Codon usage bias of H9N2 avian influenza virus complete genomes and its influence factors
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摘要:目的
探究H9N2禽流感病毒(AIV)全基因组的密码子使用偏好性及影响因素。
方法选取2010—2018年国内H9N2 AIV流行毒株的全基因组为研究对象，分析其碱基组成特性、最优密码子、密码子使用偏好性的影响因素以及病毒对宿主密码子使用模式的适应性。
结果H9N2 AIV的全基因组中AU含量高于GC。大部分最优密码子以A或U结尾，有效密码子数(ENC)平均值为52.86，提示存在密码子使用偏好性但偏好性较低。密码子使用偏好性主要受到突变压力和自然选择的共同作用，其中自然选择(所占比例为61.79%~76.15%)作用大于突变压力(所占比例为23.85%~38.21%)。H9N2 AIV对人Homo sapiens的密码子适应指数平均值为0.739~0.741，提示H9N2 AIV禽流感病毒可能已适应人类的密码子使用模式。
结论本研究为H9N2 AIV的基因进化分析、已有疫苗的密码子优化和新型疫苗(密码子去优化疫苗)研制提供了理论依据。
Abstract:ObjectiveTo study codon usage bias of H9N2 avian influenza virus (AIV) complete genomes and its influence factors.
MethodThe complete genomes of Chinese epidemic H9N2 AIV strains from 2010 to 2018 were selected. The characteristics of base composition, optimal codons, influence factors of codon usage bias and adaption to the codon usage patterns of the host were analyzed.
ResultAU content was higher than GC content in the whole genomes of H9N2 AIV. Most of the optimal codons ended with A or U, and the average of effective number of codons (ENC) was 52.86, suggesting that codon usage bias existed, but the bias was low. The codon usage bias was mainly affected by mutation pressure and natural selection. Natural selection (accounting for 61.79%−76.15%) played a greater role than mutation pressure (accounting for 23.85%−38.21%). In addition, the average codon adaptation ind ex of H9N2 AIV to Homo sapiens ranged from 0.739 to 0.741, suggesting that H9N2 AIV might have adapted to human codon usage patterns.
ConclusionThe study provides a theoretical basis for genetic evolution analysis of H9N2 AIV, codon optimization of existing vaccines and development of new vaccines (codon deoptimization vaccine).
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Keywords:
- H9N2 avian influenza virus /
- codon usage bias /
- natural selection /
- mutation pressure
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柑橘黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性的病害，在柑橘生长的各个时期均可造成危害，引起柑橘植株新梢黄化、叶片斑驳、果实无法正常成熟、树势逐渐衰弱直至死亡等症状[1-2]。柑橘黄龙病主要通过带病苗木和柑橘木虱Diaphorina citri进行传播蔓延。目前柑橘黄龙病已经在50多个国家和地区发生危害，并造成了巨大的经济损失[3]。在我国随着柑橘产业的不断扩大，黄龙病呈现出老病区为害日益加重，新病区不断蔓延的态势。虽然黄龙病病原目前还无法人工培养，不能进一步完成柯赫式法则，但目前的大量研究表明，柑橘黄龙病是由候选韧皮部杆菌“Candidatus Liberibacter spp.”引起的[4-5]。由于黄龙病菌尚未能进行人工培养，很难从形态学、生物学、病原学等方面对黄龙病菌进行深入研究。随着DNA测序技术的不断发展，尤其是新一代测序技术的逐渐成熟，基因组学为柑橘黄龙病菌的研究提供了新的方法和思路。全基因组提供了一些与病原生物学特性、致病性等方面相关的基因信息，为研究植物病原细菌的新陈代谢、基因功能等提供依据。前期研究表明，黄龙病菌在感病植株体内浓度较低且分布不均匀，导致较难获得高质量的病原DNA[6]。因此，高浓度病原材料的获取成为得到高质量黄龙病基因组序列的前提。本文将从柑橘黄龙病的研究概况、黄龙病菌全基因组测序策略、基因组的特征描述以及病原基因组学的应用等方面进行系统综述。
1. 柑橘黄龙病的研究概况
