Gene knockout of Tiki1 gene in rabbit by TALEN system
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摘要:目的
利用转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统获得Tiki1基因敲除的兔模型，为研究Tiki1对动物早期发育作用机理提供兔源的动物模型。
方法基于TALEN系统设计了靶向兔Tiki1基因的打靶载体，分别将10和50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到原核期的家兔受精卵胞质中，然后收集发育至囊胚期的胚胎，鉴定囊胚率和基因修饰效率，通过测序检验囊胚的基因突变。为了进一步获得Tiki1基因敲除兔，后续将50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到17个原核期的家兔受精卵胞质中，将受精卵分别移植到2只受体兔体内。
结果注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率（64%）与注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率（57%）差异不大，但注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率（100%）显著高于注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率（14.3%）。测序结果表明，Tiki1基因的突变范围从 1到28 bp缺失不等。经过胚胎移植共生出3只仔兔，其中有2只兔子能检测到基因突变。
结论所建立的TALEN技术体系可以对家兔Tiki1基因进行高效的敲除。
Abstract:ObjectiveTo obtain a rabbit model of Tiki1 gene knockout by the transcription activator-like effector nuclease (TALEN) system, and provide a rabbit model for investigating the mechanism of Tiki1 gene on early development of animals.
MethodUsing TALEN system, the target vector of rabbit Tiki1 gene was constructed and then 10 or 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA was injected into the cytoplasm of fertilized eggs at pronuclear stage. Embryos developed to blastocyst stage were collected. The blastocyst rate and gene modification efficiency were investigated. To further obtain Tiki1 knockout rabbits, 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA was subsequently injected into the cytoplasm of 17 prokaryotic fertilized eggs of rabbit, and then the fertilized eggs were transplanted into two recipient rabbits.
ResultThe blastocyst rate of the treatment group injected with 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA（64%) was almost the same as that of the group injected with 10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA(57%), while the blastocyst gene modification efficiency of the group injected with 50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA(100%) was significantly higher than that of the group injected with 10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA (14.3%). The sequencing results showed that mutations of Tiki1 gene ranged from the deletion of 1 bp to 28 bp. A total of three rabbits were born after embryo transfer, and two of them were detected with genetic mutations.
ConclusionThe TALEN technology system established in this study could effectively knock out Tiki1 gene in rabbit.
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Keywords:
