Screening and identification of an oxytetracycline degradation strain resistant to Cu2+ and Zn2+ and its characteristics
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摘要:目的
铜、锌离子和土霉素作为养殖业中常用饲料添加剂，在畜禽粪便和污水中大量残留，形成了复合污染。本文在铜、锌离子的胁迫下筛选出降解土霉素的菌株。
方法通过选择培养基，从养殖废水中筛选分离出1株土霉素降解菌DJI，优化其降解条件，测定DJ1菌株对其他四环素类抗生素和氯霉素的耐受性。
结果通过菌株形态学特征及18S rDNA序列比对分析，确定DJ1菌株为Cutaneotrichosporon cutaneum。该菌在pH7、温度30 ℃、装液量50 mL(使用250 mL三角瓶)、底物质量浓度200 mg/L、接种量为1% (φ)的条件下，培养5 d后对土霉素的降解率为78.83%。在低质量浓度(50 mg/L)土霉素的培养基中，添加50 mg/L Zn2+抑制了土霉素的降解；而在高质量浓度(200 mg/L)土霉素培养基中，添加50 mg/L Cu2+抑制了土霉素的降解。菌株DJ1对四环素类抗生素及氯霉素具有高耐受能力，耐受均超过700 mg/L，能在抗生素与重金属铜、锌离子二元交叉培养基平板上生长，具有耐抗生素与重金属的双重抗性。
结论菌株DJI具有高耐受四环素类抗生素、氯霉素、铜和锌离子的能力，能高效降解土霉素，可在环境抗生素污染防治中发挥积极作用。
Abstract:ObjectiveAs the main feed additive in breeding industry, Cu2+, Zn2+ and oxytetracycline contribute to high amounts of residues in livestock and poultry excrement and sewage, forming complex pollution. We are aimed at screening strains to degrade oxytetracycline under the stress of Cu2+ and Zn2+.
MethodThe strain DJ1 of oxytetracycline degrading bacteria was screened and isolated from culture wastewater using selective medium. The biodegrading conditions of oxytetracycline by strain DJ1 were optimized. The tolerances of strain DJ1 to other tetracycline antibiotics and chloramphenicol were determined.
ResultThe strain DJ1 was identified as Cutaneotrichosporon cutaneum based on morphology and 18S rDNA sequence alignment. The oxytetracycline degradation rate of DJ1 reached 78.83% after five days of culturations under the condition of pH7, 30 ℃ temperature, 50 mL liquid in 250 mL flask, 200 mg/L substrate and 1%(φ) inoculum size. In medium with lower concentration (50 mg/L) of oxytetracycline, 50 mg/L Zn2+ inhibited oxytetracycline degradation, while 50 mg/L Cu2+ inhibited oxytetracycline degradation in medium with higher concentration (200 mg/L) of oxytetracycline. DJ1 strain had high tolerance to tetracycline antibiotics and chloramphenicol, the tolerating concentrations to both were above 700 mg/L. DJ1 strain could grow on the plate of binary cross medium with antibiotics and heavy metals of Cu2+ and Zn2+, showing dual resistance to antibiotics and heavy metals.
ConclusionDJ1 strain has high tolerance to tetracycline antibiotics, chloramphenicol, Cu2+ and Zn2+. It can efficiently degrade oxytetracycline and can be used to control antibiotic contamination in the environment.
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Keywords:
- oxytetracycline /
- degradation rate /
- antibiotic /
- heavy metal /
- tolerance
