Prevention of diapause in silkworm eggs by hyperoxia method
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摘要:目的
比较高浓度氧处理法(高氧法)与传统HCl处理法(HCl法)阻断蚕卵滞育效果的差异，探讨高氧法阻断滞育在家蚕Bombyx mori转基因技术体系上的应用。
方法采用高氧法和HCl法在产后20 h处理二化性蚕品种‘大造’，比较孵化率、孵化时间，调查高氧法的最佳处理条件；将高氧法应用于一化性蚕品种‘土耳其’和转基因二化性蚕品种‘大造’，调查其对一化性蚕品种蚕卵阻断滞育效果及转基因二化性蚕品种显微注射后蚕卵阻断滞育效果。
结果高氧法对二化性蚕卵在孵化率、孵化时间上都与HCl法有相近的阻断滞育的效果，其最佳条件为产卵后20 h用体积分数为70%的O2处理40 h；该方法也能成功阻断一化性蚕品种，孵化率达(71±20)%；高氧法处理的显微注射转基因家蚕卵孵化率达到了(49±9)%，而对照组的孵化率为0。
结论高氧法为今后生产上替代HCl法，采用安全环保的蚕卵阻断滞育技术，解决转基因蚕卵阻断滞育和提高转基因家蚕育种进度的关键问题提供了可行的新方法。
Abstract:ObjectiveTo compare the differences between the effects of high oxygen concentration treating mehod (hyperoxia method) and traditional HCl treating method (HCl method) on prevention of diapause in silkworm (Bombyx mori) eggs, and investigate the application of hyperoxia method in transgenic technology system of silkworm.
MethodThe bivoltine silkworm‘Dazao’ were treated by hyperoxia method and HCl method on the 20th hour after spawning. The hatching rate and incubation period were compared, and the best condition of hyperoxia method was investigated. The univoltine silkworm‘Tuerqi’ and transgenic bivoltine silkworm‘Dazao’were treated by hyperoxia method. The effects of hyperoxia method and microinjection on blocking univoltine silkworm diapause were investigated.
ResultHyperoxia method had similar dispause prevention effects with HCl method considering hatching rate and incubation duration. The best condition was treating 40 hours by 70% (φ) O2 after spawning for 20 hours. Hyperoxia method could successfully prevent diapause in univoltine silkworm eggs. The hatching rate was (71±20)%. The hatching rate of micro-injected transgenic silkworm eggs treated by hyperoxia method approached (49±9)%, while that of control group was 0.
ConclusionHyperoxia method is a feasible new method for replacing HCl method in the future production, enables safe and environmental friendly prevention of diapause in silkworm eggs, solves key problems of diapause prevention in transgenic silkworm eggs, and improves breeding progress of transgenic silkworms.
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Keywords:
- silkworm /
- diapause prevention /
- hyperoxia method /
- transgene /
- scanning electron microscopy
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稻田养鱼是根据生态循环农业和生态经济学原理，利用稻田湿地生态系统养殖水生动物，实现生态系统良性循环的高效种养模式[1]。与常规水稻Oryza sativa单作相比，稻鱼共生系统中养殖的田鱼在稻田中取食、扰动、跳跃、游动等活动，均有利于将环境中本不易吸收的氮形态转变成易于被水稻吸收的有效氮形态，促进系统中氮素的吸收、利用和迁移，减少氮素流失，同时田鱼产生的排泄物又可增加田间肥力，为水稻提供养分，提高水稻产量[2-6]。然而，与常规水稻单作相比，目前稻鱼共生模式的水稻产量仍相对较低且不稳定，这可能与稻鱼共生系统中通常仅施用一次基肥、不施或少施穗肥和粒肥而使得水稻生长中后期养分供应不足有关。
