Gene knockout of Tiki1 gene in rabbit by TALEN system
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摘要:目的
利用转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统获得Tiki1基因敲除的兔模型，为研究Tiki1对动物早期发育作用机理提供兔源的动物模型。
方法基于TALEN系统设计了靶向兔Tiki1基因的打靶载体，分别将10和50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到原核期的家兔受精卵胞质中，然后收集发育至囊胚期的胚胎，鉴定囊胚率和基因修饰效率，通过测序检验囊胚的基因突变。为了进一步获得Tiki1基因敲除兔，后续将50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到17个原核期的家兔受精卵胞质中，将受精卵分别移植到2只受体兔体内。
结果注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率（64%）与注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率（57%）差异不大，但注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率（100%）显著高于注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率（14.3%）。测序结果表明，Tiki1基因的突变范围从 1到28 bp缺失不等。经过胚胎移植共生出3只仔兔，其中有2只兔子能检测到基因突变。
结论所建立的TALEN技术体系可以对家兔Tiki1基因进行高效的敲除。
Abstract:ObjectiveTo obtain a rabbit model of Tiki1 gene knockout by the transcription activator-like effector nuclease (TALEN) system, and provide a rabbit model for investigating the mechanism of Tiki1 gene on early development of animals.
MethodUsing TALEN system, the target vector of rabbit Tiki1 gene was constructed and then 10 or 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA was injected into the cytoplasm of fertilized eggs at pronuclear stage. Embryos developed to blastocyst stage were collected. The blastocyst rate and gene modification efficiency were investigated. To further obtain Tiki1 knockout rabbits, 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA was subsequently injected into the cytoplasm of 17 prokaryotic fertilized eggs of rabbit, and then the fertilized eggs were transplanted into two recipient rabbits.
ResultThe blastocyst rate of the treatment group injected with 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA（64%) was almost the same as that of the group injected with 10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA(57%), while the blastocyst gene modification efficiency of the group injected with 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA(100%) was significantly higher than that of the group injected with 10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA (14.3%). The sequencing results showed that mutations of Tiki1 gene ranged from the deletion of 1 bp to 28 bp. A total of three rabbits were born after embryo transfer, and two of them were detected with genetic mutations.