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水质和粮食安全是全球农业可持续发展的中心问题[1]。中国是世界上最大的稻米生产国，产量约占全球稻米产量的28%[2]。作为一种耗水型作物，水稻种植用水量在许多地区占农业用水总量的80%左右，因此在确保粮食安全的前提下有效防控稻田面源污染至关重要。随着当前集约化农业生产模式的广泛应用，施用大量农药、化肥的同时叠加不合理的灌溉和排水方式，一方面造成严重的农业面源污染、降低水稻产量；另外，大量污染物通过地表径流、农田排水、地下渗漏等方式扩散到其他水生生态系统，导致周边湖泊、河流等水生生态系统的水质下降，并引发水体富营养化、蓝藻暴发等生态环境问题[3-4]，引起社会的高度关注。因此，积极探索环保型水稻种植模式、改善农业面源污染环境已成为当前农业发展的一个重要方向。
稻渔综合种养系统是以水稻种植为基础，在稻田养殖鱼、虾、鸭等水生动物或禽类，在不施用或者少量施用化肥、农药的同时，生产出高质量水稻和优质动物蛋白，是一种有机、可持续的现代农业生产模式[5]。稻虾种养模式是水稻种植与小龙虾养殖的有机结合，当前已在我国众多湖区得到大面积推广，是稻渔综合种养系统的典型模式。一方面稻田中的杂草、害虫等可为小龙虾提供天然饵料，小龙虾的粪便也可以成为水稻的肥料；同时，养殖小龙虾还可通过有效减少稻田中害虫数量、增加土壤有效含氧量及促进田间水体元素循环等途径减少稻田农药和化肥的使用[6-8]。
近年来，为了提高稻虾综合种养模式中小龙虾的效益，农民过量投放饵料和病害防治药物，过多的投入品以及由此产生的固液态废弃物在养殖季结束时随尾水集中排放，大大加剧周边水体富营养化的风险。环洞庭湖区是湖南稻虾综合种养的重要区域，主要分布在益阳市、常德市、岳阳市、长沙市望城区，种养面积已突破5.3万hm2[9]。稻虾养殖尾水大多不经任何处理直接排至洞庭湖，严重威胁湖泊水质及生态环境；因此，改善稻虾养殖技术、减少养殖尾水中营养物质的排放对于保障湖区生态环境、推动湖区稻虾产业发展及面源污染防治均具有重要的理论和现实意义。
为了得出洞庭湖区稻虾综合种养的科学模式，本研究设置了3种模式：水稻单作模式、水稻−低密度虾模式和水稻−高密度虾模式，结合综合水质指数评价法对3种模式的水质进行综合评价，以确定不同模式对水环境的影响；此外，还对不同模式的经济效益进行了比较。本研究旨在遴选科学的种养模式，为湖区农业面源污染的治理及农业发展提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验区概况
试验地位于湖南省长沙市望城区(28°44′N，112°87′E)，属于亚热带季风气候，温和湿润，年平均气温17 ℃，年降水量约1 370 mm，年日照时数1 610 h，无霜期约274 d。试验地土壤为沙壤，耕层约20 cm，基本肥力性质见表1。
表 1 试验地土壤基本理化性质Table 1. Basic physical-chemical properties of the tested soil处理
TreatmentpH w/(g·kg−1) w/(mg·kg−1) 总N
Total N总P
Total P总K
Total K有机质
Organic matter速效P
Available P速效K
Available K稻虾
Rice-red crayfish6.02±0.03 0.97±0.07 0.58±0.02 5.69±0.27 27.50±2.24 2.71±0.76 43.94±2.89 水稻单作
Rice monocropping6.01±0.02 0.98±0.06 0.59±0.01 5.49±0.24 29.80±4.31 2.23±0.50 36.65±2.66 1.2 试验设计
本研究采用小区试验的方法，将本底值相近的田块设计成为均匀的9个试验小区，每个试验小区面积为667 m2，并设有田埂，用地膜包裹，试验小区四周开挖虾沟，上宽0.5 m，下宽0.3 m，深0.6 m。设置2种稻虾综合种养模式(低密度稻虾、高密度稻虾)和水稻单作模式，每种模式设置3次重复，9个试验小区完全随机区组排列。供试水稻为中熟品种‘农香42’。供试虾为红螯螯虾Cherax quadricarinatus，虾苗规格为120尾·kg−1，其中低密度稻虾处理投放20 kg(2 400尾，投放密度为300 kg·hm−2)，高密度稻虾处理投放25 kg(3 000尾，投放密度为375 kg·hm−2)。试验红螯螯虾放养密度由本研究前期对环洞庭湖地区(以常德市、益阳市、岳阳市为主要调研对象)稻虾综合种养实际生产的调研结果确定，调研结果显示环洞庭湖区稻虾综合种养的虾苗放养密度以300、375 kg·hm−2最具代表性，因此选取300、375 kg·hm−2作为本研究目标放养密度。
1.3 田间管理
1.3.1 水稻管理
2022年5月中旬进行整地、育秧；6月上旬进行水稻机插秧，栽插的原则是宽行窄株、沟边密植，10月中下旬收割。本研究所有处理均于水稻种植前施用基肥，基肥选用三元复合肥(N、P、K质量比为15∶15∶15)；水稻单作模式施用基肥40 kg，2种稻虾综合种养模式均减少20%(w)的肥料投入，即施用基肥32 kg。
1.3.2 红螯螯虾管理
2022年7月初投放红螯螯虾虾苗，10月中旬收获成虾。每日分别在06:00、17:00投喂，初始投喂量为虾苗总质量的3%(w)，后期根据红螯螯虾长势及饵料台吃食情况调整投喂量。
1.3.3 水位管理
水稻单作：水稻移栽后至分蘖盛期前，田间保持淹水3~4 cm；水稻分蘖盛期采用浅水晒田，水层1~2 cm；水稻分蘖后期至灌浆期前，田面保持15~20 cm水位；水稻灌浆期，田间排水，开始晒田。
稻虾综合种养模式：水稻移栽后至分蘖盛期前，田间保持淹水3~4 cm；水稻分蘖盛期采用浅水晒田，水层1~2 cm；水稻分蘖后期至成熟期前，田面保持15~30 cm水位；水稻成熟期至水稻收割，逐渐降低水位至田面以下。整个稻虾共作期间，仅在水稻成熟期对田间进行排水，虾沟一直保持淹水状态。
1.4 水体样品采集与测定
