Antibacterial activity and mechanism of garlic organic sulfide against Bacillus amyloliquefaciens
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摘要:目的
明确大蒜有机硫化物(GOS)对豆制品优势腐败解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的抑菌活性及作用机理。
方法通过抑菌圈法和二倍稀释法测定GOS对菌株的抑菌活性、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，并分析其对细菌生长曲线及胞外蛋白酶活性的影响；分析GOS处理后解淀粉芽孢杆菌代谢活性、碱性磷酸酶活性、β–半乳糖苷酶活性及胞外溶液电导率的变化，并结合扫描电镜观察菌体形态变化，探讨GOS对解淀粉芽孢杆菌的抑菌机理。
结果3 g/mL 的GOS对解淀粉芽孢杆菌DY1a和DY1b的抑菌圈直径分别为31.7和25.7 mm，MIC均为30 mg/mL，MBC分别为240和480 mg/mL。30 mg/mL GOS对菌株DY1a和DY1b胞外蛋白酶活性的抑制率分别为47.3%和15.6%，使细菌细胞代谢活性(D490 nm)分别下降了2.771和4.091，胞外碱性磷酸酶活性分别提高了0.029和0.036 U/mL，胞外β−半乳糖苷酶活性(D420 nm)分别提高了0.047与0.016，胞外溶液电导率分别提高了0.060和0.031 mS/cm。扫描电镜结果显示，GOS处理后的菌株细胞表面出现皱缩、孔洞式塌陷和破裂。
结论大蒜有机硫化物对解淀粉芽孢杆菌抑制作用明显，其抑菌机理与影响细菌细胞壁、细胞膜的通透性和完整性，干扰细菌生理代谢活动有关。
Abstract:ObjectiveTo explore antibacterial activity and mechanism of garlic organic sulfide (GOS) against Bacillus amyloliquefaciens.
MethodThe antimicrobial activity, minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of GOS against B. amyloliquefaciens strain were determined using the inhibition zone method and the double dilution method, and its inhibitory effects on bacterial growth curve and extracellular protease activity were evaluated. Metabolic activity, alkaline phosphatase activity, β-galactosidase activity, extracellular conductivity and thallus morphological changes observed through scanning electron microscope of B. amyloliquefaciens treated with GOS were investigated for elucidating antibacterial mechanism of GOS against B. amyloliquefaciens.
ResultDiameter of inhibitory zone of GOS against B. amyloliquefaciens DY1a and DY1b were 31.7 and 25.7 mm respectively, MIC of both strains were 30 mg/mL, MBC were 240 and 480 mg/mL, respectively. The inhibition rate of 30 mg/mL GOS on DY1a and DY1b extracellular protease activity were 47.3% and 15.6% respectively. After treatment with 30 mg/mL GOS, metabolic activity (D490 nm) decreased by 2.771 and 4.091 respectively, extracellular alkaline phosphatase activity increased by 0.029 and 0.036 U/mL, extracellular β-galactosidase activity (D420 nm) increased by 0.047 and 0.016 respectively and the extracellular electrical conductivity increased by 0.060 and 0.031 mS/cm respectively. The results of SEM showed that the surface of bacteria cells treated with GOS had shrinkage, cavity collapse and rupture.
ConclusionThe excellent antibacterial effect of GOS against B. amyloliquefaciens may be attributed to irreversible damage to cell wall and cell membrane and alterations of cell physiological metabolism.
