MADS是一类重要的转录因子，其命名来源于酿酒酵母的Mini chromosome maintenance 1(MCM1)、拟南芥AGAMOUS(AG)、金鱼草DEFICIENS(DEF)和人类Serum response factor(SRF)基因，它们所编码蛋白的N端都含有由50~60个氨基酸组成的MADS-box保守结构域^[1]。植物MADS家族从系统发育上可分为I型和II型(又称MIKC型)2种，二者的区别主要在于有无K-box结构域^[2-3]。关于I型MADS基因家族成员的报道较少。在水稻中，I型的OsMADS78和OsMADS79在种子发育早期发挥了重要的调控作用^[4]；拟南芥中研究比较深入的I型MADS是AtAGL62，参与调控拟南芥胚乳发育过程中的细胞分化^[5]。II型MADS基因是植物所特有的，也是目前研究最多的，其中被广泛熟知的是参与花器官的形成和发育，如经典的花器官发育模型“ABC(D)E模型”中控制花萼和花瓣形成的AP1、控制花瓣和雄蕊形成的AP3、控制雄蕊和心皮形成的AG等基因，均属于MADS家族成员^[3]。除了参与调控开花，MADS基因还被报道参与植物多种生长发育过程。水稻的OsMADS25通过正调控生长素的累积参与促进主根和侧根的生长^[6]；豆科作物大豆Glycine max的MADS成员GmNMH7能够抑制结瘤相关基因的表达，进而在根瘤的形成和发育过程中扮演负调控角色^[7]。MADS家族基因还参与植物应对非生物胁迫的适应性调控^[8]。拟南芥AtAGL6通过抑制盐胁迫响应基因的表达，负调控植物耐盐^[9]；水稻OsMADS25响应ABA信号，正调控植株对低温的适应性^[10]；超量表达野生大豆MADS基因GsMAS1，增加了拟南芥对铝毒的耐受性^[11]。此外，多个MADS基因被报道参与缺磷的响应，如水稻的OsMADS23、OsMADS25和OsMADS27^[12]，但具体分子功能还有待进一步研究。

大豆是我国重要的粮油作物，然而我国大豆生产严重不足，每年约1亿吨需要进口^[13]。限制大豆生产的因素很多，其中，磷作为植物生长必需的大量营养元素，在土壤中很容易被吸附固定，导致土壤有效磷含量普遍偏低，低磷胁迫是限制我国大豆生长和产量的重要因素之一^[14-15]。研究大豆磷营养调控机理，挖掘调控大豆适应低磷胁迫的重要转录因子，对于磷高效大豆品种的遗传改良和培育具有重要意义^[15-16]。MADS家族转录因子在大豆全基因组共有163个成员^[17]，但是目前有功能报道尤其是有响应低磷胁迫功能的相对较少。本研究克隆了1个大豆II型MADS成员——GmMADS4，并通过生物信息学、亚细胞定位、表达模式分析以及超量表达该基因对根系磷稳态的影响分析，进一步挖掘该基因可能的功能，为深入解析GmMADS4在大豆生长发育以及低磷胁迫适应过程中的功能奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

本研究所用植物材料为大豆品种‘粤春03-3’，由华南农业大学根系生物学研究中心惠赠；烟草Nicotiana benthamiana为本氏烟草。所用菌株为大肠埃希菌DH5α、根癌农杆菌GV3101、发根农杆菌K599。

1.2   试验处理及样品准备

不同组织部位表达模式及缺素处理表达模式分析参考Yao等^[18]的方法。挑选大小一致的大豆种子，播种于砂土中进行萌发，5 d后选择长势一致的幼苗，转移到1/2 Hoagland正常营养液中进行培养。对于不同组织部位样品，分别在培养的第32天(大豆开花时)收获根、茎、叶、花，第50天收获种子。对于缺素处理样品，幼苗在正常营养液培养1周后，取部分幼苗分别转移到无氮、无磷、无钾的1/2 Hoagland营养液(北京酷来搏公司)中处理24 h，然后收获根和新叶以备分析。试验于2021年4—6月在日光温室进行，白天平均气温30 ℃，夜晚平均气温25 ℃，日平均光照时间为13 h。收获后的样品立即用液氮冷冻，之后放入−80 ℃条件下保存，用于RNA提取。