2022年6—10月，分别在水稻的分蘖期、拔节期、孕穗期、扬花期、灌浆期和成熟期，从低密度、高密度稻虾处理的田面和虾沟以及水稻单作处理的田面采集水样，带回实验室保存于4 ℃冰箱，等待后续检测。样品名称及编号分别为：低密度稻虾模式田面水体样品(RCL)、低密度稻虾模式虾沟水体样品(RCL-G)、高密度稻虾模式田面水体样品(RCH)、高密度稻虾模式虾沟水体样品(RCH-G)、水稻单作模式田面水体样品(RM)。由于水稻单作模式在灌浆期即开始晒田，因此在灌浆期水稻单作模式无水体样品；成熟期3个处理均需要晒田，仅采集低、高密度稻虾处理虾沟水体样品。使用便携式水质分析仪(YSI Pro Quatro)现场测定水体溶解氧含量、温度、溶解性总固体含量、电导率和pH；采用碱性过硫酸钾消解−紫外分光光度法测定水体总N含量；采用纳氏试剂分光光度法测定水体铵态N(NH4+−N)含量；采用紫外分光光度法测定水体硝态N(NO3−−N)含量；采用钼酸铵分光光度法测定水体总P含量；采用高锰酸钾法测定水体的化学需氧量。
1.5 数据分析
1.5.1 水体质量评价
综合水质指数评价法将各种参数指标整合成一个可以反映整体水质情况的常数，减少单独使用一些指标产生的差异，从而综合评价水生生态系统水环境的整体质量[10-11]。在这一方法中，所有候选的指标都可能是水体质量的最终评价因素，由于部分指标的获取有一定难度，因此可以选择具有代表性的指标建立一个最小数据集(Minimal data set，MDS)，旨在从所有候选参数中筛选出最具代表性的子集，以尽可能全面地代表所有候选参数。然后，对选择出来的合适指标进行加权与评分，最终将分数合并为水质指数(Water quality index，WQI)。
本研究选取9个水体理化指标进行WQI评价，选择评价因子建立MDS。为了克服指标间的信息重叠，采用主成分分析(Principal component analysis)进行分组，将特征值≥1、主成分载荷值绝对值≥0.5的水体指标分为一组。计算分组指标的范数值，选择各组中范数值在前10%的指标。选择后，分析各组指标间的相关性，如果具有相关性(r≥0.3)，确定得分最高的指标进入MDS，如果无相关性(r<0.3)，所有指标都进入MDS，从而得到最终的MDS。范数值的计算公式见式(1)：
$$ {N}_{ik}=\sqrt{{\displaystyle\sum} _{i=1}^{k}({U}_{ik}^{2}{\lambda }_{k})} \text{，} $$ (1) 式中：Nik为水体变量i在前k个主成分上的综合载荷；Uik为水体变量i在第k个主成分上的载荷；λk为主成分k的特征值。
式(2)和(3)分别为“越多越好”和“越少越好”曲线的线性评分：
$$ {S}_{i}=\dfrac{X-L}{H-L} \text{，} $$ (2) $$ {S}_{i}=1-\dfrac{X-L}{H-L} \text{，} $$ (3) 式中：Si为水体指标的线性得分，0~1；X为变量值；L为变量中的最小值；H为变量中的最大值。
在计算了水体指数的得分和权重后，采用式(4)计算WQI：
$$ \mathrm{W}\mathrm{Q}\mathrm{I}={\displaystyle\sum} _{i=1}^{n}{W}_{i}{S}_{i} \text{，} $$ (4) 式中：Wi为主成分分析得到的加权指标；Si为使用式(2)或(3)计算的指数得分；n为数据集中的指数量。WQI取值0~1，WQI越高，说明水体质量越好。
1.5.2 经济效益评价
水稻产量测定：在水稻成熟期，每小区按5点取样法调查100穴水稻的有效穗数，计算单穴平均有效穗数；每小区按平均有效穗数取样5穴，测定每穗总粒数、每穗实粒数、结实率和千粒质量；各处理分收分晒，测实际产量[12]。
红螯螯虾产量测定：红螯螯虾通过虾的规格分级记产，计算产值，红螯螯虾规格分为小青、中青、大青、炮头。小青指体质量<20 g，中青指体质量20~<30 g，大青指体质量30~<45 g，炮头指体质量≥45 g。
1.5.3 水质数据分析
统计分析均采用SPSS 26.0进行，在P<0.05水平差异显著；采用双因素方差分析研究水稻不同生长时期和不同处理对水体理化指标和WQI的影响；采用多重比较检验法(Duncan’s法)检验水稻不同生长时期和不同处理的水体理化指标和WQI的差异性；采用Pearson相关分析确定水体理化指标的两两相关性；采用线性回归比较与验证WQI的MDS；使用Origin 2021绘图软件制图。
2. 结果与分析
2.1 水体物理指标的变化
不同处理及水稻不同生长时期对水体物理指标的影响如图1A~1C所示。整个试验阶段的水体温度随水稻生长时期的推移逐渐降低。在水稻分蘖期，低密度稻虾处理水体的电导率高于高密度稻虾处理，且电导率和溶解性总固体含量均显著高于水稻单作；在水稻拔节期和扬花期，高密度稻虾处理水体的电导率和溶解性总固体含量高于低密度稻虾处理，且均显著高于水稻单作；在水稻孕穗期，高密度稻虾处理水体的溶解性总固体含量显著高于低密度稻虾处理和水稻单作；在水稻灌浆期，高密度稻虾处理水体的电导率和溶解性总固体含量均显著高于低密度稻虾处理。
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图 1 水体理化指标在不同处理和水稻各生长时期的变化RCL：低密度稻虾模式田面水体，RCL-G：低密度稻虾模式虾沟水体，RCH：高密度稻虾模式田面水体，RCH-G：高密度稻虾模式虾沟水体，RM：水稻单作模式田面水体；P1：分蘖期，P2：拔节期，P3：孕穗期，P4：扬花期，P5：灌浆期，P6：成熟期；各小图中柱子上方的不同小写字母表示相同生长时期不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。