早在19世纪初，Reinking[7]在调查广东珠三角作物病虫害时就发现了柑橘上类似黄龙病典型的斑驳、黄化症状，人们普遍以此作为柑橘黄龙病在我国最早记录的证据。此外，在东南亚的部分国家(如：菲律宾、印度、泰国、印度尼西亚等)以及南非等国先后发现了柑橘黄龙病[2]，但是不同地区对该病的命名并不一致，如在我国大陆称为黄龙病或黄梢病(Yellow shoot disease)[1, 8]，在台湾称为立枯病(Likubing)，在印度尼西亚称之为叶脉韧皮部恶化病(Vein phloem degeneration)，在菲律宾称之为叶斑病(Leaf mottle)，在印度称之为梢枯病(Dieback)，在南非则称之为青果病(Citrus greening)。鉴于我国林孔湘教授在柑橘黄龙病研究所做的卓越贡献，1995年在第13届国际柑橘病毒学家会议上，与会学者一致同意将其提出的柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)作为该病害的正式学名。
柑橘黄龙病菌可侵染几乎所有柑橘属的栽培品种，在柑橘生长的各个时期，从几个月的苗木至数十年的老树均能感染。黄龙病典型症状包括新梢黄化、叶片斑驳、“红鼻子果”等，其症状受寄主的树龄、品种及环境因素影响，而且容易与缺素症状相混淆[9]。PCR检测结果表明，斑驳型黄化、“红鼻果”等症状的黄龙病菌阳性检测率较高[10]。另外，利用草地菟丝子Cuscuta campestris可将黄龙病菌从柑橘植株传至草本寄主长春花Catharanthus roseus，并在菟丝子和长春花植株体内进行大量增殖[11-12]。因此，菟丝子及长春花适宜作为黄龙病菌的研究材料。
柑橘黄龙病病原的认识经历了非常曲折复杂的过程，曾被认为是由水害、缺素或镰刀菌引起[1-2]。直到1956年林孔湘[1]通过病芽嫁接试验，证明了该病可通过接种传染，确定柑橘黄龙病是一种传染性病害。但由于当时认识水平有限，曾认为该病原是由病毒引起[2]。随着电子显微技术的发展，多个国家的研究者在感染黄龙病植株的筛管组织内观察到类菌原体(Mycoplasma-like organisma, MLOs)，并认为类菌原体与黄龙病相关[2, 13]。Bové等[14]通过青霉素处理能够抑制病树发病，推测该病原为细菌。Garnier等[15]发现该病原不能通过25 nm口径的滤膜，并发现在细胞质膜外可能还存在有一层细胞壁，提出该病原可能属于革兰阴性菌。
随着PCR与DNA测序技术的发展，分子检测技术逐渐应用于黄龙病的研究。Jagoueix等[4]通过细菌的16S rRNA基因通用引物扩增柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种的16S rRNA基因片段，对克隆片段进行测序，并与GenBank数据库进行比对，证实了黄龙病菌归属于原核生物门Proteobacter α变形菌纲Alphaproteobacteriacea根瘤菌目Rhizobiales根瘤菌科Rhizobiacea的候选韧皮部杆菌属Candidatus Liberibacter spp.。根据病原菌的分布、对热的敏感性、传播媒介的种类以及16S rDNA序列的特异性，将柑橘黄龙病菌分为3个种，包括：亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”, CLas)、非洲种(“Candidatus Liberibacter africanus”, CLaf)以及美洲种(“Candidatus Liberibacter americanus”, CLam)[3]。亚洲种目前分布最广、为害最严重，分布的范围包括了亚洲、南美洲以及北美洲的国家和地区，非洲种主要分布在南非等一些非洲国家，美洲种则主要在巴西[3]。邓晓玲等[16]和田亚南等[17]通过对我国柑橘黄龙样品进行16S rRNA基因的扩增以及测序分析，证实了我国柑橘黄龙病菌均属于亚洲种。
2. 柑橘黄龙病菌全基因组的测序策略
与可分离培养的微生物不同，黄龙病菌在进行基因组测序时所用的DNA样本混杂大量寄主DNA，导致测序得到的数据中含有大量的寄主序列，增加了序列拼接和获得高质量黄龙病菌基因组的难度。综合目前已发表黄龙病菌基因组的测序策略，主要可分为以下3步：高浓度黄龙病菌材料的获取；高通量测序；黄龙病菌全基因组的拼接。
2.1 高浓度黄龙病菌材料的获取
根据NCBI Genome数据库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)，截至2019年4月已完成测序的黄龙病菌株共有18个(表1)，其中8个为完整基因组水平，10个为不完整的Contig水平。
表 1 柑橘黄龙病菌基因组的基本信息1)Table 1. Basic information of sequenced Candidatus Liberibacter genomes编号2)
No.年份
Year菌株
Strain寄主
Host来源地区
Original region基因组大小/Mb
Genome size基因组完整性 genome GC含量/%
GC content预测基因数3)
Number of predicted genes测序深度
Coverage1 2009 psy62[18] 柑橘木虱 美国佛罗里达州 1.23 完整 36.5 1 186 16 x 2 2013 Gxpsy[19] 柑橘木虱 中国广西 1.27 完整 36.5 1 141 50~80 x 3 2014 A4[20] 柑橘 中国广东 1.21 完整 36.4 1 122 138 x 4 2014 HHCA[21] 柠檬 美国加州 1.15 不完整 36.5 1 131 6 x 5 2014 Ishi-1[22] 未确定 日本 1.19 完整 36.3 1 078 300 x 6 2015 FL17[23] 未确定 美国佛罗里达州 1.23 不完整 36.5 1 116 50 x 7 2015 YCPsy[24] 柑橘木虱 中国广东 1.23 不完整 36.5 1 125 1 120 x 8 2015 SGCA5[25] 橘树 美国加州 1.20 不完整 36.4 1 114 12 x 9 2017 TX2351[26] 柑橘木虱 美国德克萨斯州 1.25 不完整 36.5 1 184 7 x 10 2017 JXGC[27] 未确定 中国江西 1.23 完整 36.4 1 120 95 x 11 2018 AHCA1[28] 柑橘木虱 美国加州 1.23 完整 36.6 1 112 69 x 12 2018 