ConclusionThe TALEN technology system established in this study could effectively knock out Tiki1 gene in rabbit.
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Keywords:
- rabbit /
- TALEN /
- Tiki1 gene /
- blastocyst /
- gene knockout /
- gene modification
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猪只的生长发育、繁殖效率及整体健康状况极大地受到猪舍环境因素的影响，如温度、湿度、二氧化碳浓度、氨气浓度等[1-4]。不适宜的环境条件不仅可能抑制猪只的生长发育与生产性能，还有可能导致健康问题的发生，增加疾病发生的概率，从而对养猪产业的经济效益及持续发展能力构成负面影响[5-6]。目前，猪舍环境的调控方法以模糊控制等基于模型的控制(Model-based control, MBC)算法为主[7-9]，这些方法依赖于预先构建的模糊推理系统，其构建过程需要深入的专业知识以及对特定领域规则的精细设计。然而，由于养殖模式多、气候条件复杂以及环境参数调整困难，致使准确地构建模型变得尤为困难[10-13]。
基于数据驱动的控制方法不依赖于预先构建的环境模型，而是仅需利用系统的离线或在线输入、输出数据。这种方法能够有效地解决在猪舍环境控制中遇到的建模困难的问题。常见的基于数据驱动的控制方法包括无模型自适应控制(Model-free adaptive control, MFAC)算法、神经网络控制以及迭代学习控制等。MFAC算法利用动态线性化技术和伪雅可比矩阵(Pseudo-jacobian matrix, PJM)，沿着闭环系统的动态操作点建立一系列等效的局部动态线性化数据模型，并利用最优化数学工具计算控制量，使得系统输出逐渐逼近期望值。由于该算法具有设计简单、自适应能力强、鲁棒性强等优点，它已应用于自动泊车[14]、无人机轨迹跟踪[15]、机器人控制[16]等多种控制场景。神经网络通过训练来近似表示复杂的非线性系统，其训练过程需要大量的数据和计算资源。在处理非常复杂的系统时，神经网络更具优势，但在数据有限或需要快速适应新环境时，MFAC更加有效。迭代学习控制通过迭代过程逐步改进控制性能，它适用于操作周期重复的系统，而MFAC适用于更广泛的场合，特别是在那些操作条件频繁变化的系统中。综上所述，MFAC算法更适用于猪舍环境控制。
由于MFAC算法主要适用于低耦合场景，而猪舍环境参数之间存在相互影响和耦合。本研究基于MFAC算法，融合用于尺度伸缩变换的权值矩阵，提出了多参数无模型自适应控制(Multi-parameter model-free adaptive control, MMFAC)算法，以增强算法处理耦合场景的适应性与精确度。
1. MMFAC控制算法设计
猪舍环境控制的参数涵盖温度、湿度以及有害气体(如二氧化碳和氨气)的浓度，而实施环境调节的调控装置包含但不限于通风系统、冷却装置以及加热设备。为便于算法描述，本研究以向量
$ {\boldsymbol{y}}(k) = {[{y_1}(k),{y_2}(k),\cdots ,{y_n}(k)]^{\rm T}} $ 表示猪舍内环境参数，向量中的元素分别对应温度、湿度等环境参数在第$k$ 采样时刻的测量值；以向量${\boldsymbol{u}}(k) = [ {u_1}(k),{u_2}(k),\cdots , {u_m}(k) ]^{\rm T}$ 表示通风装置、制冷装置等环境调控装置在第$k$ 时刻的控制量。前人的研究结果[17-19]表明，存在时变PJM——
${\boldsymbol{\varPhi }}(k)$ ，使得受控系统可以等效为如下紧格式动态线性化(Compact form dynamic linearization, CFDL)数据模型：$$ \Delta \boldsymbol{y}(k+1)\approx \boldsymbol{\varPhi }(k)\Delta \boldsymbol{u}(k)， $$ (1) 式中，
$$ \left\{ \begin{array}{l} \Delta \boldsymbol{y}(k+1)=\boldsymbol{y}(k+1)-\boldsymbol{y}(k)，\\ \Delta \boldsymbol{u}(k)=\boldsymbol{u}(k)-\boldsymbol{u}(k-1)。\end{array} \right. $$ (2) 根据式(1)和式(2)所示的CFDL数据模型，可以得到环境参数在下一采样时刻的预测输出值：