用Trizol试剂(Invitrogen公司)分别提取根、茎、叶、花和种子的总RNA，具体方法参照其说明书中的步骤。测定提取的总RNA的浓度和纯度，检测合格后，取1 μL的总RNA，根据逆转录试剂盒(Promega公司)说明书去除基因组DNA后进行逆转录反应，获得相应的cDNA，保存于−20 ℃，作为载体构建和RT-qPCR的模板。

1.3   生物信息学分析

GmMADS4基因基本信息包括开放阅读框(Open reading frame, ORF)长度、外显子/内含子数目、氨基酸长度，从Phytozome数据库( https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)获得。GmMADS4蛋白相对分子质量及等电点通过Expasy数据库( https://web.expasy.org/compute_pi/)获得。GmMADS4蛋白保守结构域的预测通过NCBI conserved domains ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行。基因结构通过GSDS网站( http://gsds.gao-lab.org/index.php)获得。蛋白二级结构通过Prabi网站( https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)进行预测。GmMADS4基因启动子(5′ UTR上游2 000 bp的DNA序列)顺式作用元件预测通过PlantCARE网站( http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行。GmMADS4互作蛋白预测通过STRING网站( https://www.string-db.org/)根据氨基酸序列进行。系统进化树分析通过MEGA 5.05软件完成，采用邻接法(Neighbor-joining method)，Bootstrap设置为1 000次。

1.4   载体构建

以大豆花的cDNA为模板，用基因特异引物(OE-GmMADS4-F/R)对GmMADS4基因ORF全长进行PCR扩增。50 μL的PCR反应体系：10× Ex Taq Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、正反向引物各1 μL、cDNA模板2 μL以及ddH₂O 37 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃保温10 min。扩增出的目标基因片段纯化回收后，先连入pMD18-T载体，经测序无误后，用Sac I和Xba I进行双酶切，再通过T4 DNA连接酶将GmMADS4基因连入目标载体pTF101s，获得GmMADS4-pTF01s重组质粒，检测无误后转入发根农杆菌K599备用。

构建GmMADS4融合绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，用基因特异引物GFP-GmMADS4-F/R(酶切位点为Kpn I和BamH I)扩增GmMADS4基因ORF全长，并连入目标载体pBEGFP，测序无误后转化农杆菌GV3101备用。引物设计通过PerlPrimer软件完成，引物序列见表1。

表  1  本研究所用到的引物

Table  1.  Primers used in this study

引物名称 Primer name	引物序列(5′→3′)1)Primer sequence	注释 Annotation
OE-GmMADS4-F	C GAGCTCATGGGTCGTGGCAAGAT	超量表达 Overexpression
OE-GmMADS4-R	GC TCTAGATCAAGCAAGGCGAAGGTC
GFP-GmMADS4-F	GG GGTACCGATGGGTCGTGGCAAGAT	融合绿色荧光蛋白 Fused with GFP
GFP-GmMADS4-R	CG GGATCCCGAGCAAGGCGAAGGTCATG
RT-GmMADS4-F	GAGACAGATCAGGCATAGGA	RT-qPCR
RT-GmMADS4-R	CCTACAGGTATCAGTCCGAG
RT-GmEF-1α-F	TGCAAAGGAGGCTGCTAACT	RT-qPCR
RT-GmEF-1α-R	CAGCATCACCGTTCTTCAAA
1) 下划线为酶切位点 　1) The restriction sites are underlined

