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噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性

龙航宇, 陶佳梦, 姜亚杰, 李晓斌, 邹佳汝, 翁亚彪, 林瑞庆

龙航宇, 陶佳梦, 姜亚杰, 等. 噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性[J]. 华南农业大学学报, 2020, 41(1): 42-47. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.201903003
引用本文: 龙航宇, 陶佳梦, 姜亚杰, 等. 噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性[J]. 华南农业大学学报, 2020, 41(1): 42-47. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.201903003
LONG Hangyu, TAO Jiameng, JIANG Yajie, et al. Expression of phage lysin Cp51 in recombinant Lactococcus lactis and its antibacterial activity against Clostridium perfringens type A[J]. Journal of South China Agricultural University, 2020, 41(1): 42-47. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.201903003
Citation: LONG Hangyu, TAO Jiameng, JIANG Yajie, et al. Expression of phage lysin Cp51 in recombinant Lactococcus lactis and its antibacterial activity against Clostridium perfringens type A[J]. Journal of South China Agricultural University, 2020, 41(1): 42-47. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.201903003

噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性

基金项目: 广东省重点领域研发计划(2019B020218004);广东省科技计划(2014A020208099)
详细信息
    作者简介:

    龙航宇(1991—),男,硕士研究生,E-mail: 1161289587@qq.com

    通讯作者:

    林瑞庆(1973—),男,副研究员,博士,E-mail: rqlin@scau.edu.cn

  • 中图分类号: Q939.48;S858.31

Expression of phage lysin Cp51 in recombinant Lactococcus lactis and its antibacterial activity against Clostridium perfringens type A

  • 摘要:
    目的 

    构建A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens裂解酶重组表达乳酸菌Lactococcus lactis,并检测重组菌及其表达产物的抗菌效果。

    方法 

    全基因合成噬菌体裂解酶Cp51基因,构建PNZ8148-Cp51原核表达重组载体,电转化至乳酸菌NZ9000,经乳链菌肽诱导表达可溶性Cp51蛋白;用比浊法检测表达蛋白对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性;利用细菌液混合培养检测重组菌对A型产气荚膜梭菌增殖的抑制作用。

    结果 

    噬菌体裂解酶Cp51在乳酸菌中成功表达,为1 268 bp;质量浓度1 μg·mL−1以上的重组蛋白对A型产气荚膜梭菌具有高效抗菌活性;重组乳酸菌对A型产气荚膜梭菌增殖有一定的抑制效果,混合培养后使产气荚膜梭菌活菌数从9×109 CFU·mL−1下降到约9×108 CFU·mL−1

    结论 

    A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌构建成功,为后续优化表达和临床应用研究奠定了基础。

    Abstract:
    Objective 

    To construct a recombinant Lactococcus lactis expression system of phage lysine Cp51, and study its antibacterial activity against Clostridium perfringensin type A invitro.

    Method 

    Phage lysin Cp51 gene was inserted into the prokaryotic expression vector PNZ8148, and then the recombinant vector PNZ8148-Cp51 was constructed and transformed into L. lactis NZ9000. Nisin was used to induce expression of soluble protein Cp51. The antibacterial activity of the recombinant protein against C. perfringens type A was detected by kinetic turbidimetric assay in vitro. The inhibitory effect of recombinant L. lactis on the proliferation of C. perfringens type A was tested by mixed cultivation.

    Result 

    The recombinant phage lysin Cp51 was successfully expressed in L. lactis and the Cp51 gene was 1 268 bp in length. The recombinant protein had strong antibacterial activity against C. perfringens type A at the concentration above 1 μg·mL−1 in vitro. The recombinant L. lactis also had certain inhibitory effect on C. perfringens type A with the number of C. perfringens decreased from 9×109 CFU·mL−1 to 9×108 CFU·mL−1 after mixed cultivation.

    Conclusion 

    Recombinant L. lactis expressing phage lysin Cp51 which against C. perfringens type A has been successfully constructed, which provides a basis for further optimization of expression and clinical application.

  • 近年来,南方红壤地区大豆种植业规模明显上升,截至2008年, 南方大豆种植面积已达147.1万hm2[1]。磷素作为大豆生长发育必不可少的元素之一,对其生长发育、产量形成等至关重要[1]。磷素缺失会降低大豆光合速率,影响DNA和ATP等生物分子的合成代谢,进而影响根瘤发育及能量代谢[2]。土壤中的磷素多以难溶态存在,可供植物直接利用的无机磷质量分数不足1%[3]。由于风化淋溶作用强烈,南方红壤区的土壤易发生固磷作用[4],这是导致土壤磷元素生物有效性降低的重要原因之一。此外,红壤脱硅富铁铝化严重,也会引起土壤中硅元素的大量流失。硅作为植物生长的有益元素,在植物逆境胁迫适应中发挥着积极作用[5],如硅素可有效缓解大豆幼苗的铝毒害[6];外源硅的添加可以缓解盐胁迫下大豆的生理伤害[7]等。且硅素对磷素的影响存在二重性,当植株含磷量较低时硅可以促进植物对磷的吸收,反之抑制。可见硅、磷元素均对植物生长至关重要,二者在物质合成、能量转化和新陈代谢方面发挥着不可替代的作用[8]