Figure 1. Physico-chemical indicator changes of water under different treatments and in different growth periods of riceRCL: Surface water of low density rice-red crayfish model, RCL-G: Ditch water of low density rice-red crayfish model, RCH: Surface water of high density rice-red crayfish model, RCH-G: Ditch water of high density rice-red crayfish model, RM: Surface water of rice monocropping model; P1: Tillering stage, P2: Jointing stage, P3: Booting stage, P4: Flowering stage, P5: Filling stage, P6: Ripening stage; Different lowercase letters above the columns in each figure indicate significant differences among different treatments in the same growth period (P<0.05, Duncan’s method).2.2 水体化学指标的变化
不同处理及水稻不同生长时期对水体化学指标的影响如图1D~1J所示。pH变化如图1D所示，3个处理的水体pH在6.12~7.92波动。溶解氧含量变化如图1E所示，2种稻虾综合种养处理的水体溶解氧含量在拔节期最高，在孕穗期最低，且2种综合种养模式虾沟水体的溶解氧含量普遍高于其田面水体；水稻单作田面水体的溶解氧含量随水稻生育期推移呈先下降后上升的趋势，且全程低于2种稻虾处理虾沟水体。化学需氧量变化如图1F所示，水体化学需氧量在水稻生长周期内无明显波动。低密度稻虾处理水体的化学需氧量在水稻分蘖期、孕穗期、扬花期、灌浆期均高于高密度稻虾处理，在拔节期和成熟期低于高密度稻虾处理；在成熟期，相对于低密度稻虾模式虾沟水体，高密度稻虾模式虾沟水体的化学需氧量显著上升26.2%。
总N含量变化如图1G所示，所有模式的水体总N含量随水稻生长时期推移呈先下降后上升的趋势。所有模式均在分蘖期最高，在拔节期最低；在分蘖期和成熟期，高密度稻虾处理水体总N含量显著高于低密度稻虾处理，其中成熟期虾沟水体中总N含量显著提升10.5%；其余时期低密度稻虾处理水体总N含量高于高密度稻虾处理。
总P含量变化如图1H所示，所有模式水体总P含量随水稻生长时期推移呈先下降后上升再下降的趋势。2种稻虾综合种养处理水体的总P含量在水稻分蘖期和扬花期均高于水稻单作，而在水稻拔节期和孕穗期则显著低于水稻单作；高密度稻虾处理田面水样总P含量在水稻灌浆期显著高于低密度稻虾处理水样，且均显著高于高密度稻虾处理虾沟水样；在水稻成熟期2种稻虾综合种养处理水体的总P含量无显著差异，高密度模式虾沟水体总P含量比低密度模式虾沟水体提升3.6%。
NO3−−N含量变化如图1I所示，所有模式水体的NO3−−N含量随水稻生长时期推移呈先上升后下降再上升的趋势。2种稻虾综合种养处理水体的NO3−−N含量在水稻分蘖期、孕穗期和扬花期均低于水稻单作，而在水稻拔节期则高于水稻单作；低密度稻虾处理水体NO3−−N含量在水稻灌浆期和成熟期高于高密度稻虾处理。NH4+−N含量变化如图1J所示。水稻单作水体的NH4+−N含量在水稻扬花期显著低于2种稻虾综合种养处理，而在水稻拔节期则高于低密度稻虾处理，且显著高于高密度稻虾处理；高密度稻虾处理虾沟水样的NH4+−N含量在水稻分蘖期显著高于水稻单作，且均显著高于低密度稻虾处理；高密度稻虾处理水体的NH4+−N含量在水稻拔节期和扬花期低于低密度稻虾处理；高密度稻虾处理虾沟水体的NH4+−N含量在水稻分蘖期、孕穗期和灌浆期显著高于低密度稻虾处理；在水稻成熟期，2种稻虾处理的NH4+−N含量无显著差异。
2.3 基于水质指数的水质总体状况及主要因子
2.3.1 最小数据集
从测定的10个指标中选择合适的变量纳入MDS，并进行主成分分析，结果如表2所示。共得到4个特征值>1的主成分，占所有变量特征变化的72%以上。
表 2 水体指标的主成分分析结果Table 2. Principal component analysis results of water indexes指标1)
Index主成分 Principal component 范数值
Norm value公因子方差
CommunalityⅠ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 1 −0.361 0.553 −0.175 0.527 6.331 0.744 2 −0.061 −0.257 0.330 0.775 7.328 0.780 3 0.939 0.158 0.014 0.148 5.233 0.930 4 0.945 0.138 0.080 0.143 5.262 0.939 5 −0.649 0.487 0.278 0.019 5.254 0.736 6 0.271 0.602 0.191 −0.287 5.219 0.554 7 0.204 −0.042 0.787 0.009 6.265 0.663 8 −0.036 −0.811 −0.059 0.002 5.568 0.663 9 0.252 0.147 −0.657 0.205 5.686 0.559 特征值 Eigenvalue 2.511 1.696 1.314 1.046 占比/% Percent 27.903 18.847 14.599 11.619 累积占比/% Cumulative percent 27.903 46.749 61.348 72.967 1) 1：pH，2：溶解氧含量，3：电导率，4：溶解性总固体含量，5：总N含量，6：总P含量，7：NH4+−N含量，8：NO3-−N含量，9：化学需氧量。