优化氮肥运筹管理能够显著提高水稻氮肥利用率和水稻产量[7-8]。大量研究表明，氮肥后移作为优化水稻氮素供需关系的措施，对水稻氮肥吸收利用率和产量均有明显的促进作用[9-11]。Pan等[12]的研究结果表明，相比农民种植习惯，氮肥减量(180 kg·hm−2)和后移(基蘖肥、穗肥质量分数分别为60%、40%)可有效提高氮肥利用率和水稻产量。Guo等[13]的研究结果也表明，与农民施氮习惯(350 kg·hm−2，基肥、分蘖肥、穗肥质量分数分别为37.1%、37.1%、25.8% )相比，氮肥减量和后移(240 kg·hm−2，基蘖肥、穗肥质量分数分别为40%、60%)使水稻的氮肥农学利用率提高了52.5%。其主要原因是氮肥后移增加了水稻生长中后期对氮素的吸收和积累，从而促进水稻高产和提高氮肥利用率，减少氮肥流失[14-15]。因此，明确氮肥在稻鱼共生系统中的氮素循环规律是合理施肥的基础，对促进水稻生长、提高水稻产量和氮肥利用率、减少氮素流失具有重要的意义。
本研究通过大田试验，以杂交稻‘泰丰优208’和常规稻‘19香’为试验材料，设置稻鱼共生模式下的氮肥运筹管理试验，分析稻田水稻生长情况、水稻产量及其品质、田鱼产量及其品质、稻田水体环境等对氮肥后移处理的响应，旨在探究稻鱼共生模式下氮肥后移对水稻和田鱼产量及其品质的影响，为稻鱼共生模式提供更适宜的氮素运筹管理方法，以稳定稻鱼共生系统水稻产量和田鱼产量，提高稻田经济效益。
1. 材料与方法
1.1 试验地概况
试验于2023年早、晚季(3月至11月)在广东省农业科学院水稻研究所大丰试验基地(113°23′ E，23°17′ N)进行。该基地位于广州市天河区，属珠江三角洲地区，冬季温暖，夏季炎热，光照充足，雨量充沛，属于亚热带季风气候，年降雨量为
2680 mm，年降雨134 d，年平均气温23.7 ℃。试验田土壤为沙壤土，土壤基本理化性质：pH为5.88，总有机质25.24 g·kg−1，全氮1.40 g·kg−1，全磷1.04 g·kg−1，全钾12.25 g·kg−1，碱解氮78.04 mg·kg−1，有效磷9.78 mg·kg−1，速效钾81.12 mg·kg−1。1.2 供试材料
供试水稻品种选用近年多次获得全国优质稻食味鉴评金奖的高产优质杂交稻‘泰丰优208’(全生育期110~112 d)和广东丝苗米优质香稻常规籼稻品种‘19香’(全生育期114~117 d)，二者均由广东省农业科学院水稻研究所提供。供试禾花鱼Cyprinus carpio品种选用‘乳源石鲤1号’，该品种具有体型短圆、尾柄较短、跳跃逃逸能力弱、生长快、成活率高、鱼骨较软、肉质嫩滑等特点，适合在稻田中养殖，是我国第1个审定用于稻田养殖的禾花鱼新品种，鱼苗由中国水产科学研究院珠江水产研究所提供。
1.3 试验设计与田间管理
试验于2023年3月中旬进行小区基础设施工程改造，各小区长5.2 m、宽4.1 m，面积21.32 m2。各小区田埂多次用泥土加固，高约0.5 m，且用薄膜包住以防水肥互串。各小区采用水管单独灌溉，排水口加两层U型铁网防止禾花鱼逃逸。各小区中开挖长4.0 m、宽0.5 m、深0.5 m的鱼沟。全部小区采用人工插秧，每穴栽插2粒谷苗，各小区水稻栽插密度一致，株行距均为20 cm。插秧后适时投放鱼苗，每公顷1.8万尾(早季每尾约30 g，晚季每尾约10 g)。放鱼前先用少数鱼苗试水，确认鱼苗正常后，再将鱼苗投入稻鱼共生的小区中。鱼苗投放后第8天开始投料，按田鱼投放质量的3%投料，每天定时定点投喂。水稻全生育期均淹水灌溉，中期不晒田，投放鱼苗前田间保持浅水层，投放鱼苗后至禾花鲤鱼收获前田间水层维持在10~20 cm。所有试验小区的田间管理措施(灌溉水、喷施农药等)一致。
试验采用随机区组设计，设置3个施肥处理：即不施氮肥(M0)、一次性基施氮肥(M1，不添加追肥)和氮肥后移(M2，基肥和追肥质量比为7∶3)，2个水稻品种(杂交稻‘泰丰优208’和常规稻‘19香’)，共6个试验组合，每个试验组合设3个重复小区，共18个小区。在移栽前1 d施入基肥，氮肥为尿素，氮肥总用量早季为150 kg·hm−2、晚季为180 kg·hm−2；磷肥为过磷酸钙(含质量分数为12%的P2O5)375 kg·hm−2；钾肥为氯化钾(含质量分数为60%的K2O)225 kg·hm−2。追肥在水稻幼穗第1次枝梗原基分化期(早季在秧苗移栽后35 d，晚季在秧苗移栽后30 d)时施下。
早稻于3月7日播种育秧，4月7日插秧，4月17日放鱼苗，7月13日(‘泰丰优208’)和7月23日(‘19香’)收割测产，7月24日田鱼全部收获称质量；晚稻于7月28日播种育秧，8月10日插秧，8月28日放鱼苗，11月12日收割测产，11月13日田鱼全部收获称质量。
1.4 测定指标
1.4.1 水稻农艺性状
于早稻、晚稻的穗分化期(PI)、抽穗期(HD)和成熟期(MA)，分别在每小区内标记连续12穴水稻植株，调查记录每穴的茎蘖数和有效穗数。在穗分化始期和抽穗期，每小区选取具有代表性水稻植株6穴，用SPAD-502便携式叶绿素仪(Osaka，Japan)测量最新完全展开叶片的SPAD值。在水稻穗分化始期、抽穗期和成熟期，在每个小区内选取代表性水稻植株12穴，成熟期分为穗和茎叶，带回室内放入鼓风干燥箱，105 ℃杀青20 min后调到75 ℃烘干至恒质量后称质量，以此测定水稻植株地上部的干物质量。
1.4.2 稻田水质环境参数
在追肥前1 d和追肥后连续10 d(其中早季种植‘19香’的处理小区由于该品种生育期较晚，采样时间相对提前了3 d，但总采样时间仍为11 d，晚季则根据2个水稻品种的生育期来制定采集水样计划)，采用美国Hach HQ4300多参数水质分析仪(Hach Company，CO，USA)监测水质，用PHC10103电极测定水体pH、用LDO10103电极测定水体溶解氧浓度、用CDC40103电极测定水体电导率。同时，在稻田内按5点取样法用针筒抽取水样并混匀后装入棕色瓶中，带回实验室经普通滤纸(直径12.5 cm)过滤后，采用全自动流动分析仪(AA3，Bran+Luebbe，Germany)测定水体总氮、铵态氮(NH4+−N)和硝态氮(NO3−−N)含量。
1.4.3 水稻产量及其构成要素
在水稻成熟期，取代表性植株12穴，手工脱粒，自然风干，再采用风选法将实粒和空瘪粒分开。考种时，测定每穗总粒数、单位面积总粒数、结实率和千粒质量。测定小区产量时，在每个重复小区中间收割5 m2，脱粒晒干后进行风选，清除杂质和空瘪粒，称量稻谷总质量。取3个100 g于105 ℃烘干至恒质量后称质量，计算含水量，并折算成含水量14.0%的产量。