    生物炭作为一种优质生态修复材料,拥有较大的比表面积及丰富的多微孔结构,可以吸附固定土壤养分,提高植物对营养元素的利用效率,减少养分淋失[9]。研究表明,添加生物炭可以直接向土壤释放磷素[10],还可以通过表层阳离子桥键作用吸附土壤磷[11]。生物炭添加通过提高酸性土壤pH、改变土壤微生物群落结构、增加土壤溶磷菌丰度及活性、减少磷淋溶等提高了土壤磷素利用率[12-13]。实际农业生产中,合理施用生物炭可以提高土壤磷的有效性及植株含磷量[14]。除了磷元素,硅也是生物炭中含量较高的无机元素之一[15]。以富硅原料如稻壳、稻秆等制备的生物炭较之普通硅肥,可以更有效地改善土壤理化性质、修复重金属污染、实现固氮减排等,相同条件下制备的稻壳生物炭的硅含量要高于稻秆生物炭[16]。胡祖武等[17]研究表明添加富硅生物炭能有效提高红壤土中可吸收利用形态硅的含量,进而显著提高硅元素在作物体内的吸收利用效率。此外,往酸性红壤中添加硅可以减少土壤磷吸附并促使其解吸,从而大大增加土壤磷活性及生物有效性[18]。宋文涛等[19]发现添加质量分数为4%的秸秆生物炭可显著提高土壤磷素有效性,其中,稻秆生物炭作为一种富硅生物炭,合理的农业应用显著提高了赤红壤中有效磷的含量。

    国内外大量研究表明生物炭具有提高硅、磷有效性的潜力,但添加生物炭对红壤硅、磷形态及植物硅、磷吸收之间的影响和机理尚不明确。本研究从土壤−植株系统出发,探究富硅生物炭及不同添加量的施用条件对土壤硅、磷形态转化、有效性及大豆硅磷吸收转运的作用机制,旨在为生物炭在酸性土壤改良及农业生态系统可持续发展等方面的合理应用提供理论依据和实践指导。

    供试土壤为酸性低磷土壤,采自增城市宁西镇华南农业大学教学科研基地(N23°14′,E113°38′),其基本化学特性为:pH 4.54,全磷0.16 g·kg−1,总碳6.62 g·kg−1,总氮1.26 g·kg−1,有效硅53.2 mg·kg−1,速效磷1.12 mg·kg−1。供试的大豆品种为‘华夏9号’。供试的2种生物炭分别用取自华南农业大学农学院农场的稻壳和稻秆采用限氧升温炭化法(700 ℃)烧制而成。制备得到的稻壳生物炭、稻秆生物炭pH分别为10.69、10.72,含碳量(w)分别为47.7%、57.0%,C/N分别为64.0、161.7,全磷质量分数分别为5.69、1.76 g·kg−1,有效硅质量分数分别为790.7、480.8 mg·kg−1

    研究为盆栽试验,于华南农业大学生态农场网室(N23°17′, E113°37′)进行。试验包含7个处理:不加生物炭(CK),添加质量分数为1%、2%、4%的稻壳生物炭(DK1、DK2、DK4),添加质量分数为1%、2%、4%的稻秆生物炭(DG1、DG2、DG4),每个处理包含5个重复。盆的直径和高度分别为22.5和19.0 cm,生物炭和底肥在大豆移栽前1周拌入土壤混合均匀,每盆装土4 kg,底肥施用量分别为尿素570 mg、过磷酸钙140 mg、硫酸钾220 mg。待土壤平衡7 d,将已消毒并培养至胚根露白的大豆种子移栽(4株/盆),通过称重法保持土壤湿度为田间持水量的60%~70%。种植90 d后收获大豆植株,测定株高、茎粗、干质量、根系等生长指标和硅、磷含量指标。同时采集盆内所有土壤样品,自然风干后分别过10目和100目筛网,用于测定土壤pH、有效阳离子交换量(Effective cation exchange capacity, ECEC)、交换性酸含量、盐基饱和度、总碳含量、总氮含量、硅磷化学形态等指标。

    植物株高和茎粗用直尺、游标卡尺测量;根系自土壤中完整挖出后用去离子水冲洗表面杂质,然后用STD1600根系扫描仪(Regent Instruments,Canada)及WinRHIZO 3.1软件进行根长、根表面积、根体积及根平均直径的测定。待根系指标测定完毕,将植株茎、叶、荚、根4个部分分别装入牛皮信封,杀青30 min(120 ℃),然后烘干(80 ℃)至恒定质量,用千分之一天平称取地上(下)部生物量。将烘干后的植株粉碎测定硅、磷含量。植株硅含量的测定参考戴伟民等[20]的高温碱熔解法,经1.25 mol·L−1 NaOH溶液高温高压熔解后,采用硅钼蓝比色法测定;植株磷含量测定采用鲍士旦[21]的H2SO4−H2O2消煮−钼锑抗比色法。

