Advances in recombinant live vector vaccines for animal viruses
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摘要:
病毒活载体疫苗作为一种新型疫苗，与传统疫苗相比，具有极大的优势与应用前景，是当今与未来疫苗研制与开发的重要方向之一。目前在人类医学和兽医领域，病毒活载体疫苗均取得了大量的研究成果。本文综述了主要的兽用病毒疫苗载体及重组活载体疫苗的最新研究进展，并分析了其发展趋势，为进一步研制新型重组病毒疫苗提供参考。
Abstract:As a new type of vaccine, virus live vector vaccine has great advantages and application prospects compared with traditional vaccine, and it’s an important direction of current and future vaccine development. At present, in the fields of human medicine and veterinary medicine, virus live vector vaccine has achieved a lot of research achievements. In this paper, the latest research progress of main veterinary virus vaccine vectors and recombinant live vector vaccines were reviewed, and their development trends were analyzed, so as to provide a reference for the further development of new recombinant virus vaccines.
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Keywords:
- live vector vaccine /
- animal virus /
- veterinary vaccinology /
- recombinant virus vaccines /
- immunity
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随着畜牧业的不断发展，动物养殖方式规模化，畜禽疫病的防控显得尤为重要。疫苗免疫是预防和控制畜禽疾病最有效、最具成本–效益的措施。目前兽医疫苗领域使用的疫苗主要是传统减毒活疫苗和灭活疫苗。这些疫苗显著降低了一些重大疾病对畜禽生产的危害，为畜牧业发展提供了保证。但随着畜禽养殖水平的发展、疫病防控形势的变化，这些疫苗也显现出缺陷与不足。
减毒活疫苗通常非常有效，因为它们可以诱导细胞免疫和体液免疫反应，其疫苗毒株通常是通过筛选天然弱毒及人工传代致弱获得，这也意味着疫苗毒株研制具有不确定性，研发周期较长，并且致弱毒株存在毒力返强的风险[1]。灭活疫苗通常比较安全，但是不能诱导机体细胞免疫，可能不如减毒疫苗有效，其接种剂量大，成本较高。传统疫苗通常是一种疫苗预防一种疾病，由于需要考虑不同抗原之间拮抗及竞争关系，因此多联多价疫苗较少。近几年，新型病毒疾病的爆发给人类健康和畜禽养殖都造成了极大的威胁，如何快速、有效地制备针对流行毒株的疫苗候选毒株给疫苗研发者提出了挑战。
随着DNA重组技术、病毒反向遗传操作及基因编辑等基因工程技术的发展，疫苗研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡，特别是重组活载体疫苗的研制，越来越引起人们的广泛关注。基因工程重组活载体疫苗是利用基因工程技术将编码病原体保护性抗原的基因导入活载体中使之表达的活疫苗，主要包括重组病毒载体活疫苗和重组细菌载体活疫苗[2]。活载体疫苗兼具灭活疫苗的安全性好及活疫苗的免疫效果好、成本低等优点，减少了毒力返祖的风险；诱导免疫动物产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫；载体中可以插入多个不同病原的抗原基因并同时表达，从而实现一针防多病的目的，为多价疫苗或多联疫苗的研制提供了可能；利用成熟的疫苗载体，可以快速制备针对新发或流行毒株的疫苗候选毒株，大大减少了疫苗毒株的研制周期[3]。