1.4.4 水稻氮素吸收和利用效率
水稻植株各器官样品消煮后，采用全自动连续流动分析仪(AA3，Bran+Luebbe，Germany)测定氮元素含量。称取烘干磨细后的植物样品0.2 g置于消化管中，加入浓硫酸5 mL，摇匀。在消化炉上先低温缓缓加热，待分解冒白烟逐渐升高温度，当溶液全部呈棕黑色时，从消煮炉上取下消化管，逐管逐滴加入2 mL 9.79 mol·L−1双氧水，逐管摇匀，再加热至沸腾，消煮约30 min，稍冷后重复加双氧水再消煮，如此多次重复，每次添加双氧水的量逐次减少，等消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热约10 min，除去剩余的双氧水，取下消煮管冷却后，用蒸馏水将消煮液完全转移至50 mL容量瓶中，待上机测定。氮素吸收利用率(REN)=(施氮区植株吸氮量−无氮区植株吸氮量)/施氮量×100%，氮素农学利用率(AEN)=(施氮区产量−无氮区产量)/施氮量，氮肥偏生产力(PFPN)=成熟期稻谷产量/氮肥施用量，氮素收获指数(HIN)=成熟期稻谷氮素积累量/成熟期地上部氮积累总量×100%。
1.4.5 田鱼存活率及产量
在水稻成熟期，将各小区禾花鲤鱼全部捕获计数并称总质量，同时随机抽取10条分别称质量，计算禾花鲤鱼产量和存活率等。存活率=收获捕捞的田鱼数量/投放鱼苗数量×100%。
1.4.6 稻米品质
每个处理取自然风干后的稻谷实粒，称取一定质量，用砻谷机研磨成糙米并称质量；随后用精米机将糙米研磨成精米并称质量，并筛选分离出整精米和碎米，将整精米(长度≥ 3/4完整米粒的为整精米)称质量并计算整精米率。选择完整的整精米，使用植物图像分析仪(MICROTEK ScanMaker i800 plus)扫描识别垩白、米粒长度和宽度等外观特征，再用SC-E软件(杭州万深检测科技有限公司)处理图像并计算垩白粒率、垩白度和长宽比。
1.4.7 禾花鲤鱼肉品质
于水稻成熟期，各小区随机抽取10尾鲜活的禾花鲤鱼，委托广东农科监测科技有限公司对各处理的鲤鱼肉的粗脂肪含量、粗蛋白质含量、以及总氨基酸含量进行检测，检测所采用的方法参照国标法GB 5009.6—2016[16]进行。
1.5 数据处理
采用R4.1.0(R Core Team 2021)进行数据ANOVA分析。采用SigmaPlot14.0和R4.1.0进行图表绘制。
2. 结果与分析
2.1 不同施氮处理对水稻生长性状的影响
从图1可以看出，‘泰丰优208’早、晚季M1和M2处理的水稻茎蘖数均显著高于M0处理，而‘19香’仅有穗分化期和成熟期的茎蘖数显著高于M0处理（图1A、1B、2A、2B）。对于水稻叶片SPAD值而言，‘泰丰优208’M2处理在早、晚季的穗分化期和抽穗期均显著高于M0处理，而‘19香’仅在晚季时显著高于M0处理（图1C、1D、2C、2D）。对于水稻地上部干物质量而言，2个水稻品种早、晚季成熟期M2处理的地上部干物质量均显著高于M0（图1E、1F、2E、2F）。对于水稻群体透光率而言，早、晚季抽穗期M1和M2处理的水稻群体透光率均显著低于M0处理（图1G、1H、2G、2H），这主要是因为在穗分化期追施氮肥后促进了水稻生长，提高了叶片叶绿素含量，促进了水稻有效穗的形成和干物质的积累。
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图 1 稻鱼共生系统中不同施氮处理对早季水稻生长性状的影响PI、HD、MA分别表示穗分化期、抽穗期、成熟期；各图中，同一时期柱子上方的不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05，LSD法)。Figure 1. Effects of different N application treatments on growth traits of early season rice in rice-fish co-culture systemPI, HD, and MA indicate panicle initiation stage, heading stage, and maturity stage respectively; In each figure, different lowercase letters above bars of the same stage indicate significant differences among treatments (P<0.05, LSD method).![]()
图 2 稻鱼共生系统中不同施氮处理对晚季水稻生长性状的影响PI、HD、MA分别表示穗分化期、抽穗期、成熟期；各图中，同一时期柱子上方的不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05，LSD法)。Figure 2. Effects of different N application treatments on growth traits of late season rice in rice-fish co-culture systemPI, HD, and MA indicate panicle initiation stage, heading stage, and maturity stage respectively; In each figure, different lowercase letters above bars of the same stage indicate significant differences among treatments (P<0.05, LSD method).2.2 不同施氮处理对稻田水质环境的影响
在稻鱼共生系统中，不同氮肥运筹管理对稻田水体环境的影响程度不同。从图3和图4可以看出，不同水稻品种在早、晚季追施氮肥后，水体pH均有所上升，之后下降至与M1、M0处理相近的水平（图3A、3B、4A、4B）。早季时M2处理在追施氮肥后对水体溶解氧浓度影响较小，与M0和M1处理相比均无显著差异（图3C、3D）；而晚季时M2处理的水体溶解氧浓度在施肥后第3~4天显著高于M0和M1处理（图4C、4D）。早、晚季M2处理在追施氮肥后的水体电导率则立即上升，且显著高于M0和M1处理，但‘泰丰优208’在2 d后开始下降，‘19香’在1 d后开始下降，二者均在第4~5天后降低至与不施氮小区相当的水平（图3E、3F、4E、4F）。在追施氮肥后，M2处理显著提高了水体总氮、铵态氮和硝态氮含量，但均在1 d后开始下降，之后逐渐恢复至与M1和M0相近的水平（图3G~3L、4G~4L）。