SGCA1[28] 橘树 美国加州 0.23 不完整 36.3 506 1 x 13 2018 TX1712[29] 橙 美国德克萨斯州 1.20 不完整 36.4 NF 10 x 14 2018 SGpsy[28] 柑橘木虱 美国加州 0.77 不完整 36.3 NF 2 x 15 2018 YNJS7C[30] 未确定 中国云南 1.26 不完整 36.6 1 158 15 x 16 2013 PW_SP[31] 长春花 巴西圣保罗 1.18 不完整 31.1 1 006 18.6 x 17 2014 São Paulo[32] 长春花 巴西圣保罗 1.20 完整 31.1 1 028 > 100 x 18 2015 PTSAPSY[33] 南非木虱 南非比勒陀利亚 1.19 完整 34.5 1 103 60~80 x 1) 信息收集时间为2019−04−11；2) 1~15为亚洲种，16、17为美洲种，18为非洲种；3) NF表示NCBI基因组数据库未提供
1) Information was collected at 11th, April 2019; 2) 1−15:“Candidatus Liberibacter asiaticus”, 16, 17:“Candidatus Liberibacter americanus”, 18:“Candidatus Liberibacter africanus”, 3) NF represents none information found in NCBI genome database用于测序的样本材料按寄主类型可分为植物材料和柑橘木虱材料，其中最早完成测序的是来自佛罗里达柑橘木虱的Psy62菌株[18]，同样为柑橘木虱来源的菌株有gxpsy、PTSAPSY、Ishi-1、TX2351和SGpsy。而植物寄主来源包括来源于长春花寄主的A4、São Paulo和PW_SP菌株及来源于柑橘寄主的HHCA、FL17、SGCA5、JXGC、AHCA1、SGCA1、TX1712和YNJS7C菌株。目前已发表基因组中黄龙病菌的测序深度(Coverage)最高的为柑橘木虱来源的YCPsy菌株(1 120 x)，且第1个完成测序的Psy62菌株同样来源于含有高浓度病原的柑橘木虱样品，说明黄龙病菌能在柑橘木虱体内大量富集，因此可得到含有较高病菌浓度的总DNA。但大量的田间数据表明，相比于感病柑橘植株，田间柑橘木虱的带菌率普遍较低[34]。因此，在适宜条件下，可采取人工饲养柑橘木虱若虫以获取含有高浓度黄龙病菌的柑橘木虱作为基因组测序材料[35]。
植物寄主材料方面，田间感染黄龙病的柑橘植株体内黄龙病菌分布不均匀，且病菌浓度随季节性变化较大。通常DNA提取后得到的样品包含寄主植物DNA、线粒体DNA以及叶绿体DNA，而柑橘黄龙病菌DNA所占的比例较低[6]。因此，为获得含有高浓度黄龙病菌的植物寄主材料，可通过适当的方法对黄龙病菌进行富集。草地菟丝子和长春花是黄龙病菌富集最常用的2种寄主材料。早期的研究发现通过草地菟丝子可成功将柑橘黄龙病菌从柑橘传至长春花[11-12]，且黄龙病菌能在长春花上进行一定程度的富集[11]。目前已发表的基因组中，亚洲种A4菌株、美洲种São Paulo和PW_SP菌株均为经长春花富集后测序得到。此外，Zhang等[36]通过从含有CLas的菟丝子材料进行测序得到了CLas UF506菌株，并报道了和CLas相关的2种噬菌体：SC1和SC2。
在保证测序深度和准确度的前提下，黄龙病菌的浓度越高，测序得到的黄龙病菌的序列也越多，拼接得到的基因组质量越高。但部分样品由于其特殊性与局限性，未能通过媒介植物或媒介昆虫的途径进行富集。HHCA菌株和SGCA5菌株分别来自加州2012和2015年发现的黄龙病病树，上述病树第一时间确诊为黄龙病后已被挖除，无法通过媒介介导对其病原进行富集。针对上述类似的特殊样品，Zheng等[20]提出通过微生物DNA富集与放大相结合的策略来提高总DNA中黄龙病菌DNA的比例，从而提高测序结果中黄龙病菌序列的比例。但该方法仅能除去部分含有甲基化的寄主DNA，而无法去除无甲基化的寄主DNA及叶绿体和线粒体DNA[37]。
2.2 高通量测序
用于获得黄龙病菌基因组序列的测序方法随着该领域技术的发展而更新。最早完成测序的CLas Psy62菌株和CLam São Paulo菌株采用454焦磷酸测序。随着测序技术的不断发展，测序的深度和准确性不断提高。随后黄龙病菌菌株的测序则主要以Illumina HiSeq和MiSeq测序平台为主，包括Illumina HiSeq 2000 (gxpsy、PW_SP、Ishi-1、PTSAPSY、AHCA1)、Illumina Hiseq X Ten(JXGC、YNJS7C)和Illumina MiSeq(A4、HHCA、FL17、YCPsy、SGCA5、SGCA1、SGpsy、TX2351、TX1712)。
2.3 柑橘黄龙病菌全基因组的拼接与验证
柑橘黄龙病样本测序得到的数据大部分是寄主DNA序列，仅有部分为黄龙病菌的DNA序列，使得基因组拼接存在一定的难度和局限性。目前在黄龙病菌基因组序列拼接上最常用的2种方法是基于参考基因组的拼接(Reference-based mapping assembly)和从头拼接(de novo assembly)。已发表的黄龙病菌基因组序列大部分是通过短片段文库(150~300 bp)的二代测序(454/Illumina)结合以首次发表的Psy62菌株基因组为参考基因组进行Mapping拼接所得到，如A4、Ishi-1、gxpsy等。但作为参考基因组的Psy62菌株来源于美国柑橘木虱样品，与我国的黄龙病菌存在一定差异[38]，会影响序列拼接的准确性，也限制了发现新序列的可能性。因此，不依赖于参考基因组的从头拼接也成为了黄龙病菌基因组拼接常用的方法。通过从头拼接的方法，Zheng等[27]从来自我国江西的JXGC菌株中鉴定出了1种与CLas相关的第3种类型(Type Ⅲ)原噬菌体，与先前报道的SC1和SC2原噬菌体存在一定的差异。但由于黄龙病菌目前还无法分离培养，在从头拼接的过程中，由于黄龙病菌与寄主叶绿体序列间或其他的内生微生物序列间存在部分相似性，不同来源的序列由于相似性而拼接形成嵌合序列，从而导致从头拼接得到的序列具有偏差。因此，从头拼接得到的Contig需要进一步通过Blast和PCR结合Sanger测序进行验证，以排除嵌合体Contig的干扰，从而提高基因组的质量。此外，对于部分病原浓度较低的样本，从头拼接很难达到理想的拼接效果，而基于参考基因组的拼接方法则可尽可能从低浓度病原样本中提取出相关的序列[21]。上述2种拼接方法各有优缺点，实际拼接过程应当根据样本具体情况选择合适方法进行拼接，目前针对黄龙病菌序列拼接策略更多的是结合从头拼接和基于参考基因组的拼接方法进行互补，从而得到最终的基因组序列。