    土壤pH用ST2100型号pH计测定,水、土质量比1.0∶2.5;土壤有效阳离子交换量参考鲍士旦[21]的方法测定;土壤交换性酸含量采用1 mol·L−1 KCl溶液交换−中和滴定法测定;土壤交换性盐基总量参考刘光崧[22]的方法测定,土壤盐基饱和度通过计算盐基总量和实际阳离子交换量的比值来表征;土壤总碳、总氮含量用TOC仪器测定。

    土壤不同硅化学形态参考Song等[23]报道的逐级提取方法,依次采用0.01 mol·L−1 NaOAc−HOAc、质量分数为30%的H2O2、0.5 mol·L−1 NH2OH·HCl、0.5 mol·L−1 NaOH溶液提取有效态硅、有机结合态硅、铁锰氧化态硅和无定形硅,最后用硅钼蓝比色法测定硅含量。土壤不同磷化学形态参考Condron等[24]改进之后的Hedley磷分级方法[25],采用 1 mol·L−1 NH4Cl溶液提取得到NH4Cl−Pi、0.5 mol·L−1 NaHCO3溶液提取得到NaHCO3−Pi和 NaHCO3−Po、0.1 mol·L−1 NaOH 溶液提取得到NaOHI−Pi和NaOHI−Po、1 mol·L−1 HCl溶液提取得到HCl−Pi、0.1 mol·L−1 NaOH溶液提取得到NaOHII−Pi和NaOHII−Po,以上提取步骤为连续提取,最终用质量分数为98%的浓H2SO4溶液和质量分数为30%的H2O2溶液消解残渣态磷(Residual P)。除无机磷的磷含量参考He等[26]的碱性方法测定外,其余磷含量均使用钼锑抗比色法测定。土壤活性磷含量由NH4Cl−Pi、NaHCO3−Pi、NaHCO3−Po三者的含量组成;中稳性磷含量由NaOHI−Pi、NaOHI−Po二者的含量组成;稳定性磷含量由HCl−Pi、NaOHII−Pi、NaOHII−Po三者的含量组成。

    采用Excel 2016、SPSS(26.0)软件完成试验数据的整理与计算分析,数据以5次重复的平均值±标准误的形式展示;采用Origin2022和Word2016软件完成相关图表的绘制;运用单因素方差分析(One-way ANOVA)和邓肯氏(Duncan’s)新复极差多重比较(α= 0.05)检验不同处理间差异的显著性;采用R语言对土壤硅、磷形态与大豆植株不同部位硅、磷吸收进行皮尔逊(Pearson)相关性分析。

    与不添加生物炭的对照处理(CK)相比,其余处理均显著提高土壤pH(P<0.05),且随生物炭添加量的增加,提高效果愈显著,土壤pH逐渐趋近中性(表1)。添加质量分数为1%、2%、4%的稻壳生物炭使土壤pH分别增加4.6%、11.9%、17.1%,而添加质量分数为1%、2%、4%的稻秆生物炭的处理分别增加6.8%、16.0%、46.8%,其中DG4处理对土壤pH的提升效果最显著。生物炭处理显著降低土壤交换性酸的含量,随着添加量的增加,下降幅度增大,其中稻秆生物炭处理的下降幅度为58.2%~ 95.6%,稻壳生物炭为25.8% ~ 64.9%,前者降低幅度显著高于后者。

    表  1  稻壳生物炭和稻秆生物炭处理对土壤化学性质的影响1)
    Table  1.  Impacts of rice husk and straw biochar treatments on chemical properties of soil
    处理
    Treatment
    pH b(交换性酸)/(cmol·kg−1)
    Exchangeable acid content
    有效阳离子交换量/(cmol·kg−1)
    Effective cation exchange capacity
    盐基饱和度/%
    Base saturation
    C/N
    CK 4.55±0.04e 2.25±0.11a 3.9±0.1d 41.6±2.3e 5.9±0.1e
    DK1 4.76±0.03d 1.67±0.04b 3.5±0.1d 51.9±1.7d 7.9±0.1d
    DK2 5.09±0.02c 1.54±0.08b 3.1±0.1d 50.7±2.3d 12.2±0.9c
    DK4 5.33±0.01b 0.79±0.04c 3.3±0.1d 76.2±1.3c 18.9±0.3a
    DG1 4.86±0.04d 0.94±0.02c 6.5±0.9c 85.0±2.0b 6.8±0.2de
    DG2 5.28±0.03b 0.26±0.03d 8.4±0.5b 96.9±0.5a 11.2±0.3c
    DG4 6.68±0.05a 0.10±0.00d 13.1±1.0a 99.2±0.1a 15.9±0.6b
     1) CK:不施生物炭;DK1、DK2和DK4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻壳生物炭;DG1、DG2和DG4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻秆生物炭;表中数据为平均值±标准误,同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05, Duncan’s法)。
     1) CK: No biochar; DK1, DK2 and DK4 are additions of 1%, 2% and 4% rice husk biochar, respectively; DG1, DG2 and DG4 are additions of 1%, 2% and 4% rice straw biochar, respectively; Data in the table are means ± standard errors, different lowercase letters in the same column represent significant differences (P < 0.05, Duncan’s method).
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    稻壳生物炭对土壤ECEC无显著影响,而稻秆生物炭显著增加了其含量(P < 0.05),DG4处理较CK增加了235.9%。添加生物炭可显著增加酸性土壤的盐基饱和度(P < 0.05),并且其作用效果随着添加量的增加更为显著,添加质量分数4%的稻壳生物炭和稻秆生物炭处理分别增加了34.5%、57.6%。生物炭的处理显著提高了土壤的C/N,与CK相比,DK4处理提高了220.3%。