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1.5   亚细胞定位分析

GmMADS4蛋白亚细胞定位通过烟草叶片表皮细胞瞬时表达^[19]进行分析。将含有GmMADS4-pBEGFP载体质粒的农杆菌GV3101活化后扩大培养，菌体收集后用重悬液(包含10 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L MES以及0.1 mmol/L 乙酰丁香酮)重悬，使D_{600 nm}为0.5左右，静置2~3 h，通过注射器导入生长3~4周的烟草叶片下表皮，转化3 d后即可进行观察。以转化空载体pBEGFP的叶片为对照。GFP荧光的观察通过激光共聚焦显微镜进行，激发光波长为488 nm，发射光波长为507 nm。

1.6   RT-qPCR分析

将大豆待测cDNA样品稀释10倍作为模板，RT-qPCR参考Liu等^[20]的方法，试剂采用Go Taq qPCR Master Mix(Promega，美国)，通过StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR仪(ABI，美国)完成，程序设置为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s，40个循环；72 ℃ 30 s。基因定量引物RT-GmMADS4-F/R和内参基因GmEF-1α (Glyma17g23900)定量引物RT-GmEF-1α-F/R见表1。目的基因的相对表达量用2^－ΔΔCt法计算。

1.7   大豆复合植株转化

大豆复合植株转化参考Zhuang等^[21]的方法。种子萌发后，用注射器的针头分别蘸取适量携带pTF101s空载体和GmMADS4-pTF101s的K599发根农杆菌，然后在大豆幼苗子叶节的位置穿孔并涂抹菌体，进行侵染。约10 d左右可以看到有毛根长出，待毛根长到10 cm左右，把原来的主根剪掉，留下毛根，即为转基因复合植株。将超量表达GmMADS4和对照转基因复合植株转移到正常营养液中培养2周，收获地上部和毛根进行相关指标的测定。

1.8   生物量的测定

植株生物量用干质量表示，样品收获后立即在105 ℃烘箱杀青30 min，然后调到75 ℃烘干至恒质量，称取植株总干质量；每个处理有4次独立的生物学重复。

1.9   可溶性磷含量的测定

将0.1 g毛根用液氮速冻并研磨至粉碎，加1 200 µL双蒸水继续研磨以充分提取毛根中的可溶性磷；将研磨混合液转入2 mL离心管，于4 ℃、14 000 r/min离心30 min；取上清液采用钼锑抗比色法^[22]测定磷含量，测定波长为700 nm。

2.   结果与分析

2.1   GmMADS4基因结构及保守结构域预测

随着基因组数据库的更新，本研究获得了1个大豆MADS成员，基因座位号为Glyma01g37470，命名为GmMADS4，该基因ORF长度为732 bp，编码244个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为28 000，等电点为9.31。GmMADS4基因结构如图1A所示，该基因由7个外显子和6个内含子组成，两端各有1段非编码区。通过NCBI conserved domains保守结构域预测网站分析GmMADS4蛋白保守结构域，结果表明，该基因编码蛋白N端第2—77个氨基酸，为保守的MADS结构域，说明该基因属于MADS超家族，此外还含有1个K-box结构域(图1B)。

图  1  GmMADS4基因结构及保守结构域预测

Figure  1.  Gene structure and conserved domain prediction of GmMADS4

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2.2   GmMADS4蛋白二级结构预测

进一步分析了GmMADS4蛋白二级结构，结构表明GmMADS4蛋白包含多个α螺旋、β转角、延伸链和无规则卷曲(图2)。其中，α螺旋最多，占51.44%；其次为无规则卷曲，占23.05%；延伸链占16.05%；β转角最少，占9.47%(图2)。

图  2  GmMADS4蛋白二级结构预测

大写字母表示GmMADS4蛋白氨基酸序列；小写字母代表不同的二级结构，h代表α螺旋，c代表无规则卷曲，e代表延伸链，t代表β转角

Figure  2.  Secondary structure prediction of GmMADS4

Capital letters indicate amino acid sequence of GmMADS4 protein; Lowercase letters represent different secondary structures, where h stands for α helix, c for random coil, e for extended strand, and t for β turn

