出毒株，并与以往不同的是进化为2个不同的分支。以GM2为代表毒株的分支检出7株，且有新的进化分支形成。有3株分布在NADC30毒株为代表的分支上。经典株 CH-1a、美洲型疫苗株VR2332 和高致病性与经典毒株过渡株亚群未检出。其中共有6株毒株分布于新出现的分支中，与以往国内报道的毒株不同。
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图 2 ORF5基因遗传进化分析采用NJ法建树，自举值检验为1 000Figure 2. Genetic evolution analysis of the ORF5 geneThe tree is built using the NJ method, and the bootstrap value test is 1 000ORF5的核苷酸序列分析显示，ORF5的核苷酸序列相似性达80.3%~100.0%，通过遗传进化树可以看到，各分支毒株与其所属分支的代表毒株NADC30、GM2 和JXA1的核苷酸序列相似性分别为92.6%~93.9%、 89.8%~93.0%和 93.4%~99.3%。其中新出现的分支与CH-1a、JXA1和GM2的核苷酸序列相似性分别为91.7%~92.1%、92.4%~93.0%和81.9%~82.2%。在遗传进化树上独立形成分支的毒株 FJNP-LRX-04与以上参考毒株相比核苷酸序列相似性为82.7.%~87.2%，其中相似性最高的参考毒株是JXA1，相似性为87.2%。
3. 讨论与结论
本试验采集了福建地区几个市县PRRSV疑似蓝耳阳性病料，且收集了来源于福建地区中小规模养殖场的病料，所以本次试验覆盖地区广，有一定的代表性。福建地区送检猪场阳性率为73%，根据ORF5基因遗传进化分析显示，福建地区的毒株具有多样性，分布在5个大的分支上，检出以JXA1亚群为主，且分化呈两大分支的形式存在。以GM2为代表的lineage 3分支毒株在多地猪场都有检出，该支系毒株90年代最早出现在中国香港和台湾。有研究表明：GM2毒株在一些猪场长期存在，并且有不断扩大流行的趋势[17-18]。通过临床观察和统计，流行GM2毒株的猪场怀孕母猪流产率在10%左右，仔猪临床表现以高热为主，死亡率在10%~25%之间。以类NADC30为参考毒株的亚群检出率为7%，推测可能类NADC30毒株在福建地区尚未成为流行毒株。
通过遗传进化分析显示，新出现的毒株亚群分支的GP5氨基酸位点出现了一些新的特征，这些氨基酸变化在其他亚群中没有出现，其对毒株的生物学特征的影响需要进一步试验验证。该类型毒株分布于福建部分县市猪场，且没有呈现明显的地域特征。其中检测到FJNP-LRX-04等新毒株与流行参考毒株JXA1 ORF5基因序列相似性为92%~93%，是否会成为流行毒株需要进一步研究。病毒囊膜上的糖基化位点，会屏蔽相关的抗原表位，造成免疫逃逸[19]，以JXA1为代表的高致病性毒株存在4个糖基化位点，而新出现的分支亚群也有同样特点，所以可能会出现对现有疫苗免疫逃逸。
本研究通过对福建地区中小规模猪场PRRSV的分子检测及ORF5基因的变异分析，初步了解了福建地区中小规模猪场PRRSV毒株流行情况，并且对引种或跨区域传播引起的风险提供了一定的参考。
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表 1 18年生湿地松生长量与松脂质量基本概况
Table 1 The basic information of growth and resin mass of 18-year-old Pinus elliottii
项目 Item 树高/m
Tree height胸径/cm
Diameter at breast height单株材积/m3
Individual tree volumem(松脂)/g
Resin weight均值 Mean 13.26 20.03 0.22 2.84 最大值 Max. 17.50 33.30 0.68 16.00 最小值 Min. 7.80 11.50 0.05 0.10 标准差 SD 1.51 3.89 0.10 2.13 变异系数/% Coefficient of variation 11.36 19.44 47.10 75.04 
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表 2 湿地松生长性状与松脂质量的遗传参数估计1)
Table 2 Estimates of genetic parameters for growth traits and resin mass in Pinus elliottii
性状
Trait单株狭义遗传力(hi2)
Individual narrow-sense heritability家系平均遗传力(hf2)
Family average heritability树高 Tree height 0.415 1±0.142 7 0.751 2±0.071 7 胸径 Diameter at breast height 0.252 7±0.206 3 0.648 3±0.198 7 单株材积 Individual tree volume 0.299 8±0.106 1 0.685 5±0.082 5 松脂质量 Resin mass 0.216 1±0.092 0 0.600 5±0.107 9 1)表中“±”之后的数据为标准误，n=805
1) The data after “±” are standard errors, n=805
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表 3 性状间的加性遗传相关与表型相关系数1)
Table 3 Additive genetic and phenotypic correlation coefficients between traits
性状 Trait HT DBH Vol Den mt HT 0.731±0.017*** 0.783±0.014*** 0.324±0.034*** 0.084±0.039* DBH 0.813±0.095*** 0.965±0.002*** 0.269±0.034*** 0.182±0.036*** Vol 0.884±0.063*** 0.983±0.011*** 0.275±0.034*** 0.151±0.037*** Den 0.613±0.248** 0.449±0.306* 0.524±0.283* −0.007±0.037 mt 0.095±0.269 0.096±0.288 0.156±0.368 −0.007±0.037 1) HT为树高，DBH为胸径，Vol为单株材积，Den为木材密度，mt为转换的松脂质量；表中“±”之后的数据为标准误；表中右上方数据为表型相关系数，左下方数据为遗传相关系数；“*”、“**”和“***”分别表示达0.05、0.01和0.001水平的显著相关
1) HT: Height of tree; DBH: Diameter at breast height; Vol: Individual tree volume; Den: Wood density; mt: Transformed resin mass. Data after “±” are standard errors. Upper right data are phenotypic correlation coefficients, and lower left data are genetic correlation coefficients. “*”, “**” and “***” indicate significant correlation at 0.05, 0.01 and 0.001 levels, respectively
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