    土壤硅的化学形态主要包括无定形态硅、铁锰氧化态硅、有机结合态硅、有效态硅,本试验中土壤无定形态硅的质量分数最高,可达1500 mg·kg−1以上(图1)。施用不同剂量的生物炭对4种形态的土壤硅质量分数均有一定的提高作用,特别是无定形态硅、有效态硅质量分数的增加幅度较大,分别为9.3% ~43.8%和4.1%~85.0%。随着生物炭添加量的提高,土壤硅含量的增加幅度也随之提升,其中添加4%稻秆生物炭使得土壤有效态硅、有机结合态硅和铁锰氧化态硅的质量分数分别增加了84.8%、78.6%和24.2%。

    图  1  稻壳生物炭和稻秆生物炭处理对土壤硅形态的影响
    CK:不施生物炭;DK1、DK2和DK4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻壳生物炭;DG1、DG2和DG4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻秆生物炭;相同颜色柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05,Duncan’s法)。
    Figure  1.  Effects of rice husk and straw biochar treatments on soil Si morphology
    CK: No biochar; DK1,DK2 and DK4 are additions of 1%, 2% and 4% rice husk biochar, respectively; DG1, DG2 and DG4 are additions of 1%, 2% and 4% rice straw biochar, respectively; Different lowercase letters on bars of the same color represent significant differences among treatments (P < 0.05, Duncan’s method).

    土壤残渣态磷含量随着稻壳生物炭添加量的增加逐渐降低,但是添加稻秆生物炭的效果则呈现完全相反的规律。当添加量为2%时,稻秆生物炭对残渣态磷含量的影响最为显著,约为CK的2.1倍(图2A)。土壤中NaOHI−Pi(无机磷主要形态之一)和NaOHI−Po(有机磷主要形态之一)属于中稳性磷的主要组成部分(图2B),随着稻壳生物炭添加量的增加,前者含量显著增加,后者含量显著降低,但稻秆生物炭的添加则显著增加了二者含量。NaOHII−Pi作为土壤稳定性磷的重要组成部分,其含量随着生物炭添加量的增加逐渐增加,其中添加4%稻秆生物炭的处理较之CK增加了近4.5倍;除添加4%稻壳生物炭的处理之外,其余处理HCl−Pi、NaOHII−Po这2种磷组分的含量均随生物炭添加量的增加而增加(图2C)。与CK相比,添加生物炭使得土壤活性磷组分NaHCO3−Po的质量分数增长175.2%~2139.6%,其中DG2处理的增长效果最为显著,约为CK的22.6倍;仅高添加量的生物炭处理可以显著提高土壤中NaHCO3−Pi和NH4Cl−Pi组分的含量(图2D)。

    图  2  稻壳生物炭和稻秆生物炭处理对土壤磷形态的影响
    CK:不施生物炭;DK1、DK2和DK4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻壳生物炭;DG1、DG2和DG4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻秆生物炭;各图中,相同形态磷柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05,Duncan’s法)。
    Figure  2.  Effects of rice husk and straw biochar treatments on soil P forms
    CK: No biochar; DK1,DK2 and DK4 are additions of 1%, 2% and 4% rice husk biochar, respectively; DG1, DG2 and DG4 are additions of 1%, 2% and 4% rice straw biochar, respectively; In each figure, different lowercase letters on bars of the same form of P represent significant differences among treatments (P < 0.05, Duncan’s method).

    图3A、3B可知,生物炭处理显著提高大豆总干质量和地上部干质量,且影响趋势基本一致,均随着生物炭添加量的增加而增幅上涨;当添加质量分数相同时,稻秆生物炭的提高效果更为显著,为CK的1.9~2.5倍。添加稻壳生物炭对大豆株高无显著影响,而添加稻秆生物炭则显著提高了大豆株高,其中DG2处理与CK相比提高26.1%,最为显著(图3C)。生物炭添加显著增大植株茎粗,不同剂量的稻壳生物炭处理之间差异并不显著,而对于稻秆生物炭来说,随着添加量的增大,大豆茎粗显著增大,DG4处理与CK相比提高29.2%(图3D)。

    图  3  稻壳生物炭和稻秆生物炭处理对大豆生物量的影响
    CK:不施生物炭;DK1、DK2和DK4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻壳生物炭;DG1、DG2和DG4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻秆生物炭;各图中,柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05,Duncan’s法)。
    Figure  3.  Effects of rice husk and straw biochar treatments on soybean biomass
    CK: No biochar; DK1,DK2 and DK4 are additions of 1%, 2% and 4% rice husk biochar, respectively; DG1, DG2 and DG4 are additions of 1%, 2% and 4% rice straw biochar, respectively; In each figure, different lowercase letters on bars represent significant differences (P < 0.05, Duncan’s method).