1) 1: pH, 2: Dissolved oxygen content, 3: Electrical conductivity, 4: Total dissolved solid content, 5: Total N content, 6: Total P content, 7: NH4+-N content，8: NO3--N content, 9: Chemical oxygen demand.根据MDS的构建方法，从主成分Ⅰ~Ⅳ中挑选载荷值绝对值≥0.5，即具有高度加权的变量。在主成分Ⅰ中挑选出的指标为电导率、溶解性总固体含量和总N含量；在主成分Ⅱ中挑选出的指标为pH、总P含量和NO3−−N含量；在主成分Ⅲ中挑选出的指标为NH4+−N含量和化学需氧量；在主成分Ⅳ中挑选出的指标为pH和溶解氧含量。从这些指标中挑选出范数值在前10%的7个指标：电导率、溶解性总固体含量、总N含量、pH、NH4+−N含量、化学需氧量和溶解氧含量；再结合图2水体各指标间的相关性分析，去除相关性较高的指标(电导率和总N含量)后，最终得到5项MDS指标：溶解性总固体含量、pH、NH4+−N含量、化学需氧量和溶解氧含量(表3)，即这5项指标是导致田间水质变化的主要因素。
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图 2 水体各指标间的相关性分析1：pH，2：溶解氧含量，3：电导率，4：溶解性总固体含量，5：总N含量，6：总P含量，7：NH4+−N含量，8：NO3-−N含量，9：化学需氧量；“*”表示在P<0.05水平显著相关(Pearson法)。Figure 2. Correlation analysis among all water indexes1: pH, 2: Dissolved oxygen content, 3: Electrical conductivity, 4: Total dissolved solid content, 5: Total N content, 6: Total P content, 7: NH4+-N content，8: NO3−-N content, 9: Chemical oxygen demand; “*” indicates significant correlation at P<0.05 (Pearson method).表 3 最小数据集指标的公因子方差和权重Table 3. Communality and weight of indicators in minimal data set指标
Index公因子方差
Communality权重
Weight溶解性总固体含量
Total dissolved solid content0.939 0.255 pH 0.744 0.202 NH4+−N含量
NH4+-N content0.663 0.180 化学需氧量
Chemical oxygen demand0.559 0.152 溶解氧含量
Dissolved oxygen content0.780 0.212 2.3.2 基于综合水质指数评价法的水质变化特征
对3种模式在水稻不同生长时期的水体样品分别计算WQI，结果如图3所示。在前4个生长时期，所有处理的WQI均随水稻生长时期的推移呈下降趋势。在分蘖期，低密度稻虾处理虾沟水体的WQI最高，其次是水稻单作，低密度稻虾处理田面水体最低；在拔节期，高密度稻虾处理田面水体的WQI显著高于低密度稻虾处理田面水体和水稻单作；在孕穗期，高密度稻虾处理田面水体的WQI显著低于其他处理；在灌浆期，低密度稻虾处理的WQI整体高于高密度稻虾处理，但差异不显著；在成熟期，低密度稻虾处理虾沟水体的WQI达到0.72，显著高于高密度稻虾处理虾沟水体。
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图 3 不同处理以及水稻不同生长时期的水体质量分析RCL：低密度稻虾模式田面水体，RCL-G：低密度稻虾模式虾沟水体，RCH：高密度稻虾模式田面水体，RCH-G：高密度稻虾模式虾沟水体，RM：水稻单作模式田面水体；P1：分蘖期，P2：拔节期，P3：孕穗期，P4：扬花期，P5：灌浆期，P6：成熟期；柱子上方的不同小写字母表示相同生长时期不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。Figure 3. Analysis of water quality under different treatments and in different growth periods of riceRCL: Surface water of low density rice-red crayfish model, RCL-G: Ditch water of low density rice-red crayfish model, RCH: Surface water of high density rice-red crayfish model, RCH-G: Ditch water of high density rice-red crayfish model, RM: Surface water of rice monocropping model; P1: Tillering stage, P2: Jointing stage, P3: Booting stage, P4: Flowering stage, P5: Filling stage, P6: Ripening stage; Different lowercase letters above the columns indicate significant differences among different treatments in the same growth period (P<0.05, Duncan’s method).2.4 经济效益评价
2.4.1 水稻产量与产值