目前用于研究的细菌疫苗载体有沙门氏菌、卡介苗、大肠埃希菌和乳酸杆菌等。用于研究的病毒疫苗的载体包括痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、不分节段的单股RNA病毒等[4]。这些载体广泛用于兽用活载体疫苗研究领域。病毒载体因病毒基因组的复制特点和病毒生物学特性的不同，而应用于不同动物和疫病的预防。本文综述几种疫苗活载体在兽医领域的应用及最新研究进展，旨在为新型疫苗的研制提供有价值的参考。
1. 痘病毒活载体疫苗
痘病毒是基因组最大的DNA病毒，也是最早研究的病毒疫苗载体，1982年首次报道牛痘病毒作为载体表达外源基因[5]，此后人们一直在从事痘病毒载体开发及重组病毒活载体疫苗的研究。痘病毒载体最大优势是容量大，其基因组约180~300 kb，对外源基因插入耐受性强，至少可以容纳30 kb的外源片段而不丧失感染力[6]，可以插入多个外源基因，且有较高的表达水平，具备成为多价疫苗载体的良好前景。痘病毒有大量的非必需片段，其可用作插入外源基因的位点，胸苷激酶基因(Thymidine kinase gene, TK)是常用于外源基因插入的位点[7-8]。此外痘病毒具有增殖滴度高、稳定性好的特点，接种后可诱导细胞免疫和体液免疫，具有持久免疫力，细胞质中完成全部复制过程，不会整合到宿主基因组，因此安全性好[9]。目前主要的痘病毒载体包括痘苗病毒、牛痘苗病毒、鸡痘病毒(Fowlpox viruses, FPV)、猪痘病毒(Swinepox virus, SPV)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus, CNPV)和羊痘病毒(Capripox, CPV)等活载体。痘病毒基因组庞大且不具备感染性，目前还没有足够容量的克隆载体构建反向遗传操作系统，构建重组痘病毒的常规方法是利用同源重组[10]。CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种成熟的基因编辑技术，已应用于痘苗病毒重组病毒疫苗的构建[11]。该技术也具有高效率、特异性、简单性和低成本等特点，特别适用于具有多种免疫原疫苗的构建。
重组痘病毒是最早用于商品化的兽用活载体疫苗，20世纪90年代之后，表达新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)F基因的重组鸡痘病毒、表达NDV HN和F基因的重组鸡痘疫苗和表达H5 亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)血凝素(HA)蛋白的禽痘载体疫苗陆续通过美国农业部(USDA) 的认证并商品化[12]。除此之外，兽用疫苗领域应用禽痘病毒载体已成功表达了传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV) VP0、VP2和VP243基因[8, 13]、马立克氏病病毒(Marek s disease virus, MDV) gB和gC 基因[14-15]、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)gB和gD 基因[16-17]、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV) S1 基因[18-19]、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP3和GP5基因[20]、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)ORF1和ORF2基因[19]以及口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)的衣壳蛋白[19]等，IL-18、IL-6、IFN II等细胞因子基因也与抗原基因分别或串联插入载体中，在机体中同时表达增强载体疫苗免疫效力[21-23]。山羊痘载体已应用于反刍类动物疫苗研究，包括表达O型FMDV VP1基因[24]、牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)H蛋白[25]、PPRV H蛋白[26]、蓝舌病病毒(Blue tongue virus, BTV) VP7蛋白[27]等疫苗的开发。猪痘病毒载体应用于表达PCV2型Cap蛋白、PRRSV多表位肽[28]、猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)保护性抗原[29]的活载体疫苗的构建。金丝雀痘病毒载体系统已被用作一系列兽医疫苗的平台，包括针对犬瘟热病毒、猫白血病病毒、狂犬病病毒和马流感病毒等疫苗[3]。