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普通大蓟马Megalurothrips usitatus又名豆大蓟马、豆花蓟马，隶属于缨翅目蓟马科大蓟马属，主要分布于澳大利亚、马来西亚、斯里兰卡、菲律宾、斐济、印度、日本等[1-3]，在我国海南、台湾、广东、广西、湖北、贵州、陕西等地也均有发生为害[4-5]。据报道，该虫有28种寄主，其中16种为豆科植物，目前它已成为危害华南地区豆科作物的主要害虫[6-9]，田间调查和室内试验均表明豇豆为其嗜好寄主[10-11]。普通大蓟马主要以锉吸式口器取食豇豆幼嫩组织的汁液，可造成叶片皱缩、生长点萎缩、豆荚痂疤等，严重影响豇豆品质[12-13]。此外，该虫体积小、发生量大、隐秘性强，大部分时间都躲在花中取食，从豇豆苗期至采收期均可为害[14-15]，以上特点均增加了农户的防治难度。当其为害严重时，农户只能增加施药频率和施药量，这也导致该虫对多种常用化学农药产生了严重的抗药性[16-17]。
目前关于普通大蓟马的研究主要集中在生物学特性[18]及综合防治技术[19-20]等层面，随着抗药性的不断发展与研究的不断深入，从分子层面解析普通大蓟马的抗药性机制和寄主选择机制等以寻求新型绿色防控方法势在必行，室内种群的大规模饲养是展开这些研究的基础。化蛹基质作为影响昆虫种群规模的关键因子，韩云等[21]曾指出普通大蓟马在含水量(w)为15%的砂壤土中羽化率显著高于砂土、壤土和黏土，但不适用于室内大规模饲养，因为实际应用中，存在土壤类型无法明确区分、配制砂壤土会增加人工饲养的工作量等问题。土壤以外的其他基质对普通大蓟马化蛹的适合度鲜见研究报道。
本研究以普通大蓟马为试验对象，室内观测其在沙子、蛭石和厨房用纸3种基质及无基质条件下的羽化规律，分析该虫对不同化蛹基质的适合度，以期为普通大蓟马的室内大规模饲养提供基础资料，为该虫的综合治理提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
普通大蓟马于2017年采自广东省广州市增城区朱村豇豆田，采回后在RXZ-500C型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)内用豇豆豆荚饲养，饲养条件为温度(26±6) ℃，光照周期12 h光∶12 h暗，相对湿度(70±5)%。室内饲养多代后，选取发育一致的老熟2龄若虫(以体色变为橙红色为标准)进行室内试验。
供试基质包括沙子、蛭石、锯末和厨房用纸，并以无基质作为空白对照。试验前将沙子、蛭石和锯末置于DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)中105 ℃恒温烘烤6 h备用。
1.2 试验方法
首先称取过筛烘干后的沙子50 g 3组，分别加入2.5、3.5和4.5 mL蒸馏水，充分混匀，配制成含水量(w)分别为5%、7%和9%的沙子化蛹基质；称取过筛烘干后的蛭石10 g 3组，分别加入10.0、12.5和15.0 mL蒸馏水，充分混匀，配制成含水量(w)分别为20%、25%和30%的蛭石化蛹基质；称取过筛烘干后的蛭石10 g 3组，分别加入12.5、15.0和17.5 mL蒸馏水，充分混匀，配制成含水量(w)分别为25%、30%和35%的锯末化蛹基质。将以上基质分别转移至350 mL玻璃组培瓶内，基质深度均为5 cm，将厨房用纸对折成合适大小后平铺在组培瓶底部作为基质。在所有基质上放置纱网，再加入1根新鲜的豇豆豆荚(长度约4~5 cm)，分别接入50头普通大蓟马老熟2龄若虫，用250目纱布封口后置于人工气候箱中饲养，每日观察并记录成虫羽化数量。每个处理设6次重复。设置不加入任何化蛹基质的空白对照。
含水量的测定方法按以下公式[22]进行：
含水量=实际含水质量/烘干后基质质量×100%。
1.3 数据分析
运用SPSS 24.0软件进行试验数据处理分析，不同基质及含水量对普通大蓟马羽化率、蛹历期和性比(雄性∶雌性)的影响采用单因素方差分析，并运用Duncan’s法检验差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 不同基质对普通大蓟马羽化率、蛹历期和性比的影响
普通大蓟马在不同基质中的羽化率、蛹历期和性比具有显著差异(图1)。由图1A可知，普通大蓟马在厨房用纸中的羽化率显著高于其他基质，为54.33%，其次为含水量5%(w)的沙子，羽化率为44.67%；锯末最不适宜于普通大蓟马羽化，在含水量(w)为25%、30%、35%的锯末中普通大蓟马的羽化率分别为10.33%、5.33%、16.67%，显著低于空白对照与其他基质。
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图 1 不同基质对普通大蓟马羽化率、发育历期和性比(雄性∶雌性)的影响1~3分别为含水量(w)为5%、7%和1%的沙子，4~6分别为含水量(w)为20%、25%和30%的蛭石，7~9分别为含水量(w)为25%、30%和35%锯末，10：厨房用纸，11：无基质；各图中的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Effects of different substrates on eclosion rate, pupa developmental period and male-female ratio of Megalurothrips usitatus1: Sand with 5% moisture, 2: Sand with 7% moisture, 3: Sand with 10% moisture, 4: Vermiculite with 20% moisture, 5: Vermiculite with 25% moisture, 6: Vermiculite with 30% moisture, 7: Sawdust with 25% moisture, 8: Sawdust with 30% moisture, 9: Sawdust with 35% moisture, 10: Kitchen paper, 11: No substrate; Different lowercase leters in the same figure indicated significant difference among different substrate (P<0.05, Duncan’s method)由图1B可知，普通大蓟马在含水量5%(w)的沙子中蛹的发育历期最短，为5.29 d，其次为含水量7%(w)的沙子，为6.01 d，在其他基质中的蛹期则无显著差异，在6.14~7.16 d。
由图1C可知，普通大蓟马在含水量30%(w)的蛭石中性比最高，为0.60，含水量10%(w)的沙子和30%(w)的蛭石性比相对较低，分别为0.12和0.06，在其他基质中性比无显著差异。
2.2 不同基质条件下普通大蓟马的羽化情况