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图 3 稻鱼共生系统中不同施氮处理对早季稻田水体环境的影响Figure 3. Effects of different N application treatments on paddy water environment at early season in rice-fish co-culture system![]()
图 4 稻鱼共生系统中不同施氮处理对晚季稻田水体环境的影响Figure 4. Effects of different N application treatments on paddy water environment at late season in rice-fish co-culture system2.3 不同施氮处理对水稻产量的影响
从表1可以看出，早季‘泰丰优208’和‘19香’M1和M2处理的稻谷产量均显著高于M0处理，但M1和M2处理间无显著差异；而晚季‘19香’M2处理的稻谷产量显著高于M0和M1处理。2个水稻品种M2处理的2季稻谷总产量均高于M1处理，即‘泰丰优208’为13.38 t·hm−2，‘19香’为10.66 t·hm−2。早、晚季2个水稻品种的M1和M2处理的有效穗数均显著高于M0处理，其中晚季‘19香’的M2处理显著高于M1处理。同时，早季‘泰丰优208’和早、晚季‘19香’M1和M2处理的每穗实粒数和收获指数均高于M0处理。此外，早季‘泰丰优208’和晚季‘19香’M2处理的结实率均显著高于M0处理。
表 1 稻鱼共生系统中不同施氮处理对水稻产量及其构成要素的影响1)Table 1. Effects of different N application treatments on rice yield and its components in rice-fish co-culture system季节
Season品种
Variety处理
Treatment产量/
(t·hm−2)
Yield有效穗数/
(穗·m−2)
Panicle number每穗实粒数
Grain number
per ear结实率/%
Seed setting
rate千粒质量/g 1000 -grain
weight收获指数
Harvest
index早季
Early season泰丰优208
Taifengyou 208M0 3.97b 163.20b 67.81b 63.17b 22.39a 43.07b M1 7.37a 275.69a 132.62a 79.36a 22.44a 55.42a M2 7.68a 249.31a 127.24a 78.01a 23.06a 54.07a 19香
19 XiangM0 3.61b 125.00b 82.11b 64.36a 20.48a 38.46b M1 5.81a 191.97a 133.61a 64.77a 20.89a 43.42a M2 5.72a 182.64a 135.66a 67.86a 20.36a 44.05a 晚季
Late season泰丰优208
Taifengyou 208M0 5.12a 204.86b 149.57a 80.03a 21.62a 62.55a M1 5.85a 265.97a 145.98a 78.33a 21.23a 60.72a M2 5.70a 253.47a 140.41a 72.46b 20.77a 61.67a 19香
19 XiangM0 3.06c 155.56c 151.88c 67.44b 20.23a 47.09c M1 4.46b 195.14b 164.94b 70.16b 20.29a 50.61b M2 4.94a 204.17a 183.74a 74.23a 19.76a 52.99a 1)相同季节和品种的同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，LSD法)。
1) Different lowercase letters of the same column for the same season and variety indicate significant differences among treatments (P < 0.05, LSD method).2.4 不同施氮处理对水稻氮素吸收利用的影响
从表2可以看出，稻鱼共生系统中，与M1处理相比，M2处理显著提高了2个水稻品种早、晚季抽穗期和晚季成熟期的REN，抽穗期和成熟期的增幅分别为25.82%~91.11%和62.74%~67.35%。从AEN上看，仅晚季‘19香’的M2处理显著高于M1处理。从PFPN上看，早、晚季M1和M2处理均显著高于M0处理，其中‘泰丰优208’在晚季时M1处理显著高于M2处理，而‘19香’则表现出M2处理显著高于M1处理。从HIN上看，早、晚季2个水稻品种M1和M2处理相比均无显著差异。
表 2 稻鱼共生模式下不同施氮处理对水稻氮素吸收利用的影响1)Table 2. Effects of different N application treatments on nitrogen absorption and utilization of rice in rice-fish co-culture system季节
Season品种
Variety处理
TreatmentREN/% AEN/
(kg·kg−1)PFPN/
(kg·kg−1)HIN/% 抽穗期 Heading stage 成熟期 Maturity stage 早季
Early season泰丰优208
Taifengyou 208M0 19.13b 54.40b M1 27.40b 38.58a 22.71a 48.98a 69.41a M2 35.91a 41.15a 24.78a 45.97a 65.19a 19香