2. 疱疹病毒活载体疫苗
疱疹病毒的基因组较大(约150 kb)，可以插入多个外源基因。疱疹病毒构建的活载体疫苗可诱导特异性黏膜免疫，可以在神经细胞中建立无症状的潜伏感染，实现一次接种，终生免疫。作为兽用疫苗活疫苗载体研究的疱疹病毒主要包括伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(Duck enteritis virus, DEV)和牛疱疹病毒I型等。其中，HVT和PRV活载体疫苗是病毒基因工程疫苗研究中的热点。由于病毒基因组较大，早期重组疱疹病毒构建方法与重组痘病毒方法相同，依赖同源重组技术。随着细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)的发明，有了足够容量的载体容纳疱疹病毒基因组，使得构建疱疹病毒感染性克隆成为现实。目前重组疱疹病毒构建主要基于BAC感染性克隆，利用Red/ET等重组工程技术对病毒基因组进行修饰[30]。目前，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术被报道用于PRV[31]、DEV[32]病毒载体疫苗的构建中。不同于痘病毒只能利用自身启动子，疱疹病毒可以利用CMV、SV40和CAG等启动子启动外源基因表达，病毒本身的gB、TK基因的启动子对启动外源基因的表达也有良好的效果[33]。
PRV宿主范围很广，猪是唯一的贮存宿主，PRV也感染犬、羊、牛、猫、兔、狐狸、水貂等动物，但不感染人。Bartha-K61等疫苗毒株在世界养猪业已使用数十年，其安全性已得到广泛的认同，具有成为猪用疫苗载体的潜力。通过对PRV基因功能的研究发现，gE、gI、gG、gC 及TK 等基因为复制非必须区，其中gE、gI及TK为毒力相关基因，通过敲除强毒株的gE、gI及TK实现病毒减毒致弱，同时这些位点可作为外源免疫原基因的插入位置，构建二联或多联多价疫苗[34]。Lei等[35]在gE/gI/TK基因缺失株rPRV-TJ的基础上构建了一种表达CSFV E2蛋白的重组病毒，经过免疫的猪可产生抗PRV或抗CSFV的中和抗体。Klingbeil等[36]利用Bartha株BAC克隆，将gG基因替换为密码子优化后的H1N1型猪流感病毒(SIV)HA基因，重组病毒单次免疫可诱导高水平的HA特异性抗体。Hong等[37]以PRV TK/gE缺失株为载体，构建能共同表达FMDV蛋白前体P1-2A和猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)VP2蛋白的重组PRV，结果表明该重组病毒具有较高的免疫原性和安全性。徐高原等[38]用gG基因缺失的PRV表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV) 的NS1 蛋白，接种小鼠后能够抵抗PRV强毒的攻击，也获得了对JEV的细胞免疫和体液免疫反应。邓晓辉[39]在TK基因缺失的PRV ZJ株BAC克隆的基础上在gE基因插入PPV VP2和PCV2 Cap串联基因，2种抗原基因在重组病毒中均能够表达。除了病毒性抗原基因，寄生虫抗原基因如日本血吸虫谷胱甘肽−S转移酶(Sj26GST)和脂肪酸结合蛋白基因(SjFABP)[40]、鼠弓形体SAG1和MIC3 蛋白基因[41]均可以利用PRV载体表达。
HVT已被全世界家禽业广泛用作针对马立克氏病(Marek’s disease, MD)的安全有效的疫苗。HVT也被认为是构建表达外源抗原基因多价重组活疫苗和诱导产生保护性免疫最有效载体之一。HVT在有母源抗体存在的情况下也能引起持续性感染，将单剂疫苗接种于18胚龄的鸡胚或1日龄雏鸡即可诱导终生免疫。第1代rHVT疫苗是使用基因组重组技术生产的，这种方法需耗费大量时间。目前广泛使用的方法是将HVT基因组克隆到黏粒(Cosmid)或细菌人工染色体(BAC)中，利用反向遗传操作，使其他病毒的保护性抗原基因能够快速、有针对性地插入到HVT基因组中[42]。Iqbal[43]在携带HVT基因组的BAC克隆的基础上，将高致病性H7N1型 AIV病毒的HA基因插入HVT基因组中。重组病毒不仅提供针对高致病性H7N1型AIV的保护，而且还提供针对强毒MDV的保护。Gergen等[44]将NDV F基因以及ILTV gD和gI基因插入HVT基因组非必需区域，构建一个双重组HVT，通过卵内途径接种单剂量HVT-NDV-ILT的鸡可以产生高水平保护力，免受速发型NDV、ILTV和MDV强毒的攻击(保护率分别为97%、94%和97%)。