试验期间水稻的种植时间为2022年6月14日至10月12日，低密度稻虾、高密度稻虾和水稻单作的水稻产量分别为5.21、4.35和6.57 t·hm−2，产值分别为18 235、15 225和22 987元·hm−2；单作的水稻产量与产值较高，2种稻虾综合种养模式中低密度处理的水稻产量与产值较高(表4)。
表 4 3种处理的水稻产量与产值1)Table 4. Rice yield and output value in three treatments处理
Treatment有效穗数/(104·hm−2)
Number of
productive ears每穗总粒数
Total number of
grains per panicle结实率/%
Setting
percentage千粒质量/g
Thousand-seed
weight产量/
(t·hm−2)
Yield产值/(元·hm−2)
Output
valueLRC 212.2±2.7b 119.6±3.4a 80.1±0.9b 25.6±0.5b 5.21±0.03b 18 235±96b HRC 206.2±2.9c 108.3±5.2b 80.3±0.4b 24.3±0.4c 4.35±0.01c 15 225±82c R 230.6±4.4a 121.9±2.9a 85.1±0.3a 28.7±0.4a 6.57±0.20a 22 987±94a 1)LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾，R：水稻单作；水稻收购价格为3.5元·kg−1，水稻收购价格不考虑稻虾米溢价；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。
1)LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish, R: Rice monocropping; The rice procurement price is 3.5 yuan·kg−1, and its purchase price does not take into account the premium of rice-red crayfish; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method).2.4.2 红螯螯虾产量与产值
本研究于2022年7月10日开始投放虾苗，2022年10月9日起捕，连续捕捞2 d，养殖周期为91 d。低密度和高密度稻虾处理的虾产量分别为923和752 kg·hm−2，产出投入比分别为1.93和1.36，存活率分别为79.3%和51.8%。低密度养殖的红螯螯虾产量、产出投入比及存活率较高(表5)。
表 5 2种放养密度稻虾复合模式中红螯螯虾产量指标1)Table 5. Production index of red crayfish in rice-red crayfish integrated systems of two stocking densities处理
Treatment产量/(kg·hm−2)
Production产出投入比
Output-input ratio存活率/%
Survival rateLRC 923±8a 1.93±0.10a 79.3±0.2a HRC 752±8b 1.36±0.10b 51.8±0.3b 1)LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，t检验)。
1)LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between two treatments (P<0.05, t-test).2种稻虾复合模式产量与产值的统计结果如表6所示，低密度和高密度稻虾处理的红螯螯虾产值分别为90 575和73 356元 ·hm−2，大规格(中青、大青、炮头)红螯螯虾产量分别占总产量的96.3%和95.8%；低密度养殖的大规格红螯螯虾占比和红螯螯虾产值较高。
表 6 2种放养密度稻虾复合模式中红螯螯虾养殖产量及产值1)Table 6. Red crayfish production and output value in rice-red crayfish integrated systems of two stocking densities处理
Treatment产量/(kg·hm−2) Production 产量占比/% Production proportion 产值/
(元·hm−2)
Output
value小青
Small
green中青
Medium
green大青
Large
green炮头
Cannon
head小青
Small
green中青
Medium
green大青
Large
green炮头
Cannon
headLRC 34.5±2.6a 412.5±2.5a 270.0±3.5b 205.5±4.3a 3.7 44.7 29.3 22.3 90 575±102a HRC 31.5±3.5a 282.0±1.7b 310.5±4.1a 127.5±2.8b 4.2 37.5 41.3 17.0 73 356±139b 1) LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾；小青、中青、大青和炮头售价分别为64、85、100和128元·kg−1；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，t检验)。
1) LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish; Small green is priced at 64 yuan·kg−1, medium green 85 yuan·kg−1, large green 100 yuan·kg−1, cannon head 128 yuan kg−1; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between two treatments (P<0.05, t-test).2.4.3 经济效益分析