$$ \boldsymbol{y}(k+1)=\boldsymbol{y}(k)+\boldsymbol{\varPhi }(k)\Delta \boldsymbol{u}(k)。 $$ (3) 记向量
$ {{\boldsymbol{y}}^ * }(k) = {[y_1^ * (k),y_2^ * (k),\cdots ,y_n^ * (k)]^{\rm T}} $ 为环境参数在第$k$ 时刻的期望值，那么环境控制算法的设计目标是通过计算系统输入${\boldsymbol{u}}(k)$ ，使得${\boldsymbol{y}}(k + 1)$ 在${\boldsymbol{u}}(k)$ 的作用下，趋近于${{\boldsymbol{y}}^ * }(k + 1)$ 。这意味着，系统输入${\boldsymbol{u}}(k)$ 的计算问题是一个最优化问题，问题描述如式(4)所示。$$ \mathrm{min}\boldsymbol{ }{\Vert {\boldsymbol{y}}^{\ast }(k+1)-\boldsymbol{y}(k+1)\Vert }^{2}。 $$ (4) 对于未发生耦合现象的受控系统，可通过式(4)所示的最优化问题进行风机、制冷装置等执行机构的控制量的计算，以实现将所有环境参数调节至理想范围。然而，猪舍环境参数相互影响，呈现出系统耦合的特性。考虑到成本因素，部分养猪设施在其环境控制系统的设计中，可能未能配备完备的通风、冷却及加热装置，即缺乏充分的执行机构以实现系统的解耦。这一限制导致了控制系统无法同时将所有受控参数调节至理想范围。此时，环境调控算法在设计之初，需要确定哪些环境参数对猪只的生长性能等关键因素具有决定性影响，并将控制重点放在这些参数的精确调节上。
由于(4)式所示的最优化问题等价于：
$$ \min \displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {{{\left[ {{\boldsymbol{y}}_i^ * (k + 1) - {{\boldsymbol{y}}_i}(k + 1)} \right]}^2}}， $$ (5) 如果
$$ {\left[ {{\boldsymbol{y}}_i^ * (k + 1) - {{\boldsymbol{y}}_i}(k + 1)} \right]^2} \gg \displaystyle\sum\limits_{j = 1,j \ne i}^n {{{\left[ {{\boldsymbol{y}}_j^ * (k + 1) - {{\boldsymbol{y}}_j}(k + 1)} \right]}^2}}， $$ (6) 式中，符号
$ \gg $ 表示远大于。那么，通过(4)式计算得到的控制量${\boldsymbol{u}}(k)$ ，将优先降低索引$i$ 对应环数参数预测值与期望值之间的误差。因此，在猪舍环境控制系统发生耦合现象时，可以通过引入权值
${w_i}$ 增加索引$i$ 对应环境参数预测值与期望值之间的误差，从而保证索引$i$ 对应环境参数得到更精准的控制。此时，控制量的求解问题如(7)式所示。$$ \min \displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {{w_i}{{\left[ {{\boldsymbol{y}}_i^ * (k + 1) - {{\boldsymbol{y}}_i}(k + 1)} \right]}^2}} 。$$ (7) 通过将(7)式整理为矩阵形式，得到(8)式所示的MMFAC算法。
$$\begin{split} & \mathrm{min}\boldsymbol{ }{\left[{\boldsymbol{y}}^{\ast }(k+1)-\boldsymbol{y}(k+1)\right]}^{{\rm T}}\boldsymbol{W}\left[{\boldsymbol{y}}^{\ast }(k+1)-\boldsymbol{y}(k+1)\right]+\\ & \lambda {\Vert \Delta \boldsymbol{u}(k)\Vert }^{2}， \end{split} $$ (8) 式中，
${\boldsymbol{W}} = {\mathrm{diag}}({w_1},{w_2},\cdots ,{w_n})$ ；$\lambda $ 为控制量增量$ \Delta {\boldsymbol{u}}(k) $ 的惩罚系数，它用于防止控制量过快变化导致的系统不稳定。通过求解式(8)所示的最优化问题，得到第
$k$ 采样时刻，MMFAC算法的控制量${\boldsymbol{u}}(k)$ 的计算公式为$$\begin{split} \boldsymbol{u}(k)= & \boldsymbol{u}(k-1)+{\left[\lambda \boldsymbol{I}+{\boldsymbol{\varPhi }}^{{\rm T}}(k)\boldsymbol{W\varPhi}(k)\right]}^{-1}\\ & {\boldsymbol{\varPhi }}^{{\rm T}}(k)\boldsymbol{W}\left[{\boldsymbol{y}}^{\ast }(k+1)-\boldsymbol{y}(k)\right]， \end{split} $$ (9) 式中，