此外，HVT被用于表达H5N1型AIV HA和NA基因[45]、NDV HN基因和F基因[46]、IBDV VP2 基因[47]、禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)env/gag基因[48]、艾美球虫EalA基因[49]、鸡衣原体多型外膜蛋白片段(PmpD-N)[50]的保护性抗原的载体。由于HVT作为禽用疫苗载体具有巨大优势，表达NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白和H5 AIV的HA抗原的重组HVT (rHVT)疫苗在美国、巴西等国家获得批准使用[51-53]。在我国传染性法氏囊病病毒、火鸡疱疹病毒载体活疫苗(vHVT-013-69株)也已获得商业化应用。除了HVT载体，其他禽类疱疹病毒也被开发用于疫苗载体，例如MDV-2型的SB-1株[54]和MDV-1型的CVI988株[55]，这2种MDV疫苗载体增加了禽类病毒疫苗载体的选择。
DEV减毒活疫苗具有安全性高、易于生产的优点，能够诱导广泛和强烈的免疫应答，在疫苗接种后数小时内诱导保护性免疫，这些特征使DEV成为非常理想的水禽活病毒载体。目前可用于修饰DEV的方法策略与HVT基本相同，利用同源重组或利用感染性克隆进行反向遗传操作。Liu等[56]通过同源重组方法将鹅源的H5N1型高致病性禽流感病毒(HPAIV)的HA基因插入US2或gI/gE基因缺失位点，以构建表达AIV HA抗原的2株重组DEV病毒。Wang等[57]构建了DEV中国疫苗株C-KCE BAC克隆，利用同源重组将H5N1型AIV HA基因插入DEV UL55区并拯救出重组病毒，该重组病毒对DEV及H5N1型AIV均有良好的保护效果。Zou等[58]将1型和3型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV) VP1基因串联插入疫苗株C-KCE UL27和UL26之间，重组病毒对1型和3型DHAV攻毒均能完全保护。陈柳等[59-60]在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,分别构建表达小鹅瘟病毒(GPV)主要免疫原蛋白VP2基因和鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因的重组病毒, 重组病毒对雏鸭和雏番鸭100%安全，可诱导鸭产生外源蛋白特异性抗体，对DEV和DTMUV攻毒保护率均达到100%。Zou等[61]首次将CRISPR / Cas9系统应用于修饰DEV基因组，构建重组DEV病毒C-KCE-HA / PrM-E，可以作为预防H5N1型AIV、DTMUV和DEV感染的三联活疫苗候选毒株。
ILTV疫苗是家禽生产中广泛使用的疫苗，可通过滴鼻、喷雾或饮用水免疫预防多种疾病，操作便捷。Pavlova等[62]研究表明gE、gI和pUS9基因缺失的ILTV可用于重组病毒载体。Veits等[63]的研究表明UL0对于体外病毒复制是不必要的，UL0缺失导致毒力减弱但仍具有良好的免疫保护效果，可插入外源基因，是一个良好的重组疫苗载体。Shao等[64]在US9缺失的ILTV突变体中插入基因VII型NDV的F基因，试验证明重组病毒比LaSota疫苗更有效地限制了基因型VII NDV的复制，接种较低剂量疫苗也可提供足够的临床保护。
3. 腺病毒活载体疫苗
腺病毒种类较多，宿主范围广，不同腺病毒基因组大小差异较大(26~45 kb)。腺病毒可诱导先天性和获得性免疫[4, 65]，能引起强烈的体液免疫和细胞介导的抗原特异性应答[66]，并可通过注射和口服接种。对于兽用疫苗，腺病毒良好的热稳定性具有巨大的优势，使用简单生产工艺和疫苗佐剂即可在45 ℃环境中保存6个月不失活，这对于偏远农牧地区疫苗保存和使用具有重要意义[67]。动物腺病毒(AAV)和人腺病毒(HAV)主要抗原决定衣壳蛋白之间的相似性较小，血清交叉中和能力较弱，AAV能感染人体细胞但不能复制，因此不存在针对性免疫应答。同时HAV与AAV缺乏同源序列，因此共复制和重组现象概率较低。因此AAV应用于人载体疫苗更为安全，同理，HAV也适用于动物载体疫苗[4]。