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2.3   MADS家族蛋白进化树分析

为了预测GmMADS4基因的功能，本研究将GmMADS4蛋白序列与已报道的模式植物拟南芥和水稻MADS家族成员，以及大豆MADS家族其他成员进行了系统进化树分析。这些MADS成员大致可以分成2个亚家族，分别为亚家族I和亚家族II (图3)。I型MADS成员包括已报道的拟南芥的AtAGL23/62和水稻的OsMADS78/79；GmMADS4属于II型MADS成员，该类型的MADS成员还包括拟南芥的AtAP1、AtAG、AtSOC1、AtANR1、AtP1、AtAP3、AtAGL12/14/15/16/17/18/21，水稻的OsMADS20/23/25/26/27/62，大豆的GmNMHC5、GmNMH7、GmSEP1以及GmAGL1/11/15，其中GmMADS4与拟南芥的AtAP3序列相似性较高(图3)。

图  3  MADS家族蛋白系统进化树分析

Figure  3.  Phylogenetic tree analysis of MADS family proteins

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2.4   GmMADS4基因启动子顺式作用元件分析

取GmMADS4基因5'UTR上游2 000 bp的序列为启动子，分析其中的顺式调控元件，结果表明，在GmMADS4基因启动子中含有多种类型的顺式调控元件。其中最多的是典型的光响应元件，有22个，包括9个Box 4、5个G-Box、3个GT1-motif、2个TCCC-motif、2个AE-box和1个LAMP-element元件。其次是植物激素响应相关的元件，有9个，其中响应茉莉酸甲酯的有4个，包括2个CGTCA-motif和2个TGACG-motif；还有4个脱落酸响应元件ABBRE和1个赤霉素响应元件P-box。除了光响应和激素响应元件外，还包括胚乳表达相关元件GCN4_motif、分生组织表达相关元件CAT-box等参与生长发育调控的元件，厌氧感应元件ARE，以及MYB和MYC转录因子介导的多种逆境胁迫响应元件。

2.5   GmMADS4互作蛋白预测

通过STRING网站对GmMADS4的互作蛋白进行了预测，结果发现，有5个候选蛋白可能与GmMADS4 (GLYMA01G37470.1)存在互作关系(图4)。其中，GmMADS8 (GLYMA13G09660.1)、GmMADS9 (GLYMA14G24590.1)、GmMADS10 (GLYMA04G42420.1)、GmMADS7 (GLYMA06G12380.1)为MADS家族蛋白，GmLFY1 (GLYMA04G37900.2)为LEAFY家族蛋白。

图  4  GmMADS4互作蛋白预测

不同颜色的圆球表示不同的蛋白，其中红色为GmMADS4；直线相连的2个蛋白预测存在相互作用

Figure  4.  Interaction protein prediction of GmMADS4

Different colored spheres indicate different proteins, red is GmMADS4; Two proteins connected in a straight line are predicted to have an interaction

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2.6   GmMADS4基因克隆及超量表达载体构建

为了分析GmMADS4基因功能，本研究用特异性引物OE-GmMADS4-F/R 通过PCR克隆了GmMADS4基因ORF全长，结果如图5A所示；PCR扩增获得1条单独的条带，位置在750 bp左右，与GmMADS4基因ORF全长732 bp大小一致。经测序无碱基突变后，进一步连接到超量表达载体pTF101s上。图5B为GmMADS4-pTF101s重组质粒酶切检测，与重组质粒酶切前(泳道1)相比，经Sac I和Xba I限制性内切酶双酶切后(泳道2)在略低于800 bp的位置出现了1个条带，大小与GmMADS4基因ORF全长一致，说明重组质粒构建成功。

图  5  GmMADS4基因克隆及酶切检测

A：GmMADS4基因PCR扩增，B：GmMADS4-pTF101s重组质粒酶切检测；M代表DNA marker，P代表PCR产物，泳道1为重组质粒酶切前，泳道2为重组质粒酶切后

Figure  5.  Cloning and enzyme digestion of GmMADS4

A: PCR amplification of GmMADS4 gene, B: Digestion verification of GmMADS4-pTF101s recombinant plasmid; M represents DNA marker, P represents PCR product, lane 1 is the recombinant plasmid before digestion, lane 2 is the recombinant plasmid after digestion