3种模式的经济效益分析如表7所示，除去成本，低密度、高密度稻虾和水稻单作的收益分别为73 672、49 866和6 983元·hm−2，低密度稻虾共作模式的收益更高。
表 7 3种处理的经济效益对比1)Table 7. Comparison of economic benefits of three treatments处理
Treatment秧苗成本/
(元·hm−2)
Seedling
cost化肥成本/
(元·hm−2)
Fertilizer
cost饲料成本/
(元·hm−2)
Feed
cost虾苗成本/
(元·hm−2)
Shrimp seed
cost人工成本/
(元·hm−2)
Labor
cost田地租金/
(元·hm−2)
Land
rent水稻产值/
(元·hm−2)
Rice
output虾产值/
(元·hm−2)
Red crayfish
output收益/
(元·hm−2)
ProfitLRC 500 2 920 3 578 9 000 10 140 9 000 18 235 90 575 73 672±198a HRC 500 2 920 4 155 12 000 10 140 9 000 15 225 73 356 49 866±221b R 500 3 504 3 000 9 000 22 987 6 983±94c 1) LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾，R：水稻单作；收益数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。
1) LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish, R: Rice monocropping; Different lowercase letters after the profit data indicate significant differences among treatments (P<0.05, Duncan’s method).3. 讨论与结论
3.1 讨论
研究表明，稻虾综合种养会对水体环境产生较大的影响[13-14]。在稻虾共作期间，稻田水位较浅会使得水体的理化因子更容易受到外界影响而发生变化，系统研究水体理化因子的动态变化，能够更全面地了解共作系统中的环境特征。本研究中，3种处理水体的多个指标间存在显著差异，表明小龙虾养殖对水体具有显著影响。温度是影响小龙虾生长发育的重要环境因子[15]。红螯螯虾生长的适宜水温为24~30 ℃，当温度超过35 ℃时，开始出现死亡[16]。本研究红螯螯虾的试验周期为7—10月，水体温度为23.3~34.7 ℃，基本符合虾的适应温度。水体pH是稻田生态系统中重要的非生物因素，可以通过直接或间接影响其他因素来影响水稻生长[17]。本研究中，随着水稻生长时期推移，3个处理的水体pH均呈现下降趋势，在低密度和高密度稻虾处理中有偏向酸性的变化，但在水稻成熟期回归了弱碱性，这可能与稻田的饲料投放有关[18]。王世会等[19]同样研究发现稻渔综合种养模式会导致水体pH下降。溶解氧对虾的生长发育具有重要促进作用[20]。本研究中，环沟中水体的溶解氧含量大多显著高于田面，这可能是由于虾沟中的气体交换相较田面更为便利，并且虾沟水体接收到更多的光照，使得浮游植物释放更多的氧气[21]。Bashir等[22]同样发现在稻渔综合种养模式中，环沟水体的溶解氧含量明显高于田间水体。这种相对较高的溶解氧水平为稻虾综合种养模式中虾类的代谢活动提供了更为适宜的生态条件，从而对虾的生长发育产生积极的影响[23]。
N、P作为动植物生长所需的必要营养元素，在维持农业生态系统健康和促进作物生长中发挥着至关重要的作用[24]。然而，当过度投入N、P时不仅会导致水体中N、P元素过量积聚及水质恶化，还可能造成水产品死亡[25]。本试验中，总N、NO3−−N含量均随水稻生长时期推移先下降后上升，这可能是因为水稻前期生长发育旺盛对N的吸收量较大，后期随着小龙虾的生长，投饵量逐渐增加，从而导致水体中N素累积，这与已往研究结果一致[14, 26]。水体总P含量随水稻生长时期先下降后上升再下降，稻虾处理水体总P的最大累积出现在水稻的灌浆期，且高密度稻虾处理显著高于低密度稻虾处理，这可能是因为此时临近小龙虾的收获期，开始加大饲料投喂，而高密度稻虾处理的饲料投喂量高于低密度稻虾处理，饲料在水体中有盈余，因此导致P素在水体中累积。化学需氧量是衡量水体中有机物质含量的指标，化学需氧量越大，说明水体受有机物污染越严重[27]。本研究中，3种处理的化学需氧量随水稻生长时期推移无大的波动，但在成熟期高密度稻虾处理的化学需氧量显著高于低密度稻虾处理，可能是因为此时接近龙虾养殖尾声，加大了饲料投放量，而高密度稻虾处理的龙虾存活率较低密度稻虾低，投入的饲料有盈余，导致高密度稻虾处理的化学需氧量升高。Li等[28]的研究也表明在稻虾综合种养系统中增加投饵量会导致水体化学需氧量显著上升。
水质评价是通过水体理化指标定量描述水体质量[29]，得到水体污染程度，为科学管理水体和防治水体污染提供理论依据[30]。本研究使用的综合水质指数分析法广泛应用于各种水体的质量评价[31-32]；但是目前以分析河流和湖泊等自然生态系统为主，分析农业养殖水体质量的研究较少。随着养殖业的迅速发展，对水质的要求日益提高，近年来，WQI开始用于养殖水体的综合水质评价[33]。本研究通过构建3种模式WQI的MDS，并进行比较与验证，发现溶解性总固体含量、pH、NH4+−N含量、化学需氧量和溶解氧含量这5项指标是导致田间水质变化的主要因素。2种稻虾模式虾沟内的水质在大多时期优于田面，这可能是由于虾的大部分活动在虾沟中，虾的活动会增加水体的溶解氧含量，水体中残余的养分也会被虾利用吸收。在水稻扬花期和灌浆期，整体上各处理间的WQI差异不大，而在水稻成熟期，低密度稻虾处理虾沟水体的WQI显著高于高密度稻虾处理虾沟水体，这可能是由于高密度模式的虾死亡率较高，投放的饵料有剩余，从而引起水质恶化。梁宇辉[34]研究得出相较于小龙虾池塘精养模式和水稻单作模式，稻虾种养模式能够有效降低水质污染风险、提高生态效益；与本研究结果相似。水稻单作模式中，在水稻灌浆期前，为了便于水稻晒田需要进行排水处理；稻虾模式中，在水稻成熟期，为了便于水稻的收割和虾的捕捞需要进行排水处理。在本研究中，2种稻虾模式水质整体优于水稻单作模式，且低密度稻虾处理水质为3种模式中最优。相较水稻单作模式，稻虾模式生态效益更好，降低养殖密度，给外环境带来的生态风险会更低。