    图4A可知,添加生物炭显著提高大豆根系生物量,除1%添加质量分数外,当添加质量分数相同时,稻秆生物炭的提升幅度最大,其中DG2处理的效果最为显著,相比CK增大2.0倍。除1%添加质量分数外,其余生物炭处理均提高大豆植株根冠比(图4B)。除DK1处理外,其余生物炭处理还显著增加了大豆植株的根长、根体积及根表面积(图4C、4D、4E)。但是对于根平均直径这一指标来说,与CK相比,仅在生物炭添加质量分数为1%时出现了一定的增长趋势,其余处理均表现为随着添加质量分数的增大而逐渐降低(图4F)。

    图  4  稻壳生物炭和稻秆生物炭处理对大豆根系形态结构的影响
    CK:不施生物炭;DK1、DK2和DK4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻壳生物炭;DG1、DG2和DG4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻秆生物炭;各图中,柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05,Duncan’s法)。
    Figure  4.  Effect of rice husk and straw biochar treatments on root morphology and structure of soybean
    CK: No biochar; DK1,DK2 and DK4 are additions of 1%, 2% and 4% rice husk biochar, respectively; DG1, DG2 and DG4 are additions of 1%, 2% and 4% rice straw biochar, respectively; In each figure, different lowercase letters on bars represent significant differences (P < 0.05, Duncan’s method).

    以不同剂量添加不同原料制备得到的生物炭对大豆植株硅含量的影响因部位不同而存在不同规律(图5A)。当生物炭施用量水平相同时,大豆各部位硅含量的大小表现为叶>根>荚>茎。不同处理对茎荚部硅含量的影响差异并不大,但却显著增加了根、叶部硅含量,其中叶部硅含量的增加最为显著,DK4处理的增加效果相比CK增加了48.4%。

    图  5  稻壳生物炭和稻秆生物炭处理对大豆植株硅、磷吸收的影响
    CK:不施生物炭;DK1、DK2和DK4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻壳生物炭;DG1、DG2和DG4分别为添加质量分数为1%、2%和4%的稻秆生物炭;各图中,相同器官柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05,Duncan’s法)。
    Figure  5.  Effects of rice husk and straw biochar treatments on Si and P absorption of soybean plants
    CK: No biochar; DK1,DK2 and DK4 are additions of 1%, 2% and 4% rice husk biochar, respectively; DG1, DG2 and DG4 are additions of 1%, 2% and 4% rice straw biochar, respectively; In each figure, different lowercase letters on bars of the same organ represent significant differences among treatments (P < 0.05, Duncan’s method).

    大豆植株磷含量主要集中在荚部,除DK1处理外,其余添加生物炭的处理均显著提高了荚部的磷含量,尤其是稻秆生物炭的提高效果最为显著,在DG4处理下可以达到2.62 g·kg−1的最高水平(图5B)。相较于CK,添加生物炭的处理对植株各部位磷含量的影响总体呈现逐级增大的趋势,当添加量相同时,稻壳生物炭对大豆植株各部位磷含量的增长效果整体低于稻秆生物炭。对于稻秆生物炭来说,随着添加量的增加,植株各部位磷含量表现出显著差异,其中增长效果最显著的是DG4处理,大豆根、茎、叶、荚4个部位的磷含量较之CK分别增大了2.1、51.3、2.5和0.9倍。

    表2可知,土壤有效态硅与活性磷、稳定性磷之间存在显著的正相关性(P<0.001);大豆植株茎、根部的磷含量与土壤稳定性磷及有效态硅含量显著正相关(P<0.001);土壤无定形态硅与植株根、叶部硅含量(P<0.001)以及茎部磷含量(P<0.001)均存在显著的正相关性;土壤中稳定性磷含量与植株叶部磷含量呈显著正相关(P<0.001);植株茎荚部的硅含量与土壤中的硅磷含量无显著相关性。