- rabbit /
- TALEN /
- Tiki1 gene /
- blastocyst /
- gene knockout /
- gene modification
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苦楝Melia azedarach又名翠树、楝树、紫花树、森树等，为楝科楝属落叶乔木，分布于中国、韩国、日本、印度、斯里兰卡、印度尼西亚和澳大利亚等地，欧洲、美洲也有栽培[1]。苦楝生长速度快、木材材质优良、纹理美丽，易加工，可用于家具、建筑、农具、船舶、乐器等方面，木材抗白蚁、抗虫蛀、耐腐。苦楝耐烟尘、能大量吸收有毒有害气体，是优良的城市及工矿区绿化树种，也是我国南方四旁绿化常用树种[2-3]。苦楝的根、皮、花、果均可入药，也可作为植物源农药[4]。分子标记是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术[5~6]。目前已有少量文献对部分苦楝种源的遗传多样性进行分析，程诗明[7]采用7对AFLP引物对分层随机抽样的8个群体240个个体基因组进行研究分析，共扩增得到658条清晰谱带，其中650条为多态性谱带，各群体多态位点百分率为51.4%~76.29%；陈羡德[8]利用筛选出的20个RAPD引物对15个不同来源的苦楝进行分析，20个随机引物共扩增出193条重复性好、清晰的谱带，其中多态性谱带共计189条，占97.9%。夏海涛[9]采用筛选出的24个简单重复序列间多态性(Inter-simple sequence repeat，ISSR)引物对13个种源苦楝优树DNA进行分析，共扩增出382个位点，多态位点百分率为98.43%，其中南宁和仓山种源的多态位点百分率最高，为54.97%，延平的多态位点百分率最低，为43.98%，说明13个种源苦楝的遗传多样性丰富。但是，苦楝分布广泛，以前的研究采样点偏少，不足以准确地反映全分布区苦楝的遗传多样性。本项研究从国内18个省(区、市)37个县(市)采集苦楝种子，并收集肯尼亚内罗毕苦楝种子，采取相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子标记方法进行遗传多样性分析。此外，SRAP分子标记结合了扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)及随机扩增的多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)各自的优点，方便快速，只需要极少量DNA材料，且不需要预先知道DNA序列信息，即可快速获得大量的信息，试验结果稳定可靠，且再现性较高，重复性较好[10~11]。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以国内全分布区的37个种源和肯尼亚内罗毕1个种源为对象进行苦楝SRAP遗传多样性分析，采种点地理位置及编号见表 1。试验材料采于广州市华南农业大学苗圃1年生苦楝，采集幼嫩枝条上嫩叶6~8片，低温保存用于提取DNA。
表 1 苦楝材料及来源Table 1. Materials and sources of Melia azedarach
1.2 试验仪器与设备
试验仪器主要有超微量紫外分光光度计(Thermo nanodrop 2000)，PCR扩增仪(PTC-200)，DYY-Ⅲ型恒压恒流电泳仪(北京六一仪器公司)，凝胶成像系统(Bio-rad)，高速离心机(Eppendorf)等。试验用TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+及100 bp DNA ladder等购自TaKaRa公司，琼脂糖和Gold View核酸染料购自广州鼎国生物科技有限公司，酚、三氯甲烷、乙醇、异丙醇、硫代硫酸钠、硼酸、甲醛、冰醋酸、硝酸银等其他试剂为国产分析纯。SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成，本研究所用引物序列见表 2。
表 2 用于苦楝SRAP分析的引物序列Table 2. Primer sequences used for SRAP analysis of Melia azedarach
1.3 苦楝DNA提取和SRAP-PCR扩增
苦楝基因组DNA提取参照上海生工生物工程有限公司柱式基因组DNA提取试剂盒说明书。所提取的基因组DNA用8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测质量，超微量紫外分光光度计检测浓度后稀释至50 ng·μL-1，置于-20 ℃条件下保存备用。通过单因子及正交试验建立并优化苦楝SRAP-PCR最佳反应体系为模板DNA 30 ng、dNTPs浓度0.125 mmol·L-1、Mg2+浓度2.25 mmol·L-1、引物浓度0.48 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U(25 μL)。SRAP-PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。
1.4 数据统计与分析方法
电泳结果统计时将具有相同迁移率的扩增片段，按0/1系统纪录，有带记为1，无带记为0，并参照标准Marker带估计扩增片段的大小，形成0/1矩阵。将图形资料转换成数据资料，并输入Excel 2007中建立0/1数据矩阵，使用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传距离和相似系数，使用非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 SRAP扩增多态性条带统计