由表1数据可知，沙子含水量(w)为5%时普通大蓟马羽化最早，始于第2天；其次为蛭石，羽化始于第4天，其他条件下羽化均始于第3天；以锯末为基质时羽化最晚，始于第5天。沙子含水量(w)为5%和厨房用纸条件下，羽化高峰出现在第5天，羽化率分别为21%和22.67%；次高峰在第6天，羽化率分别为14.33%和21%。沙子含水量(w)为9%、锯末以及空白对照下羽化高峰出现在第7天，其他条件下羽化高峰均出现在第6天。不同基质类型及含水量条件下，普通大蓟马的羽化均结束于第8天或第9天，与不同基质培养条件下普通大蓟马蛹期之间的差异相对应。
表 1 不同基质对普通大蓟马逐日羽化率的影响1)Table 1. Effects of differents substrates on daily eclosion rate of Megalurothrips usitatus% t/d 沙子含水量(w) Water content in sand 蛭石含水量(w) Water content in vermiculite 5% 7% 9% 20% 25% 30% 1 0 0 0 0 0 0 2 1.67±0.42c 0 0 0 0 0 3 1.00±1.68c 0 0 0 0 0 4 1.33±0.67c 5.33±0.33c 0.33±0.33b 0 0 0 5 21.00±3.82a 5.33±2.17b 2.67±1.91b 3.00±2.30bc 10.33±3.48ab 0.33±0.33b 6 14.33±4.66b 17.33±1.76a 2.67±1.91b 11.67±2.09a 14.67±3.33a 7.67±2.22a 7 2.33±0.80c 5.00±0.85b 8.67±1.84a 6.33±2.28b 7.67±1.74bc 6.67±1.52a 8 0.67±0.42c 0.67±0.67c 0.67±0.42b 4.00±1.35bc 4.00±1.37cd 1.67±0.94b 9 0 0 0.33±0.33b 0.67±0.42b 0 0.67±0.42b 10 0 0 0 0 0 0 3. 讨论与结论
化蛹基质的类型对普通大蓟马化蛹具有一定影响，本研究发现锯末和蛭石不适宜于普通大蓟马化蛹，锯末和蛭石不同含水量条件下大蓟马的羽化率都显著低于空白对照。有研究指出土壤中砂土含量低于30%时，蓟马若虫不能化蛹[23]，蓟马在砂壤土中的羽化率也显著高于砂土、黏土、壤土等单一土壤[21]。
化蛹基质的含水量对普通大蓟马化蛹具有显著影响，本研究发现当沙子含水量(w)为5%时，羽化率仅次于厨房用纸，高达44.67%，与孟国玲等[23]关于豆带蓟马Taenithripsglycines在含水量(w)为5.7%时羽化率最高(43.63%)的报道相对一致。韩云等[21]研究发现普通大蓟马在含水量(w)为15%的砂壤土中羽化率最高，为52.08%，而土壤含水量(w)5%时羽化率仅为6.67%。这与本研究结果不符，究其原因可能是不同类型的基质吸水力与保水力不同，导致在相同的绝对含水量下湿度有差异。此外，有研究曾指出高含水量不利于蓟马化蛹[24]，这与本研究结果相一致，沙子含水量(w)5%时的羽化率显著高于含水量(w)7%和10%。
在本研究中，成虫性比普遍低于1∶1，含水量(w)30%的蛭石羽化性比最高，为0.6，含水量(w)30%锯末最低，为0.06，其他处理的性比无显著差异，为0.12~0.48。张念台[8]和谭柯[24]在田间调查的结果也显示其成虫性比低于1∶1，后代总是偏于雌性，谭柯[24]则表示后代偏雌性可能是蓟马暴发的原因之一。这与本研究结果相一致，后代偏于雌性。
本研究发现普通大蓟马在厨房用纸中的羽化率最高，蛹发育历期与其他基质相比无明显差异，且以厨房用纸为化蛹基质时，可以清楚地观察到普通大蓟马蛹期的形态特征变化，可以随时根据试验需求收集不同时期的若虫或成虫。虽然沙子含水量(w)5%时蛹发育历期最短且羽化率也较高，但蓟马一旦入土化蛹便无法继续观察形态或收集虫体。因此，本试验条件下，厨房用纸是最适合室内普通大蓟马大量饲养的化蛹基质。
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图 1 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)对2株解淀粉芽孢杆菌的抑菌作用
Figure 1. Antibacterial effects of different concentrations of garlic organic sulfide (GOS) on two strains of Bacillus amyloliquefaciens
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图 2 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)对2株解淀粉芽孢杆菌生长的影响
GOS初始质量浓度为960 mg/mL
Figure 2. Effects of different concentrations of garlic organic sulfide (GOS) on the growth of two strains of Bacillus amyloliquefaciens
GOS initial concentration is 960 mg/mL
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图 3 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)对2株解淀粉芽孢杆菌生长曲线的影响
Figure 3. Effects of different concentrations of garlic organic sulfide (GOS) on the growth curves of two strains of Bacillus amyloliquefaciens
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图 4 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)对2株解淀粉芽孢杆菌细胞代谢活性的影响
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 4. Effects of different concentrations of garlic organic sulfide (GOS) on metabolic activities of two strains of Bacillus amyloliquefaciens
Different lowercase letters above the column indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