19 XiangM0 16.22b 53.09b M1 21.08b 32.00a 14.69a 33.76a 57.91a M2 26.52a 35.26a 17.32a 34.90a 59.38a 晚季
Late season泰丰优208
Taifengyou 208M0 34.74c 73.47a M1 12.58b 17.70b 4.03a 43.07a 69.18b M2 24.04a 28.81a 3.18a 38.84b 70.03ab 19香
19 XiangM0 25.10c 59.78a M1 19.53b 21.75b 7.82b 34.31b 62.51a M2 30.76a 36.40a 10.45a 38.94a 62.16a 1)REN：氮素吸收利用率，AEN：氮素农学利用率，PFPN：氮肥偏生产力，HIN：氮素收获指数；相同季节和品种的同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，REN和AEN采用t检验分析，PFPN和HIN采用LSD法分析)。
1) REN: Nitrogen absorption and utilization efficiency, AEN: Agronomic efficiency of nitrogen, PFPN: Partial factor productivity of nitrogen, HIN: Harvest index of nitrogen; Different lowercase letters of the same column for the same season and variety indicate significant differences among treatments (P < 0.05, REN and AEN are analyzed by t test, while PFPN and HIN are analyzed by LSD method).早、晚季水稻产量与总氮素积累量之间均呈线性正相关关系，且决定系数（R2）分别为0.91和0.58 (P<0.001)，说明水稻产量随着总氮积累量的增加而提高（图5）。
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图 5 稻谷产量与植株总氮积累量之间的关系Figure 5. Relationship between rice grain yield and total nitrogen accumulation in rice plant2.5 不同施氮处理对稻米品质的影响
从表3可知，稻鱼共生模式下，不同氮肥管理对稻米品质的影响较小。早季 ‘泰丰优208’M2处理的糙米率和精米率均显著高于M0处理；而早季‘19香’和晚季2个水稻品种各处理间均无显著差异。同时，M2处理下的2个水稻品种的整精米率、长宽比、垩白粒率和垩白度与M0、M1处理相比均无显著差异，这也说明在稻鱼共生系统中，在水稻穗分化期追施氮肥对稻米碾磨品质和外观品质均无显著影响，且2个供试品种各处理的稻米垩白粒率和垩白度均符合国家优质籼米三级以上稻米标准(GB/T 1354—2018)[17]。
表 3 稻鱼共生系统中不同施氮处理对稻米碾磨品质和外观品质的影响1)Table 3. Effects of different N application treatments on rice milling and appearance quality in rice-fish co-culture system季节
Season品种
Variety处理
Treatment糙米率/%
Brown rice
rate精米率/%
Milled rice
rate整精米率/%
Whole milled
rice rate长宽比
Length to
width ratio垩白粒率/%
Chalky rice
rate垩白度
Chalkiness早季
Early season泰丰优208
Taifengyou 208M0 75.39b 66.26b 40.62a 3.04a 3.04a 5.56a M1 76.51ab 65.80b 38.59a 2.97a 4.34a 6.55a M2 77.65a 67.89a 39.83a 3.02a 6.20a 8.03a 19香
19 XiangM0 72.78a 60.21a 39.37a 3.41a 3.93a 5.94a M1 72.86a 59.17a 44.91a 3.50a 4.79a 6.61a M2 74.02a 60.05a 44.90a 3.59a 5.05a 6.63a 晚季
Late season泰丰优208
Taifengyou 208M0 77.80a 68.72a 64.70a 3.12a 3.84a 5.74a M1 78.29a 69.50a 64.34a 3.20a 2.84a 5.29a M2 78.29a 69.30a 64.92a 3.20a 3.51a 5.62a 19香
19 XiangM0 74.15a 63.04a 54.94a 3.65a 3.71a 4.67a M1 73.92a 62.84a 53.93a 3.53a 3.01a 4.04a M2 74.84a 61.75a 53.50a 3.59a 2.28a 3.78a 1) 相同季节和品种的同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，LSD法)。
1) Different lowercase letters of the same column for the same season and variety indicate significant differences among treatments (P < 0.05, LSD method).2.6 不同施氮处理的田鱼产量
从表4可以看出，稻鱼共生系统中不同水稻品种种植条件下氮肥后移处理对早、晚季稻田养殖禾花鲤鱼的影响程度较小。从禾花鲤鱼存活率上看，早季‘泰丰优208’M1处理的存活率最高，且与M0、M2处理差异显著；而晚季2个水稻品种的各处理之间无显著差异。从禾花鲤鱼单尾质量和产量上看，早、晚季2个水稻品种的各处理间均无显著差异。