在黄龙病基因组拼接软件使用方面，常用的从头拼接组装软件包括Velvet(Guangxi-1、PW_SP、PTSAPSY)、Newbler(São Paulo)、CLC Genomics Workbench(A4)和Bowtie(SGCA5)，菌株HHCA reads通过Velvet[39]和CLC Genomics Workbench软件同时分析，菌株YCPsy reads采用Velvet和Bowtie[40]组装，菌株Ishi-1 reads通过BWA[41]和Bowtie软件组装。针对黄龙病菌基因组的拼接，目前暂没有系统的研究表明通过软件的选择可以进一步提高黄龙病菌基因组拼接的质量。因此，提高黄龙病菌基因组的质量，最重要的是要选择含有高浓度病原或含有高比例病原DNA的样本进行测序。
3. 柑橘黄龙病菌基因组的特征描述
3.1 黄龙病菌基因组的生物学信息
黄龙病菌基因组大小约为1.26 Mb，GC含量约为36.5%。Duan等[18]通过全基因组序列分析发现，相比于根瘤菌目下的其他细菌，柑橘黄龙病菌的基因组严重减小。这种短小的基因组很可能与黄龙病菌所处的细胞内生存环境有关[42]。同时，其他植物病原细菌常见的许多致病基因(如Type Ⅲ分泌系统)也还未在黄龙病菌基因组中发现。
基因组注释结果表明柑橘黄龙病菌基因组中约含有1 233个蛋白，分析发现柑橘黄龙病菌缺乏编码毒素或特殊分泌系统的基因。柑橘黄龙病菌基因组中还缺乏编码某些重要氨基酸的基因，比如组氨酸、色氨酸、硫胺素、苯丙氨酸和酪氨酸等，因此必须从寄主细胞中获取，加重了寄主的负担[18]。基因组序列分析还发现柑橘黄龙病菌缺乏2–酮–3–脱氧–6–磷酸葡糖酸(KDPG)裂解途径，推测糖酵解可能是柑橘黄龙病菌的主要代谢途径。柑橘黄龙病菌能够利用葡萄糖、果糖、木酮糖，但无法分解利用甘露糖、半乳糖、鼠李糖、纤维素等糖类物质[18, 43]。除了葡萄糖–6–磷酸异构酶，柑橘黄龙病菌基因组含有一套相对完整的糖酵解途径相关酶，但缺乏葡萄糖磷酸转移酶系统。
基因功能预测还表明，柑橘黄龙病菌基因组含有一套完整的三羧酸循环(TCA)所需的酶，但是缺乏用于直接形成丙酮酸的酶，如丝氨酸脱水酶、丙氨酸消旋酶和丙氨酸脱氢酶。推测柑橘黄龙病菌通过葡萄糖和TCA中间体转化成丙酮酸，进而为柑橘黄龙病菌的生存提供绝大部分的丙酮酸。同时，基因组还缺乏乙醛酸循环所需的酶，如异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶，这表明柑橘黄龙病菌不能在乙酸盐或脂肪酸环境生长。根据柑橘黄龙病菌碳水化合物代谢循环途径可以看出柑橘黄龙病菌可以通过使用外源的延胡索酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐和天冬氨酸盐用于TCA循环和丙酮酸生成的碳底物和能源。同时，柑橘黄龙病菌基因组还发现了C4二羧酸转运蛋白基因，进一步证实了上述的推测[43]。
基因组的分析还表明，柑橘黄龙病菌存在能够在微需氧生长条件下将电子从还原底物转移至氧的呼吸链。柑橘黄龙病菌可以使用苹果酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、天冬氨酸盐和谷氨酸盐作为碳源，主要是因为利用这些化合物的酶在柑橘黄龙病菌基因组中均存在[43]。此外，在柑橘黄龙病菌基因组中还存在1个重要的参与有氧呼吸的化合物——NADH脱氢酶复合物的基因，但是缺乏用于甲基萘醌类化合物和辅酶Q生物合成的基因。因此，柑橘黄龙病菌要实现呼吸链的功能，可能需要使用外源醌[43]。由于柑橘黄龙病菌基因组缺乏硝酸盐、硫酸盐、延胡索酸盐和三甲胺还原酶系统，柑橘黄龙病菌可能无法在厌氧条件下生存[18, 43]。Duan等[18]推测柑橘黄龙病菌可能存在厌氧呼吸的情况，因为柑橘黄龙病菌基因组存在参与氮代谢的相关酶，如NAD +合酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶。但是，在涉及氮代谢的酶和厌氧呼吸链的电子受体之间存在明显的区别，在厌氧情况下，并未发现任何电子受体使用氮，特别是硝酸盐或亚硝酸盐还原酶，在没有这些电子受体的情况下，很难使呼吸链与氮化合物的还原相结合。此外，其他2种同样感染植物韧皮部的微生物，螺原体Spiroplasma citri和沙雷氏菌Serratia marcescens，两者都是兼性厌氧细菌，只有在有氧存在时才能通过有氧呼吸产生ATP[44-45]。另外，有研究表明韧皮部中确实存在氧，虽然韧皮部中的氧含量低于大气中的氧含量，但足够柑橘黄龙病菌进行有氧呼吸[46]。
3.2 柑橘黄龙病菌相关原噬菌体的研究
柑橘黄龙病菌基因组结构的分析表明，该基因组由保守的染色体区域序列和高变异的原噬菌体序列组成，而原噬菌体区域的变异主要表现为噬菌体类型的差异[27, 36]。Villechanoux等[47]首次鉴定了柑橘黄龙病菌相关的一段噬菌体DNA序列，柑橘黄龙病菌全基因组序列公布后，又进一步揭示了基因组中相关噬菌体的信息。Duan等[18]在首次报道的柑橘黄龙病菌株Psy62基因组鉴定了1个与噬菌体相关的区域，含有12个原噬菌体相关的基因。随后Zhou等[48]进一步证实了Psy62菌株含有2个柑橘黄龙病菌相关的原噬菌体FP1和FP2。Zhang等[36]通过电子显微镜观察到感染CLas的长春花韧皮部中的噬菌体粒子，并通过鸟枪法测序和fosmid DNA文库构建测序，成功获得了佛罗里达柑橘黄龙病菌株UF506的基因组，并在该菌株中鉴定了2个环状噬菌体基因组，SC1(Type Ⅰ类型)和SC2(Type Ⅱ类型)，其中SC1参与噬菌体的裂解循环，SC2参与溶原转化。基因功能注释发现在SC1和SC2中含有编码多个毒力因子的基因，这些基因的存在可能增加了柑橘黄龙病菌的致病性。SC1和SC2可编码过氧化物酶，用于抵御寄主植物产生的超氧游离基、过氧化氢和羟基自由基。同时，SC1和SC2还可编码黏附素，黏附素可能会促进柑橘木虱对柑橘黄龙病菌的传播[36]。随后报道的来自不同地区和寄主的柑橘黄龙病菌基因组序列中也先后发现了原噬菌体区域以及相关的噬菌体基因[19- 21, 23-25]。