本研究采用20对SRAP引物对苦楝38个不同种源进行扩增，分析结果见表 3。由表 3可知，引物扩增条带多数集中在100~1 500 bp之间，20对引物组合对全部样品进行分析，共扩增出247条带，其中多态性条带101条，平均多态性百分率为40.89%。20对引物扩增的条带数从5条(Me11/Em29)到17条(Me20/Em7)不等，平均为12.1条。多态性条带的数量从1条(Me11/Em29、Me6/Em29)到12条(Me20/Em7)不等，多态性比率最高的引物组合为Me24/Em14(88.89%)，其次为Me20/Em7(70.59%)、Me1/Em9(60.00%)；多态性比率最低的引物组合为Me6/Em29(12.50%)，总体而言，引物多态性比率较高。
表 3 SRAP引物组合扩增信息分析Table 3. Analysis of amplification with SRAP primer combination
多态性信息量(Polymorphism information content，PIC)是用来衡量不同引物对反应多态性高低的程度，20对引物组合的PIC为0.188~0.488，其中Me1/Em9扩增引物总条带数(15条)、多态性条带数(9条)以及PIC(0.387)均较高，该引物组合可以成为苦楝SRAP分子标记的骨干引物[12]，20对引物的平均PIC为0.299，介于0.25~0.50之间，说明所选的SRAP引物可以很好地反映苦楝的遗传多样性[13]。引物Me1/Em9的扩增图谱见图 1。
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图 1 Me1/Em9引物对苦楝群体材料的扩增聚丙烯电泳图M：100 bp DNA ladder；1~38分别为种源编号A04、A09、B01、B03、B04、B06、C02、C03、C04、C10、D01、D05、E01、E02、E03、F01、F04、G01、G03、H03、H06、I01、I02、J01、J02、J03、K01、K02、L01、M01、M02、O01、P03、P04、Q01、Q02、U01、Z01的DNA。Figure 1. Amplified products of samples from different provenances of Melia azedarach on polyacrylamide gels with the primer combination of Me1/Em92.2 38个不同苦楝种源的聚类分析
根据SRAP标记分析结果，对苦楝38个种源间基于Nei’s的遗传距离进行UPGMA聚类分析，从聚类分析结果(图 2)可知，以0.350为阈值，38个种源可以分为7类，A04、A09、B01、B04、B06、C02、C03、C10、H03、H06、Z01为第1类，这一类主要分布在海南、广东、广西等地理位置偏南的地区，其中肯尼亚内罗毕的种源Z01也在这一类；B03、E02、E03、F01、F04、I01、J01、J02、K02为第2类，这一类主要分布在广东、福建、浙江、江苏东部沿海省份；E01、G01、G03、I02、J03、K01、L01、M02、P03、P04、U01为第3类，主要分布在湖南、湖北、陕西、河北等地；D01、D05、M01为第4类，主要为云南种源；Q01、Q02为第5类，来自甘肃。O01和C04各为一类，分别来自河南内乡和广西永福。
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图 2 SRAP标记的38个苦楝种源UPGMA聚类图Figure 2. UPGMA clustering dendrogram of 38 Melia azedarach provenances with SRAP markers3. 讨论
本试验从783对引物组合中筛选获得多态性较好的引物组合20对，这些引物组合多态性百分率平均为40.89%，PIC平均为0.299，说明SRAP分子标记可以较好地应用于苦楝的遗传多样性分析[13]，并为充分开发、利用苦楝资源及完善苦楝遗传背景分析奠定基础。通过本试验开发出了多态性比率和PIC均较高的可用于苦楝SRAP分析的骨干引物(Me4/Em5、Me1/Em9)，可将大部分种源划分为准确的类型，为快速分析苦楝不同种源提供了方法。
根据SRAP标记分析结果，以0.350为阈值，可将38个苦楝种源划分为7类。其中，O01和C04各为一类，分别来自河南内乡和广西永福。由于这2类仅各含1个种源，代表性不强，为稳妥起见，河南内乡和广西永福暂不独立成类，将其余的36个种源，划分5个类群。苦楝种源类群划分有明显的地理趋势和气候生态特征。例如第1类群的种源来自海南、广东、广西等偏南省份，属于纬度较低，沿海地区的苦楝，这些地方水热条件充足。肯尼亚内罗毕种源聚在此类，这可能因为当地气候条件与我国两广、海南岛的气候更相似；第2类群种源主要分布在广东、福建、浙江、江苏东部沿海省份，其气温和降水量普遍低于第1类种源地；第3类群种源主要分布在湖南、湖北、陕西、河北等地，其气温和降水量低于第2类种源地；第4、5类群分别为云南、甘肃种源，两地区的气候差异很大，与前3类也有较大差异。
将该聚类结果与苦楝果核及种子性状做比对[14]，果实主要表型特征为第1类的果实种子形态较小且质量较轻、棱粒较小；第2类的果实果核棱纹明显、果核单果棱数及粒数较少；第3类的果实种子较宽，果核形态近球形且棱纹不明显；第4类的果实种子形状较大且质量较重，果核皮较厚，果核单果棱数较多，但种粒数较少；第5类的果实果核和种子的质量及形态较大，核果皮较厚且棱纹较明显，果核单果棱数及粒数较多。
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图 1 Tiki1基因TALEN靶位点
加下划线的序列表示靶位点
Figure 1. Target sites for TALEN of Tiki1 gene