    表  2  土壤硅、磷形态与植株硅、磷吸收的皮尔逊相关性分析1)
    Table  2.  Pearson correlation analysis between soil Si, P morphology and plant Si, P uptake
    指标
    Index
    a b c d e f g h i j k l m n o p
    a 1.000
    b 0.430 1.000
    c 0.516* 0.741*** 1.000
    d 0.559** 0.423 0.402 1.000
    e 0.584** 0.231 0.081 0.447* 1.000
    f 0.923*** 0.366 0.431 0.624** 0.728*** 1.000
    g 0.839*** 0.273 0.317 0.431 0.729*** 0.938*** 1.000
    h 0.959*** 0.449* 0.517* 0.529* 0.608** 0.953*** 0.853** 1.000
    i 0.436* 0.264 0.435* 0.825*** 0.291 0.557** 0.401 0.430 1.000
    j 0.020 0.091 −0.054 0.333 0.104 0.175 0.076 0.121 0.402 1.000
    k 0.501* 0.555** 0.516* 0.805*** 0.297 0.489* 0.280 0.466* 0.734*** 0.328 1.000
    l −0.118 0.241 0.281 0.449* −0.285 −0.070 −0.189 −0.143 0.494* 0.001 0.319 1.000
    m 0.780*** 0.626** 0.516* 0.491* 0.470* 0.700*** 0.602** 0.784*** 0.196 −0.029 0.306 0.046 1.000
    n 0.834*** 0.480* 0.599** 0.731*** 0.374 0.841*** 0.768*** 0.808*** 0.687*** 0.121 0.604** 0.297 0.677*** 1.000
    o 0.763*** 0.478* 0.476* 0.656** 0.604** 0.833*** 0.847*** 0.720*** 0.644** 0.204 0.563** 0.137 0.559** 0.872*** 1.000
    p 0.594** 0.536* 0.615** 0.559** 0.473* 0.691*** 0.731*** 0.585** 0.623** 0.135 0.544* 0.216 0.446* 0.810*** 0.872*** 1.000
     1) a:有效态硅,b:有机结合态硅,c:铁锰氧化态硅,d:无定形态硅,e:残渣态磷,f:活性磷,g:中稳性磷,h:稳定性磷,i:根−硅,j:茎−硅,k:叶−硅,l:荚−硅,m:根−磷,n:茎−磷,o:叶−磷,p:荚−磷;*、**和***分别表示相关性达0.05、0.01和0.001的显著水平(Pearson法)。
     1) a: Available Si, b: Organic bonded Si, c: Ferromanganese oxide Si, d: Amorphous Si, e: Residual P, f: Labile P, g: Intermediate-stable P, h: Stable P, i: Si in root, j: Si in stem, k: Si in leaf, l: Si in pod, m: P in root, n: P in stem, o: P in leaf, p: P in pod; *, ** and *** indicate correlations at the significant levels of 0.05, 0.01 and 0.001 respectively (Pearson method).
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    生物炭是由有机物料在厌氧条件下产生的,不同原料本身的差异致使制备得到的生物炭在理化特性、元素组成等方面也存在差异,如制备条件相同时稻秆生物炭的碳含量(38.39%~71.86%)高于稻壳生物炭(35.2%~44.7%)[27-28]。生物质热解过程中产生的有机酸以及制备原料有机基质中释放的碱盐等都会对生物炭的pH产生影响[29-30],较高温度条件制备得到的生物炭pH大多介于中性至碱性,将其添加至红壤可以有效改善土壤酸度[31-32]。Wang等[33]认为生物炭提高土壤pH可能是由于热解过程中材料表面形成了带负电荷的羧基、羟基和酚类官能团等,这些官能团可以有效降低土壤中的H+浓度。本研究中,生物炭添加显著提高了供试红壤的pH,且随着生物炭添加量的增加而增幅提升,其中稻秆生物炭对土壤pH的影响更为显著,这可能是由于本试验中制备得到的稻秆生物炭本身pH就要高于稻壳生物炭。施用生物炭还改变了土壤有效阳离子交换量,Peng等[34]指出添加2.4 t·hm−2的水稻秸秆生物炭可以有效增加土壤阳离子交换量(CEC);El-Naggar等[35]在砂质土壤中添加30 t·hm−2的水稻秸秆生物炭后土壤CEC增加了3 cmol· kg−1,而我们的研究结果指出在酸性红壤中添加4%稻秆生物炭使得土壤ECEC增加了235.9%,与前人一致。生物炭的添加会改变土壤化学性质,包括pH、电导率及CEC等,这些性质的改变都会对土壤各养分间的相互作用产生影响[36]。研究表明,生物炭可以直接增加土壤中有效磷的含量[37],促使磷形态发生转化,提高磷素有效性,扩大磷库潜力[38]。本研究中,添加生物炭显著提高了土壤活性磷组分含量,且随着添加量的增加作用效果更为显著,其中稻秆生物炭的作用效果显著高于稻壳生物炭,这与白玉超等[39]研究结果一致。除了磷素,本研究中生物炭添加使得土壤中4种形态的硅含量均有一定程度的提升。以富硅植物原料如水稻秸秆、稻壳等制备得到的生物炭,其硅含量往往可以达到其干物质质量的20%[40],可直接作为硅肥用于土壤改良。在本研究的结果中,土壤中有效态硅所占比例显著提高,而无定形态硅的比例有所减少,这表明添加生物炭会促使部分无定形态硅向有效态硅转化,以此提高土壤硅元素的有效性,与其他学者研究结果[41]一致。

    生物炭添加会对作物生长产生影响,会对大豆各生育期株高、茎粗、根长、根体积、鲜质量及干物质积累量有一定的促进作用[42]。生物炭对大豆促生增产的效果随着施用量的增加呈现先增加后降低的趋势,当添加量为81 kg·hm−2时效果最为显著[43];适量的生物炭(186.36 kg·hm−2)施入黑钙土壤后可以有效促进大豆生长,增加地上部株高,茎、叶、根鲜质量及干质量,提高植株生物量[44],以上研究均与本试验得到的结论一致。此外,本研究还发现生物炭的添加可以显著提高大豆根、叶部的硅含量。研究所用的稻壳生物炭和稻秆生物炭有效态硅质量分数分别为790.7、480.8 mg·kg−1,远远高于供试土壤水平(53.2 mg·kg−1),因此添加生物炭能向土壤提供丰富的外源硅,进而促进大豆硅元素的吸收积累。除了硅素,添加生物炭还显著提高了植株各部位磷的含量,这与邝曦芝等[9]在其研究中发现的添加生物炭可以显著促进赤红壤大豆植株磷吸收的结论高度一致。磷在土壤中的可移动性较差,根部吸收是植物从土壤中获取磷素的主要方式[45],因此根系形态学特征与豆科作物的磷吸收利用效率之间密切相关[46]。本研究中,添加生物炭显著提高了大豆根长、根表面积及根体积,增大了根系与土壤的有效接触面积,以此促进了大豆对磷元素的吸收积累,并且此效果随着生物炭添加量的增加逐渐增强,其中稻秆生物炭的综合作用效果更为显著,这可能与生物炭的基本性质密切相关。