除致病相关基因外，在黄龙病菌相关原噬菌体序列上还发现多个与噬菌体互作相关的位点，如CRISPR/Cas系统和限制-修饰(Restriction-modification，RM)系统。Zheng等[49]通过分析广东菌株A4基因组，发现在A4菌株的原噬菌体区域存在CRISPR位点。同时通过比对分析CRISPR位点附近基因的序列与基因注释信息，发现候选CRISPR位点附近具有多个与DNA和RNA进程相关功能的cas基因，表明A4菌株的原噬菌体区域携带具有结构和功能完整的CRISPR/Cas系统。进一步比对发现，在不同的柑橘黄龙病菌株中都含有CRISPR/Cas系统，而且CRISPR位点上的Spacer1和Spacer3序列基本一样，最大的变异区域是Spacer2序列。携带不同原噬菌体类型的柑橘黄龙病菌株具有各自特异的Spacer2序列。因此，Zheng等[49]结合我国南方柑橘黄龙病菌株中单个类型噬菌体占优势的结果，推测在1个柑橘黄龙病菌寄主细胞中，2种类型的噬菌体可能存在竞争关系，已经整合至黄龙病基因组的原噬菌体可能利用该CRISPR/Cas系统抵御另一种类型的噬菌体。此外，Zheng等[27]通过测序不含有Type Ⅰ和Type Ⅱ类型原噬菌体的JXGC菌株，发现在JXGC菌株中存在一段新的环形序列，经序列比对鉴定为1种新的原噬菌体P-JXGC-3(Type III类型)，与已报道的2类原噬菌体(SC1和SC2)序列存在较大的差异。Type Ⅲ类型原噬菌体P-JXGC-3除了和SC1/SC2原噬菌体约有50%的序列相似外，在P-JXGC-3原噬菌体序列上还携带有一个完整RM系统。RM系统的功能是细菌用来抵御外源噬菌体侵染，推测P-JXGC-3的主要功能可能是协助黄龙病菌抵御外来噬菌体的侵染。
4. 柑橘黄龙病菌基因组学的应用
4.1 黄龙病菌致病相关基因的功能分析
柑橘黄龙病菌能感染几乎所有的芸香科柑橘属植物，引起叶片斑驳黄化、果实畸形、树势衰弱、产量下降等。相比于其他的植物病原细菌，黄龙病菌的基因组相对较小，而且尚未发现许多常见的在其他植物病原细菌上存在的致病基因[18]。通过对基因组381个可能的致病基因在感病柑橘和带菌的柑橘木虱样本进行表达，比较分析后，发现182个基因在感病柑橘中的表达水平要显著高于柑橘木虱中的表达水平，这些基因涉及的功能有转录调控、转运系统、分泌系统、鞭毛合成、抗压等，推测这些基因很可能和黄龙病菌对寄主植物的致病性相关[50]。
大量的研究表明，植物病原细菌通过分泌系统产生一些致病因子，从而使寄主发病显症[51]。有研究通过分析基因组的分泌系统和效应子试图揭示黄龙病菌的致病机制，黄龙病菌含有Type I类型的分泌系统和一个完整的Sec分泌系统[18, 52]，但缺少其他常见的细菌分泌系统，如Ⅲ型分泌系统。Prasad等[52]通过基因组分析发现在CLas的所有蛋白中共预测到166个分泌蛋白含有末端信号肽(其中86个分泌蛋白经过验证)，表明这些蛋白可通过Sec分泌系统作用于寄主，推测可能是与黄龙病菌致病相关的效应子蛋白。基于上述研究，Clark等[53]通过选取CLas基因组保守的分泌蛋白SDE1作为分子探针，研究发现SDE1可直接与柑橘类木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶相互作用(PLCPs)并抑制蛋白酶活性。PLCPs蛋白是病菌诱导型蛋白，在黄龙病感染的柑橘植株内积累多，表明其在柑橘防御反应中起一定作用。而黄龙病菌的SDE1蛋白则通过抑制柑橘防御免疫相关蛋白酶PLCPs的活性，从而达到感染的目的。此外，Pitino等[54]通过在烟草中瞬时表达16个黄龙病菌效应子，发现其中Las5315 mp的效应子(与SDE1为同一效应子)可定位于植物寄主的叶绿体，诱导植株淀粉积累、叶片黄化和细胞死亡。
除效应子外，黄龙病菌细胞上的鞭毛蛋白和肽聚糖相关蛋白等也可能具有一定的致病性。Zou等[55]通过Psy62基因组与其他近缘细菌进行全基因组比较发现，Psy62菌株的基因组含有一套完整的鞭毛合成基因系统。随后Zou等[55]筛选了其中一个鞭毛蛋白(fla)进行功能验证，发现fla鞭毛蛋白具有类似病原体相关模式分子(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)活性，能诱导本生烟草Nicotiana benthamiana产生过敏性坏死反应。然而形态学研究并未观察到CLas细胞携带有鞭毛结构[56]。通过Gateway技术发现黄龙病菌细胞外膜的肽聚糖相关脂蛋白(Pal)基因可引起植物寄主的过敏性坏死反应，而外膜蛋白Mot基因及溶血素Hly基因无明显致病效应[57]。除细菌外膜直接与寄主接触外，黄龙病菌可编码多个ATP-binding cassette(ABC)转运体，其中Zn转运体与Zn高度亲和并将其摄入细胞内，与植物缺“锌”症状有关，且研究表明Zn转运体基因在感病叶片和根中均表达上调[58]。
此外，噬菌体可通过将自身DNA注射入细菌细胞，并整合至细菌基因组成为原噬菌体，从而使细菌获得噬菌体基因组上的致病基因。Fleites等[59]通过将黄龙病菌原噬菌体上的Holin基因(SC1_gp110)和2个细胞内溶素基因(SC1_gp035和CLIBASIA_04790)分别在大肠埃希菌和Liberibacter crescens 菌株BT-1上表达分析，发现上述3个基因在一定程度上抑制了大肠埃希菌和L. crescens的生长和媒介昆虫的取食等，进一步推测出柑橘黄龙病菌基因组原噬菌体可能具有限制柑橘黄龙病菌生长和寄主范围的潜在功能。Jain等[60]通过分析黄龙病菌原噬菌体上1个超氧化物酶基因SC2_gp095在不同寄主中的表达情况发现，在长春花中其表达量高于柑橘寄主，而在柑橘木虱中却被抑制表达。通过在大肠埃希菌和L. crescens系统中研究该基因功能发现含有基因SC2_gp095的细菌对过氧化氢的抗性能提高20%~25%。同时通过在植物中进行瞬时表达发现该基因严重抑制了寄主植物介导过氧化氢防御信号中关键基因的表达，进而引起症状的延缓表现，进一步解释了柑橘黄龙病菌从侵染柑橘到出现症状有时存在很长潜伏期的原因。
4.2 黄龙病菌基因组遗传多样性的研究