目前构建重组腺病毒活载体疫苗与培养的技术简单而成熟。腺病毒作为载体经历了3个阶段。第1代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第1代腺病毒载体[68]，病毒失去了复制能力，此类型载体在未经过纯化时可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应，且产生了启动抑制外源基因表达的肿瘤坏死因子，纯化后可以安全使用，体内表达周期可达4周；第2代腺病毒载体：将 E2区表达 DNA 结合蛋白的基因进行温度敏感性突变，使病毒在不适宜温度范围内晚期基因产物不表达，病毒滴度急剧下降，目前应用相当局限；第3代腺病毒载体缺失了全部或大部分腺病毒基因，仅可保留ITR和包装信号共约500 bp的顺式作用元件，需要有辅助病毒和互补细胞系才能包装产生病毒颗粒[69]。这一载体系统需要腺病毒突变体作为辅助病毒。目前兽用疫苗研究中广泛的腺病毒载体仍是第1代腺病毒载体，常用的有禽腺病毒(FAdV)和人腺病毒5型载体(Human adenovirus type 5 vectors, Ad5)。基于腺病毒的兽医疫苗的开发有几个原因：1)某些烈性传染病没有针对性的良好疫苗，例如裂谷热病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)，表达RVFV表面糖蛋白的重组腺病毒单次剂量免疫可保护绵羊、山羊和牛免受RVFV致命威胁[70]；2)现有的疫苗价格昂贵，例如狂犬病病毒灭活疫苗[71]，因此无法用于常规预防性接种，而以重组腺病毒为基础的狂犬疫苗成本较低，用于非人类灵长类动物，具有长达22个月的保护[71]；3)现有的疫苗病毒易被母源抗体中和，从而早期免疫无效，例如犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)疫苗，而表达CDV糖蛋白的重组腺病毒疫苗对高母源抗体的幼犬也有效[71]。
禽腺病毒FAdV-I ORF8、ORF9、ORF10可作为外源基因插入位点，目前已报道的FAdV载体疫苗有表达IBDV的VP2 基因[72]、IBV的S1基因[73]和AIV HA基因重组禽腺病毒，其都能起到良好的免疫保护效果。目前腺病毒载体在禽类上主要用于禽流感病毒疫苗的开发[74-76]。人腺病毒5型载体(Ad5)系统可以作为猪用疫苗载体，已有研究人员构建出表达FMDV核衣壳蛋白[77]、CSFV E2蛋白[78]和PRRSV GP5蛋白[79]的重组腺病毒。
重组腺病毒的另一种用途是开发免疫区分型 (Differentiating infected from vaccinated animals, DIVA)疫苗。重组腺病毒疫苗通常只表达1或2种来自相关病原体的蛋白，即主要中和抗体反应的抗原。因此，对疫苗的免疫反应只会是正常感染的一个子集，通常可以开发一种检测方法来区分疫苗接种和野毒感染的动物。在接种DIVA疫苗的地区也可以进行监控疫病感染，对于国际上通报畜禽病原体，DIVA疫苗提供了一种鉴别感染的方法，从而保护健康动物的国际贸易。例如小反刍兽疫病毒(PPRV)，它是绵羊和山羊的一种重要疾病病原，对发展中国家造成严重影响。现有的PPRV减毒活疫苗不可能进行DIVA检测。而表达PPRV表面糖基蛋白的重组腺病毒可以保护绵羊/山羊免受疾病的侵袭[80]，由于缺乏对高免疫原性核衣壳蛋白的抗体，这种动物可以很容易地与受感染的动物区分开来[80]。并且这种疫苗的最低有效剂量相对较低[81]，这使得DIVA疫苗即使对价值较低的绵羊和山羊家畜也具有成本效益。
4. 新城疫病毒活载体疫苗
新城疫病毒(NDV)疫苗广泛用于养禽生产中，NDV作为载体具有很多优点：NDV疫苗免疫保护效果好；病毒重组率低，安全性高；可在鸡胚上增殖，生产成本低；比较稳定，可以 通过饮水或气雾方式进行免疫；可以诱发黏膜免疫；表达蛋白少，对宿主的免疫干扰小。作为RNA病毒，重组新城疫病毒构建依赖反向遗传操作系统。1999 年，Peeters等[82]构建基于T7 RNA聚合酶的NDV反向遗传学系统 并拯救出NDV Lasota疫苗株。此后NDV反向遗传操作系统逐渐发展成熟，也为NDV活载体疫苗的发展打下基础。Nakaya等[83]利用NDV反向遗传操作系统将AIV HA基因插入到NP上游，NP与P、P与M、M与F、F与HN基因之间及L基因下游均能拯救获得重组病毒，AIV HA基因也均可表达，外源基因插入位置越接近NDV基因组的3′末端表达量越高，但对NDV复制的干扰也更强，Zhao等[84]成功将GFP基因插入NDV VG/GA 疫苗株不同的基因之间(NP/P、P/M、M/F、F/HN 和HN/L)并拯救重组病毒。通过分析不同重组病毒GFP mRNA的表达量发现，P和M基因之间的非编码区是外源基因在NDV基因组中的最佳插入位置。有研究人员将NDV的F和HN蛋白的胞外域用禽副黏病毒2型(APMV-2)或禽副黏病毒8型(APMV-8)的对应部分替代，在此基础上嵌合H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白，拯救的重组嵌合NDV与NDV特异性抗体反应性低，免疫商品鸡后，能克服NDV母源抗体的干扰，并能有效诱导产生针对HA的抗体，可抵抗H5N1亚型HPAIV的攻击[85-86]。目前NDV载体主要用于表达H5、H7、H9型HA及NA基因疫苗的研制。在我国，以LaSota疫苗株为载体构建的表达AIV H5亚型HA基因的重组新城疫病毒所研制的禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rL H5株)于2007年获得新兽药证书[87]。报道显示，以NDV作为载体成功构建的表达IBDV的VP2基因[86]、ILTV的糖蛋白gB和gD基因[88]和IBV S1基因[89]的重组NDV具有良好的安全性和免疫保护力。