    胡克伟等[47]指出磷会降低土壤吸附态硅的含量,增加水溶态硅及活性硅含量,降低无定形态硅的占比,进而增强硅在土壤中的有效性;Silva[48]和Roy等[49]研究表明添加硅素至土壤会降低土壤中磷的吸附,提高土壤磷活性,增加磷有效性。由此可见,土壤硅、磷形态之间存在一定的交互作用,而本研究中土壤有效态硅与活性磷、稳定性磷之间存在极显著的正相关性恰好印证了这一点。不仅如此,植物体内的硅、磷含量同样存在交互作用,并且不同部位之间相互影响,存在差异。我们的研究发现大豆叶部的硅、磷含量存在显著正相关性;根部的硅含量和叶、荚部的磷含量存在显著正相关性,与茎部的磷含量存在显著正相关性,这可能是由于生物炭的添加提高了大豆根系对土壤中硅素的吸收,而硅素的存在使得植株地上部P/Fe和P/Mn比率增加,以此减少了铁、锰等金属离子对植物的毒害作用,进而提高了大豆植株体内磷酸的移动性和生物可利用效率[50],其具体原因有待进一步验证。综上,本研究认为添加生物炭会对土壤硅、磷的化学组分产生影响,而土壤硅、磷形态的不同直接影响了植物对硅、磷元素的吸收,并且2种元素之间的影响并非各自独立,而是共同作用,相互促进肥效,提高各自生物利用效率[51]

    生物炭的添加显著提高了土壤pH、ECEC及盐基饱和度,降低了交换性酸含量,一定程度上改良了酸性红壤的基础环境,以此增加了土壤中有效态硅、有效态磷的含量。土壤硅、磷形态的变化促进了大豆生长及根系形态发育,提高了植株各部位对硅、磷元素的吸收利用。研究发现,稻秆生物炭的综合作用效果要显著高于稻壳生物炭,其中添加质量分数为4%的稻秆生物炭处理对于酸性土壤的改良及促进大豆植株对硅、磷吸收利用等方面的综合作用效果最为显著,具有很高的实际应用潜力。

  • 图  1   重组质粒PNZ 8148-Cp51的酶切鉴定

    M:DNA marker DL5000;1:大肠埃希菌中构建的阳性质粒;2:乳酸菌NZ9000中的重提质粒

    Figure  1.   Identification of recombinant plasmid PNZ 8148-Cp51 by enzyme digestion

    M:DNA marker DL5000; 1: Positive plasmid in Escherichia coli; 2: Positive plasmid extracted from Lactococcus lactis NZ9000

    图  2   NZ9000/PNZ8148-Cp51蛋白纯化SDS-PAGE电泳图

    M:蛋白marker;1:蛋白流穿液;2:初次洗涤液;3:末次洗涤液;4:150 mmol·L−1咪唑洗脱液

    Figure  2.   SDS-PAGE analysis of purified NZ9000/PNZ8148-Cp51 protein

    M: Protein marker; 1: Flow-through solution; 2: First washing solution; 3: Last washing solution; 4: 150 mmol·L−1 imidazole elution

    图  3   NZ9000/PNZ8148-cp51 Western Blot检测结果

    M:蛋白marker;1:NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导培养液上清;2:NZ9000/PNZ8148(空载)诱导菌;3:NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导菌;4:NZ9000/PNZ8148-Cp51不诱导菌;5:NZ9000/PNZ8148诱导条带;6:NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导破碎上清;7:NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导破碎沉淀

    Figure  3.   Detection of NZ9000/PNZ8148-Cp51 by Western Blot

    M: Protein marker; 1: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced supernatant; 2: NZ9000/PNZ8148(negative control) induced bacteria; 3: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced bacteria; 4: NZ9000/PNZ8148-Cp51 non-induced bacteria; 5: NZ9000/PNZ8148 supernatant; 6: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced supernatant; 7: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced precipitate

    图  4   不同浓度NZ9000/PNZ8148-Cp51噬菌体裂解酶对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性

    Figure  4.   Antibacterial activities of different concentrations of NZ9000/PNZ8148-Cp51 phage lysin against Clostridium perfringens type A

    图  5   产气荚膜梭菌Cp2-4单独培养及混合培养生长曲线

    Figure  5.   Growth curves of Clostridium perfringens Cp2-4 in pure and mixed cultures

  • [1]

    PETIT L, GIBERT M, POPOFF M R. Clostridium perfringens: Toxinotype and genotype[J]. Trends Microbiol, 1999, 7(3): 104-110. doi: 10.1016/S0966-842X(98)01430-9

    [2]