早期柑橘黄龙病菌多样性的研究通过使用单克隆抗体来进行，通过制备用于直接检测柑橘黄龙病菌的单克隆抗体，对采自不同地区的样品进行检测，结果发现，并不是所有的样品都能被检测到，说明部分柑橘黄龙病菌样品发生了变异[61-62]。
分子生物学的发展与应用推动了柑橘黄龙病菌遗传多样性的研究。早期用于黄龙病菌多样性分析的基因主要是基于保守的基因序列，如rrs、rpl、omp、rpoB以及16S rDNA序列等[63-72]，分析保守基因在不同来源菌株内的序列变异。基于16S rDNA序列和omp基因的SNPs分析，相比于印度西部地区的柑橘黄龙病菌株，来自印度东北地区的柑橘黄龙病菌株和来自日本、台湾以及越南的柑橘黄龙病菌株更相近[72]。Tomimura等[69]对来自日本的65个柑橘黄龙病菌株通过双重PCR同时扩增柑橘黄龙病菌基因组的DNA pol和nus-rplL操纵子区域，结果发现这些日本菌株至少含有2种不同的基因型。
自柑橘黄龙病菌全基因组发表之后，越来越多的变异位点被用于柑橘黄龙病菌的种群多样性分析，其中包括短串联重复序列、转座子位点以及高变异的噬菌体/原噬菌体区域。Chen等[38]鉴定了柑橘黄龙病菌基因组的一个含有短串联重复序列的噬菌体阻遏蛋白，并通过分析重复数量的变化，区分了中国柑橘黄龙病菌和佛罗里达柑橘黄龙病菌种群。该位点还进一步被用于分析中国南方种群[73]、印度种群[74]、佛罗里达种群[75]以及巴西种群[76]的多样性。Katoh等[77-78]通过分析柑橘黄龙病菌株Psy62的全基因组，鉴定了27个简单重复位点(Simple single repeats, SSRs), 并分析了这27个位点在不同菌株间的多样性，发现不同地区的菌株分组和它们各自的来源区域相关。许美容等[79]通过对黄龙病全基因组的短串联重复序列进行系统分析，结合中国的黄龙病样本筛选了33个高变异的SSR位点，其中20个变异较大的位点可作为分析不同地区黄龙病菌株间遗传多样性的候选位点。Wang等[80]分析了柑橘黄龙病菌基因组1个高变异的位点，并分析了该位点在262个柑橘黄龙病菌样品间的变异情况，总共得到8种PCR扩增电泳结果，其中来自中国的菌株主要是E-types A和B，而E-type G则主要在佛罗里达发现。
原噬菌体作为细菌基因组一个高变异的区域，主要是因其能通过溶原和溶菌循环将自身DNA序列不断整合到宿主细菌基因组，并随着寄主DNA复制而复制[81]。由于噬菌体序列的高度变异性，不同地区的柑橘黄龙病菌株中含有的噬菌体区域也会存在较大的变异。Zhou等[48]利用原噬菌体区域中一个高度变异的串联重复序列分析了来自不同国家柑橘黄龙病菌株的多样性，不同菌株间在该位点上的每个重复单元序列具有一定的保守性但是重复数量却有着很大的变异。通过该高变异的位点的多样性分析不仅能区分不同地区来源的柑橘黄龙病菌株，而且也可区分同一地区的不同样品。同时，Puttamuk等[82]利用同一个高变异位点对采自泰国的柑橘黄龙病菌种群进行了多样性分析，区分了泰国不同地区的菌株。Liu等[83]通过分析原噬菌体的末端酶基因的遗传变异，发现与广东柑橘黄龙病菌种群相比，我国云南柑橘黄龙病菌种群具有更高的基因频率，推测这2个不同海拔的柑橘黄龙病菌种群产生变异可能是遗传漂移的结果。此外，根据3种类型原噬菌体及其相应的组合对我国南方地区的柑橘黄龙病样品进行分类，可将我国柑橘黄龙病菌株分为3组Ⅰ组(广东、江西、广西、福建)、Ⅱ组(浙江和湖南)以及Ⅲ组(云南和海南)[84]。同时，基于黄龙病菌原噬菌体类型的分析发现美国加州2012和2015年发现的黄龙病菌携带有不同类型的原噬菌体，推测这2个菌株可能来源不同[85]。此外，Dai等[28]通过结合原噬菌体类型、短串联重复、微型反向重复转座元件等位点进一步分析了美国加州黄龙病菌种群的遗传多样性规律。
4.3 基因组学研究提高黄龙病菌分子检测的灵敏性
黄龙病菌的基因组学研究推动了病原分子检测的发展，尤其是筛选检测靶标与早期检测优化。由于目前还没有针对黄龙病的有效药剂和抗病品种，主要的防控措施还是以严格检疫、及时处理病树、种植无病苗木及防治传播媒介昆虫为主。因而，快速准确地对柑橘黄龙病进行早期诊断和检测是尽早采取防控措施的前提。目前柑橘黄龙病常用的分子检测方法包括常规PCR、巢式PCR以及实时荧光定量PCR，而实时荧光定量PCR因快速、简便、灵敏等优点成为近年来广泛用于柑橘黄龙病检测的分子技术。早期用于柑橘黄龙病分子检测的目的基因主要是一些保守的看家基因，如16S rRNA基因、β-操纵子(rplKAJL-rpoBC)和外膜蛋白基因(omp)[6, 16, 86-88]。Li等[6]通过比对亚洲种、非洲种和美洲种16S rRNA基因序列差异，分别设计了几种特异的实时荧光引物和探针，该系列引物目前广泛应用于柑橘黄龙病的检疫检测。
随着全基因组序列的发布，越来越多的基因位点被用作检测的靶标。Kogenaru等[89]通过分析亚洲种全基因组序列，鉴定亚洲种特有的基因，并设计特异引物，得到18对可用于特异检测亚洲种的实时荧光定量PCR引物。
为了提高检测的灵敏性，在基因组的高拷贝基因位点设计引物也成为近年来黄龙病检测的一大研究方向。Morgan等[90]在柑橘黄龙病菌基因组原噬菌体区域上的一段高拷贝的短串联重复序列设计实时荧光PCR引物(LJ900f/LJ900r)，并通过SYBR Green I和TaqMan进行病原检测，采自美国佛罗里达州的大部分样品里都表现出很高的灵敏性。但是该方法存在一定的缺陷，柑橘黄龙病菌基因组的原噬菌体存在较大变异[48]，而且有研究报道了不存在原噬菌体区域的柑橘黄龙病菌株[31]。Zheng等[91]通过基于基因组高拷贝的5个保守基因(nrdB)设计的RNRf/RNRr引物，能比目前常用的其他检测引物的灵敏性高约3倍左右，该引物为目前黄龙病检测较为常用的引物。
5. 展望
基因组学研究突破了黄龙病菌难培养造成的研究瓶颈，极大地推动了柑橘黄龙病的研究。近年来，柑橘黄龙病菌基因组学在病原描述、病原遗传多样性、致病机制、病原–寄主互作及分子检测靶标筛选等研究方面取得了一定的进展，但黄龙病菌不能培养的现状在一定程度上阻碍了基因组学的研究，含有高浓度的柑橘黄龙病菌DNA的样品依然是获得高质量基因组序列的前提。虽然有研究报道成功培养了黄龙病菌[92]，但试验无法重复。因此，今后在黄龙病菌基因组测序材料选择上除了要突破黄龙病菌培养的困难外，仍需要探索高浓度的病原材料，如高效的黄龙病菌富集方法。同时，也可通过选用合适的植物寄主材料进行黄龙病菌的培养，尽可能提高黄龙病菌的浓度以获取高质量的基因组序列。