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图 5 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)处理2株解淀粉芽孢杆菌的胞外碱性磷酸酶(AKP)活性的变化
各图中相同时间柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 5. Changes of extracellular AKP activity in two strains of Bacillus amyloliquefaciens treated with different concentrations of garlic organic sulfide (GOS)
Different lowercase letters above columns of the same time in each graph indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
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图 6 大蒜有机硫化物(GOS)处理2株解淀粉芽孢杆菌的胞外电导率变化
各图中相同时间柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 6. Changes of extracellular electrical conductivity in two strains of Bacillus amyloliquefaciens treated with garlic organic sulfide (GOS)
Different lowercase letters above columns of the same time in each graph indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
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图 7 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)处理2株解淀粉芽孢杆菌的胞外β–半乳糖苷酶活性变化
各图中相同时间柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 7. Changes of extracellular β-galactosidase activity in two strains of Bacillus amyloliquefaciens treated with different concentrations of garlic organic sulfide (GOS)
Different lowercase letters above columns of the same time in each graph indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
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图 8 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)处理2株解淀粉芽孢杆菌细胞表面形态
A：未处理菌株DY1a；B：30 mg/mL GOS处理菌株DY1a；C：480 mg/mL GOS处理菌株DY1a；D：未处理菌株DY1b；E：30 mg/mL GOS处理菌株DY1b；F：480 mg/mL GOS处理菌株DY1b
Figure 8. Cell surface morphology of two strains of Bacillus amyloliquefaciens treated by different concentrations of garlic organic sulfide (GOS)
A: Strain DY1a untreated; B: Strain DY1a treated with GOS at 30 mg/mL; C: Strain DY1a treated with GOS at 480 mg/mL; D: Strain DY1b untreated; E: Strain DY1b treated with GOS at 30 mg/mL; F: Strain DY1b treated with GOS at 480 mg/mL
表 1 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)对2株解淀粉芽孢杆菌的杀菌作用
Table 1 Bactericidal effect of different concentrations of garlic organic sulfide (GOS) against two strains of Bacillus amyloliquefaciens
ρ(GOS)/
(mg·mL−1)菌落数/ (CFU·mL−1)
Colony countDY1a DY1b 480 0 0 240 0 50 120 20 290 60 300 >300 
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表 2 不同浓度大蒜有机硫化物(GOS)对2株解淀粉芽孢杆菌胞外蛋白酶活性的影响1)
Table 2 Effects of different concentrations of garlic organic sulfide (GOS) on extracellular protease activities of two
strains of Bacillus amyloliquefaciens ρ(GOS)/
(mg·mL−1)DY1a DY1b 水解圈直径/mm
Diameter of
hydrolysis zone蛋白酶活性抑制率/%
Inhibitory rate of
protease activity水解圈直径/mm
Diameter of
hydrolysis zone蛋白酶活性抑制率/%
Inhibitory rate of
protease activity0 17.41±0.85a 0 16.37±0.04a 0 15 16.17±1.36a 13.7 16.68±0.43a 0 30 12.64±0.71b 47.3 15.04±0.42a 15.6 45 7.00±0.00c 83.8 10.98±0.46b 55.0 1)同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
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