    ROOD J I, ADAMS V, LACEY J, et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme[J]. Anaerobe, 2018, 53: 5-10. doi: 10.1016/j.anaerobe.2018.04.011

    [3]

    ZAHOOR I, GHAYAS A, BASHEER A. Genetics and genomics of susceptibility and immune response to necrotic enteritis in chicken: A review[J]. Mol Biol Rep, 2018, 45(1): 31-37. doi: 10.1007/s11033-017-4138-8

    [4]

    PARISH W E. Necrotic enteritis in the fowl (Gallus gallus domesticus): I: Histopathology of the disease and isolation of a strain of Clostridium welchii[J]. J Comp Pathol, 1961, 71: 377-393. doi: 10.1016/S0368-1742(61)80043-X

    [5]

    SCHUCH R, PELZEK A J, RAZ A, et al. Use of a bacteriophage lysin to identify a novel target for antimicrobial development[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e60754. doi: 10.1371/journal.pone.0060754

    [6]

    POUWELS P H, LEER R J, SHAW M, et al. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes[J]. Int J Food Microbiol, 1998, 41(2): 155-167. doi: 10.1016/S0168-1605(98)00048-8

    [7] 刘斌, 黄少磊, 刘彦民, 等. 分子标记技术应用于乳酸菌分类鉴定的研究进展[J]. 中国微生态学杂志, 2012, 24(7): 670-673.
    [8] 郝凤奇, 王春凤, 杨桂连, 等. 牛乳中乳酸乳球菌nisRK基因的克隆与序列分析[J]. 吉林农业大学学报, 2010, 32(1): 108-112.
    [9] 丁瑞雪, 王一然, 乌日娜, 等. 发酵乳调控人体肠道营养健康的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(12): 281-287.
    [10] 杨芳, 郭瑞凤. 益生菌联合肠内营养在重症患者疾病治疗中的应用[J]. 临床与病理杂志, 2018, 38(12): 2702-2706. doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2018.12.031
    [11] 唐丽杰, 徐毅刚, 葛俊伟, 等. 乳酸乳球菌NZ9000在小鼠体内的定植研究[J]. 中国乳品工业, 2007(7): 11-12. doi: 10.3969/j.issn.1001-2230.2007.07.003
    [12] 吕梦娜, 龙航宇, 王丽梅, 等. A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测[J]. 华南农业大学学报, 2017, 38(5): 19-23.
    [13]

    HOLO H, NES I F. High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media[J]. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(12): 3119-3123.

    [14]

    BORYSOWSKI J, WEBER-DABROWSKA B, GORSKI A. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2006, 231(4): 366-377. doi: 10.1177/153537020623100402

    [15] 葛怀娜, 刘珊娜, 刘金福, 等. 李斯特菌噬菌体裂解酶CBD蛋白的克隆与表达[J]. 食品工业科技, 2016, 37(16): 234-237.
    [16] 苑文涛, 张亚宁, 夏雨婷, 等. 猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶的原核表达及活性检测[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(10): 37-40.
    [17]

    LIANG X, ZHANG L, ZHONG J, et al. Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(1): 95-101. doi: 10.1007/s00253-006-0809-4

    [18]

    HAN W, MERCENIER A, AIT-BELGNAOUI A, et al. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase[J]. Inflamm Bowel Dis, 2006, 12(11): 1044-1052. doi: 10.1097/01.mib.0000235101.09231.9e

    [19]

    MARTIN R, CHAIN F, MIQUEL S, et al. Effects in the use of a genetically engineered strain of Lactococcus lactis delivering in situ IL-10 as a therapy to treat low-grade colon inflammation[J]. Hum Vaccin Immunother, 2014, 10(6): 1611-1621. doi: 10.4161/hv.28549

    [20]

    YANG Y, KANG Z, ZHOU J, et al. High-level expression and characterization of recombinant acid urease for enzymatic degradation of urea in rice wine[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(1): 301-308. doi: 10.1007/s00253-014-5916-z

    [21]

    MOBERGSLIEN A, VASOVIC V, MATHIESEN G, et al. Recombinant Lactobacillus plantarum induces immune responses to cancer testis antigen NY-ESO-1 and maturation of dendritic cells[J]. Hum Vaccin Immunother, 2015, 11(11): 2664-2673. doi: 10.1080/21645515.2015.1056952

    [22] 杨航, 余军平, 危宏平. 裂解酶治疗的研究进展与应用前景[J]. 微生物学通报, 2015, 42(1): 178-184.
  • 期刊类型引用(2)

    1. 张喜悦,李昕,赵格,赵建梅,曲志娜,刘俊辉,王娟,王琳,刘娜,宋时萍,黄秀梅,高玉斌,邹明,王君玮. 表达猪大肠杆菌987P-F18多表位肽重组乳酸乳球菌的构建及表征. 中国动物检疫. 2024(12): 103-109 . 百度学术
    2. 范雪梅,林瑞庆,翁亚彪,刘红. 饲料禁抗背景下鸡球虫病和坏死性肠炎的综合防控. 养禽与禽病防治. 2020(10): 11-15 . 百度学术

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-02-28
  • 网络出版日期:  2023-05-17
  • 刊出日期:  2020-01-09

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