${\boldsymbol{I}}$ 表示单位矩阵，唯一未知量为PJM矩阵${\boldsymbol{\varPhi }}(k)$ ，它代表了环境参数向量${\boldsymbol{y}}(k)$ 的变化趋势。根据式(1)所示的CFDL数据模型可知，该模型提供了一个近似的表示，而非精确等同。因此，PJM矩阵的参数辨识过程旨在最小化CFDL数据模型表达式左右两侧的差距，即$$ \mathrm{min}\boldsymbol{ }{\Vert \Delta \boldsymbol{y}(k)-\boldsymbol{\varPhi }(k) \Delta \boldsymbol{u}(k-1)\Vert }^{2}+\mu {\Vert \boldsymbol{\varPhi }(k)-\boldsymbol{\varPhi }(k-1)\Vert }^{2}， $$ (10) 式中，参数
$\mu $ 为对PJM矩阵${\boldsymbol{\varPhi }}(k)$ 增量的惩罚系数，其值为正，它用于防止因${{\boldsymbol{\varPhi }}}(k)$ 过快变化而导致的系统不稳定。对式(10)所示的最优化问题进行求解，得到PJM矩阵的计算公式为
$$\begin{split} \boldsymbol{\varPhi }(k)= & \left[\Delta \boldsymbol{y}(k)\Delta {\boldsymbol{u}}^{{\rm T}}(k-1)+\mu \boldsymbol{\varPhi }(k-1)\right]\\ & {\left[\Delta \boldsymbol{u}(k-1)\Delta {\boldsymbol{u}}^{{\rm T}}(k-1)+\mu \boldsymbol{I}\right]}^{-1}。 \end{split} $$ (11) 图1展示了MMFAC算法的整体执行流程。首先，对环境参数进行测量，并将测量值存入向量
${\boldsymbol{y}}(k)$ 。接着，依次获取权重矩阵${\boldsymbol{W}}$ 、环境参数在下一时刻的期望值$ {{\boldsymbol{y}}^ * }(k + 1) $ 、以及上一时刻的控制量${\boldsymbol{u}}(k - 1)$ 和PJM矩阵${{\boldsymbol{\varPhi } }}(k - 1)$ 。然后，应用式(11)计算PJM矩阵在当前时刻的${{\boldsymbol{\varPhi }}}(k)$ 。其次，应用式(9)计算当前时刻的控制量${\boldsymbol{u}}(k)$ 。最后，根据${\boldsymbol{u}}(k)$ 对风机、湿帘等环境调控装置进行控制。通过循环执行以上步骤，MMFAC算法能够实现猪舍多参数环境控制。2. 试验与结果分析
2.1 仿真试验验证与结果分析
为了验证本研究所提出的基于MMFAC算法的猪舍多参数控制算法的正确性和有效性，本研究对式(12)所示的多输入多输出离散非线性系统进行了仿真试验。式中，
${u_1}$ 、${u_2}$ 表示控制量，${y_1}$ 、${y_2}$ 表示系统输出，${x_1}$ 、${x_2}$ 表示中间变量。该模型仅用于生成输入、输出数据，而非用于控制算法的设计。$$ \left\{ \begin{gathered} {y_1}(k + 1) = \dfrac{{{{\left| {{y_1}(k)} \right|}^2}}}{{1 + {{\left| {{y_1}(k)} \right|}^2}}} + 0.3{x_1}(k)， \\ {x_1}(k + 1) = \dfrac{{{{\left| {{y_1}(k)} \right|}^2}}}{{1 + {{\left| {{x_1}(k)} \right|}^2} + {{\left| {{x_2}(k)} \right|}^2} + {{\left| {{y_2}(k)} \right|}^2}}} + \\ \quad \quad \quad \quad \;\;\; \left[ {1 + 0.1\sin (2{\text{π}} k/1\;500)} \right]{u_1}(k)， \\ {y_2}(k + 1) = \dfrac{{{{\left| {{y_2}(k)} \right|}^2}}}{{1 + {{\left| {{y_2}(k)} \right|}^2}}} + 0.2{x_2}(k)， \\ {x_2}(k + 1) = \dfrac{{{{\left| {{y_2}(k)} \right|}^2}}}{{1 + {{\left| {{x_1}(k)} \right|}^2} + {{\left| {{x_2}(k)} \right|}^2} + {{\left| {{y_1}(k)} \right|}^2}}} + \\ \quad \quad \quad \quad \;\;\; \left[ {1 + 0.1\cos (2{\text{π}} k/1\;500)} \right]{u_2}(k)， \\ \end{gathered} \right. $$ (12) 初始条件为：