稻渔综合种养从环境友好、高效增产、农民增收等方面推动了绿色农业的高效发展[35]。本研究以不同密度稻虾种养和水稻单作为研究主体，探讨了水稻产量与产值、红螯螯虾产量与产值、种养阶段经济效益的变化情况。研究结果表明，相较水稻单作，2种稻虾模式的水稻产量与产值有所下降，其中高密度模式下降更多。低密度稻虾处理的红螯螯虾产量、产出投入比、存活率均高于高密度稻虾，这可能是由于高密度处理的虾投入量过大，压缩了生长活动空间，加强了种内竞争，使虾存活率降低，最终导致红螯螯虾产量降低[36]。低密度稻虾处理的红螯螯虾产值高于高密度稻虾处理，这可能是由于低密度稻虾处理的虾产量较高，且炮头虾产量的占比较高。研究结果说明低密度稻虾处理的虾投放密度较合理，给虾提供足够的生长空间。王晨等[37]研究发现，水稻单作模式的生产成本显著低于稻鱼综合种养模式，但稻鱼综合种养模式的经济效益显著高于水稻单作模式；本研究结果也得到了类似的结论。通过对3种模式的经济效益进行对比，发现2种稻虾模式的收益显著高于水稻单作，提升6~9倍。这可能是因为在不需要过多增加成本的情况下，收获了额外的产品红螯螯虾，大大增加了收入。在2种稻虾处理中，低密度稻虾处理的经济效益是高密度稻虾的1.47倍，这主要是由于低密度稻虾处理中虾的产出投入比和存活率较高，导致其红螯螯虾产值显著高于高密度稻虾。因此，在稻虾综合种养模式中，选择合适的放养密度，有助于充分利用水体中的养分，防止过度竞争和资源浪费，以实现最佳的经济效益和环境效益。
3.2 结论
1)多个水体理化指标在不同处理和水稻不同生长时期间呈现显著差异。WQI和MDS分析表明：溶解性总固体含量、pH、NH4+−N含量、化学需氧量和溶解氧含量这5项水体理化指标是导致田间水质变化的主要因素。
2)在水稻成熟期，低密度稻虾综合种养模式的WQI显著高于高密度稻虾综合种养模式，且具有较高的经济效益；因此在稻虾综合种养模式中需选择合适的虾养殖密度，这对于提高稻田环境效益和经济效益均具有一定的意义。
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图 3 pH对DJ1菌株降解土霉素的影响
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 3. Effect of pH on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1
Different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
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图 4 接种温度对DJ1菌株降解土霉素的影响
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 4. Effect of incubation temperature on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1
Different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
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图 5 接种量对DJ1菌株降解土霉素的影响
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 5. Effect of inoculum size on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1
Different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
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图 6 装液量对DJ1菌株降解土霉素的影响
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 6. Effect of substrate volume on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1
Different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
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图 7 土霉素浓度对DJ1菌株降解土霉素的影响
柱子上方的不同小写字母差异表示显著(P<0.05，Duncan’s法)
Figure 7. Effect of oxytetracycline concentration on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1
Different lowercase letters on bars indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)
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