表 4 稻鱼共生系统中不同施氮处理对稻田禾花鲤鱼存活率及其产量的影响1)Table 4. Effects of different N application treatments on the survival rate and yield of Cyprinus carpio in rice-fish co-culture system品种
Variety处理
Treatment早季 Early season 晚季 Late season 存活率/%
Survival rate单尾质量/g
Weight per fish田鱼产量/(kg·hm−2)
Fish yield存活率/%
Survival rate单尾质量/g
Weight per fish田鱼产量/(kg·hm−2)
Fish yield泰丰优208
Taifengyou 208M0 58.75b 51.22a 626.95a 68.33a 34.53a 388.13a M1 81.25a 53.78a 759.07a 60.83a 34.19a 388.52a M2 56.62b 54.81a 655.84a 64.17a 36.66a 440.12a 19香
19 XiangM0 58.75a 51.22a 626.95a 68.33a 34.53a 388.13a M1 70.34a 53.66a 707.47a 64.17a 33.04a 395.56a M2 62.63a 53.99a 693.01a 67.50a 36.81a 466.70a 1) 相同品种同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，LSD法)。
1) Different lowercase letters of the same column for the same variety indicate significant differences among treatments (P < 0.05, LSD method).2.7 不同施氮处理对禾花鲤鱼肉品质的影响
从表5可以看出，早季时，稻鱼共生系统中2个水稻品种M2处理的鱼肉粗脂肪含量显著低于M0和M1处理；晚季时，2个水稻品种的M2处理的鱼肉粗脂肪含量显著低于M1处理，二者与M0处理间无显著差异。2个水稻品种各处理间的鱼肉粗蛋白和总氨基酸含量均无显著差异。
表 5 稻鱼共生系统中不同施氮处理对禾花鲤鱼肉粗脂肪、粗蛋白和总氨基酸含量的影响1)Table 5. Effects of different N application treatments on the crude fat, crude protein, and total amino acid contents in the muscle of Cyprinus carpio in rice-fish co-culture systemw/(g·kg−1) 品种
Variety处理
Treatment早季 Early season 晚季 Late season 粗脂肪
Crude fat粗蛋白
Crude protein总氨基酸
Total amino acid粗脂肪
Crude fat粗蛋白
Crude protein总氨基酸量
Total amino acid泰丰优208
Taifengyou 208M0 25.5a 152.0a 160.0a 31.0b 170.3a 144.4a M1 24.0a 159.3a 158.6a 37.7a 168.3a 152.8a M2 16.0b 149.7a 155.9a 33.0b 168.7a 155.5a 19香
19 XiangM0 25.5a 152.0a 160.0a 31.0ab 170.3a 144.4a M1 22.0a 151.0a 168.7a 32.5a 172.0a 147.7a M2 14.0b 149.3a 169.2a 28.0b 170.3a 140.1a 1)相同品种同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，LSD法)。
1) Different lowercase letters of the same column for the same variety indicate significant differences among treatments (P < 0.05, LSD method).3. 讨论与结论
氮肥后移主要是增加了水稻生长中后期对氮素的吸收，增加成熟期的有效穗，提高水稻产量和氮肥利用率，减少氮素流失，目前已有相关研究证实了这一现象[9-10, 18]。本研究也发现，在稻鱼共生系统中，氮肥后移增加了水稻抽穗期的茎蘖数和叶片叶绿素含量，稳定了成熟期干物质积累量和2个供试水稻品种的早、晚两季的总产量(‘泰丰优208’为13.38 t·hm−2，‘19香’为10.66 t·hm−2)。这主要是因为在水稻穗分化始期追施氮肥，满足了水稻中后期氮素养分需求，提高了水稻叶片叶绿素含量，增强叶片光合作用，促进水稻穗的生长，提高成穗率和结实灌浆，稳定水稻早晚季总产量，同时也提高了氮肥利用效率，减少氮素流失。袁帅[19]和王宇智[20]的研究结果报道常规水稻种植模式下氮肥后移增加了水稻有效穗数和地上部干物质积累量，提高叶片光合速率，增加水稻产量，提高氮肥利用效率。
从本研究结果看，稻鱼共生系统中氮肥后移处理对稻田水质环境的影响较大，尤其显著提高了水体电导率、总氮含量、铵态氮含量和硝态氮含量，但3~5 d后恢复至与不施肥处理相当的水平，与段小丽等[21]和Ruan等[22]的研究结果相类似。这主要是因为在追施尿素后，尿素溶于水后迅速转化为铵态氮，铵态氮在硝化细菌的作用下转化为硝态氮，为水稻吸收利用，期间水体的电导率也会随着这一过程发生改变。
稻鱼共生系统中氮肥后移处理对稻田养殖禾花鲤鱼的影响程度不同，甚至可能对田鱼产量起到一定的促进作用。在水稻穗分化始期施入氮肥后，可能会导致禾花鲤鱼的存活率有所下降，但对鱼的单尾质量无显著影响，主要是在追施氮肥后，在高温高湿的天气下，会促进水体藻类的生长与繁殖[23]，增加了禾花鲤鱼的食物多样性，进而增加了禾花鲤鱼的质量[24]。从本研究结果看，氮肥后移和一次性基施氮肥处理均可以增加禾花鲤鱼的产量，这也说明施氮有可能增加了水体藻类的多样性，而氮肥后移是分次施入，也增加了藻类繁殖的次数，同时也增加了禾花鲤鱼食用浮游生物的次数。这与Mbaabu[25]和韩军等[26]的研究结果相类似，即在鱼塘养殖的情况下，施入适量氮肥后，促进了水体中藻类的光合作用和饵料生物的增长，为鱼类提供了更多的食料，同时水中藻类生物的生长和光合作用的增强也提高了水中的溶氧量，最终稳定了鱼的存活率和产量。