5. 其他动物病毒载体疫苗
水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(Oral poliovirus vaccine, OPV)在人用载体疫苗方面研究较多，在动物疫苗方面也有少量应用。柯勇等[90]以VSV为载体，利用反向遗传操作在G和L基因间插入猪流行性腹泻病病毒(Porcine epidemic diarrhoeal disease virus, PEDV)纤突蛋白S基因并成功拯救重组病毒，重组病毒能够有效激发机体产生高水平中和抗体。OPV可作为载体表达口蹄疫病毒的抗原表位，重组病毒可以诱导动物产生特异性中和抗体，保护试验动物不受口蹄疫病毒攻击[12]。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作为一种RNA病毒，有学者将其疫苗毒株开发为疫苗载体，例如以PRRSV为载体成功构建了表达CSFV E2蛋白[91]和PCV2 ORF2基因[92]的重组病毒。鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于γ冠状病毒，是基因组最大的RNA病毒之一，研究人员构建了IBV疫苗株反向遗传系统，利用反向遗传操作技术将纤突蛋白S1基因替换成流行毒株S1基因，重组疫苗株能够对供体流行毒株的攻击提供保护[93]。Yang等[94]利用IBV H120株反向遗传操作系统将5ab基因替换为NDV HN基因，拯救获得的重组病毒能够表达蛋白并能诱导机体产生保护性抗体。
6. 展望
不同的病毒载体在刺激机体免疫方面存在差异，例如在小鼠的疟疾模型中，与腺病毒载体相比，痘病毒MVA载体诱导较低的CD8 + T细胞应答，在第1周即达到峰值，且能增加TCM细胞(Central memory T cells)的产生。而腺病毒载体持续抗原表达，导致动力学延迟，TE(Effector T cells)和TEM(Effector memory T cells)反应缓慢且持续，CD8 + IFN-γ+细胞在3周时达到峰值，这种现象可能与抗原表达的持续时间有关[95]。此外，痘病毒载体和腺病毒载体易受母源抗体及体内中和抗体影响，导致免疫失败，因此在腺病毒载体选择上常使用不同血清型的异源动物的腺病毒作为载体，痘病毒载体在插入免疫原基因的同时会插入白介素或干扰素等免疫调节因子，提高免疫应答的同时减少痘病毒载体本身的免疫抑制反应。而疱疹病毒HVT作为载体受母源抗体影响小，一次免疫后终生持续存在。在选择能够诱导特定抗原基因的适当免疫应答的病毒载体时，应考虑以上载体性质。目前有研究将不同病毒载体与已知或新的佐剂组合，增加或进一步调节引发的免疫应答。
兽医疫苗学作为一门学科正面临着许多挑战。目前畜牧业集约化养殖模式也催生了一系列问题，疫病防控便是其中最重要的问题，生产中使用的大多数疫苗都是几十年前开发的，由于长期疫苗选择，病毒抗原漂移与转换造成病毒抗原特性发生了很大的变化，导致疫苗对流行毒株效果不佳。此外，新的疫病如高致病性禽流感、非洲猪瘟等不断出现，也给畜牧业造成了巨大的威胁。高强度的疫苗免疫对动物生长及生产造成了负面影响，同时对于规模化养殖场也是巨大的劳动负担。对于这些问题，病毒活载体疫苗提供了一种解决方案。利用病毒活载体可以快速获得针对流行毒株的疫苗候选毒株，大大缩短了疫苗研发时间；构建多联多价疫苗可以减少免疫次数及改变免疫方法，减少了免疫工作量。同时病毒活载体疫苗的研制也对疫苗研发者提出了更高的要求，在病毒载体、抗原基因的选择、插入基因位置、病毒稳定性与外源基因表达量、佐剂选择等方面做出调整与优化才能最大程度发挥载体疫苗的效果。目前使用腺病毒、疱疹病毒和痘病毒作为活疫苗载体，在人类医学和兽医学领域都得到了广泛的研究，作为一种转基因产物，其安全性仍是人们最关心的问题。进一步提高病毒活载体疫苗的安全性与靶向性是未来载体疫苗发展的方向。活载体疫苗等新型疫苗显示出广阔的应用前景，其具备的一系列显著优势必将得到更加深入和广泛的研究与应用，并将为畜禽等动物传染性疾病防治以及食品安全和人类健康发挥重要作用。
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