纵观已报道的黄龙病菌基因组序列，均是采用基于短片段测序文库的二代测序完成，而且绝大部分菌株基因组序列是通过以已发表的基因组(如Psy62等)为参考进行拼接得到，极大地限制了新序列获取的可能。短片段测序得到的reads长度通常为150~300 bp，在序列拼接(从头拼接)过程中如遇到基因组的重复区域超过测序读长就很难继续，需要借助参考基因组来完成，因此很难对黄龙病菌的基因组结构进行研究。同时由于黄龙病菌基因组的16 S rRNA基因区域和寄主植物的叶绿体相应序列相似性较高，原本属于黄龙病菌的短片段reads在一定比对参数下，也可map到叶绿体上，反之亦然。黄龙病菌的测序可通过提高测序reads的长度来解决上述问题。例如，使用Pacbio或Nanopore测序平台进行长片段测序以获取黄龙病菌较长序列片段来实现重复区域的测序与基因组结构的分析。但无论选用何种测序平台，最重要的前提仍是要获取高浓度黄龙病菌材料。
从已发表的柑橘黄龙病菌基因组数量来看，远无法反映当前我国乃至世界黄龙病菌种群的特征。通过对我国不同发病地区及世界上其他黄龙病流行地区的菌株进行测序，不仅能更全面地描述不同地区黄龙病菌的基因组信息，而且通过基因组间的比较分析可进一步明确不同地区菌株的差异与共性，为研究黄龙病菌的起源、进化、变异等提供重要依据。针对不同菌株间基因组的比较分析可进一步筛选出关键的靶标基因(如与致病性和细菌生存相关的基因)，用于进一步筛选药剂防治靶标及分析黄龙病菌的致病机理，为柑橘黄龙病的防控提供理论基础。
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图 1 不同年份H9N2禽流感病毒的有效密码子数绘图分析
Figure 1. Plot analysis of effective number of codons of H9N2 avian influenza virus in different years
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图 2 不同年份H9N2禽流感病毒的PR2绘图分析
下标“3”代表密码子第3位
Figure 2. PR2 plot analysis of H9N2 avian influenza virus in different years
The subscripted “3” indicates the 3rd place of codon
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图 3 不同年份H9N2禽流感病毒的对应性分析
Figure 3. Correspondence analysis of H9N2 avian influenza virus in different years
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图 4 不同年份H9N2禽流感病毒的中性绘图分析
Figure 4. Neutrality plot analysis of H9N2 avian influenza virus in different years
表 1 H9N2禽流感病毒基因组的碱基组成分析1)
Table 1 Base composition analysis of H9N2 avian influenza virus genomes
% 碱基2) Base 年份 Year 2010—2012 2013—2015 2016—2018 A 32.92±0.09 32.92±0.10 33.03±0.08 C 19.49±0.09 19.48±0.07 19.41±0.09 U 22.89±0.09 22.88±0.10 22.90±0.10 G 24.71±0.15 24.72±0.13 24.65±0.11 GC 44.19±0.16 44.20±0.15 44.07±0.14 A3S 41.42±0.52 41.48±0.79 41.80±0.54 C3S 26.57±0.86 26.51±1.05 26.73±0.70 U3S 30.95±0.60 30.83±1.48 30.76±1.07 G3S 28.08±0.49 28.11±0.98 27.74±1.24 GC3S 42.06±0.58 42.07±0.69 41.93±0.73 1)表中数据为平均值±标准差；2)下标“3S”代表同义密码子第3位
1)The datum in the table is average ± standard deviation; 2) The subscripted “3S” indicates the 3rd place of synonymous codon
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表 2 H9N2禽流感病毒基因组的最优密码子分析
Table 2 Optimal codon analysis of H9N2 avian influenza virus genomes
氨基酸
Amino acid密码子1)
Codon同义密码子相对使用度
Relative synonymous codon usage氨基酸
Amino acid密码子1)
Codon同义密码子相对使用度
Relative synonymous codon usage高表达组
High expression group低表达组
Low expression group高表达组
High expression group低表达组