有研究发现稻鱼共生模式下适量的水肥调控促进草鱼的生长发育，有助于提高鱼的营养成分和鱼肉风味[27]。本研究发现稻鱼共生模式下氮肥后移处理显著降低了禾花鲤鱼肉的粗脂肪含量，说明在稻鱼共生模式下施氮有可能改善了稻田水体环境中可被鲤鱼食用的食料，促进鲤鱼生长，改善鲤鱼肌肉性质，同时施肥还可能增加禾花鲤鱼的活跃程度，消耗了鱼体内的脂肪，最终导致脂肪减少。这与Rezend等[28]的研究报道类似，在池塘中养殖巨骨舌鱼，施肥会改变鱼肉的组成，即提高了肉质的水分含量，同时降低了鱼肉的粗脂肪含量。
综上所述，稻鱼共生系统中氮肥后移处理有利于增加水稻抽穗期的茎蘖数和提高叶片叶绿素含量，促进水稻穗的生长，提高或稳定水稻产量，且显著提高了稻田氮肥利用率。同时，氮肥后移处理提高了水体环境中电导率、总氮含量、铵态氮含量和硝态氮含量，但随后恢复至与不施肥处理相当的水平，且这对稻田禾花鲤鱼的单尾质量和产量均未产生显著影响，并降低了禾花鲤鱼肉的粗脂肪含量，提高鱼肉风味。
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图 1 不同浓度O2阻断滞育后的二化性‘大造’蚕卵孵化率
Figure 1. The hatching rate of bivoltine silkworm ‘Dazao’eggs under O2 treatment with different concentrations
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图 2 不同产后取卵时间及高氧处理时间的二化性‘大造’蚕卵的孵化率
A：产后4 h取卵；B：产后12 h取卵；C：产后20 h取卵；D：产后32 h取卵；E：产后48 h取卵
Figure 2. The hatching rate of bivoltine silkworm ‘Dazao’ eggs treated after different oviposition time and hyperoxia treating time
A: 4 h after oviposition; B: 12 h after oviposition; C: 20 h after oviposition; D: 32 h after oviposition; E: 48 h after oviposition
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图 3 二化性‘大造’蚕卵在不同处理条件下的孵化率
一个样品大约有116~183粒卵；每个点代表3个独立样品的平均值±标准差；“*”表示相同时间点高氧法和HCl法处理存在显著性差异(P<0.05，t检验)
Figure 3. The hatching rate of bivoltine silkworm ‘Dazao’eggs under different treatment
The hatching time is calculated using 116 to 183 eggs per sample; Each point represents the mean ± SD of three independent replicates; “*” indicates significant difference between two treating methods (P<0.05，t test)
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图 4 高氧及HCl法处理后不同发育时间的二化性‘大造’卵壳表面扫描电镜观察
A~C分别为高氧法处理组产后20、48和72 h；D~F分别为HCl法处理组产后20、48和72 h；G~I分别为对照组产后20、48和72 h；图中箭头表示脱落的脂质；标尺=50 µm
Figure 4. Scanning electron microscopy observation of eggshell surface of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs of different developmental time after hyperoxia and HCl treatments
A-C represent eggshell surface under hyperoxia treatment after spawning for 20, 48, and 72 hours; D-F represent eggshell surface under HCl treatment after spawning for 20, 48, and 72 hours; G-I represent eggshell surface of control group after spawning for 20, 48, and 72 h；The arrow indicates the shedding of lipid；Bar = 50 µm
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图 5 高氧及HCl法处理后不同发育时间的二化性‘大造’卵壳表面气孔扫描电镜观察
A~E分别为高氧法处理组产后20、48和72 h及5和9 d；F~J分别为HCl法处理组产后20、48和72 h及5和9 d；K~O分别表示对照组产后20、48和72 h及5和9 d; 图中箭头表示气孔;标尺=5 µm
Figure 5. Scanning electron microscopy observation of aeropyle surface of bivoltine silkworm ‘Dazao’ eggs of different development time after hyperoxia and HCl treatments