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2.7   GmMADS4在大豆不同部位的表达模式

为了分析GmMADS4基因主要在大豆哪个部位发挥功能，本研究通过RT-qPCR分析了该基因在大豆根、茎、叶、花和种子中的表达量(图6)。在大豆根、茎、叶、花和种子中都能检测到GmMADS4基因的表达；值得注意的是，GmMADS4主要在花和种子中有较高的表达量，尤其在花中的表达量最高，而在根、茎和叶中表达量相对较低，尤其在茎中表达量最低(图6)。GmMADS4基因在花中的表达量约是种子中的1.7倍，同时约是根、茎和叶中表达量的50倍以上。

图  6  GmMADS4在大豆不同部位的表达分析

Figure  6.  Expression pattern analysis of GmMADS4 in different soybean organs

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2.8   GmMADS4在大豆根和叶中响应缺素的表达模式

进一步分析了GmMADS4基因对缺氮、缺磷、缺钾胁迫的响应，结果表明GmMADS4在大豆叶和根中响应多种非生物胁迫(图7)。GmMADS4在大豆根中主要受缺氮和缺磷处理上调表达，而对于缺钾处理没有响应；与正常处理的对照组相比，GmMADS4在缺氮和缺磷处理下的表达量分别提高了11.2和6.6倍(图7A)。在大豆叶部，缺氮、缺磷和缺钾处理均上调GmMADS4的表达；与正常处理的对照组相比，GmMADS4在缺氮、缺磷和缺钾处理叶中的表达分别提高了12.0、0.7和5.2倍(图7B)。

图  7  GmMADS4在大豆根和叶中响应缺素的表达模式分析

“*”表示缺素处理与对照相比差异显著(P < 0.05，t检验)

Figure  7.  Expression pattern analysis of GmMADS4 in response to element deficiency in soybean roots and leaves

“*” indicates significant difference between element deficiency treatment and control (P < 0.05, t test)

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2.9   GmMADS4亚细胞定位分析

为了研究GmMADS4蛋白在亚细胞水平的具体定位，本研究通过烟草叶部瞬时转化，将携带GmMADS4融合GFP (GmMADS4-GFP)的农杆菌GV3101转化烟草叶片，通过激光共聚焦显微镜观察荧光位置，其中以GFP空载体为对照。转化GFP空载体的叶片在细胞核、细胞质、细胞膜都有较强的绿色荧光，而转化GmMADS4的叶片主要在细胞核有较强绿色荧光，此外在细胞膜也有微弱的绿色荧光(图8)。这些结果表明GmMADS4主要定位在细胞核。

图  8  GmMADS4亚细胞定位分析

Figure  8.  Subcellular localization analysis of GmMADS4

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2.10   超量表达GmMADS4影响大豆可溶性磷浓度

为了研究GmMADS4基因的功能，本研究进一步利用发根农杆菌K599，通过下胚轴复合植株转化法，获得超量表达GmMADS4的大豆转基因复合植株，即根系为转基因毛根、地上部位正常的大豆植株。将超量表达株系与转化空载体的对照株系在大豆营养液中培养14 d，观察表型。与对照相比，超量表达GmMADS4有促进毛根生长、减缓地上部生长的趋势，但是从毛根、地上部以及整株干质量上看差异均不明显(图9)。超量表达GmMADS4虽然没有改变复合植株的生物量(图10A)，但是显著增加了毛根的可溶性磷含量(图10B)，与对照相比，超量表达GmMADS4转基因复合植株毛根中的可溶性磷含量显著增加51% (图10B)。

图  9  超量表达GmMADS4转基因复合植株的生长表型

Figure  9.  Growth phenotypes of overexpressing GmMADS4 transgenic composite plants

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图  10  超量表达GmMADS4对大豆复合植株生物量和可溶性磷含量的影响