Low expression groupAla GCT* 1.130 0.957 Phe TTT* 0.960 0.817 GCC* 0.884 0.730 TTC 1.040 1.184 GCA 1.610 1.972 Leu TTA 0.680 0.571 GCG 0.376 0.340 TTG 1.330 1.164 Arg AGA 2.386 2.875 CTT 1.162 1.081 AGG 1.782 1.707 CTC 0.948 0.912 CGT* 0.278 0.226 CTA 0.877 1.065 CGC 0.290 0.277 CTG 1.002 1.208 CGA* 0.834 0.462 Lys AAA 1.076 1.129 CGG 0.431 0.453 AAG 0.924 0.872 Asn AAT 1.139 1.122 Pro CCT 1.098 1.120 AAC 0.862 0.878 CCC 0.880 0.703 Asp GAT* 1.181 1.076 CCA 1.488 1.612 GAC 0.819 0.924 CCG 0.535 0.564 Cys TGT 0.938 0.885 Ser AGT 1.189 1.141 TGC 1.062 1.115 AGC 1.193 1.117 Gln CAA 1.149 1.095 TCT 1.059 1.153 CAG 0.851 0.905 TCC 0.782 0.802 Glu GAA 1.206 1.206 TCA 1.340 1.428 GAG 0.794 0.794 TCG 0.436 0.360 Gly GGT* 0.711 0.580 Thr ACT 1.040 0.908 GGC* 0.735 0.559 ACC 0.902 0.863 GGA 1.744 1.759 ACA 1.656 1.862 GGG 0.810 1.103 ACG 0.402 0.367 His CAT 1.243 1.259 Tyr TAT 1.176 1.170 CAC 0.757 0.741 TAC 0.824 0.830 Ile ATT 1.162 1.129 Val GTT* 1.037 0.915 ATC 0.876 0.813 GTC 0.876 0.852 ATA 0.962 1.058 GTA* 0.836 0.716 GTG 1.250 1.517 1)“*”表示高表达组的同义密码子相对使用度显著高于低表达组且差异≥0.08(P <0.01， t检验)
1)“*” indicates relative synonymous codon usage of high expression group is significantly higher than that of low expression group and the difference is equal or higher than 0.08 (P<0.01,t test)
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表 3 前两主轴对应性分析及与密码子使用偏好性主要参数的相关性分析
Table 3 Correspondence analyses of the first two principle axes and correlation analyses between the first two principle axes and main parameters of codon usage bias
前两主轴
First two
principle axes对应性分析差异比例
Variation proportion of correspondence analysis相关性1) Correlation w(U3S) w(C3S) w(A3S) w(G3S) w(GC12) w(GC3S) w(GC) ENC 总平均亲水性
General average
hydropathicity芳香性
Aromaticity第1轴 Axis 1 34.65% 0.091 −0.348** 0.262* −0.014 0.340** −0.385** 0.510** 0.633** −0.533** −0.418** 第2轴 Axis 2 21.34% 0.471** 0.513** −0.181 −0.717** 0.295** −0.291** −0.234* 0.216** −0.233* 0.342** 1)“*”代表P<0.05, “**”代表P<0.01(Spearman相关性分析)；下标“3S”代表同义密码子第3位，下标“12”代表密码子第1、2位，“ENC”代表有效密码子数
1)“*”represents P<0.05, “**”representsP<0.01(Spearman’s rank correlation analysis); The subscripted “3S” indicates the 3rd place of synonymous codon, The subscripted “12” indicates the 1st and 2nd places of codon, “ENC” indicates effective number of codons
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表 4 H9N2 禽流感病毒基因组的密码子适应指数分析1)
Table 4 Codon adaptation index analysis of H9N2 avian influenza virus genomes
年份
Year有效密码子数
Effective number of codons密码子适应指数 Codon adaptation index 鸡 Gallus gallus 人 Homo sapiens 2010—2012 52.86±0.64 0.768±0.005(−0.731**) 0.740±0.004(−0.583**) 2013—2015 0.766±0.006(−0.386*) 0.739±0.005(−0.223) 2016—2018 0.768±0.004(−0.635**) 0.741±0.003(−0.409*) 1)表中数据为平均值±标准差；括号中数据为相关系数；“*”表示P<0.05, “**”表示P<0.01(Spearman相关性分析)
1) The datum in the table indicates average ± standard deviation; The datum in the bracket is correlation coefficient; “*” represents P<0.05, “**” representsP<0.01(Spearman’s rank correlation analysis)
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