A-E represent eggshell aeropyle under hyperoxia treatment after spawning for 20 hours, 48 hours,72 hours, 5 days and 9 days; D-F represent eggshell aeropyle under HCl treatment after spawning for 20 hours, 48 hours,72 hours, 5 days and 9 days; K-O represent eggshell aeropyle of control group after spawning for 20 hours, 48 hours,72 hours, 5 days and 9 days; The arrow indicates eggshell aeropyle; Bar = 5 µm
表 1 高氧法和HCl法处理后10 d二化性‘大造’蚕卵的孵化率1)
Table 1 The hatching rates of bivoltine silkworm ‘Dazao’ eggs treated by hyperoxia and HCl after 10 days
处理
Treatment孵化卵数/粒
No. of hatching eggs死卵数/粒
No. of dead eggs总卵数/粒
No. of total eggs平均孵化率2)/%
Average hatching ratea b c a b c a b c CK 0 0 1 0 0 0 116 158 145 0±0 O2(φ=70%) 156 171 179 4 0 4 164 176 183 97±1* HCl 132 138 109 11 11 7 143 149 116 93±1 1)a、b、c代表组别；2)该列数据为平均值±标准差，n=3;“*”表示高氧法和HCl法处理间存在显著性差异(P<0.05，t检验)
1)a, b and c represent different groups; 2)Data in this column are mean ± SD, n=3;“*” indicates significant difference between two treated methods (P<0.05,t test)
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表 2 高氧法处理一化性‘土耳其’阻断滞育效果分析
Table 2 Analyses of prevention effects of diapause in univoltine silkworm ‘Tuerqi’eggs by hyperoxia method
组别
Group孵化卵数/粒
No. of hatching eggs转青死卵数/粒
No. of dead eggs in body pigmentation stage死卵数/粒
No. of dead eggs滞育卵数/粒
No. of diapause eggs孵化率/%
Hatching rateO2 CK O2 CK O2 CK O2 CK O2 CK 1 84 0 1 0 0 0 0 87 98.82 0 2 50 0 0 0 0 0 15 83 76.92 0 3 109 0 1 0 0 2 98 188 52.40 0 4 141 0 8 0 1 0 28 135 79.21 0 5 74 0 4 0 0 0 81 136 46.54 0 6 240 0 12 0 0 0 60 230 76.92 0 7 174 0 4 0 0 0 2 187 96.67 0 8 142 0 1 0 0 0 6 123 95.30 0 9 107 0 8 0 0 0 15 109 82.31 0 10 154 0 7 0 0 0 2 146 94.48 0 11 75 0 5 0 0 0 64 116 52.08 0 12 85 0 4 0 0 0 40 98 65.89 0 13 115 0 8 0 0 0 147 216 42.59 0 14 126 0 21 0 0 0 114 218 48.28 0 15 105 0 6 0 0 0 78 152 55.56 0 均值 Mean 71±20 0
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表 3 高氧法处理转基因二化性‘大造’蚕卵阻断滞育效果分析
Table 3 Analyses of prevention effects of diapause in transgenic bivoltine silkworm ‘Dazao’ eggs by hyperoxia method
组别
Group孵化卵数/粒
No. of hatching eggs转青死卵数/粒
No. of dead eggs in body pigmentation stage死卵数/粒
No. of dead eggs滞育卵数/粒
No. of diapause eggs孵化率/%
Hatching rateO2 CK O2 CK O2 CK O2 CK O2 CK 1 51 0 21 0 11 0 1 109 60.71 0 2 48 0 22 0 8 0 6 78 57.14 0 3 38 0 17 0 27 1 2 57 45.24 0 4 38 0 12 0 29 0 5 89 45.24 0 5 40 0 7 0 56 0 2 95 38.10 0 6 43 0 16 0 22 0 4 83 50.59 0 7 45 0 11 0 48 0 3 113 42.06 0 8 35 0 10 0 58 0 2 68 33.33 0 9 57 0 2 0 32 1 0 72 62.64 0 10 43 0 4 0 31 0 5 91 51.81 0 11 44 0 5 0 29 0 6 76 52.38 0 12 46 0 4 0 45 0 3 124 46.94 0 均值 Mean 49±9 0
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