“*”表示对照和超量表达处理差异显著(P < 0.05，t检验)

Figure  10.  Effects of overexpressing GmMADS4 on biomass and soluble phosphorus content of soybean composite plants

“*” indicates significant difference between control and overexpression treatment (P < 0.05, t test)

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3.   讨论与结论

MADS转录因子家族在植物多个生长发育过程中发挥重要的调控作用。本研究克隆了大豆II型MADS成员——GmMADS4，从进化关系上，GmMADS4与拟南芥MADS家族成员AP3的序列相似性最高。AP3属于经典的ABC模型中的B型基因，在花器官识别中扮演重要角色^[23-24]，同时，不同部位表达模式分析表明GmMADS4基因在大豆花中表达量最高，暗示GmMADS4可能在花器官形成和发育中发挥重要作用。在拟南芥花分生组织发育的调控过程中，拟南芥MADS成员SEP3与AG、AP3和PI均存在明显互作，以异源二聚体的形式发挥功能^[25]。本研究通过互作蛋白预测发现GmMADS4与其他4个MADS成员GmMADS7/8/9/10存在相互作用，表明GmMADS4可能以复合体的形式参与调控作用。虽然关于大豆GmMADS7/8/9/10的具体功能还未见报道，但表达模式分析表明GmMADS7/8/9/10这4个成员均主要在花中特异表达^[17]。这些结果表明，GmMADS4可能与其他蛋白互作，以异源二聚体的形式调控花器官的形成和发育。除了在花中高表达，GmMADS4在大豆种子中也有较高的表达量，且GmMADS4启动子中含有胚乳表达相关元件GCN4_motif，暗示GmMADS4还参与大豆种子发育。互作蛋白预测发现GmMADS4与GmLFY1也存在互作，GmLFY1被报道主要在发育中的豆荚和种子中表达，而在茎尖分生组织中不表达，可能参与大豆的种子发育而不是开花^[26]。这些结果表明，GmMADS4可能在大豆种子发育调控中也发挥重要功能。

MADS转录因子已被报道参与植物多种非生物胁迫，并在调控网络中扮演关键角色^[27]。本研究发现，GmMADS4在根和叶中响应缺氮和缺磷胁迫上调表达，同时在叶中也受缺钾胁迫上调表达，暗示GmMADS4可能参与氮、磷或钾元素缺乏胁迫的适应性调控。在拟南芥中，MADS家族成员AtAGL14/19/20/21/44均在根部受缺氮胁迫上调表达，其中，AtAGL20同时还受缺磷胁迫上调表达^[28-29]。超量表达AtAGL44 (也即AtANR1)能够促进拟南芥根系发育，增加侧根数目和长度，且这种调控方式依赖于硝酸根离子的存在^[30]。水稻OsMADS61在根部受缺氮胁迫上调表达^[12]，相反，OsMADS27/57在根部受缺氮胁迫下调表达^{[12, 31]}。其中，OsMADS57已被证明通过直接调控OsNRT2.3a的表达，进而调控水稻中硝酸根离子从根往地上部的长距离运输^[32]。此外，在水稻中多个MADS基因在根部受缺磷胁迫下调表达，如OsMADS23/25/27/57^{[12, 31]}。除了拟南芥和水稻，在小麦180个MADS成员中有54个MADS基因的表达在根部响应缺磷，其中TaMADS21/93/121这3个成员受缺磷胁迫上调表达超过4倍^[33]。但是，关于MADS基因参与磷信号调控功能的报道较少。本研究发现，在大豆毛根中超量表达GmMADS4能够增加毛根中可溶性磷的含量，暗示GmMADS4可能参与调控大豆根系磷稳态。

综上所述，大豆GmMADS4在花和种子中高表达，可能通过与其他转录因子互作参与调控花和种子发育。另一方面，低磷胁迫上调GmMADS4在根系中的表达，且超量表达GmMADS4增加了转基因毛根的可溶性磷含量。因此，GmMADS4可能在大豆耐低磷胁迫中发挥重要调节作用。