$$ \left\{ \begin{gathered} {u_1}(k) = {u_2}(k) = 0.5,{\text{ }}k = 1,2,3,4， \\ {y_1}(k) = {y_2}(k) = 0.5,{\text{ }}{x_1}(k) = {x_2}(k) = 0,{\text{ }}k = 1,2,3,4 。 \\ \end{gathered} \right. $$ (13) 根据式(12)所示的系统模型可知，输出
${y_1}$ 主要由输入${u_1}$ 控制，输出${y_2}$ 主要由输入${u_2}$ 控制。输入${u_1}$ 对输出${y_2}$ 的影响以及输入${u_2}$ 对输出${y_1}$ 的影响均较小。因此，该系统可视为一个弱耦合系统。为了验证改进后的MMFAC算法在弱耦合系统中依然有效，我们设定式(12)所示的受控系统的期望输出${{\boldsymbol{y}}^ * }$ 如式(14)所示。$$ \left\{ \begin{gathered} y_1^ * (k) = 1.25， \\[-2pt] y_2^ * (k) = \left\{ \begin{gathered} 1.2,{\text{ }}0 < k \leqslant 300 \\[-4pt] 3.1,{\text{ }}300 < k \leqslant 700 \\[-4pt] 2.3,{\text{ }}700 < k \leqslant 1\;000 \\ \end{gathered} \right.。 \\ \end{gathered} \right. $$ (14) 在进行仿真试验之前，首先将式(9)所定义的控制量计算公式中的惩罚系数
$\lambda $ 设定为1，并采用单位矩阵作为权重矩阵。同时，将式(11)所定义的PJM矩阵计算公式中的惩罚系数$\mu $ 设定为1。基于这些参数，实施环控算法的仿真试验，为进行对比，还进行了工业上常用的PID控制算法的仿真试验，结果如图2所示。![]()
图 2 MMFAC和PID算法对恒定期望信号的跟踪能力Figure 2. The tracking capability of the MMFAC and PID algorithms for constant desired signals通过分析以上仿真试验结果可知，MMFAC算法能够有效地将多个参数调控至期望值。当期望输出值发生突变时，MMFAC算法能够迅速调整控制输入，确保系统输出快速稳定在新的期望值上。虽然PID算法也具备这些特性，但通过对比MMFAC算法和PID算法的输出曲线可知，MMFAC算法在调整时间、超调量等性能指标方面均优于PID算法。此外，MMFAC算法需要调节的参数显著少于PID算法，简化了参数设定的过程。因此，本文采用MMFAC算法作为猪舍环境控制算法。
在上述仿真试验中，输出
${y_1}$ 主要由输入${u_1}$ 调节，而输出${y_2}$ 主要由输入${u_2}$ 调节，表明系统耦合性较低。因此，通过选用单位矩阵作为权重矩阵，能够有效地实现对2个输出变量的精确控制。进一步设想，当系统的输入变量减少至仅包括$u{}_1$ 时，输出${y_1}$ 和${y_2}$ 均受到同一输入${u_1}$ 的调节，此时，系统的耦合性增强。在这种情况下，输出${y_1}$ 和${y_2}$ 无法同时得到精确控制。例如，在设定输出${y_1}$ 和${y_2}$ 的目标值分别为2和1的情况下，并保持权重矩阵为单位矩阵，控制算法的仿真试验结果如图3所示。![]()
图 3 MMFAC对耦合系统的控制能力Figure 3. The control capability of the MMFAC algorithm for coupled system根据以上仿真试验结果可知，尽管算法成功实现了对输出
${y_1}$ 和${y_2}$ 的自适应控制，但它们的稳态误差均较大。在实际猪舍环境控制中，各参数之间呈现出耦合特性。由于成本限制，部分养殖场未能配备完备的通风、制冷及制热等调控装置，即无法通过调控装置实现参数之间的解耦。因此，这类猪舍无法同时将所有环境参数调节至理想状态。此时，需要优先保证对猪只生长最有利的参数得到更精准的控制。在此背景下，MMFAC算法通过调整权重矩阵，能够在控制系统中引入一种优先级机制，从而确保对猪只生长最重要的环境参数优先获得更为精确的控制。例如，在强耦合试验中，若要提高输出${y_1}$ 的控制精度，可通过提高权重矩阵的第1行第1列的数值，以此来赋予输出${y_1}$ 更高的控制精度。经过此种调整之后，再次执行控制算法的仿真试验，其结果如图4a1、4a2所示。类似地，若需提高输出${y_2}$ 的控制精度，可增加权重矩阵的第2行第2列的值。经此调整之后，再次执行控制算法的仿真试验，其结果如图4b1、4b2所示。![]()