The underlined sequences represent the target sites
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图 2 4 对TALEN打靶效率酶切检测电泳图
NT为阴性对照；箭头所指为T7EⅠ内切酶切开的2个片段条带
Figure 2. Electrophoregram detecting targeting efficiency of four pairs of TALEN by enzyme digestion
NT is negative control; The arrows point at two fragments generated by the T7E I endonuclease
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图 3 注射Tiki1-TALEN mRNA后家兔受精卵Tiki1基因的碱基突变
WT为野生型，P1~P5代表5种不同的基因突变型；短横线表示缺失的碱基，加下划线的序列表示靶位点
Figure 3. Base mutation of Tiki1 gene in fertilized eggs of rabbits after injection with Tiki1-TALEN mRNA
WT is wildtype, P1-P5 represent five different types of gene mutation; The short dashes represent the missing bases, and the underlined sequences represent the target sites
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图 5 仔兔Tiki1基因的碱基突变
WT为野生型，1#-1和2#-2为仔兔编号；短横线表示缺失的碱基，蓝色小写字母表示插入的碱基，加下划线的序列表示靶位点
Figure 5. Base mutations in Tiki1 genes of baby rabbits
WT is wildtype, 1#-1 and 2#-2 are indentifying numbers for baby rabbits; The short dashes represents the missing base, the blue lowercase letter represents the inserted base, and the underlined sequences represent the target sites
表 1 注射Tiki1-TALEN mRNA后家兔胚胎的体外发育结果
Table 1 Results of in vitro development of rabbit embryos after injection with Tiki1-TALEN mRNA
ρ(mRNA)/
(ng·µL−1)注射胚胎数
No. of embryos injected囊胚数
No. of blastocysts囊胚率/%
Percentage of blastocystsP1) 10 11 7 64 0.635 1 50 14 8 57 0.208 7 0 (H2O, CK) 11 9 82 1)第5列为与CK组囊胚率比较的P值(Fisher’s精确检验)
1)The fifth column shows P values when compared with the percentage of blastocysts in CK group (Fisher’s exact test)
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表 2 注射Tiki1-TALEN mRNA后家兔受精卵Tiki1基因修饰结果
Table 2 Modified results of Tiki1 gene in fertilized eggs of rabbits after injection with Tiki1-TALEN mRNA
ρ(mRNA)/
(ng·µL−1)囊胚数
No. of
blastocysts发生基因
修饰囊胚数
No. of modified blastocysts基因修饰
效率/%
Gene modification efficiency单等位基因
敲除数
No. of mono-mutant单等位基因
敲除率/%
Rate of mono-mutant双等位基因
敲除数
No. of alle-mutant双等位基因
敲除率/%
Rate of alle-mutant10 7 1 14.3 1 14.3 0 0 50 8 8 100 8 100 0 0
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表 3 基因打靶仔兔出生统计
Table 3 Birth summary of gene targeted baby rabbits
受体编号
Recipient No.ρ(mRNA)/
(ng·µL−1)移植胚胎数
No. of embryos transferred出生仔兔数
No. of newborn rabbits基因修饰兔数量
No. of gene-modified rabbits基因修饰兔占比/%
Percentage of gene-modified rabbits双等位基因敲除兔数
No. of rabbits with biallelic knockout1# 50 7 1 1 100 0 2# 50 10 2 1 50 0 合计 Total 17 3 2 67 0
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