图 4 权重矩阵对耦合系统控制性能的影响在a1和a2中，输出y1分配了高权重；在b1和b2中，输出y2分配了高权重Figure 4. The effect of the weight matrix on the control performance of coupled systemIn a1 and a2, high weights were assigned to output y1; In b1 and b2, high weights were assigned to output y2由图4a1可知，通过增加输出
${y_1}$ 的权值，成功地降低了输出${y_1}$ 稳态误差；类似地，由图4b2可知，通过增加输出${y_2}$ 的权值，成功地降低了输出${y_2}$ 稳态误差。因此，当系统呈现耦合特性时，本研究提出的MMFAC算法不仅展现了对多参数的自适应控制能力，而且能够确保被赋予较高权重的输出变量获得更小的稳态误差。值得注意的是，MMFAC算法在增强被赋予较高权重的输出变量的控制精度的过程中，将不可避免地降低那些被赋予较低权重的输出变量的控制精度。因此，在具有耦合特性的系统中应用此算法时，必须细致地考虑并平衡受控参数的权值分配，以确保系统整体性能的最优化。
2.2 猪舍环境控制试验与结果分析
为了验证本文提出的MMFAC算法在实际猪舍环境控制中的有效性，在猪舍中进行了环境控制试验。
首先将温度划分为3个区间，分别为舒适区间、警告区间和危险区间。具体划分标准如下：当温度测量值≥20 ℃且≤25 ℃时，属于舒适区间；温度测量值≥10 ℃且< 20 ℃，或者> 25 ℃且≤30 ℃时，属于警告区间；温度测量值< 10 ℃或> 30 ℃时，属于危险区间。温度处于危险区间时，对猪只的生长有显著不利影响，需要快速调控，因此需为其赋予高权重，本文设定高权重值为10.00。温度处于舒适区间时，环境已得到有效控制，因此可为其赋予低权重，本文设定低权重值为0.01。当温度处于警告区间时，赋予其中等权重，本文设定中等权重为1.00。
类似地，CO2和NH3浓度也被划分为舒适区间、警告区间和危险区间3个区间。具体划分标准如下：当CO2质量浓度≤
1080 mg/m3时，属于舒适区间；当CO2质量浓度>1080 mg/m3且≤1260 mg/m3时，属于警告区间；当CO2质量浓度>1260 mg/m3时，属于危险区间。二氧化碳浓度在这些区间的权重分配与温度的权重分配相同。同样地，NH3浓度的区间划分如下：当NH3质量浓度≤0.7 mg/m3时，属于舒适区间；当NH3质量浓度> 0.7 mg/m3且≤2.1 mg/m3时，属于警告区间；当NH3质量浓度> 2.1 mg/m3时，属于危险区间。它在这些区间的权重分配与温度的权重分配相同。
风机的控制信号输入范围为0~10 V。当向风机的变频器输入0~10 V的电压时，变频器将输出0~50 Hz的交流电。当交流电频率达到50 Hz时，电机运转至最大转速；相反，当频率为0 Hz时，电机停止运转。
应用本文提出的MMFAC算法进行试验，得到图5所示的试验数据。通过观察图5a所示的温度变化曲线和图5d所示的风机控制量变化曲线，可以看出MMFAC算法根据实际温度测量值实时计算风机控制量，并根据该控制量驱动风机，以保持温度在舒适区间范围内的稳定控制。因此，MMFAC算法能够有效实现对温度的稳定控制。同样地，通过观察图5b所示的二氧化碳浓度变化曲线和图5c所示的氨气浓度变化曲线，可以发现MMFAC算法也能够将这些参数稳定控制在各自的舒适区间内。综上所述，本文提出的MMFAC在实际的猪舍环境控制中表现出良好的应用效果。
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图 5 猪舍环境控制试验中不同环境参数的变化曲线Figure 5. The variation curves of different environmental parameters in pig house environmental control experiments3. 结论
本研究基于MFAC算法，提出了一种适用于猪舍的MMFAC算法。该算法无需事先建立被控系统的数学模型，而是通过实时输入、输出数据来实现对多参数的自适应控制。此外，通过引入权重矩阵，该算法能够优先控制对猪只生长最有利的参数。通过对仿真试验和真实猪舍环境控制试验的验证，证明了该算法的有效性。因此，该算法在猪舍环境控制领域具有良好的应用前景。
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图 1 Tiki1基因TALEN靶位点
加下划线的序列表示靶位点
Figure 1. Target sites for TALEN of Tiki1 gene
The underlined sequences represent the target sites
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图 2 4 对TALEN打靶效率酶切检测电泳图
NT为阴性对照；箭头所指为T7EⅠ内切酶切开的2个片段条带
Figure 2. Electrophoregram detecting targeting efficiency of four pairs of TALEN by enzyme digestion
NT is negative control; The arrows point at two fragments generated by the T7E I endonuclease
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图 3 注射Tiki1-TALEN mRNA后家兔受精卵Tiki1基因的碱基突变
WT为野生型，P1~P5代表5种不同的基因突变型；短横线表示缺失的碱基，加下划线的序列表示靶位点
Figure 3. Base mutation of Tiki1 gene in fertilized eggs of rabbits after injection with Tiki1-TALEN mRNA
WT is wildtype, P1-P5 represent five different types of gene mutation; The short dashes represent the missing bases, and the underlined sequences represent the target sites
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图 5 仔兔Tiki1基因的碱基突变
WT为野生型，1#-1和2#-2为仔兔编号；短横线表示缺失的碱基，蓝色小写字母表示插入的碱基，加下划线的序列表示靶位点
Figure 5. Base mutations in Tiki1 genes of baby rabbits
WT is wildtype, 1#-1 and 2#-2 are indentifying numbers for baby rabbits; The short dashes represents the missing base, the blue lowercase letter represents the inserted base, and the underlined sequences represent the target sites
表 1 注射Tiki1-TALEN mRNA后家兔胚胎的体外发育结果
Table 1 Results of in vitro development of rabbit embryos after injection with Tiki1-TALEN mRNA
ρ(mRNA)/
(ng·µL−1)注射胚胎数
No. of embryos injected囊胚数
No. of blastocysts囊胚率/%
Percentage of blastocystsP1) 10 11 7 64 0.635 1 50 14 8 57 0.208 7 0 (H2O, CK) 11 9 82 1)第5列为与CK组囊胚率比较的P值(Fisher’s精确检验)
1)The fifth column shows P values when compared with the percentage of blastocysts in CK group (Fisher’s exact test)
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表 2 注射Tiki1-TALEN mRNA后家兔受精卵Tiki1基因修饰结果
Table 2 Modified results of Tiki1 gene in fertilized eggs of rabbits after injection with Tiki1-TALEN mRNA
ρ(mRNA)/
(ng·µL−1)囊胚数
No. of
blastocysts发生基因
修饰囊胚数
No. of modified blastocysts基因修饰
效率/%
Gene modification efficiency单等位基因
敲除数
No. of mono-mutant单等位基因
敲除率/%
Rate of mono-mutant双等位基因
敲除数
No. of alle-mutant双等位基因
敲除率/%
Rate of alle-mutant10 7 1 14.3 1 14.3 0 0 50 8 8 100 8 100 0 0
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表 3 基因打靶仔兔出生统计
Table 3 Birth summary of gene targeted baby rabbits
受体编号
Recipient No.ρ(mRNA)/
(ng·µL−1)移植胚胎数
No. of embryos transferred出生仔兔数
No. of newborn rabbits基因修饰兔数量
No. of gene-modified rabbits基因修饰兔占比/%
Percentage of gene-modified rabbits双等位基因敲除兔数
No. of rabbits with biallelic knockout1# 50 7 1 1 100 0 2# 50 10 2 1 50 0 合计 Total 17 3 2 67 0
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